Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Усовершенствование лабораторной диагностики холеры с помощью антиэнтеротоксических моноклональных антител

РГб од

- 8 ОКТ 1996

На правах рукописи

АЛЕКС21Л Татьяна Едапя-сгрозка

Ш5ЕЕРШИТ302ДЕЕ ЛЛЕСРЛТОРКО:! дгшкосягнки ЯОЛЕРа С пс;?012;!0 НШеШЕРОТОКСГ-пСИСС ГЗЗПСКЛСПАШКК /-'ГПГГЕЛ

14.00.26. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ '

- диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1995

Работа кагрлиенЕ в Российском ваучпо-ЕссдедоБательском п;'07исочуииом институте "Квкроб".

Научный руководитель - доктор медицинских наук, старзий

научный сотрудиак Девдарканп З.Л.

Официальные оппонснти: доктор »ельцинских паук, старанй

научный сотрудник Дятлов И.А.; кандидат мвдv.uuucxnx всук, старанн научаий сотрудник Адакоаа Г.В.

Ведущая организация - Волгогрздсц^к ваучво-ксследоватедь-скпй сгротяаочукаий пвсгкгут. -

ЛаторЕ-.гарат разослав "ЛО "сгд^Стй 1996 г.

Ззц:;та диссертации состоится " £ "1 &0 /

IT . ___

1.199b r.

часов из заседании диссертационного совета К 074.32.01 по зацпте диссзртацнп ¡ia соисхание ученой стссет; кандидата медицинских паук при Российском пйучно-исследозатсльсхоя протквочум-поя институте "Ц'.схроб" (410005, г.Саратов, Упкверсктетскаи, 46).

С Диссертацией ног:но ознакомиться е иаучвой библиотеке института "Иакроб".

<а '■

'Учений секретарь дассертацнопного совета, доктор игдицнисксх гзаук,

стара;¡í; научный сотрудник З.Л. Дэвдарианк

АКТУАЛЬНОСТЬ З'ОЕЛЕГ.г. Сбострипвачся ситуация по холере как з срнгранмчнлх государстялх, глк i з самой 1'оссмн, лхтлпн-ля м«-грацнл (заселения з сплзл с чезнапчоналы:и;и( конфликтами 'i раз-зйгнйи рыночной экономию" , ух/дпнмк неся соцлгльчо-^коночкчесхче •'словня зизял лрчдллт ';ре з глчл м нуп акту альность л л с б лс л я лпое?з-оемениого обкч^узяичя ¡¡"чоудителя л оаслкя чго ->якде!!иологнч<зс-кол з наччн ости . Она сводится к определен1;;} слсссблостп ^-'деленного гтаиял продупчроллть теомолабяльнаЗ энтспотоксмп (ЗТ), яв-ляягзился осног-.пым фактором в:]рул ллт^ос?;! л-- -:< !зиорио1тоз и зузиааял;'. ч ргзэ( ггие х.лглхтерлог л для хотел-: с ■ л' •: л л -- о лом п л л лс :1 {5френенко З.И. ,1583; Лыиоа -..<. ч ссаат. , 1 334; Заааиук 2.3. , '''35; Покроесх.":; 'd . *!. з солит 1 908 i . Определение тохр и нолЬо.*; у л -■п.! у хплерлых пнбрчоноа леебхо д и .-.о тзкяо з нсследозательскнх работах для выяпленлл гüотолслrs- ¡¡лих субкультур природных лтлимол, и лроаессе создллия рехомбиллнтпих птлм<'ол-г!!перлроду-•.!<!.! то в кл ос::о'3о геллсл ллл л'лрлн с целью получения токсика з лр^ллрлтнлных "чолылеотллх , ■ тлл но л о г м >: л о:?, тл ул : >л> л ' л " л р о -

(злсдстеа лооих за.члнн .

■Лу'5ecTnyr;:j;io -етодц обсаругення холерлого гл'ксллл { Л Л, : : л-1 о г и ч е с к и е , цитологические, HMfiy .ч о д л; ;;у s л и л лл е , ' л л у л с с с л г? но л ~ •ммий и : р . , з м л ■■■г ■) л л лелостаткоЕ , сое-л; которых - : - с л л л з л у г ■ юсть ¡особенно лрн работе о 1нпот:-и.Ч1-) , недостаточная чуг.стчн-тсльность, частота зол ис ": с п ;лх л i л л . ллн-

тсльяост*.- п ро г, од с л нл <(iis.'!!'ia л I: :д л л г.:: л 3 о - л; л ч : с т л-. .'л з -^абот.^лн не з последит; г'' л: ? ' ■ ол ч л с:<л л л л т л л л л к у л л ■ ? -

ТОДЧ ЛЙДНХаЦКП л Т и г л м а то лсипообпл з оволптя , тл:ле л л л :: л~ 1 л л дпрсвзпие. ПОР, ТЛКЛ. РИА, лс- уд'-'л^ет"лзявт золаостьп как науч-¡шх работников, так я спецяахистэп практического здравоохрлна-чнл. Ло-проаиеиу сохраняется кеоокодкяость в лсслзл.х, дешозиа : окспрессиых четода.х дабораторяой дкаглосткки тс л с игев;п:х ^тлм-KOS Еозбудател:! холеру :ä.i основе ,болсс иямунораа-

гентоа, л которнк а c^psys счеррдь относятся чопоклональниа а.ч-тятеаа (НКА ).

Хорвсая лрокзЕодктелчность, экономичность, простота аоста-ловкя и учета реакикк и сочетали;! с внеокой чувстпительнсст!» и специфячностьп. особенно прк испольлоьаняк НКЛ, вигодис отличают гимунофермектный анализ (П4А) от других диагностических тестов [Воробьев A.A. с соавт.,1?37; Зыкпп Д.О. с соавт., 1992].

Вместе с тек кммуноферментние коиоклокальвме днагностнкумы нуг-даптск ь соверкеиствопанин к расвиреник сферы научно-практического применения.

Набор антиэктеротоксичесхих ККА, направленных к различным эпитопам XT, являясь чрезвычайно чувствительным иммунобиологическим инструментом, моает бить использован как для изучения тонкой аитигениок структуры нативной молекулы IT, так и для контроля за ее изменениями, возникаввими в процессе очистки препарата и на этапах производства содержащих его днагвостккунов и вакцин.

