Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами

На правах рукописи

Жаринов Владислав Сергеевич

Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами

14.00.29 Гематология и переливание крови 14.00.09 Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Детской гематологии Минздрава Российской Федерации (директор ГУ НИИ Детской гематологии - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г Румянцев).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.И. Карачунский Научный консультант:

Кандидат биологических наук Т. В. Наседкина

Официальные оппоненты:

Доктор медицинский наук Н.В.Мякова

Доктор медицинских наук, профессор Е.В. Неудахин

Ведущее учреждение:

НИИ педиатрии Научного центра здоровья детей РАМН

Защита диссертации состоится "_"_200 г. в_час. на заседании

.Диссертационного совета Д 208.050.01 в ГУ НИИ Детской гематологии Минздрава Российской Федерации (117997, Москва, Ленинский проспект,! 17)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ Детской гематологии Автореферат разослан 'О' {О 200/г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В.М. Чернов

/// Hi

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лейкозы - злокачественные заболевания кроветворной ткани. Ежегодно, в России регистрируется 1200 новых случаев лейкозов у детей. Еще несколько десятилетий назад, эта группа онкологических заболеваний считалась однородной, а успехи в лечении были не высокими. Однако, благодаря совершенствованию методов выявления лейкозов, росту возможностей лабораторной диагностики, проведению мультицентровых контролируемых исследований ситуация кардинально изменилась в лучшую сторону (Карачунский А.И., 1999, Самочатова Е.В., 1999). На основании данных морфологии, цитохимии, иммунофенотипирования удалось выявить варианты лейкозов и разделить ранее однородную патологию на конкретные нозологические формы и группы риска, требующие дифференцированной терапии. Это увеличило число пациентов, вышедших в стойкую ремиссию или излечившихся. Основным событием в исследовании лейкемии у человека последнего времени являются открытия конкретных генетических перестроек, либо приводящих непосредственно к появлению опухолевого клона, либо имеющих огромное прогностическое значение.

История прихода генетики в диагностику и лечение лейкозов ведёт начало с описания в 1960 году Nowell и Hungerford укороченной 22-ой хромосомы у больного с хроническим миелолейкозом. Такая картина повторялась от больного к больному, то есть она была «неслучайной» (Nowell, Hungerford, 1960). Эта хромосома была названа Филадельфийской и затем было показано, что она образуется в результате транслокации (de Klein A, 1982). Значение этого эпизода было колоссально, поскольку диагностика лейкозов была выведена на молекулярный уровень. В последние годы этот путь привел к созданию препаратов, которые выборочно блокируют действие онкобелков. Одним из первых был препарат Гливек, который открыл новую страницу в терапии хронического миелолейкоза. С тех пор было идентифицировано множество неслучайных хромосомных поломок напрямую участвующих в формировании онкологического заболевания, либо влияющих на его течение и прогноз, а в части случаев лишь помогающих следить за прогрессией заболевания или за остаточным пулом клеток опухоли (Rowley JD, Aster JC, 1993). Однако, ещё большее число обнаруженных транслокаций до

сих пор носит характер случайных и требует дальнейшего изучения их роли в формировании или развитии опухоли.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют разделить всех пациентов с различными формами лейкозов на крупные подгруппы по наличию неслучайных транслокаций, или же их достоверному отсутствию. Для большей части этих аберраций выявлено клиническое значение в определении прогноза заболевания, и они являются важнейшими факторами риска в современных клинических исследованиях.

Стандартным методом диагностики значимых химерных генов, которые образуются при слиянии участков последовательностей протоонкогенов, при транслокации, на сегодня является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, которая обладает высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью для применения в клинических лабораториях (Cross N.C.P., 1994). Цитогенетическое исследование, остававшееся долгое время основным, и позволившее сделать множество открытий в определении генетической природы злокачественных новообразований крови у детей, не отвечает требованиям клиницистов. Обладая низкой чувствительностью, зависимостью возможности получить результат от множества факторов, влияющих на рост культуры клеток, субъективностью - оно уступает место новейшим разработкам в области анализа генома (Ma S.K. 1999, Prema E. Devaraj, 1995). Необходимо отметить, что рано списывать стандартную цитогенентику из арсенала методов, применяемых в лабораторной и исследовательской практике, так как она даёт возможность представить комплексное изменение кариотипа в бластной клетке, однако, расширение возможностей новых методик, приводит всё более ограниченному использованию цитогенетического анализа в рутинной практике.

Сейчас возможно определение большого числа неслучайных хромосомных транслокаций, а точнее ещё более значимых их продуктов -химерных генов. Наиболее интересны с клинической точки зрения гибридные гены BCR/ABL, TEL/AML1, PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, MLL/AF4 и Е2А/РВХ. Тем не менее, тенденция к централизации онкогематологической помощи, создание кооперативных групп, ведущих совместные проекты, вводит новые требования к лабораторной службе. Данные о генетической природе бластных клеток, должны быть получены оперативно и быть абсолютно достоверными. Интеграция клиник для оптимизации помощи детям, страдающим лейкозами, увеличивает нагрузку на молекулярно-биологические

подразделения лабораторных комплексов. Высокотехнологичные схемы лечения повышают ответственность, ложащуюся на крупные гематологические центры.

Требуется внедрение новых методов молекулярного анализа. Кроме того, они должны расширять данные, получаемые клиническим врачом о пациенте, о природе и свойствах опухолевых клеток, вызвавших онкологическое заболевание. И такие методы молекулярного анализа в последнее десятилетие появились.

Это, использующие нанотехнологии, - биологические микрочипы, которые находят всё более широкое применение в анализе экспрессии генов, определении точечных мутаций, выявлении онкобелков. Однако, в нашей стране, несмотря на международный приоритет отечественной науки в создании таких методов, анализ с их использованием практически не распространён. Возможности проведения молекулярно-генетического исследования всем пациентам детского возраста с острым лейкозом в России ограничены низкой оснащённостью лабораторий, высокой стоимостью расходных материалов. В то же время, тестирование доступных разработанных отечественных и высокоэффективных систем с использованием технологии микрочипов до последнего времени не проводилось.

Цель исследования: улучшить качество диагностики и точность стратификации больных на группы риска при лейкозах у детей, путём определения хромосомных аберраций с использованием метода гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами.

Задачи исследования

1. Провести испытания методики, основанной на мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом для анализа хромосомных аберраций в бластных клетках при лейкозах у детей на клеточных культурах и клинических образцах.

2. Применить в клинической диагностике указанный метод, определить диагностическую и прогностическую информативность разработанной методики и ее эффективность, сравнить с другими методами: ОТ-ПЦР, секвенированием.

3. Испытать метод мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе в анализе образцов пациентов с лейкозами для определения минимальной остаточной болезни.

4. Определить частоту встречаемости наиболее важных хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и вариантов мест перестроек методом мультиплексной ПЦР с гибридизацией на микрочипе и их корреляцию с клиническими характеристиками пациентов.

5. Внедрить в клиническую практику метод мультиплексной ПЦР и гибридизации для анализа наиболее значимых хромосомных транслокаций.

Научная новизна

Впервые применен метод мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипом для комплексной диагностики лейкозов у детей. Определена с помощью метода мультиплексной ПЦР и гибридизации с биологическим микрочипом частота наиболее клинически значимых транслокаций: 12% для TEL/AML1, 3,3% - MLL/AF4, 1% - BCR/ABL при ОЛЛ, 18% - PML/RARA, 13,3% -AML1/ETO при ОНЛЛ у группы онкогематологических пациентов в российской детской популяции. Показана возможность определения точки слияния в химерных генах при использовании данного метода. Прослежена связь субвариантовb2a2 и b3a2 химерного гена BCR/ABL, и bcr1, ьст3 химерного гена PML/RARa с клиническим течением лейкоза у детей. Впервые проведён анализ клинических характеристик для пациентов с различными изоформами химерного гена BCR/ABL - b2а2 и b3а2, позволивший предположить их неравнозначное влияние на прогноз. Показана возможность отслеживания минимальной остаточной болезни или анализа не первичных образцов в условиях терапии острого и хронического лейкоза с помощью использования технологии микрочипов.

Научно-практическая значимость

Испытан новый метод диагностики основных хромосомных аберраций при лейкозах у детей. Частоты встречаемости хромосомных транслокаций соответствуют таковым для других регионов, что подтверждает целесообразность использования единых протоколов лечения в терапии лейкозов во всём мире.

Разработка и внедрение метода молекулярно-генетического исследования с использованием мультиплексной ПЦР и гибридизации с

олигонуклеотидным микрочипом позволяют точнее верифицировать опухоль, поставить диагноз, осуществлять долгосрочный прогноз, корректировать терапию в соответствии со свойствами опухоли.

