Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Корреляция иммунофенотипа и кариотипа бластных клеток в динамике программной полихимиотерапии у детей, больных острым лейкозом

На правах рукописи

□□3448324

ПЛУЖНИКОВА Галина Эдуардовна

КОРРЕЛЯЦИЯ ИММУНОФЕНОТИПА И КАРИОТИПА ВЛАСТНЫХ КЛЕТОК В ДИНАМИКЕ ПРОГРАММНОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛЕЙКОЗОМ

14 00 14-онкология 14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

Ростов-на-Дону 200В

003448324

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОСУДАРСТВЕННОМ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ УЧРЕЖДЕНИИ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В.В.Зотова

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Е.Ю.Златник

Доктор медицинских наук, профессор Ю.В.Шатохин

Ведущая организация: ФГУ Федеральный научно-клинический центр

детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава

Защита диссертации состоится 2008 г. в /Л/ч асов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий» (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий»

Автореферат разослан « ЗОъ У.9 2008 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, член-корреспондент РАМН, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Острые лейкозы- опухолевое заболевание гемопоэтической системы, при котором лейкемические нарушения происходят на уровне коммитированной уни- или бипотентной костномозговой клетки-предшественницы. На их долю приходится 30 - 40% всех злокачественных заболеваний у детей (Naomi J. W. et al., 2004). По данным отечественных и зарубежных авторов на острый лимфоб-ластный лейкоз (OJ1J1) приходится 80%, на острый нелимфобластный лейкоз (ОНЛЛ) - 20% (Алейникова О.В., 2007, Pui С.Н., 1995).

Основой современного разделения острого лейкоза на варианты послужила классификация, предложенная в 1976 г. группой французских, американских и британских гематологов (FAB классификация). Она опирается на морфологические и цитохимические характеристики бластных клеток. Позже (в 80-х гг.) иммунофенотипирование бластных клеток с использованием монокло-нальных антител позволило значительно улучшить диагностику лейкозов за счет выявления степени дифференцировки опухолевых клеток (Попа А.В. и со-авт., 1999; Тупицын Н.И. и соавт., 2001; Bain В., 1999). На основе иммунологических признаков принято выделять В- и Т-линейные острые лимфобластные лейкозы, острые нелимфобластные лейкозы.

В соответствии с уровнем дифференцировки В-лимфоцитов различают 4 подварианта В-ОЛЛ: BI (про-В) ОЛЛ, BII (common) ОЛЛ, Bill (пре-В) ОЛЛ, BIV (зрелый В) ОЛЛ; в Т-линейных - TI (про-Т), TII (пре-Т), Till (кортикальный Т), TIV (зрелый Т). Выделенные иммунологические варианты отличаются по клинике и ответу на терапию.

Дальнейшее развитие лабораторных методов, а именно - внедрение ка-риотипирования бластов показало, что спектр хромосомных нарушений при гемобластозах миелоидной природы отличается от такового при новообразованиях из лимфоидных клеток, а для В-клеточных лейкозов мутации иные, чем для Т-клеточных (Флейшман Е.В., 2001; Mitelman F., 1995; Pui С.-Н., 2001).

Вследствие того, что популяция лейкозных клеток является потомством одной трансформированной клетки, то и весь клон характеризуется рядом одинаковых хромосомных и молекулярно-генетических нарушений, которые усложняются в ходе опухолевой прогрессии. Показано, что в дебюте острого лейкоза первичные хромосомные аберрации выявляются у 80-90% больных (Pui С,-Н., 1995). В тех случаях, когда комплекс классических диагностических критериев не дает ответа на вопрос, имеется ли в исследуемом случае неопластический процесс или нет, обнаружение клона клеток с однотипными приобретенными хромосомными перестройками или молекулярно-генетическими изменениями позволяет с уверенностью поставить диагноз опухоли и отвергнуть возможность неопухолевого процесса: приобретенные изменения наблюдаются только в опухоли, а врожденные — во всех клетках организма. Выявление типичных хромосомных перестроек важно для окончательной постановки диагноза, выбора тактики лечения, проведения мониторинга минимальной остаточной болезни (MRD) (Van Dongen J.M., et al., 1999; Алейникова O.B., 2007).

С начала 70-х годов XX века в мире было выделено и проанализировано более 100 факторов риска острого лимфобластного лейкоза у детей. Большая часть из них в связи с интенсификацией и стандартизацией терапии потеряла свое прогностическое значение. Некоторые факторы риска остаются актуальными до сегодняшнего дня, среди них основными являются уровень инициального лейкоцитоза, возраст пациента и иммунофенотип бластных клеток. Инициальный гиперлейкоцитоз и Т-клеточный иммунофенотип бластных клеток относятся к достаточно хорошо изученным факторам риска острого лимфобластного лейкоза у детей и коррелируют с плохим прогнозом вследствие развития большего количества рецидивов (Владимирская Е.Б. и соавт., 1997). Как с этими показателями соотносятся данные об изменении кариотипа изучено недостаточно.

В последние годы проводятся интенсивные исследования биологии роста лейкемической опухоли. FAB-классификация не дает возможности стратифицировать заболевание по факторам риска. Такая стратификация - необходимое

условие совершенствования терапии. В классификации опухолей гемопоэтиче-ской и лимфоидной тканей, предложенной ВОЗ в 1999 г. (Schoch С. et al., 2003; Harris N.L. et al., 2004; Brüning R.D. et al., 2001), на основании иммунофеноти-пических и цитогенетических признаков сделана попытка оценки клинических особенностей с использованием биологических характеристик опухолевого роста. Классификация ВОЗ (2001 г.) опирается на признание основополагающего значения молекулярно-генетических событий в развитии и клиническом оформлении острого лимфобластного лейкоза. Однако в последующие годы оказалось, что представленные в классификации ВОЗ цитогенетические формы острого нелимфобластного лейкоза также не являются однородными, а включают в себя различные варианты генных мутаций.

Для некоторых наиболее часто встречаемых транслокаций выделены группы с хорошим, относительно благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Однако в каждом конкретном случае предсказание ответа на лечение является весьма трудной задачей. Только комплекс клинико-лабораторных показателей позволяет с некоторой долей вероятности сделать предположение о возможности получения ремиссии.

Актуальность изучения данной проблемы обусловлена необходимостью выяснить прогностическое значение неслучайных хромосомных аберраций в комплексе с иммунофенотипическими данными в процессе программной полихимиотерапии для их дальнейшего клинического использования.

Цель исследования: изучение корреляционной взаимосвязи цитогенетических нарушений бластных клеток и их иммунофенотипических особенностей в динамике полиохимиотерапии у детей Ростовской области, больных острым лейкозом. Поставленная цель достигалась решением следующих задач исследования:

1. Исследование спектра хромосомных аберраций, встречающихся у детей в дебюте разных вариантов острого лейкоза (Т- и В- клеточные, недифференцированный, бифенотипический, из натуральных киллеров и

миелоидный), в процессе терапии и при минимальной остаточной болезни;

2. Изучение изменения иммунного фенотипа властных клеток в динамике заболевания;

3. Выявление наиболее информативных прогностических критериев развития заболевания на основе установленных корреляционных взаимоотношений между цитогенетическими и иммунофенотипическими особенностями властных клеток у больных острым лейкозом.

Научная новизна темы

- Впервые у детей Ростовской области установлены корреляционные взаимоотношения между кариотипом и иммунофенотипом бластных клеток при остром лимфобластном, остром миелоидном и других лейкозах.

- Впервые определены наиболее информативные прогностические критерии динамики заболевания, основанные на исследовании кариотипа и иммуно-фенотипа бластных клеток.

- Впервые показана возможность выделения больных в группы риска в плане прогноза ответа на терапию с учетом выявленных иммунофенотипиче-ских и цитогенетических особенностей лейкозного клона.

Практическая значимость

Научно-практическая значимость работы заключается в расширении представлений о спектре неслучайных хромосомных аберраций при различных вариантах острого лейкоза у детей и их значимости как в процессе лейкемиза-ции, так и при развитии минимальной остаточной болезни и рецидива заболевания. Полученные результаты не только дополняют существующие представления, но и вносят новые аспекты в изучение патогенеза острого лейкоза у детей, позволяют до начала лечения выявлять детей с неблагоприятными факторами прогноза, отнести их к соответствующей группе риска и назначить адекватную терапию.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Существует коррелятивная взаимосвязь между рядом нарушений кариотипа бластных клеток, повышенной экспрессией ими неродственных дифферен-цировочных антигенов и прогнозом течения заболевания.