По имег.лкмся в литературе данным секрецнк токсина предвест-вует его экспрессия на нарукной мембране холерного вибриона [Авакиц A.A. с соавт., 1S72; Адамов А.К. с соавт., 1S84; Hirst Т.Р.. et al., 1964, 1984, 1987]. Этот феномен до сих пор не бил реализован в полкой мере при разработке экспресс-методов обнаружения токснгенных стаимов холерного вибриона на ранних этапах лабораторной диагностики холеры. Мспояьзпваине дли этих селе:: ант;!энтеротоксическнх ККА является наиболее перспективным.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Усовершенствование методов определения холерного токсина к тохсигениих стаимов холерного вибриона с использованием аятиэнтеротокс!1ческ1:х ИХЛ.

ЙЛДАЧ'Л ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить опткпалькае условия гибридизации снленоцнтов, ехенн I' дозы иммунизации ииаей для получения максимального i:c-аичсстиа гибридом, продуцкруюкпх НКА к холерному токсину и его Ь суббеднниве (МКА-СБ).

2. Пронести икмуиохимкчесхий ü эпитопкын анализ аптиэнтеро-токсьческпх НКА.

3. Довести сравнительное изучение эффективности различных вариантов инкуноферменткого анализа для детекции•холерного токсина.

4. Разработать способ определения in vitro активности холе-рогеыа, входящего в состав таблетированной холерной вакцины и вакцины холероген-анатоксия+О-антнген.

5. Изучить эффективность использования нммуноферыеитной тест-системы на основе ИКА-СВ для характеристики природных к генно-

-!г:.»перг::х гта^яо^-зрчдуаезтос. холараого токсаяа.

6. Onpor.n a¿rri, с norot'bfí :?Г..\-С3 ?. ui'CTio.i.Tisínossoú чиу.р'З з?п <S2H ) »o'.ivsoro згзотохсззг л рапс riß с?ох.> гужьтгизровапя« хозер«ого

7. Усосярчсяст'ю^гть з-/.г.г_рясс-Д1;аг':сст"ку тггксягаяяц" воз5у*.г.тела хозср!7 о Чсзс.-ьаоЕавгеи Ляусрес/ируацяг -. т;?.. Рчаргботать увп^г'л.грсга.гггй «^мпасз-т rrcriepîïi-x «лиостпро-

?охс»<!«5Сж«з: 'M'A »пз nocîCîTosss Олусгпсг.зруэтаг"« гит'П"!?

: ; л.

плгтгАг; лошсал п знлпглсст:. îasot". годами

'«бтеагонгой 5сотвхпологпя яолучев яабср MRA к В суСъвда »aun XT '■лл^чяой чвг.7опео® г.аграах.еагостп, с я отцы которого усоарр-епствовача эксаресс-дяагЕостаха тс- скпЕродуд1 - уоднх атак.-.иа 'oaSyjBTerr холер::. Ваерз'-е с r.nurv:-,-:-, аг.ггагатеротоксячсст.пз ИКА i К?Н спр»д°лг:па ло:;зг~за л л я 2250то::сгза в

сбряояоз з раапв» срока -yni.TsaapotaaïE. Соэлааа :: успевяо тс-итсяа упвгереал^г.ап cxi-kä го-гурсц-гаого Я' A sas анзЕЯоаяг хо-актгTosc^noo з сизсргглк я бпогсгзческвх хгизмсстл л

кг.отиих л згией, гоглрпасгл.т лсгильзсЕалпе азтпвядоги^: -

глтоп.. Изучена ловзя с'ерл плуттго-прлктг'гесгюго пр:::;гг):е->?1!~' за-п.-;втеретоксп,!ескзх свгзаллая с хараг.-/ерг,стяко£ гевпоас^е—

орпчя лта.^.'ов мЕгг-'оорглллзисл, продтцелтсгз лолорлогг; то^сллл ^

ептрода актпакостг хогерлпх гагс::тт. Яраоршгстгк»«: яслте-гсл лзработкк ггтодягг р.-.лпсго с re р л т: к к г.- voire"пс.чродухг;!'!:! у дгакчоч эзбудптел« логергл а пс^пгг*^ !!Сл а дс.т—¡П'.музоаЕй.'ггза {ДПЛ). зереие де:газе.ва вознояиссть взггаюзакоигхекосгв vsçanux 'jsyc-•зхропеч кл'л 6;рнР!ГТоК~Д х 3 суоьедппгтц..- scju-omrc

згечча для ирозадэяяя ПСА (ДЗТА ) ел,- всстггопгс MOA :: :сть сеголЬ5Рсг.ккя асттгзЕтсротаксяческизс зптл-тел с десйлоп ïTUoa. Опревеяеиь фггтора, гегкгг^цге эффсствзвость г;:брпд"г-,ч~ :л я угялрчЕзгпзнв колчпгстро апт лте.тосродуцпруп^их глбрпдегг.

По .-та'герпалз!; зпсссртадлп со^талл е:ш п утверждая!! директор;.:! >С1ШПЧЯ "Чвкроб" "Четодлчоскяа релаггзлдапял ао оярпдедое.о яу-огог: тзхенла я его Е-суиъедгпкгг.: с scnoibSOBaasoíS сонокла-.-л.аптлт-зл a i>r-nvncâep4«:irT^CTi аиахк-»«" (протокол Sil эт .12.33 г.). .'¡стсдлчес-гз разрабогжг ups

мни научных исследовании, с лабораториях ГосНКПЧИ "Микроб", ъ работе' СЯЭБоп. п при эп:;дениолог!!ческом ыонигоркиге.

Д<1Г0!>АСИЯ 1'АБЭТН. Материалы диссертации били представлеии v дологани на: 2-ой Всесовзиои конфаргнцки "Бактериальные токси-ни" (К'раала, Латвия, 1989); рабочем совещании по гибридокно". биотехнологии (1'остов-н/Д, 1989 ); кеггосударстьеииои пауч-¡;о-;:рактнческой конференции "Актуальные попроси профилактика чуни и других ввфехсциокных заболеваний", посвкаеипой 100-летиг. открытия возбудителя чуки (Ставрополь, 1594); научной ксафорен-ци;: РосНИЗЧ!) " JUiKpoC)'', пиСЕяценнси 100-латиз памяти Л. Пастера (Саратоз, 1995); областной конференции "Проблемы новаторской деятельности ученых, изобретателей и других тпорчоекпх работников ь условиях рс.^0р1;к:-э!1а!1кл экономик!:" 16 апреля 19S6 г., Саратов, 1996.

ilaTtp^iJiL; диссертации нспальзузтея при чтении лекции по гиб-рндемнеп биотехнологии па курсах специализации к усоверсепство-Ьаш.з грачей n Спологоз во особо опасным инфекциям г.рь 1-осККЯЧИ "Кикроб".'