В результате выполненной работы реализован ряд эффектов: медицинский - улучшение диагностики и определения прогноза; экономический - уменьшение затрат на диагностику и лечение; научный - появилась возможность скринингового анализа пациентов на наличие основных хромосомных аберраций, открылись возможности для мультицентровых исследований с целью определения значения тех или иных транслокаций и их изоформ; биологический - адаптирована методика применения олигонуклеотидных микрочипов для анализа химерных РНК путём гибридизации.

Внедрение. Результаты диссертационного исследования по использованию метода реализованы при анализе образцов пациентов в кабинете биочип-диагностики (Поликлиника №3 ЦКБ РАН), в лаборатории биологических микрочипов (ИМБ РАН). Планируется внедрение метода в лабораторную практику нескольких зарубежных лабораторий. Благодаря проведению данной работы организована диагностика ряда наиболее значимых хромосомных аберраций методом мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипами у пациентов с острым и хроническим лейкозом.

Организация исследования. Работа выполнена в ГУ НИИ Детской гематологии МЗ РФ (директор ГУ НИИ ДГ МЗ РФ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. Г. Румянцев) на базе Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, РАН (директор ИМБ РАН -академик РАН, доктор химических наук, профессор ).

Исследование проводилось в соответствии с планом НИР №005/019/001 по теме: «Разработка и внедрение в практику молекулярно-генетических методов диагностики и биологически обоснованных методов терапии и профилактики заболеваний крови у детей и подростков»

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции Теномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 20-21 июня, 2002 г.); на III симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 6-7 февраля, 2003 г.); на III

съезде онкологов и радиологов СНГ (Республика Беларусь, Минск, 25-28 мая 2004 г)

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников ГУ НИИ Детской гематологии и Российской Детской Клинической Больницы 23 сентября 2004 года По результатам диссертации опубликовано 14 работ

Структура и объем диссертации.

Материал диссертации изложен на ^ЛТстраницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания пациентов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, приложения, библиографического указателя, включающего 17 работ отечественных и 130 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 15 таблицами, 10 рисунками и 2 клиническими примерами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Пациенты и методы исследования

Период исследования детей с острыми и хроническими лейкозами составил 4 года с 1 января 2000 года по 1 января 2004 года При этом проводился ретроспективный анализ пациентов, поступавших с 1 января 2000 года по 1 января 2002 года, а по 1 января 2004 года проводился проспективный учет и контроль Исследовательские базы

Разработка и тестирование методики мультиплексной ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом, а так же создание микрочипа проведено в центре биологических микрочипов ИМБ РАН им В А Энгельгардта (руководитель центра - академик РАН, доктор химических наук, профессор АД Мирзабеков) Определение хромосомных аберраций с помощью молекулярно-генетических методов проводилось там же Биологический материал (костный мозг, периферическая кровь) предоставили клиники

• отделение онкогематологии Российской детской клинической больницы (РДКБ МЗ РФ, Москва) - зав отделением Д В Литвинов

• отделение общей гематологии Российской детской клинической больницы (РДКБ МЗ РФ, Москва) - зав. отделением к.м.н ГА Новичкова/М.А. Масчан

• отделение онкогематологии №2 Российской детской клинической больницы (РДКБ МЗ РФ, Москва) - зав. отделением к.м.н Н.Р. Тюкалова

• отделение гематологии Морозовской детской городской клинической больницы (МДГКБ, Москва) - зав. отделением д.м.н. А. М. Тимаков/к.м.н. К.Л. Кондратчик

• отделение детской онкогематологии Московского областного онкологического диспансера (МООД, г. Балашиха) - зав. отделением к.м.н. СР. Варфоломеева

• отделение гематологии Областной детской клинической больницы (ОДКБ, г. Нижний Новгород) - зав. отделением А.В. Шамардина

• отделение гематологии Городской детской клинической больницы №4 (ГДКБ №4, г. Новокузнецк) - зав. отделением к.м.н. СА Дудкин

Также использовалась информация из исследовательских баз данных, любезно предоставленных к.м.н. Е.Р. Рогачевой, Д.Б. Лаврухиным, М.В. Сухачевой, д.м.н. профессором А.И. Карачунским (ГУ НИИ ДГ), к.м.н. ОА Тигановой (МДГКБ), к.м.н. М.М. Шнейдер (ГУ НИИ ДГ). Критерии включения пациентов в исследование:

> Возраст 0-20 лет

> Первично диагностированный острый лимфобластный лейкоз без предшествующей химиотерапии или с лечением только глюкокортикоидами продолжительностью до 10 дней. Это условие было необходимо для того что бы исключить тех пациентов, у кого наличие транслокации не могло быть достоверно определено.

> Первично диагностированный острый нелимфобластный лейкоз, при условии проведения химиотерапии менее трёх дней и сохранении бластных клеток в периферической крови.

> Первично диагностированный хронический миелоидный лейкоз.

> Диагноз лейкоза (ОЛЛ, ОНЛЛ, ХМЛ) подтвержден данными морфоцитохимических и иммунологических анализов опухолевых клеток.

> Рецидив ОЛЛ, ОНЛЛ, вторичный лейкоз - только в анализе частоты

встречаемости транслокаций Пациенты

Всего было обследовано 548 человек Из них 300 пациентов с ОЛЛ, 128 с ОНЛЛ и 40 с ХМЛ Кроме того 75 пациентов с рецидивами ОЛЛ и ОНЛЛ и 5 с вторичными лейкозами Для 55 пациентов проводился мониторинг минимальной остаточной болезни (225 образцов) При этом, 247 образцов из общего числа пациентов использовались на этапе разработки методики Таким образом, всего исследовано 723 образца костного мозга и/или периферической крови

Был создан банк замороженных клеток и РНК, включающий более 1000 образцов

Клеточные линии К-562, MV-4-11, NB4 и REH были источником химерной РНК с продуктом BCR/ABL (t(9,22)(q34,q11)), MLUAF4 (t(4,11)(q21,q23)), PML/RARa (t(15,17)(q21,22)), и TEL/AML1 (t(12,21)(p13,q22)), соответственно

У родителей пациентов или у совершеннолетних пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования с использованием генетического материала

Методы выявления хромосомных аберраций В качестве метода анализа мы использовали мультиплексную ПЦР с обратной транскрипцией и последующую гибридизацию с олигонуклеотидным микрочипом Клинический образец (костный мозг или периферическую кровь), предварительно смешанный с антикоагулянтом (ЭДТА-КЗ) подвергали гемолизу для выделения лейкоцитарной фракции Затем из 5-10х106клеток выделяли тотальную РНК

Выделение РНК из лейкоцитарной фракции проводили стандартным методом экстракции кислым фенолом, либо с помощью специального набора реактивов и колонок (RNAqueous kit, Ambion Inc, США или RNeasy mini kit, Qiagen, США) Очистку от возможных примесей геномной ДНК производили с помощью ферментативной обработки ДНКазой-I (Promega, США) с последующим переосаждением кислым фенолом Комплементарную ДНК получали в реакции обратной транскрипции с использованием специфических праймеров и фермента - M-MLV (Силекс, Россия)

Проводилась мультиплексная гнёздная ПЦР с использованием 4-х смесей праймеров В ходе второй стадии ПЦР получали амплифицированные продукты с флуоресцентной меткой на конце Для этого использовались меченные Су5

прямые праймеры второго раунда. Спектр анализируем ых химерных генов был следующий: МШАР4, ТЕ1_/АМ1_1, ВОЯ/АВЦ Е2А/РВХ, РМЦ/ЯАЯа, АМН/ЕГО, ОВРВ/МУИ11 и АВЬ-контроль. Для детекции наличия продуктов амплификации применяли электрофорез в 2% агарозном геле (МавеСкта Т.У., 2003) При использовании стандартной ПЦР в сравнительном анализе проводилось иследование на более широкий спектр транслокаций, в частности на аномалии региона 11 д23 (РаШвдаагС, 2000).

Продукты мультиплексной ПЦР смешивались и подвергались гибридизации с микрочипом. Биочип представляет собой миниатюрные ячейки объёмного геля на стеклянной подложке с иммобилизованными в них олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды комплементарны определённым участкам химерных генов: как общим районам, так и местам слияния генов-партнёров. С помощью такого микрочипа возможен анализ на 8 основных при лейкозах неслучайных транслокаций: 1(4;11), ф2;21), ОД22) р190 и р210, ф;19), ^15;17), ОД21), ¡пу(16) (схем.1).

