Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Усовершенствованный молекулярно-генетический метод определения хромосомной транслокации t (9; 22) при некоторых формах лейкозов

-г

ОЛ

0

На правах рукописи

СИДОРОВА Жанна Юрьевна

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХРОМОСОМНОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ I (9; 22) ПРИ НЕКОТОРЫХ ФОРМАХ ЛЕЙКОЗОВ

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии.

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор Блинов М.Н.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук доцент Мамаев H.H. доктор медицинских наук Калиновский BJL

Ведущая организация - Военно - Медицинская Академия

Защита состоится 1997 г. „ ,//3 часов на

заседании специализированного совета Д 084.19.01 Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан 1997 г

Ученый секретарь специализированного совета

B.C. Быков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Открытия последних лет, полученные благодаря стремительному развитию молекулярной биологии, убедительно свидетельствуют о том, что злокачественная трансформация клеток нередко обусловлена активацией протоонкогенов, которая заключается в количественном или качественном изменении самих протоонкогенов и кодируемых ими белков. Наиболее частой причиной активации протоонкогенов при лейкозах являются хромосомные перестройки. В последние годы накапливается все больше и больше данных о том, что течение лейкозов и их прогноз во многих случаях довольно тесно коррелирует с типом хромосомных транслокаций (Cleary M.L. 1991; Rabbits Т.Н., 1991; Sawyers C.L. et al., 1991; Korsmeyer S.J. 1992; Nichols J. et al., 1992; Bartram C.R. 1993).

Известно, что более чем у 90% больных ХМЛ и 5-10% больных острыми лимфолейкозами при анализе кариотипа обнаруживается филадельфийская хромосома (Ph-хромосома), возникающая в результате хромосомной транслокации t (9; 22), которая приводит к образованию BCR-ABL химерного гена. В результате образования химерного BCR-ABL гена продуцируется белок p210BCR*ABLiura белок р190вся_А1и', которые играют важную роль в становлении последующей лейкозной трансформации (Konopka J.B. et al., 1984; Bartram C.R., 1985; Saglio G. et al., 1986).

Ph-хромосома с успехом выявляется при цитогенетическом исследовании в большинстве случаев, однако, в ряде случаев хромосомная транслокация t (9; 22) не приводит к образованию специфического цитогенетического маркера (Ph-хромосомы), а выявляется только на молекулярно-генетическом уровне. Подобная ситуация встречается в 5 % случаев больных ХМЛ и 10-15% больных острыми лимфолейкозами.

Клинический опыт последних лет свидетельствует о принципиальной возможности излечения ряда гемобластозов или, по крайней мере, значительного удлинения безрецидивного периода, что стало возможным благодаря новым подходам к их терапии. Успех терапии и последующая тактика ведения больных во многом зависят от полноты эрадикации лейкозного клона, оценка которой с помощью традиционных цитогенетических методов часто невозможна ввиду их относительно низкой чувствительности.

Это делает актуальной задачу по разработке и внедрению в практику высокочувствительных молекулярно-генетических методов идентификации остаточных лейкозных клеток в организме больного, то есть для диагностики минимальной остаточной болезни (МОБ). Использование этих методов для выявления хромосомной транслокации t (9; 22) у больных ХМЛ и ряда больных ОЛЛ неоценимо в ситуациях, когда хромосомная транслокация не сопровождается возникновением цитогенетического маркера (Ph-хромосомы), или доля клеток, несущих Ph-хромосому минимальна - после интенсивной

химиотерапии, трансплантации гемопоэтических клеток, курсо интерферонотерапии.

В настоящее время лучшими для детектирования хромосомно перестройки t (9; 22), приводящей к образованию BCR-ABL гена, считаютс методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакци (WXKawasaki E.S et. al., 1988; Roth M.S. et al., 1989; Lee M.-Sh. et al., 1991 Fey M.F. et al., 1991; Negrin R.S. et al., 1991; Maurer J. et al., 1991). Он отличаются высокой чувствительностью (выявляют 1 лейкозную клетку сред 100000 нормальных) и специфичностью и весьма разнообразны. Одни требую дополнительной блот-гибридизации, в других оценка результатов производите непосредственно по анализу продуктов ПЦР в геле, но используются или одно или двухраундовая ПЦР. Однако, до настоящего времени остается открыты! вопрос о наиболее оптимальном варианте метода.

В связи с этим, актуальной представляется разработка оптимальноп метода, который бы с одной стороны обладал высокой точностью i специфичностью, а с другой - был бы относительно прост, недорог и мог 6i быть использован в клинической практике.

Цель работы: Разработка и внедрение в клиническую практик усовершенствованного метода определения BCR-ABL химерного гена да идентификации хромосомной транслокации t (9; 22) с помощью ПЦР при XMJ и некоторых других гемобластозах, а также для диагностики МОБ.

Задачи исследования:

1. Апробировать различные методы выделения тотальной клеточной РШ из клеток периферической крови больных лейкозами и здоровых доноров i провести сравнительный анализ пригодности полученных препаратов РНК дои дальнейшего молекулярно-генетического исследования.