2. Для стратификации групп риска целесообразно до начала терапии и в динамике проводить иммунофенотипирование и кариотипирование бластных клеток костного мозга. Выбор терапии проводить в соответствии с полученными данными в рамках существующих протоколов.

Апробация работы

Основные положения работы докладывались на VIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в С.-Петербурге» (2004 г.), Ill съезде детских онкологов России (2004г.), на заседании Общества иммунологов и аллергологов г. Ростов-на-Дону (2005г.), на совместном заседании онкогема-тологического центра ГУЗ ОДБ и кафедры детских болезней №1 РостГМУ ФА ЗСР (2008 г.).

Внедрение результатов в практику

Результаты исследований используются в детском онкогематологическом центре ОДБ г. Ростова-на-Дону, а также в лекционном курсе на кафедре детских болезней №1 РостГМУ ФА ЗСР.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации:

Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста. Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, оценку корреляционных взаимосвязей при ОЛ, выводы и практические рекоменда-

ции. Библиографический указатель включает 243 источника литературы, в том числе 177 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 31 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика материала и методов исследования

В соответствии с задачами, поставленными при выполнении данной работы, был исследован иммунофенотип и кариотип бластных клеток костного мозга у 103 детей, страдающих острым лейкозом (OJI), проходивших лечение в Онкогематологическом центре ГУЗ Областная детская больница г. Ростов-на-Дону в период с 2004 по 2007 гг.

Всем больным были проведены лабораторные исследования, в соответствии со стандартом для данной патологии: стернапьная пункция с последующим иммунофенотипированием, цитогенетическим, морфоло- гическим и цитологическим исследованием пунктата, миелограмма, общий анализ крови, иммунологический фон, исследование спинномозговой жидкости, коагулографические и биохимические исследования.

Исследование кариотипа бластных клеток костного мозга, полученного путем стернальной пункции, проводилось в кратковременной нестимулирован-ной культуре (2-х, 24-х и 48-ми часовой) (Schlegerberger В. et al., 1999), в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками при 37°С. Гипотонизация и фиксация выполнялись по общепринятой методике. Высушенные препараты окрашивали красителем Gimsa с использованием трипсина (GTG-окраска), что позволило получить дифференциально окрашенные хромосомы. Описание кариотипа и найденных нарушений проводили в соответствии с международной номенклатурой ISHCN (Mitelman F., 1995).

Иммунофенотипирование бластных клеток костного мозга осуществлялось методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACSCa-libur (фирма Becton Dickinson, США) на основе определения поверхностных

дифференцировочных антигенов с помощью панели моноклональных антител: CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD 10+, CD 13+, CD 14+, CD 15+, CD 16+, CD 19+, CD20+, CD22+, CD34+, CD56+, CD95+, CD133(AC133)+, HLA-DR+, MPO+, anti-TCR(a/ß)+, -(y/S), anti-Kappa, anti-lambda производства Becton Dickinson и DAKO. Полученные данные вводились в компьютер Macintosh Quadra 650 и обрабатывались в программе Cell Quest (version 1.2.2.). Исследование выполнялось в день поступления ребёнка и на 36-й день лечения для выявления MRD - минимальной резидуальной болезни при остром лимфобластном лейкозе (OJIJI) и оценки эффективности проводимой терапии, а при остром миелоба-стном лейкозе (OMJI) - в дебюте и, исходя из контрольных точек, обусловленных протоколами терапии.

Статистическая обработка материала проводилась методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ Excel и Statistica, коэффициент корреляции рассчитывался по формуле Юла.

В процессе исследования нами отмечались следующие события: выход в ремиссию (при наличии в пунктате костного мозга менее 5% бластных клеток при нормальном анализе крови, отсутствии экстрамедулярных поражений), наличие рецидива (диагностировалось при выявлении более 10% бластных клеток в костном мозге после выхода в ремиссию), минимальная остаточная болезнь (наличие остаточного аберрантного клеточного клона на 36-й день терапии при OJIJI или в программных точках при OHJ1J1), выбыл из-под наблюдения (если о ребенке нет сведений более 6 месяцев с момента выписки из стационара).

Возрастно-половой состав пациентов, согласно модифицированной периодизации Н.П. Гундобина, представлен в таблице 1.

Из представленных в таблице данных видно, что соотношение М : Ж равно 1,02, что согласуется с мировой статистикой, так же как и превалирование детей дошкольного возраста, что указывает на соответствие исследуемой группы детей общепризнанным закономерностям распределения больных OJI у детей (Алексеев H.A. и соавт., 1988) в зависимости от их возраста и пола, т.е. чис-

ло заболевших детей возрастает к дошкольному возрасту и затем снижается (26

-43 — 34 человек в нашем исследовании согласно возрастной градации).

Таблица 1

Распределение детей по полу и возрасту

Возрастные периоды Число детей Девочки Мальчики

абс отн абс отн * абс отн **

Грудной 1 мес - 1 год 3 3 0 0 3 3/5,9

Преддошкольный (ранний) 1 - 2 года 23 22,3 12 11,6/43,3 11 10,7/21,6

Дошкольный 3-6 лет 43 41,7 19 18,4/36,6 24 23,3/47

Младший школьный 7 -11 лет 17 16,5 И 10,7/21,2 6 5,9/11,8

Старший школьный 17 16,5 10 9,7/19,2 7 6,8/13,7

Всего 103 100 51 50,5/100 52 49,5/100

* - % к общему количеству всех детей / % к количеству всех девочек

** - % к общему количеству всех детей / % к количеству всех мальчиков

В соответствии с номенклатурой FAB все случаи OJI нами были разделены на OJ1JI и OHJ1JI. Среди последних, кроме OMJI, были выделены «Другие» случаи (недифференцированный, бифенотипический лейкозы и OJI из натуральных киллеров) (табл. 2.).

Таблица 2

Инициальные характеристики пациентов с OJI

ОЛЛ ОМЛ Другие

Ьольные В-ОЛЛ Т-ОЛЛ

Пол Мальчики 37 4 6 5

Девочки 34 6 11 0

Менее 1 года 1 0 2 0

Возраст 1-10 лег 64 6 7 4

Старше 10 лет 6 4 8 1

Инициальный Более 50x109/л 2 2 0 0

лейкоцитоз Не более 50x109/л 69 8 17 5

Как видно из представленных данных, среди первичных пациентов с ОЛ преобладает ОЛЛ (78%). При этом В-клеточные варианты ОЛЛ встречаются гораздо чаще Т-клеточных вариантов (87,6%). Такое распределение вариантов является характерным для детских ОЛ.

Несмотря на малую величину выборки, соотношение В- и Т- лейкозов укладывается в классические рамки: так, в нашем исследовании В - ОЛЛ выявлен у 88% (по данным литературы - 85%), Т- ОЛЛ - у 12% (по данным литературы - 15%) (\Villemse М. е! а1, 2002).

В связи с малой численностью пациентов с различными вариантами ОМЛ эта группа будет рассматриваться как целая. В ее состав вошли больные с М1 -4 чел. (24%), М2 - 4 чел. (24%), МЗ - 6 чел.(34%), Мб - 1 чел. (6%). У двух детей с врожденным миелолейкозом установить вариант не удалось.

Таблица 3

Распределение пациентов в зависимости от наличия нарушений кариотипа

Всего (чел) В том числе

Диагноз С нарушениями кариотипа (чел) Без нарушений кариотипа (чел)

ОЛЛ 81 31 38

ОМЛ 17 12 2

Другие 5 2 3

Всего 103 45 43

В ходе работы всем пациентам было проведено исследование кариотипа в пунктате костного мозга. В таблице 3 представлены данные распределения пациентов в зависимости от наличия или отсутствия нарушений кариотипа. Исследование кариотипа удалось провести не у всех больных по техническим причинам.

В таблице 4 представлены результаты терапии при разных вариантах ОЛ у детей.

В стойкой ремиссии находятся 76% пациентов с ОЛЛ, 46% пациентов с ОМЛ, 60% пациентов с другими ОЛ.

Таблица 4

Результаты терапии при разных вариантах острого лейкоза

Результаты лечения ОЛЛ ОМЛ (п=17) Другие (п=5)

В-ОЛЛ (п=71) Т-ОЛЛ (и=10)

Ремиссия 51 1 9 3

Рецидивы 15 8 4 2

Умерли 17 6 8 2

Выбыли из-под наблюдения 2 1 1 -

Результаты исследования и их обсуждение

Исходя из общего плана обследования пациентов при поступлении в он-когематологичекое отделение больницы, все пациенты прошли иммунологическое обследование.