Контр. | пустой CBFB/MYH11 3-е место Е2А/РВХ MLL/AF4 Экзон 5 BCR/ABL Ь3а2 р210 пустой | Контр.

PML/RARA ВсгЗ TEL/AML1 2-ое место

CBFB/MYH11 2-ое место Е2А/РВХ Общий MLL/AF4 Общий Экзон 11 BCR/ABL Ь2а2 р210

PML/RARA Всг1 TEL/AML1 1-ое место

CBFB/MYH11 1-ое место AML1/ETO MLL/AF4 Общий Экзон 10 BCR/ABL е1а2 p190

PML/RARA Общий* TEL/AML1 Общий

CBFB/MYH11 Общий AML1/ETO Общий MLL/AF4 Общий Экзон 9 BCR/ABL Общий

ABL | ABL ABL ABL

Примечание: * - вариант bcr2- диагностируется при наличии свечения

общего олигонуклеотида и отсутствии сигналов в группах Ьсг1 и ЬсгЗ.

Схема 1. Схема расположения олигонуклеотидов на микрочипе.

Чип изготавливался путём нанесения капель геля с олигонуклеотидами с помощью робота А11уте1пх ОМБ417 Аггауег (ААутеШх, США), всего 96 точек. Далее проводилась фотополимеризация. Гибридизация осуществлялась в присутствие буферного раствора БЭРЕ в течение 14-18 часов при 37°С.

Анализ изображения проводился на портативном анализаторе микрочипов (Чипдетектор, Биочип-ИМБ, Россия). Применялась специальная компьютерная

программа ImageWare (Биочип-ИМБ, Россия) для обсчёта и представления сигналов, получаемых с микрочипа (рис.1).

Рисунок 1. Интерфейс программы для анализа изображения с микрочипа. Ячейки сгруппированы в столбцы, обозначенные различными оттенками.

Секвенирование позитивных образцов и подтверждение мест слияния осуществлялось на автоматическом секвенаторе ABI-373A (Applied Biosystems, США).

Определение событий: Регистрация ремиссии при ОЛЛ и ОНЛЛ проводилась при наличии в костно-мозговом пунктате менее 5% бластных клеток при полиморфной цитологической картине костного мозга, нормальном анализе крови и отсутствии экстрамедулярных проявлений лейкоза. Диагноз рецидива для пациентов с ОЛЛ устанавливали при наличии более 25% бластных клеток в костном мозге или выявлении лейкемического поражения любого другого органа-мишени в соответствии с принятыми стандартами диагностики. Диагноз рецидива для пациентов с ОНЛЛ устанавливали при наличии более 10% бластных клеток в костном мозге или любое экстрамедуллярное поражение - не менее чем через 1 месяц после установления первой клинико-гематологической ремиссии. Вопрос о вторичности опухоли в группе вторичных лейкозов или наличии второй опухоли не уточнялся. Более детальный анализ этой группы не проводился. Молекулярной ремиссией считалось исчезновение химерного транскрипта при исследовании на МОБ и при чувствительности метода 10-4. Эпизодом нарастания уровня транскрипта в ходе мониторинга минимальной остаточной болезни считалось появление значимого титра в 10-3 после зарегистрированной молекулярной ремиссии. При отсутствии информации о пациенте с ОЛЛ или ОНЛЛ в течение 6 месяцев, он считался выбывшим из-под наблюдения (LFU -lost to follow up).

Анализ результатов

В качестве клинических характеристик при анализе их корреляции с изоформой химерного гена принимались: смерть в индукции, смерть в ремиссии, рецидив, а для ХМЛ - клиническая фаза бластного криза. Медиана наблюдения оценивалась с момента поступления первого образца на анализ до регистрации события или даты окончания исследования.

При сравнении групп пациентов по качественным признакам (при непараметрическом сравнении данных) использовался критерий Фишера. Оценивался уровень достоверности р, различия считались достоверными при р<0,05. Анализ результатов проводился с помощью программы Statistics 6.0 для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнение со стандартной методикой ПЦР

Анализ и характеристики

Проведено сравнение полученных результатов мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации и данных полученных стандартной ПЦР с индивидуальными праймерами. Результаты сравнительного анализа у больных с разными вариантами лейкозов (ОЛЛ, ОНЛЛ, ХМЛ) представлены в табл. 1.

Таблица 1. Спектр транслокаций, обнаруженных при использовании двух методов в параллельном анализе определённых групп по морфологии бластньх клеток.

Транслокации и химерные ОНЛЛ ОЛЛ ХМЛ

гены

ПЦР Гибридиз. ПЦР Гибридиз. ПЦР Гибридиз.

(1) t(8;21) ДЛЙЛАЕГО 7 7

(2) t(15;17) PML/RARA 10 10

(3) inv(16) CBFB/MYH11 6 6

(4) t(1; 19) Е2А/РВХ1 2 2

(5) t(4; 11) MLL/AF4 6 6

(6) t(9;22) BCR/ABL p19Q 3 3

(7) t(9;22) BCR/ABL p210 12 12

(8) t(12;21) TEUAML1A 20 20

Me обнаружено 53 53 125 125 3 3

транслокаций

Всего пациентов 76 156 15

Итак, из протестированных 247 образцов пациентов одновременно обоими методами показано полное совпадение полученных результатов.

При ОЛЛ у 31 из 156 человек транслокации обнаружены, при ОНЛЛ у 24 из 76, и при ХМЛ у 13 из 15 больных.

Кроме того, в ходе сотрудничества с отделением патологии Чикагского Университета был проведён слепой анализ одиннадцати образцов, присланных Др. П. Домером. Информация о диагнозе доноров отсутствовала. Позже, полученные результаты были сопоставлены с таковыми, имеющимися в лаборатории г. Чикаго. Нам была предоставлена информация о диагнозе пациентов. Полученные данные отображены в табл. 2. Расхождение в случае №8 было проанализировано. Данные, полученные протоколом стандартной ПЦР, были корректны в первичном образце, однако на исследование с помощью микрочипов был доставлен образец того же пациента, но в более поздний период. Исчезновение одного из вариантов транскрипта может быть связано с прогрессией заболевания.

Таблица 2. Сравнительный анализ результатов, получаемых комплексным исследованием в отделении патологии (Чикагский Университет, г. Чикаго, США) и методом мультиплексной ПЦР и гибридизации (ИМБ, г. Москва, Россия)

Пациент диатоз Мультиплексная ПЦР, Гибридизация (ИМБ, Москва, Россия) Стандартная ПЦР (Отделение патологии, Чикагский Университет, США)

1 ХМЛ ВСТАВЬ Ь3а2 ВСТАВЬ Ь3а2

2 ХМЛ ВСН/АВ1.ЬЗа2 ВСТАВЬ Ь3а2

3 ХМЛ ВС№АВ1. Ь3а2 ВСТАВЬ Ь3а2

4 ХМЛ ВСР/АВ1. Ь3а2 ВСТАВЬ Ь3а2

5 ХМЛ ВС1*/АВ1. Ь3а2 ВСИАВ!. Ь3а2

6 ХМЛ ВСР/АВ1. Ь2а2 ВСР/АВЬ Ь2а2

7 ХМЛ ВС№АВ1. Ь2а2 ВСЯ/АВЬ Ь2а2

8 ХМЛ ВСЯ/АВ!. е1а2 ВС№АВ1. Ь2а2 и е1а2

9 ОНЛЛ РМ1Л?АРА Ьсг1 РМиРАЯА Ьсг1

10 Здоровый донор Не обнаружено Не обнаружено

11 Здоровый донор Не обнаружено Не обнаружено

Чувствительность метода составила 10 , что было проверено в ряде экспериментов по анализу разведённых по методу стандартных разведений образцов и анализу пациентов в ходе мониторинга МОБ. Гибридизационная картина при некотором снижении общих уровней сигналов не меняется.

Таким образом, показана высокая точность предложенной методики. Было показано, что во всех случаях происходило определение транслокации и результаты совпадали.

Рабочее время, требующееся на диагностику с помощью обоих методов было сопоставимо. Оба метода требуют одинаковых подготовительных этапов (выделение РНК, обратная транскрипция). Длительность анализа с помощью микрочипа с момента забора материала до получения результата составила 2448 часов, большую часть времени при этом занимает процесс гибридизации, проходящий без участия исследователя.

Чувствительность: Вероятность определения транслокации при её наличии составляет 98-99%.

Специфичность: Вероятность не обнаружить транслокацию при её отсутствии составляет 99-100%.