2. Сравнить чувствительность двух наиболее часто используемы) подходов постановки ПЦР для детекции химерного транскрипта BCR-ABL однораундовый и двухраундовый (с применением дополнительной парь «гнездовых» праймеров во втором раунде ПЦР).

3. Оценить возможность использования Tth-полимеразы в качеств! обратной транскрштазы при постановке РТ-ПЦР для детекции BCR-ABI химерного гена.

4. Разработать и внедрить наиболее простой и доступный дл> клинического использования молекулярно-генетический метод идентификацю хромосомной транслокации t (9; 22).

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационного исследованш впервые получены следующие данные:

1. Доказана возможность использования одного фермента - Ttl полимеразы при постановке РТ-ПЦР для детекции BCR-ABL химерного гена;

2. Предложен модифицированный, наиболее доступный и информативный метод определения хромосомной транслокации t (9; 22); продемонстрирована его высокая чувствительность и специфичность, показана возможность его применения для диагностики и мониторинга МОБ;

3. Предложен мультипраймерный метод РТ-ПЦР с использованием одного фермента, позволяющий в ходе одной реакции проанализировать исследуемый образец РНК на наличие или отсутствие химерного транскрипта BCR-ABL, а также оценить качество проведения РТ-ПЦР и качество тестируемой РНК;

4. Установлено, что несмотря на некоторое снижение чувствительности мультипраймерного метода РТ-ПЦР по сравнению с модифицированным, он может быть использован для первичной диагностики t (9; 22) транслокации, так как позволяет регистрировать одну лейкозную клетку на 10000 нормальных;

5. Показано, что оба предложенных метода имеют ряд преимуществ по сравнению с опубликованными прототипами:

• сокращается время проведения реакции

• уменьшается риск контаминации

• удешевляется стоимость анализа

Практическая значимость работы. Модифицированный и мультипраймерный методы РТ-ПЦР прошли апробацию и используются в клинической практике гематологических отделений РосНИИГТ и Клинического Центра передовых медицинских технологий г. С.-Петербурга (КЦПМТ). С помощью разработанных методов были проведены молекулярно-генетические исследования для детекции хромосомной транслокации t (9; 22) у 80 больных ХМЛ и 40 больных OJI.

Применение в клинической практике модифицированного метода РТ-ПЦР (на примере 12 больных после алло- или ауто-ТКМ) показало, что РТ-ПЦР является наиболее приемлемым методом для диагностики и мониторинга МОБ при обследовании больных ХМЛ и OJIJL

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 1П Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), 4-ой международной конференции "Спид, рак и родственные проблемы." (Санкт-Петербург, 1996). По материалам диссертации составлены и утверждены МЗ РФ (11/11/96) методические рекомендации № 96/220 «Быстрый метод детекции BCR-ABL химерного гена для диагностики хромосомной транслокации t (9; 22)».

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, 2 работы приняты к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 11? страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы описания материалов и методов, результатов собственных исследований обсуждения полученных данных, выводов и указателя литературы. Работ! иллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает Ш публикаций.

Положения, выносимые на защиту.

1. ТШ-полимераза может быть использована не только в качестве ДНК' полимеразы, но и обратной транскриптазы при постановке РТ-ПЦР дш детекции хромосомной транслокации I (9; 22).

2. Применение ТШ-полимеразы не снижает чувствительности метода, I при проведении 40 циклов амплификации позволяет регистрировать одн) клетку, несущую ВСЯ-АВЬ ген среди 100000 нормальных.

3. Применение мультипраймерной технологии ПЦР позволяет упростил процедуру проведения анализа.

4. Разработанные методы РТ-ПЦР эффективны при использовании их I клинической практике для первичной диагностики хромосомной транслокации I (9; 22) и диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили лейкоциты, выделенные из крови здоровых лиц, больных ХМЛ и ОЛ, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях РосНИИГТ и Клинического Центра передовых медицинских технологий г. С-Петербурга (КЦПМТ) и клетки линии К-562 в стационарной фазе роста, любезно предоставленные сотрудниками лаборатории иммунологии КЦПМТ.

Для получения РНК в работе были использованы лейкоциты 10 здоровых доноров, 80 больных ХМЛ и 40 больных ОЛ, в том числе 30 больных ОЛЛ и 10 ОМЛ. У 74 больных ХМЛ и 4 больных ОЛЛ цитогенетически была выявлена РЬ-хромосома. Большинство больных ХМЛ находилось в развернутой фазе заболевания, 11 - в фазе властного криза, больные ОЛ находились в активной фазе заболевания. Среди обследованных больных аутотрансплантадая костного мозга была сделана трем больным ОЛЛ и одному больному ХМЛ; пересадка аллогенного костного мозга была проведена 8 больным ХМЛ.

Лейкоциты из крови больных лейкозами и здоровых лиц выделяли четырьмя методами. В первом случае клетки получали из 5-10 мл стабилизированной ЭДТА (к.к.0.1-0.15%) венозной крови методом отстаивания в растворе желатины (к.к. 0.5%) в течение 15-30 минут, во втором случае -путем спонтанной седиментации. Плазменный слой, содержащий лейкоциты, отсасывали, центрифугировали и клетки промывали раствором 0.14 М ИаС!. В

третьем случае, к одному объему стабилизированной крови (обычно к 2-5 мл) добавляли 3 объема 0.83% раствора NH4CI приготовленного на O.Ol M трис-буфере, pH 7.4, и оставляли кровь на 6-8 минут. После центрифугирования гемолизат отбрасывали. В четвертом случае клетки получали из 5-10 мл стабилизированной ЭДТА венозной крови путем фракционирования клеток в градиенте фиколла.