Диссе^-г&ццг» обсуждена i: одобрена ;:а иозлзбораторкоГ. научной ЛйОорагоркп г::бридом РосКИЯЧП "Микроб".

ЛУТгЛЦКЛКгП. Со ';-с;:г дисссрт<_цц;: о&уб&скоаасо £' работ.

CHlHi. СТ;i'iCii'1'A ГЛНОГ". Дясесртац.'и состоит кс ььедския и com: г;«, г, 'содер-ачих обзе/ литсратури, спкс&хис. интервалов ! методов, результатов собственных нсс::едцьаппй, зсг.;;:очы'::к, выводов 'и OwuKKOrpaiнческого указатедя> Обний объем дисссртацк:: 2ДУ страниц. Работа сро".ллвстр;:роБа.ча 22 таблицами и 23 рисунками. Библиографпчьсккп указатель ссдергат 403 источника, пг них Зч/'зарубвгвих'.

0С5202.ЕЗЕ ПОЗОГЕЗоЯ, ВЕНОСПКЗЕ НА 3&53ТУ.

1. Нопоклональпне антитела к В субьедг.пкце холерного тохеппь реагируют с различными ЭЕИтспаии, ?асвояо:евиш:и на Е-СЕ зяте-ротокеггна холерных аабриоиов обоих б.чо- п соровариантов.

2. Ециунсфернентпая тест-система на основе ионоклокалышх антител к В-СЕ холерного токсияа позволяет обнаруживать 0,1-0,5

чкг/мгг •голерогена з сред'; культивирования я 9х!0! КОЕ/хл токси-ганннх зтанмов холерного аибриона.

3. ХТ , экппресс!!оуюгп1'!с5 з промессе зыраиивани.ч на >(аружяой клеточной чечбраме, выявляется ч ИЭМ с чомиаьо МКА-СВ.

Холерные эмбрионы, продуцнругаиие токсяи, маяно амяяить методом флуоресцмрувакх антител с тмоаьо чечеяых флуорохро-мои (Р1ТС-ЧКА-СЗ) я немячеяих МКА-СЗ яа раинпх этапах варапчва-я и я

5. Проблену унифицирования препаратов мозно рейзть, используя кон-ъюгаты Р1ТС-МКА-СВ в непрямых вариантах ИФА и ДИА, а меченые ферментом МКА-СВ (МКА-СВ") в непрямом МФА. Золее того, зозмохно создание конъюгатов МКА-СВ с двойной меткой.

6. С иомопьв иммуноферментнон тест-системы на основе МКА-СВ возможно определение активности холерных вакцин, а также токси-нопродукцируюцеи способности генноинженерных зтаммов и ятамнов холерных вибрионов, выделенных при зпидмониторинге.

7. Подбор схем иммунизации, синхронизация митоза алазмоци-томных клеток, комбинирование культуральных сред (КС), добавление в них мыоиной сыворотки или зспитической жидкости (АХ), а также дрожжевого супернатанта позволяет значительно ускорить процесс получения гябридон. сократить сроки скрининга п клопи-ро&аиия, а. также увеличить количество антителопроДуцируюйвх г ибридом.

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ■

Г! работе эчли использованы 311 атамнов холерного вибриона а 72 ятамма других представителе:« семейства из

Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (РосНИПЧП 'Мякроб".) , а тем числе ■»•экелгепных зтачна V. сЬп1е?ге Сясаз—З, 7. сЬо1егае 0лсса-?5, 7. :по1згзе ¿-39. 7. сЬо1агге 3-1307, дибез-:!о предоставление док-1. тнол. наук Н.Л. Смирновой.

Слияние якнунинх ?ядгноцитов с клетками мчяянол ялазчоцитома Я о2/0-А,-;. 1 V чнлузиртлали обработкой пояичтцленгликолем (ПЭГ) ,;00 то чч*»!» п-з Я.С. л 1. [1979] з модификации .»иЬЪ

г ,, . : 1 "зппаг г. ег а1. ¡.1и35], л гакхе ПЭГ ¿000 по

ЧоЯаггЦу С.-1. еЬ а!. [1935] я ЗбИЬзг 2. <11 а1. [19851.

Основными методами чммуиохямического анализа являлись Н®А,

- £ -

ДНА, £г»А, ЕОК', зсгився дис£вой 'лииуттдлС-^тзпг в геле (РДЦД), ь таг.^с иае;:трс^ораз а икмуиойаот-гвзг .

II. СОДЕРЕлКГ.- РАБОТЫ

Пз ргоочс;рсД1.и:; эг.1-0.-'. ■доел ось до .¡.у'-¡ей ге СС1; ег

Г5. ьра доя, продуукрузцих НКл к Е субгедгваце ХТ.

"7 ДЕлгетсз сцдькн:-< ь млуВС геко-ч, однак о тогеичеа Д£5 бе

НИИ си , о с о 0 и н к о и р а у по'-' £ ваутрвб р.'^ьинои ^СДСНЕ!;

хреж. того, сг.особе1: пгать Кй.^ с л^тс? ьп^с ватгпор-^одог^чес

ЕЗЫЫ'. ъег,' з оргак-х к т ке :::.х гтнх аисотках [^г.пгрцдзэ К.К.

с о гг.т . , 19е7]. -¡з одьич адцата ¿.'слитакзых н пка протоколов сн !<у-

икзаасв «етнре оказались зедбод« с э?<,»гктив1:кма длл Еолу-^ца? Ы1т!:т елокюдуцц'.-, гз6р1:до:. - характеркзог.сдысь неодно^рс.т-

ввид^аасл ::с6од<,«»х доз апткгеца, ддатедьацм ьитераало«-иегду Барвои а второй акумзаамвк, с^одиокрагцииа, с ч^редо-аапиеЕ', оиутриогикцх в псутра^раоичкых сиъеквиЗ. бустервия:; прк-с'дздс.мв ь течоиг.е г-ссгс- арэд^узисквеге аергода.