Экономическая целесообразность. Проведён расчёт стоимости анализа от момента забора крови или костного мозга от пациента с учётом лишь стоимости реактивов и расходных материалов для методики стандартной ПЦР и для метода мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах. Себестоимость анализа с помощью стандартной ПЦР на одну транслокацию составляет 40$, четырех основных транслокаций для ОЛЛ или ОНЛЛ 70$, а восьми транслокаций 100$. Применение мультиплексной ПЦР и гибридизации на микрочипе обходится при анализе на восемь транслокаций в 60$. Необходимо отметить, что оборудование, требующееся для анализа с использованием этих методов одинаковое и есть в наличии в любой молекулярно-биологической лаборатории. Для анализа с помощью гибридизации требуется приобретение лишь одного дополнительного прибора -портативного анализатора биочипов (ридера) с соответствующим программным обеспечением для персонального компьютера.

Секвенированив. Все образцы в которых было определено наличие химерного гена с помощью мультиплексной ПЦР и гибридизации были подвергнуты секвенированию. Показано полное совпадение результатов по этим двум методам.

Параллельный анализ образцов

Анализ проходил на известных образцах, с ранее обнаруженными транслокациями методом стандартной ПЦР, слепых первичных образцах,

образцах клеточных линий, отрицательных образцах. Из 298 детей с лейкозами, вошедших в исследование, у 105 (35%) с помощью метода мультиплексной ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе выявлены различные хромосомные транслокации против 116 (39%) с обнаруживаемыми с помощью стандартной ПЦР, а у 193 (65%) транслокации не обнаружены. Распределение пациентов с наличием или отсутствием транслокаций в зависимости от диагноза представлено в таблице 3.

Таблица 3. Распределение пациентов с наличием или отсутствием транслокаций в зависимости от диагноза.

Диагноз ВСЕГО В том числе:

Без транслокаций С транслокациями

ПЦР Гибридизация ПЦР гибридизация

ОЛЛ 165 126(76%) 132 (80%) 39(24%) 33 (20%)

онлл 102 56(54%) 61 (59,8%) 46(46%) 41 (40,2%)

хмл 31 0 0 31(100%) 31 (100%)

Итого 298 182(61%) 193(65%) 116(39%) 105(35%)

Для пациентов с ОЛЛ получены следующие результаты молекулярно-генетического исследования. У 23 детей (14%) методом стандартной ПЦР была обнаружена ^12;21) TEL/AML1, у 3 (5%) больных ^(9;22) BCR/ABL p190, ^4;11) MLL/AF4 у 5 (3%), у 2 (1%) ф;19) E2A/PBX1. У 132 детей транслокаций обнаружено не было. Методом мультиплексной ПЦР получены отличающиеся данные за счёт отсутствия возможности тестирования с помощью данного микрочипа образцов на наличие аномалий региона 1^23 (табл. 4).

Таблица 4. Распределение больных с ОЛЛ в зависимости от наличия неслучайных хромосомных транслокаций

Неслучайные хромосомные транслокации при остром лимфобластном лейкозе Количество пациентов

Стандартная ПЦР МультПЦР+чип

Абс. % Абс. %

1(12;21) ТЕ1_/АМ1_1 23 14 23 14

1(9;22)ВСК/АВЬ 3 2 3 2

((4;11)МИ7АР4 5 3 5 3

1(1;19)Е2А/РВХ 2 1 2 1

Транслокаций не обнаружено 126 76 132 80

Всего пациентов с ОЛЛ 165 100 185 100

На рис. 2 отображены полученные результаты по частоте обнаружения транслокаций у детей с ОЛЛ.

Рисунок 2. Частота обнаружения значимых транслокаций при ОЛЛ методом мультиплексной ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом.

Клинические характеристики пациентов с ОЛЛ представлены в табл. 5.

Таблица 5. Инициальные клинические данные пациентов с ОЛЛ и транслокациями, а также пациентов с ОЛЛ у которых транслокаций обнаружено

не было.

Инициальные клинические характеристики пациентов Хромосомные транслокации

Транспокации обнаружены Не обнаружено

абс % абс %

ПОЛ

Мальчики 15 45,5 68 54

Девочки 18 54,5 64 46

Р 1,0

ВОЗРАСТ

<1 года 2 6 12 7

1-10лет 26 79 71 54

>10 лет 5 15 49 39

ИММУНОФЕНОТИП

Не-Т-клеточный 33 100 106 60

Т-клеточный Не определен Определялся 0 0 21 16

0 0 5 4

33 100 127 96

Р 1,0

Инициальный лейкоцитоз <50000/мкл 22 67 90 71

Инициальный лейкоцитоз >=50000/ыкл 11 33 42 29

Р 0,0061

Всего пациентов 33 100 132 100

Таким образом, группы гомогенны по полу и иммунофенотипу, достоверных различий не выявлено.

В исследование вошли 102 пациента с острым нелимфобластным лейкозом. Хромосомные аберрации методом стандартной ПЦР и мультиплексной ОТ-ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе были обнаружены у 41 пациента, что составляет 40,5%. У 61 (59,5%) детей транслокации обнаружены не были.

Среди пациентов с ОНЛЛ, из них у 13% детей была обнаружена транслокация ОД21) AML1/ETO и у 6% то (16) CBFB/MYH11, у 20,5% -транслокация ф5;17) PML/RARA. Данные идентичны при использовании обоих методов (табл. 6).

Таблица 6. Количество больных с ОНЛЛ в анализируемых группах в зависимости от наличия неслучайных хромосомных транслокаций

Неслучайные хромосомные транслокации при ОНЛЛ Количество пациентов

Стандартная ПЦР МультПЦР+чип

Абс. % Абс. %

К15;17) РМи(*А(*А 21 20,5 21 20,5

Ц8;21)АМ1-1/ЕТО 13 13 13 13

{¡пу16)СВРВ/МУН11 6 6 6 6

Транслокаций не обнаружено 56 55 62 60,5

Всего пациентов с ОНЛЛ 102 94,5 102 100

Графически полученные при ОНЛЛ результаты отображены на рис. 3.

рт1/гага 21%

атИ/еЬ? 13%

т\\т ] \сЫЬ/туЬ11 1% 6%

Рисунок 3. Частота обнаружения значимых транслокаций при ОНЛЛ методом мультиплексной ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом.

Клинические данные пациентов с ОНЛЛ приведены в табл. 7. Достоверных различий по полу и возрасту не выявлено.

Таблица 7. Инициальные данные пациентов с ОНЛЛ и наличием транслокаций и пациентов с ОНЛЛ, у которых транслокаций обнаружено не было.

Хромосомные транслокации

Инициальные клинические характеристики пациентов Обнаружены Не обнаружено

абс % абс %

пол

Мальчики 20 49 28 46

Девочки 21 51 33 34

Р 1,0

Возраст <1 года 1-10лет

1 2,5 1 2

>10 лет 29 70,5 42 69

11 27 18 29

Р 0,9356

Всего пациентов 41 100 61 100

В группу пациентов с хроническим миелоидным лейкозом вошел 31 пациент. У всех пациентов методом мультиплексной ОТ-ПЦР и гибридизацией с микрочипом была обнаружена 1(9;22) ВОЯ/ЛВ1_ р210. Распределение по полу было следующим: 12 девочек (39%) и 19 мальчиков (61%). Большинство детей -26 человек находились в возрасте старше 10 лет (84%). Меньшая часть (16%) находились в возрастной группе от 1 года до 10 лет.

Частоты прискрининговоманализе

Скрининговый анализ проводился с использованием лишь мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации на микрочипе. При оценке частоты встречаемости исследуемых транслокаций получены следующие данные: всего за период исследования поступили образцы от 300 пациентов с первичным ОЛЛ, 128 первичных пациентов с ОНЛЛ, 40 с ХМЛ. Кроме того, 64 с рецидивом ОЛЛ, 11 - рецидивом ОНЛЛ и 5 с вторичными лейкозами.

Острыйлимфобластныйлейкоз.

Были обнаружены, с использованием технологии мультиплексной ОТ-ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе, все представленные на микрочипе транслокации.

Среди 300 пациентов с первичным ОЛЛ у 35 обнаружена 1(12;21)ТЕ1_/ЛМ1_1 (12%), у 10 1(4;11)М1±/ЛР4 (3,3%), и у 3-х пациентов (1%) определялся химерный ген ВОЯ/ЛВ1_ е1а2 (р190) и соответственно ОД22), один

пациент с Е2А/РВХ (0,3%). Не обнаружено исследуемых транслокаций у 83,4% пациентов. То есть, имели ту или иную транслокацию 16,6% (табл. 8).

Таблица 8. Соотношение обнаруженных транслокаций среди пациентов с ОЛЛ.