Полученный разными способами лейкоцитарный осадок (~107 клеток) использовали для выделения РНК - методом «минипрепа» (Wilkinson M., 1988) и методом с использованием гуанидинтиоцианата (Chomczynski P., Sacchi N., 1987). Кроме того, РНК с использованием гуанидинтиоцианата выделяли из цельной крови, увеличив количество денатурирующего раствора (Chomczynski P., Sacchi N., 1987) в 3 раза, а также по методу предложенному Lozano М.Е. с соавторами, 1993. Качество выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза фракционированием в 1,5% агарозном геле.

На первых этапах исследования для детекции BCR-ABL химерной мРНК использовали классическую двухступенчатую схему постановки РТ-ПЦР.

При проведении реакции обратной транскрипции было использовано 2 варианта ее постановки. В первом варианте в качестве затравки использовали смесь случайных гексануклеотидных праймеров, во втором варианте в качестве затравки использовали специфический праймер, антикомплементарный части нуклеотидной последовательности экзона 2 гена ABL. В качестве специфической затравки использовали праймер CML В, предложенный Kawasaki E.S., или праймер abl-RT, предложенный Roth M.S. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в работе, в том числе в ПНР, приведены в таблице № 1.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров._

Название праймера

Нуклеотидная последовательность _праймера_

CML В

5'- TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC - 3"

CML А

5'- GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC - 3'

abl-RT

5'- AACGAAAAGCTTGGGGTC - 3'

abl-1

5'- TCACTGGGTCCAGCGAGAAGGTTTTCCTTGGA GT- 3'

bcr-1

5'- AGCATGGCCTTCAGGGTGCACAGCCGCAACGGCAA- 3'

abl-2

5'-C TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCT- 3'

bcr-2

5'- GTTCCTGATCTCCTCTGACTATGAGCGTGCA- 3'

ALLE

5'- CGCATGTTCCGGGACAAAAGC - 3'

ALL F

51- GGTCATTTTCACTGGGTCCAGC - 3'

Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом. 1 мкг РНК образца и 100 пикомолей гексануклеотадов смешивали, добавив

бидистилированной воды до конечного объема 10 мкл и проводили отжиг затравок и денатурацию РНК в течении 10 минут при 65° С. Затем, добавляли 5 мкл раствора, содержащего: 50 мМ Tris НС1, рН 8.3, 8 мМ MgCb, Ю мМ DTT

(дититотрейтола), 50 единиц MMulV (фермента обратной транскрипции), 1 единиц RNasin (ингибитор РЖ-аз), 1 мкг/мкл БСА, по 500 мкМ каждого и дезоксинуклеотидтрифосфатов - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, d'iTP) и проводил реакцию 2 часа при температуре 37° С. Затем помещали пробы в лед до остановки реакции. Образцы полученной кДНК копий хранили при 4° С Реакцию обратной транскрипции с использованием специфического праймер проводили аналогично вышеописанному протоколу, добавляя н первоначальном этапе 10 пикомоль специфического праймера CML В или ab! RT к исследуемой РНК; количество дезоксинуклеотидтрифосфатов было в 2.; раза меньше - 200 мкМ. В остальном, протокол проведения ревертазно] реакции (РТ) оставался без изменения.

При использовании в РТ случайных затравок или специфическое праймера CML В, проводили однораундовую ПЦР, а при получении копи кДНК с праймером abl-RT - двухраундовую. Первый раунд ПЦР проводили : одинаковых условиях, в буфере следующего состава: 67 мМ TrisHCl, 16.6 м\ сульфата аммония, 1.5-2 мМ хлорида магния, 0.025% Tween 20. Конечны) объем пробы был 30 мкл, и содержал 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов 1-3 мкл реакционной смеси, содержащей синтезированную кДНК, 1.5 единищ термостабильной ДНК полимеразы Tag. Если ПЦР проводили согласи» протоколу, предложенному Kawasaki E.S., в реакционную смесь добавляли по : мкМ каждого из 2-х праймеров CML В и CML А. Первый цикл амплификацш проводили с предварительной денатурацией кДНК: 94° С - 2 мин., 55° С - 51 сек., 72° С -1 мин. 35 - 40 циклов амплификации осуществляли в термоциклер' при следующих условиях: 94° С - 50 сек. (денатурация), 55° С - 50 сек. (отжиг) 72° С - 1 мин. (синтез). ПЦР завершали удлиненной до 5 минут фазой синтеза При анализе образцов РНК, выделенных из крови больных острыми лейкозами в РТ реакции использовался праймер ALL F, а в последующей ПЦР - ALL F i ALL Е, при использовании которых синтезируется химерный транскрипт BCR ABL, более часто встречаемый при OJIJI (см. рис.1). При отсутстви! амплифшсата процедуру повторяли, используя праймеры CML А и CML В. Есл ПЦР проводили согласно протоколу, предложенному Roth M.S., в реакционнук смесь добавляли по 5 мкМ праймеров: bcr-1 и abl-1.