В иммунограмме больных В-ОЛЛ в дебюте заболевания отмечено повышение абсолютных и относительных показателей СО 19+ по сравнению со здоровыми детьми в 3-3,5 раза. На 36-й день ПХТ относительное содержание В-лимфоцитов понизилось, хотя и оставалось выше показателей здоровых детей, абсолютные числа упали ниже этих показателей, видимо, как следствие ПХТ. Количество СОЗ+ клеток в инициальной стадии у пациентов с ВП вариантом ОЛ было гораздо ниже по сравнению со здоровыми, а при В1 - незначительно выше во всех возрастных группах, причем падение уровня Т-клеток проявлялось в зависимости от возраста пациентов - чем старше дети, тем ниже уровень содержания. После проведения ПХТ абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов приблизилось к показателям здоровых детей. Можно предположить, что такая динамика клеточного состава периферической крови обусловлена тем, что у детей младших возрастных групп отмечается большее число незрелых лимфоцитов.

Иммунный статус больных Т-ОЛЛ характеризовался понижением относительного количества как Т-, так и В-лимфоцитов, а их абсолютные количест-

ва при этом проявляли противоположные тенденции: Т-лимфоцитов было в 6 раз больше чем у здоровых детей (в старшей возрастной группе), а В-лимфоцитов - в 3 р. меньше. На 36-й день терапии количество CD19+ лимфоцитов увеличилось как в абсолютных, так и в относительных величинах. Количество CD3+ лимфоцитов также приблизилось к показателям здоровых детей, при этом относительные значения повысились в 2,5 раза, а абсолютные снизились почти в 7 раз.

Иммунный статус больных OMJ1 проявлял разные тенденции в зависимости от варианта ОЛ. При ОМЛ-М2 варианте до начала терапии относительное содержание Т-лимфоцитов было гораздо ниже показателей здоровых детей; М1 и МЗ варианты характеризовались близкими к нормальным показателям относительного содержания, несмотря на то, что выражено снижение абсолютных значений в 1,5 раза. При этом содержание В-лимфоцитов (и абсолютное, и относительное) в инициальной стадии М2 вариантов было в 2 раза выше по сравнению с контрольной группой, а при М1 и МЗ - на 30% ниже. Но по окончании курса терапии относительное содержание CD 19+ достоверно не имело значительных отличий от здоровых детей.

Иммунный статус больных лейкемией детей исследован в ряде работ как отечественных, так и зарубежных исследователей (Асланян К.С., 2003, Борт-никова О.Г., 2006, Haynes B.F.et al., 1999). Установлено наличие в начале заболевания нарушений в Т- и В-звеньях иммунитета, усугубляющихся агрессией лейкозного клона и ПХТ. Эти сведения нашли подтверждение и в нашей работе.

При В-клеточном ОЛЛ количество бластных клеток в пунктате КМ разнилось по вариантам от 69,1±10,3% при BI до 90,8+8,4% при BII, промежуточное значение имел BIII вариант - 87,6+4,5%. Иммунофенотипирование бластных клеток в дебюте заболевания проведено у всех больных. Наиболее часто на бластных клетках при В-ОЛЛ коэкспрессировались миеломаркеры CD13+ - у 20,6%, CD33+ - у 32,8%, маркер активированных клеток HLA-DR+ - у 99% больных. Реже отмечалась коэкспрессия Т-маркера CD7+ - у 11% (рис.1).

Ремиссия Рецидив

Рис. 1. Экспрессия дифференцировочных маркеров в дебюте В-ОЛЛ при разном течении заболевания (%).

Проводилось сопоставление величины и частоты экспрессии дифференцировочных маркеров у больных В-ОЛЛ. Экспрессия таких антигенов, как СБ 13+, СО 133+ оказалась выше при более благоприятном варианте лейкоза, а в случае плохого ответа на терапию была выше экспрессия СЭ20+. Антигены Т-клеточной линии СЭЗ+, СЭ5+ выявлялись в обеих прогностических группах и не демонстрировали ясных для прогноза тенденций.

Из 66 больных ОЛЛ с исследованным кариотипом бластных клеток у 29 (44%) была обнаружена хромосомная патология. Все пациенты были отнесены к В-ОЛЛ. Палитра нарушений не была неожиданной: это ряд транслокаций 1(9;22)(я34;я11), 1)(ч21;я23), 1(11; 19), делеции - с1е1(6)(ч23), с1е1(9)(р21), комплексные нарушения 46,ХУД(7;8),1(8;9),с1е1(7). У 13 (44,8%) человек отмечена гипердиплоидность. Хуже всего ответ на терапию был у пациентов с нарушениями, затрагивающими 1Ц23, - 100% дали рецидив. На данный момент 80% пациентов с РЬ хромосомой также дали рецидив. 83% больных с нормальным кариотипом находятся в стойкой ремиссии, такие же результаты лечения получены и у больных с гипердиплоидным кариотипом (рис.2).

80

60

40

20

ЕЗ Рецидив □ Ремиссия

Другие Гипер- П[)23 t(9;22) Норма диплоид

Рис. 2. Результаты терапии при разных нарушениях кариотипа у детей с В-ОЛЛ.

Хромосомная патология, отмеченная нами в ходе исследования, относится к неслучайным хромосомным перестройкам, новых аберраций мы не выявили. Так, t(9;22) и t(4;ll) входят в протокол ALL-MB-2002 как тактикоопреде-ляющие и однозначно отнесены к группе высокого риска. При t(ll;19) могут затрагиваться разные гены, что обуславливает различную чувствительность к химиопрепаратам (Флейшман Е.В., 2001). Прогностическое значение делеции del(6)(q23) не ясно, хотя она встречается достаточно часто - в 5-10% ОЛЛ; del(9)(p21) более характерна для T-OJIJl, при В-ОЛЛ группа пациентов с этой аберрацией клинически гетерогенна, что и предопределяет трудность в оценке прогностической значимости. Комплексные нарушения кариотипа предвещают худший ответ на терапию. В нашем исследовании пациент с комплексом хромосомных аберраций умер в первом рецидиве. Гипердиплоидность была благоприятна в плане прогноза - из 13 человек 11 вышли в стойкую ремиссию. Один пациент дал рецидив (бластоз в дебюте достигал 94,5%), еще один умер в ремиссии от сопутствующего заболевания. Таким образом, выживаемость в группе составила 84,6%.

Ни у одного пациента с В-ОЛЛ и известным кариотипом, давшим впоследствии рецидив заболевания, не выявлено коэкспрессии миелоидных маркеров. Т-лимфоидные маркеры встречены у 21% давших рецидив заболевания.

Маркер стволовых клеток С034- был повышен у вышедших в ремиссию детей с разными хромосомными аберрациями. Однако при нормальном кариотипе его экспрессия оказалась выше у детей с плохим ответом на терапию.

При Т-ОЛЛ бластоз был высоким - 76,9±15,2%, характеризовался разбросом по вариантам, но не столь существенным, как при В-ОЛЛ. Известно, что Т-ОЛЛ отличается плохим ответом на терапию, в нашем исследовании 90% детей дали рецидив заболевания. Из 7 больных Т-ОЛЛ, у которых был исследован ка-риотип бластных клеток, хромосомные аберрации не были выявлены ни в одном случае. При иммунофенотипировании у 3 из 10 пациентов выявлена коэкс-прессия стволовоклеточного маркера С034+ и маркера активированных клеток НЬА-ЭК+ (рис.3). Сколько-нибудь существенного повышения экспрессии мие-лоидных маркеров СО 13+, СОЗЗ+ не отмечалось.

3

Рис. 3. Сравнительная характеристика экспрессии бластными клетками КМ диффе-рендировочных маркеров при В- и Т-ОЛЛ в дебюте (%).

Анализируя ответ на ПХТ детей с Т-ОЛЛ в зависимости от иммунофено-типа бластных клеток, мы отметили, что СЭ34+ экспрессировался только в группе детей с плохим ответом на терапию.

О,В. Алейникова и соавт. (2001), Г.В. Коленкова (2002) отмечали, что экспрессия лимфобластами стволовоклеточных маркеров СЭ34+ и С0133+ характерна для детских лейкозов и ассоциирована с хорошим прогнозом при В-

ОЛЛ. Характер ассоциации при Т-клеточном лейкозе оставался дискутабель-ным. В нашем исследовании экспрессия стволовоклеточных антигенов (CD34+, CD133+) у детей, вышедших в ремиссию, исходно значительно превышала таковые показатели здоровых детей (60,1% и 50,0% соответственно). Таким образом, значение антигена CD34+ для прогноза поведения лейкозного клона различна для В- и Т-ОЛЛ: при первом он благоприятен, а во втором случае предвещает плохой исход.