Известно, что одикп жз ^актороь, врзсадяпих » сбразованкь стаОилышх гибридом, гвааетс« иахохдеаае ивилонввз клеток ь мс-'искт едпзвия в 1о£~Сазе роста. Литературные даиние, сЕ.ндете^ь-стЕуиг^ие с СЕОсобности мктогеков синхронизировать кдеточ!;^.-. цикл ь иета^азе [Адаис Г., 4983], а о с :< у а а г,.. основанием их сраме-¡1С1.;:я ври получекзз стабильных гибридом. Ваилучвив зффект оказывало добавление колхицина или колценедг в среду культпаяровг-«ыя ыиеяойздх клеток ь концентрациях 0,1 икг/мл а 0,3 ыкг/ыд, соответственно, за 14-16 часок до габридизацнк сосызаасее ее эффективность в 3,4 а 3,2 раза.

Ислользоаанний нами ораен рззморахнваннд с удаленней крнос-

реды сразу после оттанваккя кратковременным центрифугированием, О

с последуоцик аоиеБеивеы клеток.в рсстовуо среду возводил добиться высокой сакиваеиости клеток, которая в среднем составила 85 Из 78 аититслопродуцкруицкх гибридом после аервнчного

клонирования были отобраны 16 наиболее стабильвих кяонов, вро-дуцируваих МКА к препаратам очищенного ХТ. После повторного клонирование наиболее стабильных при хранении гвЬридоа, било получено 29 субклонов, которые во специфичности продуцируемых МКА разделились из 3 группы: 1). положительно реагируете в И4А

- о -

с препаратами ХТ я В-СЕ; 2). рэагкруваие только о D-CE , что свидетельствовало об их направленности к эпитопам 3-СЕ, сбнару-зиваащимся только посла диссоциации молекула голотоксина; 3). реагирующие только .с цельным холернчм токсином.

С А-субъединицей (A-CE) ХТ реагировали псе МКА третьей группы и ККА трех гибридом перяой группы, что юдтпергдало литературные данные о наличии обзих антигенных детерминант на и В-СГ [Адамов А.К. с соавт.,1984 ; Holmgren J.at al.,1980; Heines R.K.et al., 1933].

В соответствии с поставленной целъя, дальнейшие исследования проводились с гнбридомамн первой группу. Инокулирозанные з ор-гзнизн праймиропанных пристаном мыпек линии BALB/c 4 гнбридочи развивались а виде солидных, остальное - в виде асцитких опухолей. Специфическая активности•42 n Н5А составляла з среднем 1:200000. Стабильными я наиболее активными к.лс in vitro, Tax и in vivo являлись 5 гибридом (б-^о, /ее, 7fi , 4е? , 5h«), причем индуцируемая ими A3 носила геморрагический характер. Пммунсхи— мический анализ МКА полученных гибридом показал, ■ что все они относятся к классу I^G, из ¡п;х две гибридонн продуцировали Ig подкласса Сы , три - подкласса Gl , остальные МКА относились г. подклассу Gj. Определение функциональной аффинности методом последовательного разновесного связывания выявило 7 МКА, васо-кбаффинных к 3-СЕ холерного токсина. 5 гибридом продуцировали IÍKA, проявлявшие иммуиологичесхутэ ахтчвность хзх в реакции агглютинации, так н в ?ДПЛ, что свидетельствовало об их сродстве к повторяющимся эпитопам В-СЕ, МКА 5-ти других гибридом были специфичны к единичным эячтолзм. Гпбридомы 6g9 , 7ее , 7Í9 , ¿е» и 5h« продуцировали' МКА к антигенным детерминантам Б-СЕ ХТ обоих био- и серовариантов и не давали перекрестных реакций с тохени-содергапями субстратами всех изученных энтерояатогеанпх микроорганизмов, за исключением отдельных энтеропатогенных вибрионов, например, V.cholегзе 0139 поп 01, энтеротоксини которых содержали зпитопн, гомологичные перечисленным 1'ХА-СЗ.

С пЬмояьв ЯФА-адднтявного теста определена, простргпстпепцал организация опитопоз на 3-СЕ ХТ, комплементарных МКА-СВ (Рис.1!.

При предварительном изучении различных способов аиделенм'.-МКА-СЗ из КС я AI ( каярилово-а.члочий-чий, гель-ойльтрацчя л^ jephadex 0-200, осазденне ПЭГ 60G0 я сульфатом акггояяя) пред-

¿89 719 /еь

4а.

1. С.:;г.на гнч ссхое изображение- пространственной организации опвтопов, расг,озцаваек:гх НКЛ г. В субъедивг.пе ХТ-569Б.

г.очты:не отдано последнему из них, как наиболее экономич-

ному к простому. Ахтиипесть г.о белку очИЕенкых этим способом К.ЧЛ-СВ составляла 0,144+0,11 ¡::;г/):л.

Ос:1звцы;< компонентом псвоклокаяьцоЁ викуг.оферкептьо* тест-спстсиа для сиркиаига :Л в его В-СЕ являйте» мгчеиие ЦКА-СЬ. Пии к било приготовлено 10 серий ссрокслд&зцых ко^ъпгатов с рабочий разведением 1:200000-1 :500000 к высокой ферневтатпепо;. актнЕПОсч-ыа. Анализ прямого и ненрдного вариантов постановки Н0А с МКА-Си, а так»;; подбор условий сонспбилазац!::; плаксетсг. антителам'.: или аптигеиг.1:и и .разнообразных схон сроиедения анализа, г!о;:азал, что все они пригодны для скрининга !Т, однако наиболее чуас-'зчтсльним без кодификации полимерной поверхности слагзпетои лплястсг сэндвич-вариант с кинобЕЛизосанкымн поликло-палыгх;!!;; антителами, а наиболее специфичным - сэндсич-ПФА с разнозпиговишл' ИКА-СБ. На основе Ш'.А гибридом , 7сс и 7f^> была разработана гл.тпэитеротоиснчесхая нококлопаг.:.'^« тест-свс-тсаа !!ФА, позеолк;~ ;ая обнаруживать свободней ХТ ;;л;. его Б-СЕ £ прямом У.:<л с 10-20 нкг/кл, ь сеадскч- варкаите с

раз:.*оэпнтошшнп МКА-СЕ - 0.2-0.5 иг/ил, в сэидзпч-КЭА с ¡¡»шоби-сизозЗци-оШп сояццвонааькцяи 1л:цуиоглобулкиаин и нечетки ККА-СС -0.1 г.г/мп, а тзкпе токсин, лохалнэов2;,пя;п на иаруявоь кекбра-пе холерного вибриона, при концентрации клеток 9х105 КОЕ/кл.