BCR

c-ABL

Ь2а2-р210

НИН-ПН, Ч\УЧМ ЬМ-р210

Рис. 1. Молекулярно-генетическая схема транслокации t (9; 22).

Второй раунд ПЦР проводили в буфере того же состава, в тех же условиях проведения реакции, при этом в качестве матрицы использовали 1 мкл продукта первого раунда ПЦР (полученного с праймерами bcr-1 и abl-1), добавляя в реакцию «гнездовые» праймеры bcr-2 и abl-2 в концентрации по 5 мкМ каждый. В первом и во втором раунде ПЦР проводили по 35 циклов амплификации.

При проведении РТ-ПЦР в любом варианте ее постановки всегда ставился дополнительный положительный контроль, позволяющий оценить качество анализируемого образца РНК, а также качество проведения реакции обратной транскрипции, и последующей ПЦР. Дополнительный контроль включал в себя пару праймеров pi (5'- CCTCCATGATGCTGCTTACATGTC-3') и Р2 (51-ATGTCT CGCTCCGTGGCCTTAGCT-3') для амплификации участка гена р-2-микроглобулина (Lee A., et al., 1989), постоянно экспрессирующегося в клетках. В качестве отрицательного контроля обычно использовали пробу, где вместо РЖ добавляли воду.

Визуализацию продуктов РТ-ПЦР осуществляли с помощью электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК в 6% полиакриламидном геле (ПААГ), с последующей окраской геля в растворе бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК плазмиды pUC 19, рестрицированную ферментом Msp I.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 .Оптимизация метода выделения РНК.

Результаты, получаемые с помощью РТ-ПЦР, во многом зависят от качества РНК, используемой как исходный материал. Поэтому, на первом этапе работы был проведен анализ различных методов выделения РНК из клеток периферической крови.

Метод выделения РНК должен отвечать двум основным требованиям: 1) обеспечивать получение РНК в максимально нативном состоянии (использование деградированных препаратов РНК может приводить к получению ложно-отрицительных результатов в РТ-ПЦР); 2) обеспечивать выделение РНК в количестве, необходимом для последующего анализа, из минимально возможного числа клеток (105-107 клеток), что позволяет детектировать наличие клеток с t (9; 22) транслокацией у больных с лейкопенией и обеспечивает возможность диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни.

В качестве прототипов были отобраны два метода выделения РНК - метод «минипрепа» (Wilkinson М., 1988) и метод Гомзинского (Chomczynski Р., Sacchi N., 1987). Следует отметить, что оба метода были предложены для выделения РНК из клеточных культур или тканей, поэтому возможность их применения для получения РНК из белых клеток крови требовала проведения соответствующей предварительной оценки.

В результате исследований было установлено, что методом «минипрепа» удается получить недеградированные препараты РНК из клеток лимфоидного ряда (в качестве модели использовали лимфоциты больных хроническим лимфолейкозом), несколько худшие результаты были получены при выделении РНК из клеток линии К-562. Применение метода «минипрепа» для выделения РНК из белых клеток крови доноров и больных ХМЛ и ОЛ в подавляющем большинстве случаев не позволяло получать недеградированную РНК.

Попытки адаптировать метод Гомзинского к получению РНК из ядерных клеток крови показали, что недеградированную РНК можно выделить из цельной крови без предварительного отделения лейкоцитов, однако этот вариант требует большого расхода дорогостоящего гуанидингиоцианата. Поэтому на следующем этапе работы в качестве объекта для выделения РНК были использованы изолированные из крови ядерные клетки.

Оказалось, что препараты РНК хорошего качества можно получить только в том случае, когда фракцию белых клеток крови получали методом лизиса эритроцитов. Если для изоляции лейкоцитов использовали другие методы, получаемая РНК почти всегда была частично или полностью деградированной.

Таким образом, в результате исследования по выбору методов выделения РНК, качество которой удовлетворяло бы требованиям для использования препаратов РНК в реакции обратной транскрипции, был определен оптимальный вариант выделения РНК из белых клеток крови, обеспечивающий получение недеградированных образцов при минимальном расходе гуанидингиоцианата (в 4-6 раз меньшем, чем при выделении РНК из цельной крови). Кроме того, предложенный нами способ выделения изолированных клеток и дальнейшее применение метода Гомзинского для выделения РНК, позволяет получать РНК в количестве, вполне достаточном для дальнейшего анализа, из 5х105-107 клеток. Все препараты РНК, используемые в работе выделялись по оптимизированному протоколу.

2. Сравнительная характеристика методов определения хромосомной транслокации 1 (9; 22) с использованием РТ-ПЦР.