Ранее H.H. Тупицын и соавт.(1998) указывали на то, что при Т-ОЛЛ ко-экспрессия CD 10+ ассоциирована с улучшением прогноза. Мы выявили, что при отсутствии экспрессии данного маркера только 10% пациентов находятся в ремиссии.

Бифенотипический ОЛ характеризуется экспрессией маркеров неродственных клеточных линий. Высока экспрессия маркера активированных клеток HLA-DR+ (у 100% пациентов), стволовоклеточных CD34+ (у 66,6% пациентов), CD133+ (у 33,3% пациентов). Хромосомный анализ выявил нарушения карио-типау 2 больных из 3. Летальность в группе - 66,6%. Из умерших один ребенок имел t(9;22), другой - нормальный кариотип. Ребенок с t(9;l I)(p22;q23) вышел в ремиссию после лечения. Для бифенотипического ОЛ не выявлено ассоциаций с определенными хромосомными аберрациями, хотя Hanson С.А. et al. (1993) указывает на высокую встречаемость t(9;22), нарушений, затрагивающих регион llq23.

Исследование минимальной остаточной болезни весьма актуально в свете решения проблемы стойкой ремиссии, поскольку MRD является состоянием, приводящим в ряде случаев к развитию рецидива и связанным с сохранением опухолевых клеток в крайне низких концентрациях, ниже предела чувствительности морфологических методов. Для отслеживания MRD мы использовали иммунофенотипирование бластных клеток по контрольным точкам протоколов терапии.

Из всех больных с В-ОЛЛ на 36-й день терапии повышенная экспрессия дифференцировочных маркеров отмечалась у 50,7% больных. Из них впослед-

ствии у 30,6% развился рецидив заболевания. В то же время у 11,1% больных, не имевших МГШ, также развился рецидив. В общем объеме пациентов с рецидивом заболевания больные, имевшие МГШ, занимают 73,3% (рис.4).

Из 36 человек с В-ОЛЛ, у которых была выявлена МЯО, хромосомные аберрации обнаружены у 22 человек, СЭ34+ не экспрессировался ни в одном случае, экспрессия НЬА-ОЯ+ была высока у 68% больных. 11 пациентов дали рецидив, из них умерли 9. Из 35 детей, не имевших МЯО, в ремиссию вышли 31 человек, 9 из них имели те или иные хромосомные нарушения. 4 человека дали впоследствии рецидив, среди них у 3 наблюдалась хромосомная патология.

11,1%

Рис. 4. Частота развития рецидива ОЛ в зависимости от наличия М1Ш.

Острый миелобластный лейкоз был отмечен у 17 пациентов. Смертность в этой группе составила 53%. При кариотипировании хромосомные аберрации выявлены у 75% больных (рис.5). В более ранних исследованиях указывается частота обнаружения хромосомной патологии: 83,3% - О.В. Алейникова (2002), Б.С. ЛатопсН. е1 а1. (1999) -78%. Из-за малочисленности группы мы не смогли проследить прогностических ассоциаций, однако только 50% детей с коэкспрессией Т-клеточных маркеров при М1 варианте вышли в ремиссию.

Рис. 5. Исход терапии ОМЛ при разных хромосомных аберрациях.

Ребенок с коэкспрессией СШ9+ и имевший г(8;21) умер в рецидиве. Г.В. Коленкова (2002) отмечает, что, вероятно, существует прогностически неблагоприятная ассоциации при М1 и М2 вариантах ОЛ между 1(8;21) и экспрессией СО 19+. Остальные хромосомные аберрации, отмеченные в группе с ОМЛ, относятся к ранее известным, неслучайным находкам. Так, в 100% случаях при МЗ варианте выявлена 1(15; 17). Это прогностически благоприятная группа. В то же время делеция с!е1(11)^23) относится к неблагоприятным факторам; для случаев с с!е1(12)(р13) и множественными нарушениями кариотипа прогноз неясен.

При анализе коррелятивных связей между исследуемыми показателями бластных клеток КМ были получены следующие данные. При ВП варианте ОЛЛ корреляция между транслокацией 1:(9;22) (г=0,6), нарушениями длинного плеча 11 хромосомы (г=0,48) и риском развития рецидива заболевания достоверно высока. Гипердиплоидный кариотип предвещает хороший прогноз (г=0,4). Выявление К9;22) в дебюте В-ОЛЛ в 80% случаев сопровождается рецидивом заболевания с летальным исходом. Нарушения длинного плеча 1Ц23 (транслокации с разными хромосомами-партнерами) в 100% случаев при В-ОЛЛ сопровождаются рецидивом заболевания и 50% - летальностью.

При гипердиплоидности у детей с В-ОЛЛ в 14% случаев наблюдался неблагоприятный исход - один ребенок умер в ремиссии, другой - в первом рецидиве. При наличии нормального кариотипа 20% больных дали рецидив, летальность в котором составила 75%.

Разные варианты ОЛ, сопровождавшиеся коэкспрессией С034+, проявляли разные зависимости - при В-ОЛЛ экспрессия С034+ предвещала хороший ответ на терапию (г=0,65), даже при наличии транслокации (9;22) (рис.6); при Т-ОЛЛ прогноз плохой (г=-0,53). При бифенотипическом ОЛ наличие СБ34+ также ассоциировано с рецидивом заболевания.

ВП (СО 10+)

100% 0 100% 40% 10% 9% 12%

НЕБЛАГОПРИЯТНЫЙ ИСХОД

Рис 6 Вероятность неблагоприятного исхода заболевания при ВН ОЛЛ с различным кариотипом властных клеток и экспрессией СОЭ4+.

При ОМ Л наличие транслокации 1(15; 17) предвещает хороший ответ на терапию, выход пациента в стадию ремиссии (г=0,5). Из-за малочисленности других групп (делеция длинного плеча 11 хромосомы, делеция короткого плеча 12 хромосомы) статистический анализ не представляется возможным. Весьма интересна взаимосвязь между экспрессией властными клетками СО 19+, транс-

локацией 1(8;21) и рецидивом заболевания при ОМЛ (М1 и М2). В нашем исследовании 1 ребенок имел такое сочетание признаков. Он дал рецидив заболевания. Двое детей с данной транслокацией, но без экспрессии СБ19+ находятся в ремиссии. Нормальный кариотип нельзя столь однозначно отнести к прогностически значимым данным, 1(8;21), как показал анализ, нельзя оценивать в отрыве от результатов иммунофенотипирования. Нарушения длинного плеча 11 хромосомы проявляют негативную тенденцию в плане прогноза, но однозначно оценить не представляется возможным из-за малочисленности выборки (рис.7).

НЕБЛАГОПРИЯТНЫЙ ИСХОД

Рис 7 Вероятность неблагоприятного исхода заболевания при ОМЛ при разном сочетании кариотипа и экспрессии дифференцировочных маркеров

Стволовоклеточный маркер С0133+ экспрессировался у незначительного числа пациентов (у 14%) с ОЛ. В силу этого статистический анализ невозможен, однако чаще этот маркер был отмечен у больных с хорошим ответом на терапию (вышедших в ремиссию).

Между ответом пациентов на ПХТ и экспрессией НЬА-ЭГ1+ на бластных клетках отрицательная зависимость была выявлена только при бифенотипиче-ском варианте ОЛ.

Таким образом, изучение коррелятивных взаимосвязей между кариоти-пом и иммунофенотипом бластных клеток позволило установить отчетливую зависимость между нарушениями фенотипа и определенными хромосомными аберрациями, а также коэкспрессией неродственных маркеров. Проведенное исследование способствует улучшению прогнозирования развития заболевания, выбору адекватной программы лечения, а динамическое наблюдение позволяет изменять тактику лечения и переводить больных на программы высокого риска в случаях появления новых отягощающих признаков ухудшения течения заболевания (новые хромосомные аберрации, рецидив заболевания и др.).

ВЫВОДЫ.

1. Среди острых лимфобластных лейкозов Т- клеточный острый лимфобла-стный лейкоз является прогностически крайне неблагоприятным вариантом лейкоза с 62% летальности, прогноз которого не зависит от коэкс-прессии неродственных маркеров и отсутствия хромосомных аберраций. В1 вариант острого лимфобластного лейкоза является благоприятным в плане прогноза ответа на терапию вне зависимости от наличия клональ-ных изменений бластных клеток; у больных ВП вариантом острого лимфобластного лейкоза (СО 10+) ответ на терапию зависит от наличия Ц9;22), нарушений длинного плеча 11 хромосомы (отягощающие факторы), а гипердиплоидность и нормальный кариотип относятся к благоприятным факторам.