ИзвЙтно, что хкничеекке п физические агенты, киактивирувцке холерный токсин, существенно влияют на его структуру, позтоиу анатокенвообргзоиание сопровождается не только потерей токсичности, но к определенной денатурацией белковой молекулы. Учитывая Ениеизложенпос, очевидна пагность эффективного контроля еь-тигевкой структуры холерогсиа-анатоксина в процессе производства холерной вакцины и ее хранения.

Располагая наборок ИКА, кояпленентарнун различном эпктопам

ХТ, ми провели анализ структурных изменений зго антигекак:: детерминант, происходящих а процессе анатоксинообразования. Установлено, что при воздействии формалином утрачивались эпнтспи, детектируемые МКА-СЗ 7fg н неь, и че изменялись эпитопи гомологичные МКА-СЗ,6з9, 7ei и 4а* , л наиболее чувствительными ;с инактивируюзему воздействии леици^нетилолъ 1ы;с групп ! Заворотнах З.Н., 1994) являлись эцитопы, комплементарные МКЛ-^З 5цд и 4es .

Определение активное, н холерного токсина и холерогена-анаток-сина, пходяаего в состав вакцин, в соотзетствии с действующей нормгтивно-технмчесхои документации, преполагает Использование лабораторных хивотных ;*. является процедурой трудоемкой и лес-тзял 1РТНОЙ. Проведенные эксперимента по изучение влияния условии хранения на активность ХТ показали, что зри неязменяяяейся чонцс.чтрацни белка з неблагоприятна* условиях хршения титры в снижались. Этот факт позволил предположить, что л ЯФА с ло-чилыэ МКА-СЗ удается определять не просто белкову-а концентрация ХТ, а концентрацию его биологически активных .чолекут, то есть активность холерогена. Для доказательства зозмошого чсцользо-пання антиэнтеротоксичесхой .чонок^омал.ьнаи тгзст-снстемц ЛЭА с цельп определения активности холерном г.акцины было исследоЕано 36 серии пероральной и парэнтералькой вакцин (Табл. 1.' и. 9 серий препаратов холерного тохсикг к.~» раз лих этапах его производственного получения (Табл. 2). Реэультатч лроведеяных исследований свидетельствовали о корреляция данных HÍA с МКА-03, К02Я0.! зробц по -лрейгу и ?Д!'Д с яронз зодстяечно;} .¡.¡тятокситнс-коя сыппротхой, а, следовательно, о позкочности ч длдеслоб олз-кости замени дорогостоящих проб ла жизотпих при лпредел'Злнн активности холерных вакцин на И4А с использование:« антиэптеротох-сячесхих ЯКА, отличассипся эхонокччвостьп, зоспроизподчмеетт.п, объективность« и достаточно высокой информативностью.

Молекулярная геиетика открывает знрекие лерсч-'ктпгл; а ллле конструирования .закцин я атаммов-срсдуаечтоэ. Рлзрзлл - лпая на ми тест-система г1ФА ча основе МКА-СЗ ^олволяет быстро ■ обълк-тивно характеризовать токсинонродуцируючие езойотца злилоинже-лерных птамноа, что было установлено аря сравнении л.'эечтлвнес-ти регистрация гокенноцродукцни и с ход.; ах л •¡.«-ксчби:. .л п:ых лтам-мов с покопьа реакции пассивного иммунного г.ляол» ла (РПЛГ), с лошой пробе по Крейгу к в сондвич-ЙФА с МКА-СВ. ?езуль гага ко-

Таблица 1.

Результаты определения активности холерных вакцин к токсина в сэндвич ИФА с МКА-СВ

NN серии препаратов Концентрация белка,мг/мл Активность D ЕС Обратные титра антител

РДИД НСА

Холероге гн-аиатокси] + 0-антиге!

77 2 12 000' 8 12 800

78 2 • 10 000 4-8 10 240

3 2 3 000 2 3 200

02 2 20 000 16-32 20 480

05 2 17 500 12 17 010

66 2 15 000 8 16 000

74 2 8 000 6 8 000

51/196 5 6 000 2-4 640

60 5 ве активна - 16

40/93 5 2 500 2 2 560

32/77 5 2 500 Ц-2 2 600

60 5 4 000 2 4 260

81 5 4 000 2-4 5 120

73 5 1 000 Ц 1 024

025/1 2 6 000 ' 4 640

. 5 2 12 000 16 14 500

98 2 25 000 32 32 000

88 5 10 000 16 10 400

Бивалентная таблетированиая вакцина

08 10 410, 6 ' 110 000^ 16 102 400

2 - п _ 120 ООО3 32 153 600

3 - " - 120 000 32 154 000

027 - " - 40 000 4-8 32 000

04 - и __ 100 000 16- 64 000

06 — м- _ 120 000 32 128 000

07 - _ 120 000 32 154 200

08 - н _ 120 000 32 141 100

011 - 100 000 16 - 96 000

013 - " - 100 000 8-16 64 000

015 - " - 120 000 16 150 000

016 ■ - 120 000 32 147 000

01 - 100 ООО 16 68 000

02 -- " - 100 000 16 64 000

03 - " - 100 000 8-16 64 000

05 ■ - " - 120 000 32 153 600

Усовераенс-

вованная 20 ,6+0, Е 150 000+ 32 184 000

вакцина* 10 000

йримечание: 1 - Активность в ЕС 1 мг белка;

2 - Активность в ЕС.1 таблетки.

3 - Содержание ХТ в 1 таблетке;

¿, - усовераенствованная перорсльная таблети-рованная холерная вакцина (Елисеев З.В., 1994).