Сравнительная характеристика чувствительности методов РТ-ПЦР с одним раундом и двумя раундами ПЦР проводилась следующим образом. Клетки К-562 разводили лейкоцитами, полученными от здорового донора в соотношении: 1:10,1:100, 1:1000,1:10000,1:100000. После этого, РНК выделяли по оптимизированному протоколу, и образцы полученной РНК тестировали в реакциях РТ-ПЦР как было описано в материалах и методах исследования. Визуальная детекция амплификата, полученного при постановке одного раунда ПЦР (40 циклов) с использованием праймеров СМЬ А и СМЬ В была возможной до соотношения клеток К-562/лейкоциты равного 1:100000. При использовании праймеров Ьсг-1 и аЫ-1 в первом раунде ПЦР (35 циклов) визуализация продукта реакции была возможна при разведении лейкозных

клеток до 1:100, и лишь после проведения второго раунда ПЦР, где использовались гнездовые праймеры bcr-2 и abl-2, была возможна при разведении 1:100000.

Анализируя полученные результаты, был сделан вывод, что использование 2-х раундовой ПЦР для детекдиии химерного гена BCR-ABL не дает преимущества в чувствительности метода, а количество требуемых реакгавов и время проведения анализа возрастает в 2 раза. Более того, при использовании во втором раунде ПЦР в качестве матрицы продукта, полученного после 1-го раунда ПЦР, впервые возникла проблема контаминации, то есть получение ложно-положительных ответов. Следует отметить, что при проведении РТ-ПЦР в любом варианте, всегда ставилась проба (отрицательный контроль), в которой вместо РНК добавлялась вода и проба (положительный контроль), когда с исследуемой РНК синтезировали участок гена Р-2 микроглобулина.

3. Модифицированный метод РТ-ПЦР для детекции химерного гена BCR-ABL.

Из литературных данных известно, что термостабильные ДНК полимеразы: Tag, выделенная из термофильных бактерий Thermus aquaticus и Tth, выделенная из термофильных бактерий Thermus termofilis обладают кроме ДНК-полимеразной активности еще и активностью обратной транскриптазы. При этом, Tth ДНК полимераза имеет в присутствии ионов двухвалентного марганца такую высокую ревертазную активность, что ее можно использовать в качестве ревертазы в реакции обратной транскрипции (Myers T.W. et al., 1991). Поэтому встал вопрос о возможности использования подобного методического подхода и при проведении РТ-ПЦР для идентификации BCR-ABL химерного гена, что позволило бы заметно упростить проведение анализа, снизить его стоимость и тем самым сделать его более доступным для использования в клинической практике. Следует отметить, что до сих пор такой подход к исследованию хромосомной транслокации t (9; 22) не применялся, и только недавно появились сообщения об использовании в качестве обратной транскриптазы 7Wi полимеразы при диагностике вируса гепатита С (Node F.S. et al., 1995). U,.

При проведении работы нами был использован коммерческий препарат Tth полимеразы, выпускаемый фирмой Биомастер (Москва, Россия) - так называемая TET-Z термостабильная ДНК полимераза, обладающая по данным фирмы-изготоййтеля как ревертазной, так и ДНК-полимеразной активностью.

По литературным данным (Myers T.W. et al., 1991), Tth термостабильная полимераза может быть использована как обратная транскриптаза при 70° С (на пике своей ревертазной активности). Поэтому первоначально необходимо было осуществить выбор специфического праймера-затравки, используемого для синтеза кДНК. Одним из необходимых условий при подборе этого праймера было требование «высокой» температуры отжига для него. Используя

компьютерную программу «ОЬЮО», мы проанализировали характеристики праймера СМЬ В и возможность его использования в качестве затравки при таком варианте проведении РТ-ПЦР. Оказалось, что по своим параметрам он удовлетворяет предъявляемым требованиям, и поскольку ранее была показана целесообразность использования пары праймеров СМЬ В и СМЬ А для детекции химерного транскрипта ВСЯ-АВЬ, то на начальном этапе работы с одним ферментом (ТЕТ-г полимеразой), мы использовали именно эту пару праймеров для постановки РТ-ПЦР.

Использование совершенно нового фермента - ТЕТ-2 полимеразы, и нетрадиционного подхода к проведению реакции обратной транскрипции потребовало проведения методической работы на клетках К-562: 1) по оптимизации времени, необходимого для проведения РТ, 2) по оценке порога чувствительности модифицированного, одноэтапного метода проведения РТ-ПЦР.

В ходе работы было выяснено, что оптимальное время для проведения реакции обратной транскрипции составляет 20 минут. Исследование порога чувствительности метода РТ-ПЦР с использованием одного фермента показало, что разрешающая способность метода не снизилась и позволяет детектировать химерный транскрипт ВСЛ-АВЬ в 1 клетке среди 100000 нормальных (рис.2)

ю-1 ю-210-3ни ю-5

п.н .

Рис. 2. Оценка чувствительности модифицированного метода РТ-ПЦР

1.- маркер рЫС-19, рестрицированный Мер 1

2-6 - разведение клеток К-562 лейкоцитами здоровых доноров

2.- 1:10,3,-1:100,4,- 1:1000,5,-1:10000,6,-1:100000 7.- отрицательный контроль (в качестве матрицы - НгО)

4. Мультипраймерный метод РТ-ППР.

Таким образом, после проведения методической работы по тестированию фермента TET-Z полимеразы на клетках К-562 было показано, что использование одного фермента в качестве обратной транскриптазы для проведения реакции обратной транскрипции и в качестве ДНК-полимеразы для проведения ПЦР-реакции вместо традиционно используемых двух различных ферментов не снижает чувствительности реакции РТ-ПЦР. Более того, возникает ряд преимуществ: сокращается время проведения реакции и количество используемых реактивов, уменьшается риск контаминации, упрощается процедура проведения анализа.