2. В прогнозировании ответа на терапию при остром миелобластном лейкозе большое значение принадлежит нарушениям кариотипа бластных клеток: транслокация 1(15;17)(я22^11) предвещает хороший ответ на терапию; при 1(8;21 )(ц22;ц22) - прогноз зависит от наличия коэкспрессии СО 19+ на бластных клетках миелоидной линии (его присутствие усугуб-

ляет течение заболевания); делении с1е1(11)(я23) и с1е1(]2)(р13) предопределяют крайне неблагоприятное течение.

Рецидив заболевания у больных В-клеточным острым лимфобластным лейкозом с минимальной остаточной болезнью (30,6%) и хромосомными аберрациями (48%) наблюдается чаще, чем у пациентов без минимальной остаточной болезни (11,1%) и с нормальным кариотипом (22%); смертность у больных с рецидивом заболевания достигает 86%. Экспрессия бластными клетками антигена С034+ имеет благоприятное значение для течения заболевания в случае В-клеточного острого лим-фобластного лейкоза. При Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе выявление повышенной экспрессии СЭ34+ утяжеляет прогноз, а экспрессия СБ133+ предвещает хороший ответ на терапию.

При миелобластном лейкозе (М1 и М2 варианты) коэкспрессия С019+, ассоциированная с 1(8;21), прогностически неблагоприятна; коэкспрессия миелобластами СЭ34+ также прогностически неблагоприятна. При бифе-нотипическом остром лейкозе сочетание высокой экспрессии НЬА-011+, СР34+ с хромосомной патологией прогнозирует плохой ответ на терапию.

Изучение коррелятивных взаимосвязей между кариотипом и иммунофе-нотипом бластных клеток выявило отчетливую зависимость между нарушениями иммунофенотипа и определенными хромосомными аберрациями, а также коэкспрессией неродственных маркеров, что может быть использовано для прогнозирования ответа и выбора адекватной программы лечения детей, больных острым лейкозом.

Практические рекомендации

1. Необходимо проводить кариотипирование бластных клеток костного мозга в дебюте заболевания и по контрольным точкам протоколов терапии для стратификации групп риска у детей, больных острым лейкозом.

2. Проводить иммунофенотипирование бластных клеток костного мозга в дебюте заболевания для уточнения варианта острого лейкоза, выбора протокола терапии и мониторинга минимальной остаточной болезни.

3. При выявлении коэкспрессии властными клетками CD34+ при В- и Т-клеточных острых лимфобластных лейкозах, бифенотипическом, недифференцированном острых лейкозах, а также CD19+ при М1 или М2 вариантах острого миелобластного лейкоза, сопровождающихся t(8;21); в случае t(9;22), t(4;ll), t(15;17) необходимо дифференцированно подходить к выбору тактики лечения таких больных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Плужникова Г.Э. 36-й день программной ПХТ у больных острым лимфобла-стным лейкозом: иммунофенотипирование и цитогенетические исследования / В.В. Зотова, О.Г. Бортникова, Г.Э. Плужникова, М.П. Дитор, Е.И. Сысоева., Л.Н. Фисенко., И.В. Яценко // Материалы VIII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе, «Дни иммунологии в С-Петербурге» «Молекулярные основы иммунорегу-ляции, иммунодиагностики и иммунотерапии». - С.-Пб. - 2004. - С. 352 .

2. Плужникова Г.Э. Опыт проведения цитогенетических исследований у детей с гемобластозами / ГЭ. Плужникова, В.В. Зотова, М.П. Дитор // Тезисы до-кадов III съезда детских онкологов России. - М. - 2004. (электронный вариант).

3. Плужникова Г.Э. Иммунологические особенности бластов при рецидивах острого лейкоза, прогностическое значение / В.В. Зотова, О.Г. Бортникова, Г.Э. Плужникова, Е.И. Сысоева, К.С. Асланян, JI.B. Гончарова// В сб. «Тезисы докладов Объединенного иммунологического форума». - Екатеринбург -2004.-С. 288.

4. Плужникова Г.Э. Прогноз развития острого лейкоза на основании исследования иммунофенотипа и кариотипа бластных клеток / О.Г. Бортникова, Г.Э. Плужникова, В.В. Зотова, М.П. Дитор, Е.И. Сысоева // В сб. «Оптимизация

деятельности детских стационаров в условиях реформирования здравоохранения». - Ростов-на-Дону. - 2005. - С. 113-114.

5. Плужникова Г.Э. Значение корреляции данных цитогенетических и имму-нофенотипических исследований в прогнозе исхода острых лейкозов. // В сб. «Актуальные проблемы педиатрии и дерматологии». — 2005. — Орел. - (электронный вариант).

6. Плужникова Г.Э. Корреляция цитогенетических и иммунофенотипических исследований у больных острым лейкозом / Г.Э. Плужникова, В.В. Зотова, М.П. Дитор, H.A. Голованова // Вопросы современной педиатрии. - 2005. -т.4.-приложение№1,-С. 416.

7. Плужникова Г.Э. Коррелятивная зависимость иммунофенотипа и кариотипа у больных острым лейкозом / Г.Э. Плужникова, М.П. Дитор, Е.И. Сысоева // Материалы II Всероссийского конгресса по детской аллергологии и иммунологии «Иммунитет и болезни детского возраста: «органные» и «системные» принципы диагностики, терапии и профилактики» 2-4 октября, Москва. -2006 г.-С. 81.

8. Плужникова Г.Э. Корреляция кариотипа и иммунофенотипа как прогностический фактор исхода ОЛ у детей / Г.Э. Плужникова, В.В. Зотова, М.П. Дитор, М.П. Бондарева // Труды VIII Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». 27-29 июня 2007г. -Москва. - С. 256.

9. Плужникова Г.Э. Кариотип бластных клеток при разных иммунофенотипических вариантах острых лейкозов у детей / Г.Э. Плужникова, М.П. Дитор, Л.А. Бойко, H.A. Голованова, A.M. Шайхутдинова, Т.Н. Калинина // Вестник РГМУ. Материалы Первого Объединенного научно-практического форума детских врачей. - М. - 2008г. - С. 154.

Список используемых сокращений

CD - кластер дифференцировки

MRD - minimal residual desese

KM - костный мозг

МКА - моноклональные антитела

ОЛ - острый лейкоз

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

ОНЛЛ - острый нелимфобластный лейкоз

ПКМ - пункта костного мозга

ПХТ - полихимиотерапия

Печать цифровая. Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Формат 60x84/16 Объем 1,0 уч -изд -л. Заказ № 914 Тираж 100 экз Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул Суворова, 19, тел 247-34-88

Острые лейкозы — опухолевое заболевание гемопоэтической системы, при котором лейкемические нарушения происходят на уровне коммитированной уни- или бипотентной костномозговой клетки-предшественницы. На их долю приходится 30 - 40% всех злокачественных заболеваний у детей (Naomi J. W. et al., 2004). По данным отечественных и зарубежных авторов на острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) приходится 80%, на острый нелимфобластный лейкоз (OHJIJI) - 20% (Алейникова О.В., 2007, Pui С.Н., 1995).

Основой современного разделения острого лейкоза на варианты послужила классификация, предложенная в 1976 г. группой французских, американских и британских гематологов (FAB классификация). Она опирается на морфологические и цитохимические характеристики бластных клеток. Позже (в 80-х гг.) иммуноф енотипирование бластных клеток с использованием моноклональных антител позволило значительно улучшить диагностику лейкозов за счет выявления степени дифференцировки опухолевых клеток (Попа А.В. и соавт., 1999; Тупицын Н.И. и соавт., 2001; Bain В., 1999). На основе иммунологических признаков принято выделять В- и Т-линейные острые лимфобластные лейкозы, острые нелимфобластные лейкозы.

В соответствии с уровнем дифференцировки В-лимфоцитов различают 4 подварианта В-ОЛЛ: BI (про-В) OJIJI, BII (common) ОЛЛ, Bill (пре-В) ОЛЛ, BIV (зрелый В) ОЛЛ. В Т-линейных - про-Т (TI), пре-Т (TII), кортикальный Т (Till), зрелый Т (TIV). Выделенные иммунологические варианты отличаются по клинике и ответу на терапию.

Дальнейшее развитие лабораторных методов, а именно - внедрение кариотипирования бластов показал, что спектр хромосомных нарушений при гемобластозах миелоидной природы отличается от такового при новообразованиях из лимфоидных клеток, а для В-клеточных лейкозов мутации иные, чем для Т-клеточных (Флейшман Е.В., 2001; Mitelman F., 1995; Pui С.-Н., 2001).