Не обнаружено ТЕМАМИ МШАР4 ВСЯ/АВ1 е1а2 Е2А/РВХ

252 (83,4%) 35 (12%) 10(3,3%) 3(1%) 1 (0,3%)

Всего с транслокациями 48 (16,6%)

Всего 300 (100%)

Графически приведённые данные отображены на рис. 4.

84%

Рисунок 4. Частоты основных транслокаций при ОЛЛ. Гибридизация на микрочипах.

Структура транслокаций среди рецидивов ОЛЛ несколько отличалась за счёт более высокого процента транслокации 1(9;22). Два пациента из 64-х имели химерный ген ВОЯ/ЛВЬ (что составило 3%), однако отличия не достоверны (р=0,2337). Транслокация 1(12;21)ТЕЦ/ЛМ1_1 была обнаружена у 12,5% (8 человек из 64-х) (табл. 8). То есть, не отмечено достоверного повышения или понижения риска появления рецидива при наличии этой транслокации (р=0,5034). Один пациент с ранее обнаруженной 1(1;19) в рецидиве имел 1(12;21) - он исключён из анализа пациентов с рецидивом.

Таблица 8. Соотношение обнаруженных транслокаций среди пациентов с рецидивами ОЛЛ.

Не обнаружено ТЕиАМИ ВСЯ/АВ1_е1а2

54 (84,5%) 8 (12,5%) 2 (3%)

Всего странсгокациями 10 (15,5%)

Всего 64 (100%)

В целом, числовые значения частот встречаемости при увеличении группы обследованных пациентов несколько уменьшились по сравнению с данными, полученными в ходе параллельного анализа. Это связано с приближением результатов к статистически достоверным данным.

Пример транслокации 1(4; 11 )М1_Ц/АР4 приведён на рис. 5.

Рисунок 5. У пациента с ОЛЛ обнаружена транслокация t(4;11)MLL/AF4. Изображение, полученное на портативном анализаторе микрочипов. Программное обеспечение Imageware (Биочип-ИМБ).

Острый нелимфобластныйлейкоз.

Исследование проводилось среди 128 пациентов с первичным ОНЛЛ. У 13,3% была обнаружена Ч8;21)АМи/ЕТО (17 человек), у 5,5% хромосомная аберрация ¡пу(16)СВРВ/МУН11 (7 пациентов). Для первого случая характерным морфологическим вариантом бластных клеток был в соответствии с РАВ-классификацией - М2-ОНЛЛ, для второго М4 Ео. Самая большая группа, состоящая из 23-х человек, что составило 18%, была сформирована пациентами с острым промиелоцитарным вариантом ОНЛЛ (ОНЛЛ МЗ) и все они имели экспрессию РМЦ/ЯАЯА химерного гена и, соответственно 1(15; 17) (табл. 9).

Таблица 9. Соотношение обнаруженных транслокаций среди пациентов с ОНЛЛ.

Не обнаружено АМИ/ЕТО СВРВ/МУН11 РМиЯАКА

81 (63,2%) 17 (13,3%) 7 (5,5%) 23(18%)

Всего с транслокациями 47 (36,8%)

Всего 128 (100%)

Графически приведённые данные отображены на рис. 6.

63,2%

1(15; 17)

Рисунок 6. Частоты основных транслокаций при ОНЛЛ. Гибридизация на биологических микрочипах.

Рецидивы ОНЛЛ были зафиксированы у 11 пациентов. Пациенты, ранее вошедшие в анализ как первичные не включались в данную группу после регистрации у них рецидива. У трёх человек (27,3%) обнаружена 1(8;21)АМ1_1/ЕТО, что в два раза выше, чем в группе первичных нелимфобластных лейкозов (р=0,2491), у 18,2% (двух человек) -¡пу(16)ОВРВ/МУН11, что несколько выше, чем у первичных, пациентов (р=0,1803), и один человек (9%) имел 1(15;17)РМ1_/РАРА (табл. 10). '

Таблица 10. Соотношение обнаруженных транслокаций среди пациентов с рецидивами ОНЛЛ.

Не обнаружено АМИ/ЕТО СВРВ/МУН11 РМиРАРА

5 (45,5%) 3 (27,3%) 2 (18,2%) 1 (9%)

Всего с транслокациями 6 (55,5%)

Всего 11 (100%)

Таким образом, отмечается несколько повышенный уровень рецидивов, среди пациентов с обнаруженной 1(8;21)АМ1_1/ЕТО (3 пациента с рецидивами к

20 несущим аберрацию) -15%, по сравнению с группой пациентов, не имеющих транслокаций (5 из 139). Различия не достоверны (р=0,0807). То же наблюдается и для пациентов, имеющих inv(16)CBFB/MYH11 - 2 из 9 - 22% (р=0,0904).

Хронический миелоидныйлейкоз.

Среди 40 человек с точно установленным диагнозом ХМЛ у всех была обнаружена t(9;22)BCR/ABL p210 (места слияния b2а2 или b3а2). В группе представлены все клинические фазы: от хронической до властного криза. Пациенты с миелодиспластическим синдромом не имели t(9;22)BCR/ABL при исследовании и не включены в данную работу.

Вторичныелейкозы.

Вторичные лейкозы были диагностированы у 5 пациентов. Один имел клинический диагноз ОЛЛ, остальные 4 - ОНЛЛ. Среди представленных пациентов у одного была обнаружена хромосомная аберрация -inv(16)CBFB/MYH11. Более детальный анализ этой группы не проводился. Вопрос о вторичности опухоли или наличии второй опухоли не уточнялся.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕСТ СЛИЯНИЯ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ

Наиболее ярки и интересны, исходя из литературных данных, места перестроек, представленные при транслокациях с образованием химерных продуктов PML/RARA - bcr1, ьст2, ьстз; BCR/ABL - е1а2 (р190), b2а2 и b3а2 (р210). Они и были взяты для более детального анализа.

Химерный ген BCR/ABL

Всего проанализировано 39 пациентов с ХМЛ или ОЛЛ и наличием экспрессии химерного гена BCR/ABL. С помощью гибридизации продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР с олигонуклеотидным микрочипом определены места слияния. При этом: 5 образцов имели е1а2 вариант (из 5 с диагностированным ОЛЛ), 10 - b2а2, и 22 - b3а2 варианты. У 2-х пациентов определить место слияния не представляется возможным из-за плохого качества кДНК. Все результаты представлены в табл. 11. Пациенты с ОЛЛ, имеющие химерный ген BCR/ABL встречались реже: 5 человек (12,8%) к 34-м с ХМЛ (87,2%). Чаще среди мест перестроек при ХМЛ определялся b3а2 - вариант (64,7%), что согласуется с литературными данными.

Таблица 11. Частота изоформ химерных генов при наличии t(9;22)BCR/ABL

ОЛЛ п=5 ХМЛ п=34

е1а2 5(100%) Ь2а2 Ь3а2 е1а2 не определен 10(29,4%) 22 (64,7%) 0 2 (5,9%)

Исходы заболевания в зависимости от изоформы химерного гена приведены в табл. 12.

Таблица 12. Клинические исходы в зависимости от формы транскрипта химерного гена BCR/ABL

вариант п умерло Р живы примечания Р

Ь2а2 Ь3а2 8 18 3 (37,5%) 3(16,7%) 0,3299 5 (62,5%) 13(83,3%) бл.кр-4 (живы) бл.кр-6(живы, из них1-РЬ-отр.) 0,3997

Одновременное разделение на клинические фазы не проводилось из-за малочисленности группы. При этом 15 пациентов находились на момент окончания данного исследования в фазе бластного криза или погибли, 5 в фазе акселерации, 8 в хронической фазе (у 2-х не определено место слияния), остальные 6 потеряны из-под наблюдения. Медиана наблюдения составила для обеих групп 12-13 месяцев.

Таким образом, более неблагоприятным представляется Ь2а2 вариант химерного гена. Умерло 3 из 8 пациентов с этой изоформой - 37,5%, против 16,7% (3 из 18) из группы с ЬЬ3а2 (р=0,3299). Но необходимо учитывать, что результаты недостоверны из-за малого числа пациентов, вошедших в анализ. Более детальный анализ клинических фаз и протоколов лечения не проводился. Основная причина смерти - прогрессия заболевания в фазе бластного криза. Отмечено, что большинство пациентов имеющих Ь2а2-вариант находились или находятся в фазе бластного криза - 75% (6 из 8). Среди пациентов с Ь3а2-изоформой процент бластных кризов был ниже - 50% (9 из 18 человек), различия так же недостоверны (р=0,3816).