Однако, оставалась еще одна проблема - необходимость включать дополнительную пробу для контроля качества РТ-ПЦР и тестируемой РНК. Поэтому на следующем этапе исследований мы попытались решить эту проблему путем создания мультипраймерной системы РТ-ПЦР. С целью упрощения, мы попытались разработать мультипраймерную систему РТ-ПЦР, для которой подобрать такие праймеры, которые позволяли бы диагностировать наличие транслокации в исследуемом образце РНК, и одновременно осуществлял, контроль качества проведения РТ-ПЦР и нативности РНК. Для этого, используя компьютерную программу «OLIGO», а также известные нуклеотидные последовательности «зоны кластеров разрыва» M-bcr, m-bcr, экзона 2 гена ABL, был проведен подбор праймеров для проведения мультипраймерной РТ-ПЦР. Одним из критических моментов при подборе праймеров была температура отжига у праймера, используемого в качестве затравки при проведении реакции обратной транскрипции, так как высокая температура (70° С) при которой синтезируется кДНК копия с исследуемой РНК требует высокой температуры отжига для праймера.

Таким образом, исходя из условий проведения РТ-ПЦР и анализа характеристик различных вариантов праймеров с помощью программы «OLIGO», наиболее оптимальным оказалось, использование в качестве специфического праймера-затравки для проведения реакции обратной транскрипции прайм ер ABL Ш (Maurer J. et al., 1991). При этом, копия кДНК, полученная с праймером ABL Ш включает в себя участок нормального гена ABL, и используя праймер ABL П (Maurer J. et al., 1991) в ПЦР реакции (рис.3) можно амплифицировать часть экзона 2 нормального гена ABL, и соответственно расценивать полученный продукт реакции как внутренний контроль на качество тестируемой РНК и проведение РТ-ПЦР. Для детекции транслокации, в качестве праймера на M Ьсг-последовательность был выбран праймер CML A (Kawasaki E.S. et al., 1988), в качестве праймера на m bcr локус - BCR I (Maurer J. et al., 1991). Нуклеотидная последовательность праймеров, подобранных для использования в мультипраймерной РТ-ПЦР указаны в таблице 2.

Используя в комбинированной реакции РТ-ПЦР одновременно 3 или 4 праймера (в случае тестирования образцов РНК, полученных от больных

острыми лейкозами) синтезировали в одной пробирке сразу два продукта реакции: химерный транскрипт BCR-ABL, а также транскрипт нормального гена ABL с участка между 2 и 3 экзонами.

СМ LA.

ABL II

.ABLUI

р210 BCR-ABL мРНК

6'BCR3K3oh>—(экзон 2 экзон 3

ABL экзон 2

S' BCR эоон

i)-(

экзон 2

ABL экзон 2

продукты РТ-ПЦР

397 л.н. 242 п.н.

322 п.н. 242 л.н.

CMLA ABL II

ABLUI

р190 BCR-ABL МРНК

S'BCR экзон

ABL Экзон 2

BCRI ABL II

ABLIH

271 п.н. 242 п.н.

Рис.3. Схематическое изображение локализации праймеров и размеры амплифицираванных продуктов, полученных в мультипраймерной РТ-ПЦР.

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров._

Название праймера

Нукпеотидная последовательность _праймера_

ABLÜI

5'- CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATTCC- 3'

ABL II

5'- CAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTG- У

CML А

5'- GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC - 3'

BCRI

5'- ATGGCGAGGGCGCCTTCCAT- 3'

В результате проведенных исследований, нами был разработан мультипраймерный метод РТ-ПЦР, позволяющей за одну реакцию протестировать образец РНК как на наличие или отсутствие перестройки, так и оценить качество постановки РТ-ПЦР и качество анализируемой РНК. При этом, было показано, что хотя чувствительность мультипраймерного метода на порядок ниже чем модифицированного, она вполне достаточна для первичной диагностики, так как позволяет выявлять 1 лейкозную клетку среди 10000 нормальных (рис 4).

Рис. 4. Сравнение чувствительности мультипраймерного и модифицированного методов РТ-ПЦР. 1.- маркер риС-19, рестрицированный Мбр 1 2-5, 7-11 - разведение клеток К-562 клетками здорового донора 6,12 - отрицательный контроль (в качестве матрицы - НгО)

5. Апробация метода РТ-ПЦР при обследовании больных хроническим миелолейкозом и некоторыми формами острого лейкоза.