Таблица 2.

Результаты определения активности холерного токсина и токсина в сэндвич ИФА с МКА-СЕ

1 I NN серий 1 1........ I........ "" Концентрация|Активность|Обратные ......1 тптри антител!

| препаратов белка,Mf/мл | в ЕС* |- 1

I ' I РДИД ! ИФА | ' !

1 1 Холерннй токсин 1 !

¡0С05 тест- 1 I- 1

| токсин 4 0 1 « 500 | 4 ! 2 560 |

| 199 1 ,2 1 1 ООО | 2 1 2 048 |

| 2/90 0 57 I 1 ООО | 2 1 2 048 |

| 91-6 1 б I 2 ООО | 2 | 1 024 |

| 1/91-6 1 О О ! 2 ООО j 2 I 2 043 |

|ХТ "Signa" 1 0 I 2 ООО | 4 I 2 560 |

I ^ 0 9 I « ООО | 4 I з 200 |

| 7 J 2 I 1 ООО | 2 I 1 024 |

I 17 4 5 I 8 t ООО | I 2 I 25 X 120 | !

Примечание: " - Активность в ЕС 1 иг белка; личественного определения токсянопродукции.в И4А совпадали с результатами РПИГ и кояной пробы. Полученные даннне позволили применить ИФА и ДИА для оценки тохсинопродукцян "при создании зтамнов гиперпродуцентов ХТ и его В-СЕ на основе атамнов У.с1ю-1егае 569В и V,сЬо1егае 1601 1^тем введения конгпгативних плаз-мид рС0107-2 и р1ЕМЗ, -соответственно.

Степень вирулентности выделенных итаммов возбудителя холеру обычно оценивагат по гемолитической активности, фаговому тесту и лить выборочно определяют холерогенные свойства на лабораторных 2ивотных, так как подобные исследования не всегда возможны в полевых условиях. Поэтому возникает необходимость использовать сростио и более точные методы определепня токсигенности, поэво-лязщае одновременно исследовать значительное число культур или субкультур, способствугцне выявлению аоауляцйонной •зеоднород-иости холерных вибрионов по признаку токснгенностн, что инеет принпипнально важное значение при оцвиже ах эпядемиояогаческой

опасности. Разработанная нами тест-система HíA ка основе НКА-СВ полностью отвечает всен этин требованиям и может с успехом прн-меняться для эпидемиологического мониторинга. С ое помощью била изучена токснноародукния у 302 птгнна холерных вибрионов, выде-лепних в различных регионах России и стран СНГ.

В неблагополучных по холере районах дли прогнозирования си-Т"~нкк рмеет существенное значении обнаружение е сыворотке ли-z 'í \*1 антитоксинов, так как, они ре гнстрнруются б высоких титрах, ¡гр.-.г.ило, за 1,5-2 месяца до начала вспыпкн и их обнаружение совладает с чернодом изолкцни ;-п коды открытых водоемов виру' ■ : ¡ т н и х генолизотрацател1.:ыч культур I Зыкин Д.Ф. , 1S92J. Кроне того, обнаружение антител ^ ХТ несводимо в зкепернмеч глльнои "■-Сок?. i; для оценки иммуиогечност.ч разрабатываемых холерных :.¡.:uh:i. Среди ккто."оя определения днтитокекчесьнх .uitii'pb все '.•¡Л'!р енрекое распространен!!а погучазт ИФА. Однако асе предло--r.'-j-.-t cxrr.u неконкурентного Ki-Л длл обнаружения антител пред-

Таблица 2.

Определение уровня хслерг.ь,.-; ант1:э;>теротсхскческкх лнтнтел ь св'Еоротьах крови я гопогекатах кипечкнка экспериментальных животных

i 1 1 ¡Оид Иссяедуели; i j Е с о г о и с - |И4Л с актиниде HíA. I с НКА-СВ |

i i: / II! б и т и о г о чзтериал |следовано I зьш конъогато-í • ' I

г 1 v i !образцов I"--1--J i i

¡ | 1 ¡ Кол-I Обратные, К г л — ¡Обратные |

! ! 1 | во ¡ титры во | тктры ¡

! 1 1 1 | поло|антител поло I антител |

\ i 1 1 j xl't . ¡ гит. ! I

! ' ¡ 1 t ¡ |р-ий| р-пй I I

i 1 ¡Мыши i !сыворотха i 1 Г " г..... | 37 |629,8±1 5 . _ 37 I i |653,3±14 |

i ; - ¡Кролики 1 j сыпоротка I | 33 i < ¡ 36 |54,9±21,3 36 i ! |61,Ь-19,Ч

i J ¡Кролики |гемогенаг 'i ..... I I i I ¡ i ' !

! 1 ¡хиьечнкка i I " | 46 |68,9-17,9 ' t 46 | 67 , 5—18,6¡ £ ¡

•1.1.МГ.1МТ использование аитивидовах конгвгатов. Конкурентные аа-

ряаяти метода чэкй^ ч у.. : ■т г, ! с л ь " ) J кли h : ч г од ■[ и толъчо для исследования >;'КА. Ламп рлзрчЬотг-Н пксокоч\'зстаит<,.льнив и •слшьчфн','-вариант конкурентного ИФА с НГА-СИ для обнаружения антлтгм -синов, осноззшшй fia образовании специфического ¡'ммупкого комплекса при зведетгнк л нсследуемнй чата'зиал пороговой '.«ониеитр:'-ц"" холерного токснза.

Эффективность этого заркачта б л л а ;;o.vi иег^дека лрр к^ч"-нви сивороток Y гомогснатов кизечияка ; г pay. сн холерой зкспс-рлненталышх знпотм.ч:; (Табл. 3) н при обследовании вакцинированных людей в зябркононоснтелен (Табл. 4). Отсутствие необхсди-

Таблвца

Обнаружение аятитокссяов в силоротлах вибр -ноиссггтеяей, захпиизрэвая!!.;х а з.чорапах дг>дс8 с помо:;ьи тест-апстеми Н«>А с ИКЛ-СВ.