Так как популяция лейкозных клеток является потомством одной трансформированной клетки, то и весь клон характеризуется рядом одинаковых хромосомных и молекулярно-генетических нарушений, которые усложняются в ходе опухолевой прогрессии. Показано, что в дебюте острого лейкоза первичные хромосомные аберрации выявляются у 80-90% больных (Pui С.-Н., 1995). В тех случаях, когда комплекс классических диагностических критериев не дает ответа на вопрос, имеется ли в исследуемом случае неопластический процесс или нет, обнаружение клона клеток с однотипными приобретенными хромосомными перестройками или молекулярно-генетическими изменениями позволяет с уверенностью поставить диагноз опухоли и отвергнуть возможность неопухолевого процесса: приобретенные изменения наблюдаются, только в опухоли, а врожденные - во всех клетках организма. Выявление типичных хромосомных перестроек важно для окончательной постановки диагноза, выбора тактики лечения, проведения мониторинга минимальной остаточной болезни (MRD) (Van Dongen J.M., et al., 1999; Алейникова O.B., 2007).

С начала 70-х годов XX века в мире было выделено и проанализировано более 100 факторов риска острого лимфобластного лейкоза у детей. Большая часть из них в связи с интенсификацией и стандартизацией терапии потеряла свое прогностическое значение. Некоторые факторы риска остаются актуальными до сегодняшнего дня, среди них основными являются уровень инициального лейкоцитоза, возраст пациента и иммунофенотип бластных клеток. Инициальный гиперлейкоцитоз и Т-клеточный иммунофенотип бластных клеток относятся к достаточно хорошо изученным факторам риска острого лимфобластного лейкоза у детей и коррелируют с плохим прогнозом вследствие развития большего количества рецидивов (Владимирская Е.Б. и соавт., 1997). Как с этими показателями соотносятся данные об изменении кариотипа изучено недостаточно.

В последние годы проводятся интенсивные исследования биологии опухолевого роста лейкемической опухоли. FAB-классификация не дает возможности стратифицировать заболевание по факторам риска. Такая стратификация - необходимое условие совершенствования терапии. В классификации опухолей гемопоэтической и лимфоидной тканей, предложенной ВОЗ в 1999 г. (Schoch С. et al., 2003; Harris N.L. et al., 2004; Bruning R.D. et al., 2001), на основании иммунофенотипических и цитогенетических признаков сделана попытка оценки клинических особенностей с использованием биологических характеристик опухолевого роста. Классификация ВОЗ (2001) опирается на признании основополагающего значения молекулярно-генетических событий в развитии и клиническом оформлении острый лимфобластный лейкоз. Однако в последующие годы оказалось, что представленные в классификации ВОЗ цитогенетические формы острого нелимфобластного лейкоза также не являются однородными, а включают в себя различные варианты генных мутаций.

Для некоторых наиболее часто встречаемых транслокаций выделены группы с хорошим, относительно благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Однако в каждом конкретном случае предсказание ответа на лечение является весьма трудной задачей. Только комплекс клинико-лабораторных показателей позволяет с некоторой долей вероятности сделать предположение о возможности получения ремиссии.

Актуальность изучения данной проблемы обусловлена необходимостью выяснить прогностическое значение неслучайных хромосомных аберраций в комплексе с иммунофенотипическими данными в процессе программной полихимиотерапии для их дальнейшего клинического использования.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение корреляционной взаимосвязи цитогенетических нарушений бластных клеток и их иммунофенотипических особенностей в динамике полиохимиотерапии у детей Ростовской области, больных острым лейкозом.

Задачи исследования:

1. Исследовать спектр хромосомных аберраций, встречающихся у детей в дебюте разных вариантов острого лейкоза (Т- и В-клеточные, недифференцированный, бифенотипический, из натуральных киллеров и миелоидный), в процессе терапии и при минимальной остаточной болезни;

2. Изучить изменения иммунного фенотипа бластных клеток в динамике заболевания;

3. Выявить наиболее информативные прогностические критерии развития заболевания на основе установленных корреляционных взаимоотношений между цитогенетическими и иммунофенотипическими особенностями бластных,. клеток у больных острым лейкозом.

Научная новизна темы f

- Впервые у детей Ростовской области установлены корреляционные взаимоотношения между кариотипом и иммунофенотипом бластных клеток при остром лимфобластном, остром миелоидном и других лейкозах.

- Впервые определены наиболее информативные прогностические критерии динамики заболевания, основанные на исследовании кариотипа и иммунофенотипа бластных клеток.

- Впервые показана возможность выделения больных в группы риска в плане прогноза ответа на терапию с учетом выявленных иммунофенотипических и цитогенетических особенностей лейкозного клона.

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость работы заключается в расширении представлений о спектре неслучайных хромосомных аберраций при различных вариантах острого лейкоза у детей и их значимости как в процессе лейкемизации, так и при развитии минимальной остаточной болезни и рецидива заболевания. Полученные результаты не только дополняют существующие представления, но и вносят новые аспекты в изучение патогенеза острого лейкоза у детей, позволяют до начала лечения выявлять детей с неблагоприятными факторами прогноза, отнести их к соответствующей группе риска и назначить адекватную терапию.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследований используются для диагностики и выбора терапии OJI в детском онкогематологическом центре ОДБ г. Ростова-на-Дону, а также в лекционном курсе на кафедре детских болезней №1 РостГМУ ФА ЗСР.

10

114 ВЫВОДЫ.

1. Среди OJIJI T-OJIJI является прогностически крайне неблагоприятным вариантом лейкоза с 62% летальности, прогноз которого не зависит от коэкспрессии неродственных маркеров и отсутствия хромосомных аберраций. BI вариант OJIJI является наиболее благоприятным в плане прогноза ответа на терапию вне зависимости от наличия клональных изменений бластных клеток; у больных BII OJIJI (CD 10+) ответ на терапию зависит от наличия t(9;22), нарушений длинного плеча 11 хромосомы (отягощающие факторы); а гипердиплоидность и нормальный кариотип относятся к благоприятным факторам.

2. В прогнозировании ответа на терапию при OMJI большое значение принадлежит нарушениям кариотипа бластных клеток: транслокация t(15;17)(q22;qll), предвещает хороший ответ на терапию; при t(8;21)(q22;q22) - прогноз зависит от наличия коэкспрессии CD19+ на бластных клетках миелоидной линии (его присутствие усугубляет течение заболевания); делеции del(l l)(q23); del(12)(pl3) предопределяют крайне неблагоприятное течение.

3. Рецидив заболевания у больных B-OJIJI с MRD (30,6%) и хромосомными аберрациями (48%) наблюдается чаще, чем у пациентов без MRD (11,1%) и с нормальным кариотипом (22%); смертность у больных с рецидивом заболевания достигает 86%.

4. Экспрессия бластными клетками антигена CD34+ имеет благоприятное значение для течения заболевания в случае B-OJIJI. При T-OJIJI выявление повышенной экспрессии CD34+ утяжеляет прогноз, а экспрессия CD 133+ предвещает хороший ответ на терапию.

5. При OMJI (Ml и М2) коэкспрессия CD19+, ассоциированная с t(8;21), прогностически неблагоприятна; коэкспрессия миелобластами CD34+ также прогностически неблагоприятна. При бифенотипическом OJI сочетание высокой экспрессии HLA-DR+, CD34+ с хромосомной патологией прогнозирует плохой ответ на терапию.

6. Изучение коррелятивных взаимосвязей между кариотипом и иммунофенотипом бластных клеток выявило отчетливую зависимость между нарушениями иммунофенотипа и определенными хромосомными аберрациями, а также коэкспрессией неродственных маркеров, что может быть использовано для прогнозирования ответа и выбора адекватной программы лечения.

116

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Успехи в терапии острых лейкозов у детей за последние 10 - 15 лет позволяют говорить о том, что 80% больных приходят к полному излечению. Этих результатов не могло быть без фундаментальных исследований в области биологии возникновения и развития лейкозного клона (Владимирская Е.Б. и соавт., 1991, Сергеев А.Г. др., 2000, Пономарев В.Б. и соавт., 2000, Владимирская Е.Б., 2003, Gilliland D.G. et al., 2004). Прорыв в изучении молекулярно-генетических основ канцерогенеза позволяет говорить о том, что не за горами время массовой генотерапии лейкемий. Новый препарат «Гливек», являющийся ингибитором протеинтирозинкиназы (Bcr-Abl тирозинкиназы) -аномального фермента, продуцируемого химерным геном Bcr-Abl филадельфийской хромосомы при хроническом миелолейкозе, который также подавляет пролиферацию Bcr-Abl-позитивных опухолевых клеток, индуцирует их апоптоз, является «первой ласточкой» патогномичной терапии в онкогематологии.