В ходе работы, с помощью предложенных методов РТ-ПЦР модифицированного и мультипраймерного, нами было обследовано 80 больных XMJI; у 55 больных (70%) мы наблюдали перестройку по типу Ь3а2, и у 25 (30%) больных вариант транслокации соответствовал Ь2а2. Полученное соотношение по частоте встречаемости вариантов возможного сплайсинга при хромосомной перестройке t (9; 22) соответствует литературным данным (Zaccaria А. et al., 1993). Цитогенетический анализ на выявление Ph-хромосомы был проведен всем 80 больным, и у шести пациентов (7.5%) она не обнаруживалась. Важно отметить, что в группе Ph-негативных больных у двоих был диагностирован ювенильный XMJI, и выявление у этих пациентов химерного транскрипта BCR-ABL (у обоих пациентов лейкозная трансформация клеток была по типу Ь3а2 ) оказало влияние на выбор тактики лечения. Также следует отметить, что двоим больным из группы Ph-негативных впоследствии была проведена аллогенная трансплантация, и диагностика и мониторинг минимальной остаточной болезни была возможна только молекулярно-генетическим методом РТ-ПЦР.

В настоящий момент времени дискутируется вопрос о значимости различных вариантов транслокации t (9; 22) (Delage R. et al. 1991; Sawyers C.L

1993), однако окончательного мнения не существует. Анализ наших данны; показал, что среди больных с вариантом транслокации Ь3а2 75% находились 1 хронической стадии заболевания, 15% в прогрессирующей стадии и 10% ] стадии бластного криза. При анализе данных о больных с вариатта транслокации Ь2а2 процентное соотношение получилось следующим: 64°/ больных в хронической фазе, 16% больных в прогрессирующей фазе и 20^ больных в стадии БК. Сравнительная гистограмма приведена на рис.5.

Распределение больных ХМЛ с вариантами транслокаций Ь3а2 и Ь2а2 по фазам заболевания

80* 70* 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

—- больные с вариантом транслокации Ь3а2. Н- больные с вариантом транслокации Ь2а2.

1 - группы больных в хронической фазе заболевания.

2 - группы больных в прогрессирующей фазе заболевания.

3 - группы больных в стадии БК.

Рис.5. Сравнительная гистограмма больных ХМЛ с вариантами транслокаций Ь3а2 и Ь2а2 по фазам заболевания.

Оказалось, что в стадии бластного криза относительное количеста больных с вариантом транслокации Ь2а2 было в 2 раза больше, чем больных < вариантом транслокации Ь3а2. Более подробно сравнительный анализ по оценю возможного прогностического значения вариантов перестройки химерного ген; ВСЯ-АВЬ был проведен у 10 больных ХМЛ. По характеру течения заболевания продолжительности хронической фазы, временем перехода в прогрессирующук фазу или наступления бластного криза, был сделан предварительный вывод < том, что возможно, наличие у больного транслокации по типу Ь2а2 имеет более

плохое прогностическое значение, хотя окончательные выводы делать преждевременно, так как работа по анализу полученных данных будет продолжена.

Из 30 обследованных больных OJIJI и 10 больных OMJI по данным цнтогенетических исследований филадельфийскую хромосому наблюдали у 4 больных OJIJI (12%). Диагностика с использованием РТ-ПЦР показала наличие хромосомной транслокации t (9, 22) у 7 больных OJIJI (23%), у четверых наблюдали транслокацию по типу Ь3а2 и у троих больных вариант транслокации соответствовал типу перестройки ela2. Ни у одного больного с диагнозом ОМЛ транскрипта химерного гена BCR-ABL мы не наблюдали, хотя в литературе описаны подобные случаи (Williams B.G. et al., 1994; Crisan D. et al., 1994).

РТ-ПЦР анализ был использован как способ диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных с XMJI и ОЛЛ, которым была проведена трансплантация костного мозга. При этом, учитывая, что мультипраймерный метод является менее чувствительным чем модифицированный метод РТ-ПЦР с использованием TET-Z полимеразы, для диагностики и мониторинга МОБ мы использовали модифицированный метод РТ-ПЦР, причем в ПЦР проводили 40 циклов, а в качестве положительного контроля использовали пробу, в которой синтезировали участок нормального гена ABL. Данные по первоначальному тестированию на присутствие хромосомной транслокации t (9, 22) и дальнейшие наблюдения за судьбой больных приведены в таблице 3.

При обследовании больных на МОБ после проведения ТКМ было показано, что присутствие химерного транскрипта BCR-ABL через полгода после проведения ТКМ является неблагоприятным признаком, что полностью согласуется с литературными данными (Fey M.F. et al., 1991; Lee M.S. et al., 1992; Bartram C.R., 1993; Van Dongen J. et al., 1996).

Диагностика минимальной остаточной болезнь была проведена у 20 Ph-позитивных больных, получавших лечение реофероном в комплексе с гидрооксимочевиной в течении 3-х месяцев. В этом случае кровь для выделения РНК у таких больных забирали до начала терапии и в конце курса. Химерный транскрипт BCR-ABL обнаруживался у всех больных, на всех сроках наблюдения, несмотря на то, что у троих больных из этой группы наблюдалась временная клинико-гематологическая ремиссия, а у одного больного - полная цитогенетическая ремиссия сразу же после лечения.

Таблица 3. Цитогенетические и молекулярно-генетические данные больных после алло- и ауто- ТКМ.