Химерный ген РМЬ/РДЯЛ

Для пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (ОНЛЛ-МЗ по РАВ-классификации) наличие химерного гена РМ17Р!АР!А, является

патогномоничным признаком. Обследовано 25 человек, из них получен вариант bcr1 для 17 человек, а ьстз для 5 человек. Вариант ьст2 был обнаружен в одном случае. У 2-х человек место слияния генов при образовании химерного продукта не определено. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13. Частота отдельных изоформ химерного гена PML/RARA

иэоформа пациентов Частота (%)

Всг1 17 68

Всг 2 1 4

ВсгЗ 5 20

Не определено 2 8

всего 25 100

Таким образом, соотношение изоформ химерного гена PML/RARA близко к описываемому в литературных источниках. Нарастание уровня транскрипта зарегистрировано у трёх человек. Все они имели Всг 1 вариант химерного гена. Уровень транскрипта при регистрации повторного увеличения титра не превысил значение в 10'3. Клинические рецидивы отмечены у двух больных. В ППР среди пациентов с Всг 1 находятся 81,25%, а среди Всг 3 все пациенты (100%). Критерий Фишера при непараметрическом обсчёте данных - р=0,5369. Таким образом, достоверных отличий в уровне достижений полной продолжительной ремиссии не отмечено (табл. 14). Медиана наблюдения составила для группы с Всг 1 - 21 месяц, для группы с Всг 3 - 36 месяцев. Пациент с изоформой Всг 2 наблюдался в течение 19 месяцев.

Таблица 14. Клинические исходы в зависимости от формы химерного

гена PML/RARA.

Вариант п Смерть в индукции Поздний ответ на АТЯА Эпизод нарастания уровня транскрипта рецидив ППР % ППР

Всг 1 17 1 2 3 2 13 81,25

Всг 2 1 0 1 1 1 0 0

ВсгЗ 5 0 0 0 0 5 100

Ме опред. 2 0 0 0 0 2 100

всего 25 1 3 4 3 21 84

На рис. 7 приведены две картины гибридизации, характерные для разных изоформ химерных генов - Всг 1 и Всг 3.

Мониторингминимальной остаточной болезни и чувствительность метода,

Минимальная остаточная болезнь отслеживалась для пациентов у которых были выявлены те или иные маркерные транслокации. Метод стандартных разведений при ПЦР позволяет выявлять достаточно низкие концентрации химерного транскрипта. Клинически и прогностически важный уровень в 10'3 определяется уверенно и с помощью методики мультиплексной ПЦР с последующей гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе. Проиллюстрирована возможность применения последнего метода в диагностике химерных генов в образцах с низким содержанием бластных клеток и в не первичных образцах.

18 пациентам с PML/RARA проводился контроль минимальной остаточной болезни. Количество присланных на контроль образцов колебалось от 1 до 11. Так, всего проанализировано 87 образцов. CBFB/MYH11 отслеживался у 6 человек (23 образца). Количество образцов от 1 до 6 на

пациента. 10 человек наблюдались с AML1/ETO транскриптом (52 образца). Количество образцов от 1 до 12. Самые длительные были контроли AML1/ETO и PML/RARA - 3 года. На рис. 8 приведены значения определённых уровней транскриптов для нескольких пациентов с AML1/ETO.

Рисунок 8. Графики уровней транскрипта при мониторинге МОБ при ОНЛЛ и наличии маркерной транслокации Ц8;21).

Уровень транскрипта для пациента М. снижался, однако молекулярная ремиссия не была достигнута - пациент погиб после молекулярного и последовавшего вскоре (3 мес) клинического рецидива. Второй пациент

м.

•1 и>* I I « п и ни 1 > а я

хвощ

Г. Достиг полной молекулярной ремиссии - у пациента зафиксирован молекулярный рецидив, через б месяцев клинический, пациент получил противорецидивную терапию, ТКМ, на момент окончания исследования жив.

При ОЛЛ, минимальная болезнь отслеживалась реже. При ^4;11) у 3 человек (18 образцов). Количество анализов составило от 5 до 7 на пациента. Один пациент мониторировался по наличию экспрессии химерного гена TEL/AML1-5 раз.

Так же МОБ оценивалась у 17 человек с ХМЛ (40 образцов). Количество наблюдений составило от 1 до б-ти на одного пациента.

Всего исследованы образцы от 55 человек (225 образцов).

ВЫВОДЫ

1. Разработанный метод ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах - высокочувствительный и специфичный метод анализа ряда хромосомных аберраций. С его помощью возможно точное определение места перестройки без применения секвенирования образца.

2. Применение новой технологии является научно и экономически целесообразным. При возможности получения полной информации о наличии восьми транслокаций с их изоформами стоимость анализа в два раза меньшая, чем при использовании стандартной ОТ-ПЦР (60$ уб 100$).

3. Применение микрочипов имеет ряд преимуществ перед стандартными методиками. Основные из них: уменьшение числа необходимых манипуляций, повышенная специфичность, объективность анализа, производительность.

4. Частота обнаруживаемых с помощью мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с микрочипами значимых хромосомных аберраций при лейкозах у детей в российской популяции не отличается от данных, полученных с помощью стандартной ПЦР и данных из литературных источников.

5. Выявлено, что с помощью тест-системы на основе гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом возможны масштабные исследования больших групп пациентов на наличие основных клинически значимых хромосомных аберраций, а также мониторинг минимальной остаточной

болезни. Показана высокая производительность методики и воспроизводимость данных.

6. Обнаружено, что при ХМЛ более неблагоприятным является b2а2 вариант химерного гена BCR/ABL Выявлена тенденция к увеличению смертности в 2 раза по сравнению с вариантом b3а2.

7. При рецидивах ОЛЛ встречается с той же частотой что и при первичном ОЛЛ химерный ген TEL/AML1, с повышенной частотой химерный ген BCR/ABL (3% против 1% для первичных ОЛЛ), при рецидивах ОНЛЛ химерный ген AML1/ETO встречался в два раза чаще при первичном ОНЛЛ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для точной верификации диагноза, определения прогноза и группы риска следует в обязательном порядке проводить анализ инициальных образцов костного мозга и/или крови детей и подростков с впервые установленным диагнозом ОЛЛ или ОНЛЛ, а также ХМЛ на наиболее значимые хромосомные аберрации.

2. Следует проводить молекулярную диагностику для определения прогноза и верификации диагноза при рецидивах этих заболеваний.

3. В молекулярной диагностике лейкозов предпочтительно использование ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или мультиплексной ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией с олигонуклеотидным микрочипом.

4. Рекомендована организация широкомасштабных исследований клинического значения изоформ химерного гена BCR/ABL при ХМЛ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т. Nasedkina, P. Domer, V. Zharinov, J. Hoberg, Y. Lysov, A.Mirzabekov. "Identification of chromosomal translocations in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays." Haematologica, 2002, 87(4):363-372

2. B.C. Жаринов, Е.А. Исаева, Т.В. Наседкина, А.И. Карачунский. «Определение наиболее частых хромосомных аберраций при

лейкозах у детей методом полимеразной цепной реакции». Материалы IX Международного симпозиума «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии», Минск, апрель 2002 г., стр.40

3. Наседкина Т.В., Жаринов B.C., Исаева ЕА, Карачунский А.И., Мирзабеков А.Д. "Олигонуклеотидные микрочипы в генодиагностике лейкозов." Сборник трудов симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва, июнь 2002 г., стр. 111-113

4. Жаринов B.C., Исаева ЕА, Наседкина Т.В, Карачунский А.И., Мирзабеков А.Д. "Определение хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом ПЦР" Сборник трудов симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", Москва, июнь 2002 г., стр. 114-116

5. ЕА Исаева, B.C. Жаринов, Т.В. Наседкина, Е.В. Флейшман, А.А. Масчан, Д.Д. Байдильдина, ГА Новичкова, М.М. Шнейдер, А.М. Тимаков, И.Б. Алакаева, А.И. Карачунский, Е.В. Самочатова, А.Г. Румянцев, А.Д. Мирзабеков. «Анализ хромосомных аберраций при ОНЛЛ у детей методом полимеразной цепной реакции». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002 том 1, №2, стр. 54-59.

6. B.C. Жаринов, Т. В. Наседкина, Е.А. Исаева, А.Д. Мирзабеков, А.И. Карачунский. «Использование мультиплексной ПЦР и гибридизации на олигонуклеотидных микрочипах в генодиагностике лейкозов». Материалы III Симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» 6-7 февраля 2003 года, Москва. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002 том 1, №2, стр. 79-80.