Для обеспечения дифференцированного подхода в терапии лейкозов есть необходимость определиться с факторами риска, в основе которых лежат биологические особенности опухолей. В течение длительного периода времени на роль определяющих факторов выдвигались различные характеристики больного организма, но так и не было выявлено определяющего фактора. Нами проведена попытка выяснить место иммунофенотипа и кариотипа бластных клеток в стратификации групп риска.

Исходя из общего плана обследования пациентов при поступлении в онкогематологичекое отделение больницы, все пациенты прошли иммунологическое обследование. В иммунограмме больных В-ОЛЛ в дебюте заболевания мы отметили повышение абсолютных и относительных показателей CD 19+ в сравнении со здоровыми детьми в 3-3,5 раза. На 36-й день ПХТ относительное содержание В-лимфоцитов понизилось, хотя и оставалось выше показателей здоровых детей, абсолютные числа упали ниже этих показателей, видимо, как следствие ПХТ.

Количество CD3+ клеток в инициальной стадии у пациентов с BII, вариантом OJI было гораздо ниже по сравнению со здоровыми, а при BI -незначительно выше во всех возрастных группах, причем падение уровня Т-клеток проявлялось в зависимости от возраста пациентов — чем старше дети, тем ниже уровень содержания. После проведения полихимиотерапии абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов приблизилось к показателям здоровых детей. Можно предположить, что такая динамика клеточного состава периферической крови обусловлена тем, что у детей младших возрастных групп отмечается большее число незрелых лимфоцитов.

Клеточный иммунитет больных T-OJIJI характеризовался понижением относительного количества Т- и В-лимфоцитов, а их абсолютные количества при этом проявляли противоположные тенденции: Т-лимфоцитов было (максимально) в 6 раз меньше чем у здоровых детей (возраст 8-16 лет), а В-лимфоцитов — в 3 меньше (возраст 8-16 лет). На 36 день терапии количество CD 19+ лимфоцитов увеличилось, как в абсолютных, так и в относительных величинах. Количество CD3+ лимфоцитов также приблизилось к показателям здоровых детей, при этом относительные значения повысились в 2,5 раза, а абсолютные снизились в 7 раз.

Иммунологический статус больных OMJ1 проявлял разные тенденции, в зависимости от варианта OJI. При OMJI-M2 варианте до начала терапии относительное содержание Т-лимфоцитов было гораздо ниже показателей здоровых детей; Ml и МЗ варианты характеризовались близкими к нормальным показателями относительного содержания, несмотря на то, что выражено снижение абсолютных значений в 1,5 раза. При этом содержание В-лимфоцитов (и абсолютное и относительное) в инициальной стадии М2 варианта было в 2 раза выше по сравнению с контрольной группой, а при Ml и МЗ - на 30% ниже. Но по окончании курса терапии относительное содержание CD 19+ достоверно не имело значительных отличий от здоровых детей.

Иммунологический статус больных лейкемией детей исследован в ряде работ как отечественных, так и зарубежных исследователей (Асланян К.С.,

2003, Бортникова О.Г., 2006, Haynes B.F.et al., 1999). Установлено наличие у них в начале заболевания нарушений в Т- и В- звеньях иммунитета, усугубляющихся агрессией лейкозного клона и ПХТ. Эти сведения нашли подтверждение и в нашей работе.

Диагностический алгоритм ОЛ основан на исследовании кариотипа и иммунофенотипа бластных клеток КМ в дебюте заболевания.

При В-клеточном ОЛЛ количество бластных клеток в пунктате КМ разнилось по вариантам от 69,1±10,3% при BI до 90,8±8,4% при BII, промежуточное значение имел ВШ вариант - 87,6±4,5%.

Иммунофенотипирование бластных клеток в дебюте заболевания проведено у всех больных. Наиболее часто на бластных клетках при В-ОЛЛ коэкспрессировались миеломаркеры CD13+ - у 20,6%, CD33+ - у 32,8%, маркер активированных клеток HLA-DR+ - у 99% больных. Реже отмечалась коэкспрессия Т-маркера CD7+ - у 11 % (рис. 1).

Рисунок 1. Экспрессия дифференцировочных маркеров в дебюте В-ОЛЛ в зависимости от течения заболевания.

Проводилось сопоставление величины и частоты экспрессии дифференцировочных маркеров у больных В-ОЛЛ. Установлено, что худший ответ на терапию сопровождался экспрессией маркера поздней активации HLA-DR+ (р<0,05) В тоже время, экспрессия таких антигенов, как, CD 13+, CD 133+ оказалась выше при более благоприятном варианте лейкоза. Антигены Т-клеточной линии CD3+, CD5+ выявлялись в обеих прогностических группах и не демонстрировали ясных для прогноза тенденций.

Из 66 больных ОЛЛ с исследованным кариотипом бластных клеток, у 29 (44%) была обнаружена хромосомная патология. Все пациенты были отнесены к В-ОЛЛ. Палитра нарушений не была неожиданной: это ряд транслокаций t(9;22)(q34;ql 1), t(4;lI)(q21;q23), t(ll;19), делеции - del(6)(q23), del(9)(p21), комплексные нарушения 46,XY,t(7;8),t(8;9),del(7). У 13 (44,8%) человек отмечена гипердиплоидность. Хуже всего ответ на терапию был у пациентов с нарушениями, затрагивающими 1 lq23 - 100% дали рецидив. На данный момент 80% пациентов с Ph хромосомой также дали рецидив. 83% больных с нормальным кариотипом находятся в стойкой ремиссии, такие же результаты лечения получены и у больных с гипердиплоидным кариотипом (рис.2). 100т

80

604020

0J □ Рецидив □ Ремиссия

Другие Гипер- llq23 t(9;22) Норма диплоид ность

Рисунок 2. Результаты терапии при разных нарушениях кариотипа у детей с В-ОЛЛ.

Хромосомная патология, отмеченная нами в ходе исследования, относится к неслучайным хромосомным перестройкам, новых аберраций мы не выявили. Так, t(9;22) и t(4; 11) входят в протокол ALL-MB-2002 как тактикоопределяющие и однозначно отнесены к группе высокого риска. При t(ll;19) могут затрагиваться разные гены, что обуславливает различную чувствительность к химиопрепаратам (Флейшман Е.В., 2001). Прогностическое значение делеции del(6)(q23) не ясно, хотя она встречается достаточно часто - в 5-10% ОЛЛ; del(9)(p21) более характерна для Т-ОЛЛ, при В-ОЛЛ группа пациентов с этой аберрацией клинически гетерогенна, что и предопределяет трудность в оценке прогностической значимости. Комплексные нарушения кариотипа предвещают худший ответ на терапию. В нашем исследовании пациент с комплексом хромосомных аберраций умер в первом рецидиве. Гипердиплоидность, как и ожидалась, исходя из данных литературы (Williams D.L. et al., 1990, Schlegelber В. et al., 1999), была благоприятна в плане прогноза - из 13 человек 11 вышли в стойкую ремиссии. Один пациент дал рецидив (бластоз в дебюте достигал 94,5%), еще один умер в ремиссии от сопутствующего заболевания, т.о. выживаемость в группе составила 84,6%.

Ни у одного пациента с В-ОЛЛ и известным кариотипом, давшим впоследствии рецидив заболевания, не выявлено коэкспрессии миелоидных маркеров. Т-лимфоидные маркеры встречены у 21% давших рецидив заболевания. Маркер стволовых клеток CD34+ был повышен у детей с разными хромосомными аберрациями, вышедших в ремиссию. Однако, при нормальном кариотипе его экспрессия оказалась выше у детей с плохим ответом на терапию.

При Т-ОЛЛ бластоз был высоким - 76,9± 15,2% (р>0,05), характеризовался разбросом по вариантам, но не столь существенным (80,1±18,6%, 72,4±9,8%, 71% при TI, TII и ТГУвариантах соответственно), как при В-ОЛЛ.

При Т-ОЛЛ только у 3 из 10 пациентов выявлена коэкспрессия стволовоклеточного маркера CD34+ и маркера активированных клеток HLA-DR+ (рис.2). Сколько-нибудь существенного повышения экспрессии миелоидных маркеров CD13+, CD33+ не отмечалось.

Сравнение экспрессии дифференцировочных маркеров при В- и Т-ОЛЛ представлено на рисунке 3.

Рисунок 3. Сравнительная характеристика экспрессии бластными клетками КМ дифференцировочных маркеров при В- и Т-ОЛЛ в дебюте.

Анализируя ответ на ПХТ детей с Т-ОЛЛ в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток мы отметили, что CD34+ экспрессировался только в группе детей с плохим ответом на терапию.