1 1 j Груяпп | Коли- 1 1 Обрат •tue ' ............1......... тктрц jСр'ЗДГР'.Л reo-|

jобследованных j ч rct- 1- 1 ' 1 i ---1-1--,j метрячосхи й |

1 1 1Ю I отр. |20 |¿0 ! 1 1 -30 |1601320|64 0 j тнтр |

1 1 [Знбрионосятсли[ 9 Г ' 1 " 1 1 1 2' | - 1 1 « 1 •••г- i 1 " ......I | 2 | - j 1 | 85,1+23,8 I

1........ ...... 1 |Здоровне | 73 1 1 i 1 1 - 1 ~ 1 I - i ) ' i - I 1 i ! - i - ! - I - I

1 1 [Вакцинирован- | 1 ' i 1 1 I !...... ! ' ' Г i i I I ! ! i

|кае пеоднохрат| ! 1 • 1 I I I ' i i

¡но зарэнтераль| 27 | - 1 « Р- 1 з | « i - | - I 56.2-22.0 i

|ной и парорзль| i ■ ! 1 i i i I ;

¡ной. ва?.ц1Г!юЯ | | i f 1 1 1 I ! I i ! ! i ' ! (

»ости п гсепелъзопапии антпвидовах г.оньпгатоэ делает разработанную пглгл антлэ:гтеротоксичес:л'п монокяоиальпу» ппг:у;-;рмеитпу; тест-систеку универсальной, пригодной как для o6napys«»i:лГ, так л гитнзптеротокслческих антител з катезриалах от любого ï>' яивотнах и лпдей.

Согласно литературным дагшпг; наблюдения с покоцьв электров-пой микроскопии црсцессз токсанообразования "у холернпх пкОрно-roD в тонком хнпечннке кроликов ацянилк образование вакуолей ÏT эяутра клетки, иагряругзщпх ï ее лозгрхностг. » отделявшихся ь

скруж.лвчус среду [Das J. et al., 1966; Chätterjee S.N. et al., 1967; Kennedy J.R. et. al.,1969; Авакян A.A. с соавт. ,1972] . Однако до снх пор не проводились подобные исследования с использованием анткэитеротокснческнх МКА. Учитывая вышеизложенное представляло интерес, используя антнэнтеротохсические МКА, провести исследования в ИЭМ с целью визуализации местонахождения ЗТ в ранние сроки культивирования холерных вибрионов. В результате проведенных экспериментов удалось подтвердить локализацию XT непосредственно на поверхности клетки холерного вибриона в первые часы выращивания.

Результаты ИЭМ послужили основанием для дальнейшего поиска методов ранней диагностики токсигенных «¡таммов возбудителя холеры, основу которых составляли бы ККА-СВ. Нами была изучена познохность использования MiA при скрининге токсигенных штаммов холерных вибрионои на ранних этапах культивирования на хндки;; и плотных питательных средах с использованием ИКА-СВ. В процессе отработки метода было выяснено, что фиксация образцов на поверхности предметны): стекол 95° этанолом не влияет на результаты определений, что позволяет использовать для исследовании культуру без предварительного обеззараживания. Было показано, что интенсивность флуоресценции клеток, продуцирующих XT, возрастала к достигала максимальных значений к б часам выращивания, снижаясь затеи б результате его секреции в среду культивирования, возможно даже полное отсутствие свечения у 18-часовых бульонных культур ктамиов-ародуцентов холерного токсина, относящихся к классическому биовару. У вибрионов биовара эльтор через. 18 часов культивирования наблюдается наиболее интенсивное свечения (Табл. 5).

do данным литературы известно, что разрешающая способность непряного МФА выие, так как с одним антителом первого порядка может одновременно связа.ться несколько меченных антител второго порядка, обеспечивая более интенсивное свечение [Жариикоьа К.Б. с соавт1993]. Проведенное нами сравнение этих вариантов подтвердило преимущество первого из ннх. Минимальная концентрация МКЛ-СВ в непрямом KQA, при которой регистрировалась специфичес-::a:i флуоресценция, составляла 0.025 мг/мл, а концентрация меченных "ITC МХА-СВ в красяцен титре - 0.5 мг/ыл. Следовательно, .¡ля постановки прямого КФА требуется ККА-СВ в 20 раз больпе.

Г;', j л i : u j t3.

Рееулыатн научения токсшопродукцки г.сшртж snop'josos з 'Л •

Время культивирования, час Нити» .-явноеП> IJMKV к> флуоресценции р^зличних ¿.Ii/И •.d.r. !

Y.cholerdüí¡naba} V. i:holerae(0¿ii-,íü) Y.ültcr(Iiuíba) Y. oltov(0:{uva)

569-8 j-aa ES 8-1X7 СассаЗ 0sccl;55 Í.'-ИуЗ ¡he- Ii lî-t::?. 21 Ai 4'6'Ö4/4

3 3 3 3 3 ' 3 3 о 3 3 ' i 2 о

4 3-4 3-4 3 3- 4 3-4 3-4 3 3 3 о о Л

б 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3 ■ 3- 4 •3 3

6 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3-4 3 3-4 3 O- i H

19 - - - - - . - 3-4 3-4 S-4 3-4 4

• Примечание: интенсивность фдуорооцэищш оце-нивавась и крссых:

"3-4" - интенсивность снечеш;;; к л i-++, н-л-;

"3" - интенсивность свечении на

"2" - интенсивность свечения на -и- (посп---цифическое)¡

"-" - СЭ9Ч9Ш10 не обнаружено.

Однако этот вариант позволяет поручить -результата в 2 раза быстрее, так как исключается один из этапов.

Таким образок, экспериментально была показана возможность обнаружения холерного токсина с поночью МКА-СВ методом флуорес-::':руюцнх антител непосредственно на поверхности клеток холерного вибриона в ранние срок:: культивирования на жидких и плотных тчтаг-льнкх средах.

ДПА, являющийся разновидность» ИФА - яркий пример зкспресс-л о г о метода обнаружения антигена (АГ), так как время проведения анализа занимает около 1 часа. Использование МКА-СВ з ДИА способствовало разработке разнообразных методик быстрого обнаружения ХТ . Отработанные нами условия фиксации исследуемого материала на нитроцеллюлезных фильтрах (НЦФ) повысили чувствительность анализа в 100 раз. Кроме того, была показана пригодность мптоаа длл индикации токснгенных штаммов холерных вибрионов в ранпие сроки выращивания на искусственных питательных средах-, а также возможность прослеживать динаиику токсииопродукции исследуемых культур. Сравнение различных вариантов ДИА (Табл. 6( и Я1А (Табл. 7) свидетельствовало о более высокой чувствительности первого метода за счет лучсей сорбционнон активности твердофазного носителя и подбора условий фиксации АГ. Более того, при низких концентрациях АГ в ДИА имеется возможность концентрировать образцы, нанося их на кеыбрану несколько раз. Обработка I образцов 96е этанолом ускоряла анализ, позволяя наносить на НПФ жнзуп культуру непосредственно бактериологической петлей.