№ д-з до ТКМ ТКМ ауто/ алло после ТКМ (месяцы)

РЬ +/- вси-АВЬ 1 2 3 4 ' 5 6 10 12

РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ РЬ ВСТАВЬ

1 хмл + Ь3а2 алло - + + + * * * * * * * * * * * ♦

2 хмл - Ь3а2 алло - + + * * * * * А

3 хмл - Ь3а2 алло - + - - * * - - * # - - * * - -

4 хмл + Ь2а2 алло - + - + - + * * - ++

5 ХМЛ + Ь3а2 алло * + + + * + + + * * * *

6 хмл + Ь3а2 алло - + - - * * - -

7 хмл - Ь2а2 алло - + - + - - - * * - + - -

8 хмл + Ь3а2 ауто + + * А

9 олл + е1а2 ауто - * * * * * - + * * - * * * - -

10 олл + е1а2 ауто - * * * * ♦ - * * * - - * * - -

11 олл + Ь3а2 ауто * * * * * * * * - + * * * *

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что оба разработанных метода РТ-ПЦР могут быть широко использованы в клинической практике. Учитывая, что мультипраймерный метод является менее чувствительным чем модифицированный метод РТ-ПЦР, мы рекомендуем для диагностики и мониторинга МОБ использовать модифицированный метод РТ-ПЦР (40 циклов), в качестве положительного контроля использовать пробу, в которой синтезируется участок нормального гена ABL. Мультипраймерный метод РТ-ПЦР мы рекомендуем использовать при первичной диагностике заболевания, как наиболее информативный и быстрый.

Применение методов РТ-ПЦР при обследовании больных XMJI и OJ1JI показало, что РТ-ПЦР является наиболее приемлемым, а в ряде случаев единственным методом для диагностики и мониторинга МОБ.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован метод получения тотальной РНК в недеградированном состоянии из лейкоцитов периферической крови.

2. Установлено, что проведение однораундовой ПЦР (40 циклов амплификации) позволяет выявлять 1 лейкозную клетку на 100000 нормальных, что обеспечивает возможность проведения как первичной диагностики хромосомной транслокации t (9, 22), так и диагностики и мониторинга минимальной остаточной болезни.

3. Доказана возможность и целесообразность применения TET-Z полимеразы при постановке РТ-ПЦР для идентификации BCR-ABL химерного гена.

4. Разработанный модифицированный метод РТ-ПЦР с использованием одного фермента обладает рядом существенных преимуществ по сравнению с известными прототипами:

а) сокращается время проведения анализа

б) уменьшается стоимость анализа

в) уменьшается риск контаминации

5. Предложен мультипраймерный метод РТ-ПЦР, позволяющий в одной пробе кроме детекции BCR-ABL химерного гена осуществлять внутренний контроль на качество тестируемой РНК и эффективность постановки РТ-ПЦР.

6. Эффективность разработанных модифицированного и мультипраймерного методов диагностики доказана при их клинических испытаниях, в ходе которых было обследовано 80 больных ХМЛ и 40 больных ОЛ, в том числе 4 больных после проведения аутоТКМ и 8 больных после аллоТКМ, что позволяет рекомендовать их для широкого внедрения в клиническую практику.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sidorova J., Blinov М., Lyschov A. A modified method for detection oi BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML). by polimerase chain reaction // Gemeinsame Jahrestagung der Deutschen und der Osterruchischen Gesselschaft fur Hamatologie und Oncologie.- Hamburg, 1995.- abst. № 503.

2. Абдулкадыров K.M., Рукавицын O.A., Бессмельцев C.C., Мартынкевич И.С., Салтыкова Л.Б., Сидорова Ж.Ю., Блинов М.Н., Щербакова Е.Г., Шилова Е.Р. Всегда ли обязательна цитогенетическая верификация XMJ1? // Тер. Архив,- 1996.- т.68,- № 7.-С. 27-31.

3. Сидорова Ж.Ю., Блинов М.Н., Лыщев А.А., Салтыкова Л.Б., Плужникова Г.Ф., Руденко В.И., Афанасьев Б.В., Хансон К.П. Определение хромосомной транслокации t (9; 22) методом ОТ-ПЦР // Сборник: 4-ая международная конференция "Спид, рак и родственные проблемы."21-25 мая 1996,- С. 86.- № S418.

4. Сидорова Ж.Ю., Салтыкова Л.Б., Лыщев А.А., Блинов М.Н Мофицированный метод выявления хромосомной транслокации t (9; 22) h Сборник: 111 Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов 26-28 ноябре 1996,- С 10.

5. Методические рекомендации № 96/220 "Быстрый метод детекции BCR ABL химерного гена для диагностики хромосомной транслокации t(9,22) Утверждены Министерством здравоохранения и медицинской промышленности Российской федерации 11.11.96 г.

6. Maiinets O.V., Sidorova J.Yu., Sitskaya K.O., Morosova E.V. Ogorodnikova Y.S., Zubarovskaya I.S., Afanassiev B.V. Analysis of Bone Marrow Chimerism By Cytogenetic and PCR Methods in Post-BMT patients // Bone Marrov Transplantation.-1997,- v.19.- suppl.l.- Р.51,- P203.

7. Sidorova J.Yu., Saltykova L.B., Lyschov A.A., Zaritskey A.Yu. Abdulkadyrov K.M., Blinov M.N. Rapid RT-PCR-based method of BCR-ABI translocation detection // J Clin Mol Pathology : Mol Pathol.-1997.-v.50.-P. 266-268.