7. ЕА Исаева, B.C. Жаринов, Т.В. Наседкина, А.И. Карачунский. «Анализ результатов терапии в зависимости от наличия различных хромосомных аберраций у детей с острым лимфобластным лейкозом». Материалы III Симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» 6-7 февраля 2003 года, Москва. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002 том 1, №2, стр. 81.

8. Т. В. Наседкина, B.C. Жаринов, ЕА Исаева, О.Н. Митяева, О.Е. Фёдорова, А.С. Глотов, АД. Мирзабеков. «Молекулярно-генетический анализ онкологических заболеваний с использованием технологии биочипов» Материалы III Симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей» 6-7 февраля 2003 года, Москва. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002 том 1, №2, стр. 83.

9. T.V. Nasedkina, V.S. Zharinov, ЕА Isaeva, O.N. Mityaeva, R.N. Yurasov, S.A. Surzhikov, A.Y. Turigin, A.Y. Rubina, A.I. Karachunskii, R.B. Gartenhaus, and A.D. Mirzabekov. "Clinical Screening of Gene Rearrangements in Childhood Leukemia by Using a Multiplex Polymerase Chain Reaction-Microarray Approach", Clinical Cancer Research, Vol. 9, 5620-5629, November 15, 2003.

10.E.A. Исаева, B.C. Жаринов, Т.В. Наседкина, Е.Р. Рогачёва, Д.Б. Лаврухин, A.M. Тимаков, Е.В. Инюшкина, А.И. Карачунский, А.Г. Румянцев. «Анализ хромосомных аберраций и их прогностическое значение при остром лимфобластном лейкозе у детей». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2003 том 2, №4, стр. 59-66.

11.T.V. Nasedkina, V.S. Zharinov, E.A. Isaeva, О.Е. Fedorova, A.S. Glotov, O.N. Mityaeva, 0. Sinicka, L. Tihomirova: Application of gel-based microarrays for genodiagnostics of cancer. European Journal of Human Genetic, V. 11, suppl.1, 2003.

12. B.C. Жаринов, Е.А. Исаева, А.И. Карачунский, Т.В. Наседкина: Олигонуклеотидные микрочипы в генодиагностике лейкозов. Материалы Третьего Съезда онкологов и радиологов СНГ, Минск 25-28 мая, 2004 года, том 2, стр. 391 -392.

13. Е.А Исаева, B.C. Жаринов, Т.В. Наседкина, А.И. Карачунский: Клиническое значение хромосомных аномалий при острых лейкозах у детей. Материалы Третьего Съезда онкологов и радиологов СНГ, Минск 25-28 мая, 2004 года, том 2, стр. 392.

14. Ермаков Б.Л., Жаринов B.C., Наседкина Т.В., Зарецкая Ю.М., Пыльгук В.И., Тимаков A.M., Корнюшин М.А., Карачунский А.И.:

Использование транслокации (4;11)(q21;q23) в качестве маркёра для определения уровня минимальной остаточной болезни в ходе трансплантации костного мозга пациенту с острым лимфобластным лейкозом. Гематология и трансфузиология №5,2004.

Список сокращений

ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК- комплементарная ДНК РНК- рибонуклеиновая кислота мРНК- матричная РНК ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОНЛЛ - острый нелимфобластный лейкоз

ХМЛ - хронический миелоидный лейкоз

ATRA - all-транс ретиноевая кислота

РДКБ - Российская детская клиническая больница

МДГКБ - Морозовская детская городская клиническая больница

ППР - полная продолжительная ремиссия

BFM - Берлин-Франкфурт-Мюнстер

МОБ - минимальная остаточная болезнь

ПЗС - камера - прибор с зарядовой связью, цифровая камера (CCD)

ЭДТА - этилдиаминтетраацетат

ОЛЛ-МБ - протокол ОЛЛ Москва-Берлин

ALL-BFM - протокол ОЛЛ группы Берлин-Франкфурт-Мюнстер

LFU - lost-to-follow-up - потерян для наблюдения

МООД - Московский областной онкологический диспансер

Работа была поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований Грант № 01-04-48831. Грант № 03-04-49355.

Отпечатано в ООО "РЕГЛАНТ" Подписано в печать 18.10.04 Усл. печ. л. 1,88. Тираж 100 экз. Заказ №337 115230 г. Москва, Электролитный проезд, ЗБ Тел. 317-70-09

P19 9 6 t

РНБ Русский фонд

2005-4 17184

Проблема молекулярной диагностики лейкозов у детей может быть решена с помощью высокотехнологичного метода, использующего высокие производительность и чувствительность полимеразной цепной реакции (ПЦР), точность и специфичность, обеспечиваемые гибридизацией с олигонуклеотидными микрочипами. Последние представляют собой объёмные гелевые ячейки на предметном стекле, которые являются «миниатюрными микропробирками», содержащими уникальные участки ДНК, комплементарные анализируемым фрагментам. Только такой подход позволяет использовать микрообъёмы пробы, обеспечивает необходимую экономичность. Кроме того, комбинация мультиплексной ПЦР и гибридизации дали возможность осуществить анализ значительного числа образцов силами небольшого коллектива в краткие сроки. Определение точных мест перестроек при образовании химерных генов стало возможным благодаря применению технологии гибридизации, выполняющей в данном случае и функцию методов секвенирования. Внедрение молекулярных методов диагностики в детскую онкогематологическую практику в нашей стране активно происходит в последние годы. Такие методы анализа возможно позволят улучшить выживаемость и качество жизни гематологических пациентов детского возраста.

Актуальность проблемы. Лейкозы - злокачественные заболевания кроветворной ткани. Ежегодно, в России регистрируется 1200 новых случаев лейкозов у детей. Еще несколько десятилетий назад, эта группа онкологических заболеваний считалась однородной, а успехи в лечении были не высокими. Однако, благодаря совершенствованию методов выявления лейкозов, росту возможностей лабораторной диагностики, проведению мультицентровых контролируемых исследований ситуация кардинально изменилась в лучшую сторону (Карачунский А.И., 1999, Самочатова Е.В., 1999). На основании данных морфологии, цитохимии, иммунофенотипирования удалось выявить варианты лейкозов и разделить ранее однородную патологию на конкретные нозологические формы и группы риска, требующие дифференцированной терапии. Это увеличило число пациентов, вышедших в стойкую ремиссию или излечившихся. Основным событием в исследовании лейкемии у человека последнего времени являются открытия конкретных генетических перестроек, либо приводящих непосредственно к появлению опухолевого клона, либо имеющих огромное прогностическое значение.

История прихода генетики в диагностику и лечение лейкозов ведёт начало с описания в 1960 году Nowell и Hungerford укороченной 22-ой хромосомы у больного с хроническим миелолейкозом. Такая картина повторялась от больного к больному, то есть она была «неслучайной» (Nowell, Hungerford, 1960). Эта хромосома была названа Филадельфийской и затем было показано, что она образуется в результате транслокации (de Klein А, 1982). Значение этого эпизода было колоссально, поскольку диагностика лейкозов была выведена на молекулярный уровень. В последние годы этот путь привел к созданию препаратов, которые выборочно блокируют действие онкобелков. Одним из первых был препарат Гливек, который открыл новую страницу в терапии хронического миелолейкоза. С тех пор было идентифицировано множество неслучайных хромосомных поломок напрямую участвующих в формировании онкологического заболевания, либо влияющих на его течение и прогноз, а в части случаев лишь помогающих следить за прогрессией заболевания или за остаточным пулом клеток опухоли (Rowley JD, Aster JC, 1993). Однако, ещё большее число обнаруженных транслокаций до сих пор носит характер случайных и требует дальнейшего изучения их роли в формировании или развитии опухоли.

Современные молекулярно-биологические методы позволяют разделить всех пациентов с различными формами лейкозов на крупные подгруппы по наличию неслучайных транслокаций, или же их достоверному отсутствию. Для большей части этих аберраций выявлено клиническое значение в определении прогноза заболевания, и они являются важнейшими факторами риска в современных клинических исследованиях.

Стандартным методом диагностики значимых химерных генов, которые образуются при слиянии участков последовательностей протоонкогенов, при транслокации, на сегодня является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, которая обладает высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью для применения в клинических лабораториях (Cross N.C.P., 1994). Цитогенетическое исследование, остававшееся долгое время основным, и позволившее сделать множество открытий в определении генетической природы злокачественных новообразований крови у детей, не отвечает требованиям клиницистов. Обладая низкой чувствительностью, зависимостью возможности получить результат от множества факторов, влияющих на рост культуры клеток, субъективностью — оно уступает место новейшим разработкам в области анализа генома (Ma S.K. 1999, Prema Е. Devaraj, 1995). Необходимо отметить, что рано списывать стандартную цитогенентику из арсенала методов, применяемых в лабораторной и исследовательской практике, так как она даёт возможность представить комплексное изменение кариотипа в бластной клетке, однако, расширение возможностей новых методик, приводит всё более ограниченному использованию цитогенетического анализа в рутинной практике.