Таким образом значение данного антигена для прогноза поведения лейкозного клона различна для В- и Т-ОЛЛ: при первом он благоприятен, а во втором случае предвещает плохой исход.

О.В. Алейникова и соавт. (2001), Г.В. Коленкова (2002) отмечали, что экспрессия лимфобластами стволовоклеточных маркеров CD34+ и CD133+ характерна для детских лейкозов и ассоциирована с хорошим прогнозом при В-ОЛЛ. Характер ассоциации при Т-клеточном лейкозе оставался дискутабельным. Ранее Н.Н. Тупицын и соавт.(1998) указывали на то, что для Т-ОЛЛ взаимосвязь между иммунофенотипом и прогнозом терапии существует с «общим» антигеном CD10: отсутствие его экспрессии на бластных клетках ассоциирована с плохим прогнозом. В нашем исследовании экспрессия стволовоклеточных антигенов (CD34+, CD 133+) у детей, вышедших в ремиссию исходно значительно превышала таковые показатели здоровых детей (60,1% и 50,0% соответственно), a CD 10+ антиген не был выявлен ни у одного пациента с Т-ОЛЛ, при этом из 10 пациентов только 1 находится в стойкой ремиссии.

Из 7 больных Т-ОЛЛ, у которых был исследован кариотип бластных клеток, хромосомные аберрации не были выявлены ни в одном случае. При этом миелоидные маркеры бластными клетками не экспрессировались. Следовательно, Т-ОЛЛ следует отнести к группе высокого риска по течению заболевания.

Бифенотипический ОЛ характеризуется экспрессией маркеров неродственных клеточных линий. Высока экспрессия маркера активированных клеток HLA-DR (у 100% пациентов), стволовоклеточных CD34 (у 66,6% пациентов), CD 133 (у 33,3% пациентов). Хромосомный анализ выявил нарушения кариотипа у 2 больных из 3. Летальность в группе - 66,6%. Из умерших один ребенок имел t(9;22), другой - нормальный кариотип. Ребенок с t(9;l I)(p22;q23) вышел в ремиссию после лечения. Для бифенотипического ОЛ не выявлено ассоциаций с определенными хромосомными аберрациями, хотя Hanson С.A. et al. (1993) указывает на высокую встречаемость t(9;22), нарушений затрагивающих регион 1 lq23.

Исследование минимальной остаточной болезни весьма актуально в свете решения проблемы стойкой ремиссии. Для отслеживания MRD мы использовали только иммунофенотипирование бластных клеток по контрольным точкам протоколов терапии. Надо отметить, что сейчас для диагностики остаточного лейкозного клона применяются методы проточной цитометрии и полимеразной цепной реакции.

Из 36 человек с В-ОЛЛ, у которых была выявлена MRD, хромосомные аберрации встречены у 22 человек, CD34+ не экспрессировался ни в одном случае, экспрессия HLA-DR+ была высока у 68% больных. 11 пациентов дали рецидив, из них умерли 9. Нарушения кариотипа выявлялись у 7. Из 35 детей, не имевших MRD, в ремиссию вышли 31 человек, 9 из них имели те или иные хромосомные нарушения. CD34+экспрес сировали 56% пациентов, а экспрессия

HLA-DR+ наблюдалась у 70%. 4 человек дали впоследствии рецидив, среди них у 3 наблюдалась хромосомная патология.

Острый миелобластный лейкоз был отмечен у 17 пациентов. Смертность в это группе составила 53%. При кариотипировании хромосомные аберрации выявлены у 75% больных. В более ранних исследованиях указывается частота обнаружения хромосомной патологии - 83,3% - О.В. Алейникова (2002), S.C. Raimondi et al. (1999) -78%.

Из-за малочисленности группы мы не смогли проследить прогностических ассоциаций, однако только 50% детей с коэкспрессией Т-клеточных маркеров при Ml варианте вышли в ремиссию, при этом в кариотипе выявлена транслокация t(8;21).

Единственный ребенок с коэкспрессией CD 19+ и имевший t(8;21) умер в рецидиве. Г.В. Коленкова (2002) указывает на наличие такой прогностически неблагоприятной ассоциации при Ml и М2 вариантах. Хромосомные аберрации, отмеченные в группе с OMJI, относятся к ранее известным, неслучайным находкам (рис.4), В 100% случаях при МЗ варианте выявлена t(15;17). Прогностически благоприятная группа. Умер один ребенок в ремиссии от сопутствующего заболевания. чел. Умерли □ Всего

Без Другие 1Ц23 t(8;21) t(15;17) нарушений

Рисунок 4. Исход терапии ОМЛ при разных хромосомных аберрациях.

При анализе коррелятивных связей между исследуемыми показателями бластных клеток КМ мы получили следующие данные:

При BII варианте OJIJI корреляция между транслокацией t(9;22), нарушениями длинного плеча 11 хромосомы и риском развития рецидива заболевания достоверно высока. Гипердиплоидный кариотип предвещает хороший ответ на терапию.

При OMJI наличие транслокации t(15;17) предвещает хороший ответ на терапию, выход пациента в стадию ремиссии. Из-за малочисленности других групп (делеция длинного плеча 11 хромосомы, делеция короткого плеча 12 хромосомы) статистический анализ не представляется возможным.

Разные варианты OJI, сопровождавшиеся коэкспрессией CD34+, проявляли разные зависимости — при B-OJIJI экспрессия CD34+ предвещала хороший ответ на терапию, даже при наличии транслокации (9;22). При Т-ОЛЛ прогноз плохой. При бифенотипическом ОЛ наличие CD34+ также ассоциировано с рецидивом заболевания. v», f

Между ответом пациентов на ПХТ и экспрессией HLA-DR+ на бластных клетках мы не смогли выявить никакой зависимости.

Стволовоклеточный маркер CD 133+ экспрессировался у незначительного числа пациентов (у 14%) с О Л. В силу этого статистический анализ не возможен, однако, чаще этот маркер был отмечен у больных с хорошим ответом на терапию (вышедших в ремиссию).

Весьма интересна взаимосвязь между экспрессией бластными клетками CD19+, транслокацией t(8;21) и рецидивом заболевания при Ml и М2 вариантах ОМЛ. В нашем исследовании только 1 ребенок имел такое сочетание признаков. Он дал рецидив заболевания. Двое детей с данной транслокацией, но без экспрессии CD 19+ находятся в ремиссии.

Н АРУ

НИЯ КАРХОТИПА

НЕБЛ А

Г О П Р И Я Т Н Ы И

ИСХОД

Рисунок 5. Вероятность неблагоприятного исхода заболевания при ОЛЛ с CD 10+ иммунофенотипом.

Выявление Филадельфийской хромосомы в дебюте В-ОЛЛ в 80% случаев сопровождается рецидивом заболевания с летальным исходом. MRD не была выявлена ни в одном случае. Нарушения длинного плеча 1 lq23 (транслокации с разными хромосомами партнерами) в 100% при В-ОЛЛ сопровождаются рецидивом заболевания и 50% летальностью. MRD сопровождала более благоприятный исход - ребенок находится во второй ремиссии. При гипердиплоидности у детей с В-ОЛЛ в 14% случаев наблюдался неблагоприятный исход - один ребенок умер в ремиссии, другой - в первом рецидиве. 22% детей с гипердиплоидностью имели MRD на 36-й день ПХТ. При наличии кариотипа без нарушений, 20% больных дали ранний рецидив, летальность в котором составила 75%. MRD была отмечена у 45% больных этой группы. Из них 22% дали рецидив, летальность достигла 100% (рис.5).

Прогностически благоприятным признаком при ОМЛ оказалось наличие t(15;17) (только 20% больных имели неблагоприятный исход), нормальный кариотип нельзя столь однозначно отнести к прогностически значимым данным, t(8;21), как показал анализ, нельзя оценивать в отрыве от результатов иммунофенотипирования. нарушения длинного плеча 11 хромосомы проявляют негативную тенденцию в плане прогноза, но однозначно оценить не представляется возможным из-за малочисленности выборки (рис.6).

Рисунок 6. Вероятность неблагоприятного исхода заболевания при ОМЛ.

Таким образом, изучение коррелятивных взаимосвязей между кариотипом и иммунофенотипом бластных клеток выявило отчетливую зависимость между нарушениями фенотипа и определенными хромосомными аберрациями, а также коэкспрессией неродственных маркеров. Проведенное исследование способствует прогнозированию развития заболевания, выбору адекватной программы лечения, а динамическое наблюдение позволяет переводить лечение больных на программы высокого риска в случаях появления новых отягощающих признаков ухудшения течения заболевания (MRD, новые хромосомные аберрации, рецидив заболевания и др.).