Сейчас возможно определение большого числа неслучайных хромосомных транслокаций, а точнее ещё более значимых их продуктов -химерных генов. Наиболее интересны с клинической точки зрения гибридные гены BCR/ABL, TEL/AML1, PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, MLL/AF4 и Е2А/РВХ. Тем не менее, тенденция к централизации онкогематологической помощи, создание кооперативных групп, ведущих совместные проекты, вводит новые требования к лабораторной службе. Данные о генетической природе бластных клеток, должны быть получены оперативно и быть абсолютно достоверными. Интеграция клиник для оптимизации помощи детям, страдающим лейкозами, увеличивает нагрузку на молекулярно-биологические подразделения лабораторных комплексов. Высокотехнологичные схемы лечения повышают ответственность, ложащуюся на крупные гематологические центры.

Требуется внедрение новых методов молекулярного анализа. Кроме того, они должны расширять данные, получаемые клиническим врачом о пациенте, о природе и свойствах опухолевых клеток, вызвавших онкологическое заболевание. И такие методы молекулярного анализа в последнее десятилетие появились.

Это, использующие нанотехнологии, — биологические микрочипы, которые находят всё более широкое применение в анализе экспрессии генов, определении точечных мутаций, выявлении онкобелков. Однако, в нашей стране, несмотря на международный приоритет отечественной науки в создании таких методов, анализ с их использованием практически не распространён. Возможности проведения молекулярно-генетического исследования всем пациентам детского возраста с острым лейкозом в России ограничены низкой оснащённостью лабораторий, высокой стоимостью расходных материалов. В то же время, тестирование доступных разработанных отечественных и высокоэффективных систем с использованием технологии микрочипов до последнего времени не проводилось.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: Улучшить качество диагностики и точность стратификации больных на группы риска при лейкозах у детей, путём определения хромосомных аберраций с использованием метода гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами.

Основные задачи исследования:

1. Провести испытания методики, основанной на мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом для анализа хромосомных аберраций в бластных клетках при лейкозах у детей на клеточных культурах и клинических образцах.

2. Применить в клинической диагностике указанный метод, определить диагностическую и прогностическую информативность разработанной методики и ее эффективность, сравнить с другими методами: ОТ-ПЦР, секвенированием.

3. Испытать метод мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе в анализе образцов пациентов с лейкозами для определения минимальной остаточной болезни.

4. Определить частоту встречаемости наиболее важных хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и вариантов мест перестроек методом мультиплексной ПЦР с гибридизацией на микрочипе и их корреляцию с клиническими характеристиками пациентов.

5. Внедрить в клиническую практику метод мультиплексной ПЦР и гибридизации для анализа наиболее значимых хромосомных транслокаций.

Научная новизна. Впервые применен метод мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипом для комплексной диагностики лейкозов у детей. Определена с помощью метода мультиплексной ПЦР и гибридизации с биологическим микрочипом частота наиболее клинически значимых транслокаций: 12% для TEL/AML1, 3,3% - MLL/AF4, 1% -BCR/ABL при ОЛЛ, 18% - PML/RARA, 13,3% - AML1/ETO при ОНЛЛ у группы онкогематологических пациентов в российской детской популяции. Показана возможность определения точки слияния в химерных генах при использовании данного метода. Прослежена связь субвариантов Ь2а2 и Ь3а2 химерного гена BCR/ABL, и bcrl, ЬсгЗ химерного гена PML/RARa с клиническим течением лейкоза у детей. Впервые проведён анализ клинических характеристик для пациентов с различными изоформами химерного гена BCR/ABL - Ь2а2 и Ь3а2, позволивший предположить их неравнозначное влияние на прогноз. Показана возможность отслеживания минимальной остаточной болезни или анализа не первичных образцов в условиях терапии острого и хронического лейкоза с помощью использования технологии микрочипов.

Научно-практическая значимость. Испытан новый метод диагностики основных хромосомных аберраций при лейкозах у детей. Частоты встречаемости хромосомных транслокаций соответствуют таковым для других регионов, что подтверждает целесообразность использования единых протоколов лечения в терапии лейкозов во всём мире.

Разработка и внедрение метода молекулярно-генетического исследования с использованием мультиплексной ПЦР и гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом позволяют точнее верифицировать опухоль, поставить диагноз, осуществлять долгосрочный прогноз, корректировать терапию в соответствии со свойствами опухоли.

В результате выполненной работы реализован ряд эффектов: медицинский - улучшение диагностики и определения прогноза; экономический - уменьшение затрат на диагностику и лечение; научный -появилась возможность скринингового анализа пациентов на наличие основных хромосомных аберраций, открылись возможности для мультицентровых исследований с целью определения значения тех или иных транслокаций и их изоформ; биологический - адаптирована методика применения олигонуклеотидных микрочипов для анализа химерных РНК путём гибридизации.

Организация исследования. Работа выполнена в ГУ НИИ Детской гематологии МЗ РФ (директор ГУ НИИ ДГ МЗ РФ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев) на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, РАН (директор ИМБ РАН - академик РАН, доктор химических наук, профессор А.Д.Мирзабеков ). Исследование проводилось в соответствии с планом НИР №005/019/001 по теме: «Разработка и внедрение в практику молекулярно-генетических методов диагностики и биологически обоснованных методов терапии и профилактики заболеваний крови у детей и подростков»

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 20-21 июня, 2002 г.); на III симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 6-7 февраля, 2003 г.); на III съезде онкологов и радиологов СНГ (Республика Беларусь, Минск, 25-28 мая 2004 г.).

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников ГУ НИИ Детской гематологии и Российской Детской Клинической Больницы 23 сентября 2004 года.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, отечественных и зарубежных авторов, приложения. Материал диссертации изложен на 108 страницах (без приложения), содержит 15 таблиц, 10 рисунков. Список литературы включает 148 источников литературы: 17 отечественных и 131 зарубежных авторов.

Выводы

1. Разработанный метод ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах - высокочувствительный и специфичный метод анализа ряда хромосомных аберраций. С его помощью возможно точное определение места перестройки без применения секвенирования образца.

2. Применение новой технологии является научно и экономически целесообразным. При возможности получения полной информации о наличии восьми транслокаций с их изоформами стоимость анализа в два раза меньшая, чем при использовании стандартной ОТ-ПЦР (60$ vs 100$).

3. Применение микрочипов имеет ряд преимуществ перед стандартными методиками. Основные из них: уменьшение числа необходимых манипуляций, повышенная специфичность, объективность анализа, производительность.

4. Частота обнаруживаемых с помощью мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с микрочипами значимых хромосомных аберраций при лейкозах у детей в российской популяции не отличается от данных, полученных с помощью стандартной ПЦР и данных из литературных источников.

5. Выявлено, что с помощью тест-системы на основе гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом возможны масштабные исследования больших групп пациентов на наличие основных клинически значимых хромосомных аберраций, а также мониторинг минимальной остаточной болезни. Показана высокая производительность методики и воспроизводимость данных.

6. Обнаружено, что при ХМЛ более неблагоприятным является Ь2а2 вариант химерного гена BCR/ABL. Выявлена тенденция к увеличению смертности в 2 раза по сравнению с вариантом Ь3а2.

7. При рецидивах ОЛЛ встречается с той же частотой что и при первичном ОЛЛ химерный ген TEL/AML1, с повышенной частотой химерный ген BCR/ABL (3% против 1% для первичных ОЛЛ), при рецидивах ОНЛЛ химерный ген AML1/ETO встречался в два раза чаще, чем при первичном ОНЛЛ.

Практические рекомендации

1. Для точной верификации диагноза, определения прогноза и группы риска следует в обязательном порядке проводить анализ инициальных образцов костного мозга и/или крови детей и подростков с впервые установленным диагнозом ОЛЛ или ОНЛЛ, а также ХМЛ на наиболее значимые хромосомные аберрации.

2. Следует проводить молекулярную диагностику для определения прогноза и верификации диагноза при рецидивах этих заболеваний.

3. В молекулярной диагностике лейкозов предпочтительно использование ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или мультиплексной ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией с олигонуклеотидным микрочипом.

4. Рекомендована организация широкомасштабных исследований клинического значения изоформ химерного гена BCR/ABL при ХМЛ.