Таким образом, в результате проведенных исследований было сказано, что связанней с клеткой холерного вибриона экзотоксин и-иио выявячт:,, используя МКА-СВ, ухе в 3-часовоа культуре воз-'■-'л::тсля различными вариантами ДНА.

Для определения внутриклеточного токсина нами била разрабо-ги'тодцки ДНА с лизатамк холерных вкбрконов, которая поззо-и предалять тохскгонкость ' ятаимоп холерных пкбоконоа даже когда токсин ие -охсиресс^руетеи н.ч клеточной мекбране. того, сна проста. ь ^орнитннна. не требует специальной .л:;знатуры н особой подготовки персонала.

¡¡а основании проведенных экспериментов нам., предложен ком:;-г !!сг-:пш методический подход по определению токсинопгодуцнруюиих • и ста ятамм-в холерных вибриоиов пси эпиднадзоре за холерой я

! -i- -i-

rd '

! -4- ... 4- + — -

i + 4- 4- a.

L. 4- Л- -r -4- f -i- -r -j- 4- -, - 4-

-Î- — 1- 4- — —

_ -л. 4-

i í-í O - -f- -i- 4- -t- -t- 4- —

! + -1- 4- 4 + 4 4-

i Ь: **

+ -;- + + + + + ! 4 4- - T -i- ■+ 4- ;

4- + I 4 + 4- 1 I I ! I f !

---------1

4- + +-Г — 4- 4- 4- 4- 4- 4- -

+ 4-+4--t-4- + -r4-f

i I t I I I I I I I I I

I I I I i I I I I I 1 !

+■ + +•

4- 4- 4- + 4- -f- -r- 4- 4 + 4- 4- 4- 4- +

+ + + + + + + + + + + +

4-4- 4. 4- + 4

4- 4 -i- 4- 4- -r- -i- 4- -h 4- 44- H- 4- 4- 4- ~ 4- 4- + 4-4-

I I I I I 1 I I I I I !

4- 4 + + -f

4- 4- 4- -r 4

I I I I l ! t J I I I !

~ i CT I

'i

o. a «

o ti ^ и

o a

: I I ; I I 1 1 I I I I

•4-Ч-4- + 4- + + + + 4-4 ■ + 4 4-4"

I I I I i I I 1 I I ! t

03 ! en

ojc:

<o i lo !0*->1\г

Q) Q: Ca cj (В O l-.l-.l-, Qj Qj Qj

ООО U-U U

85

»-> и

■ i ta m Q

11 ф

t- L.

Qj Ol

a o зд

O fj

"í

гз

и и

13 С: »4 О.) Q CI Mi V CJ tO '-О <D

Cj I I ; »-itTjüj

«3 Zs S3 S= Cvi n VI

Ф í, u u, ц и

-4 o o o o o o

и П1 ü> CJ QJ

Ö

rj

5

ф и

o ö o

A ÇH à i-t

R q

О ПГ

t-<

cri S

f-«

S

Г- C1 >

■> H S

^ tx- £

5 ¿A

с t

>. §

С' 4-

a. 3"

^ о -

r;

H ü

Ф ^

?

¡ îo

tu QJ Г

8

- ¡

4- 4- 4

- +

и

a 4-

+ + + 4-V + 4- + + + + H

4- 4- 4- 4- a- J- 4-

O

y íl

o

tí 1

H IT]

n a

M

o

fifi s.

M

o

(í

GlC.P^OPl^Cr-h Oí O OOOOOOOOQCCO

Ci W C. P.

—. l i I

¡T> CO Oí c¡ © © en ts OOOOOOO i O l

o. o. O. c. o.

O > \ l w ^

lililí

lililí

lililí

O I I l l I

~ I I I I I I

I Q.C.Q.C.C.; O I V \ x. V. \ -

I I I I I

lililí

t l l I l I

I I I I I

M

í a

M

ni cU íi

lililí

lililí

lililí

I l I 1 l I

I I I I l

0> O) Cn CD ! )QOOOO'

I I I I 1

1 1 1 I I

l I ! 1 I

I I I I I

l l I r I

I I I I I

—i—-i'—O o c¡ o o o

O O O ^ O O ■* j -tj -to ü ü ü ü u u i» o ® a a o

Q.

&

¿1 Íí X

3

o

o

in

« «

tv 1 ,

¡x¡ r?, U C, a

T¡ o-, v-i c; cj

'O 1 U-i t ir; ra ill Cv ¡i

to uj c¡ e¡ '.Ti r,!

m re-, « 'O

Q tli ni m ■•■■! - i i i— OI.) ....

ra ra <x, S: 5? Cj Cj N'

- é -Í3 £ S -i-

ai o c

o a. >- ~

o

a «

jr ta

o re i- ra, a

3 c.

H

o r-

H CTj

C..1

h x

b¡ r:

Sc::

íi El

1

lili

I I I

lili

дот-иммуноаналнзе с помозь» МКА-СВ:

1. Обнаружение ЗТ, секретируемого в среду культивирования (исследование супернатантов бульонных культур илк выравивание агаровой культуры на НЦФ );

2. - Обнаружение ЭТ, экспресснровапного на наружной клеточной мембране (исследование бульонной или агаровой' культуры);

3. Обнаружение внутриклеточного ЭТ (исследование клеточных лкззтов агаровой культуры).

Эта методика оказалась успекнон при определении холероген-ности и динамики токсиногенеза итамиа У.сЬо1егзе 0139 "Зепра1" в процессе глубинного культивирования. Не выявленный в кохной пробе с помоцью антихолерогеиной кроличьей сыворотки, энтеро-^оксин обнарузивался НКА-СВ 659 на поверхности клеток в _5-часо-лон пробе, а, начиная с 7-часов вырациваяня - п в среде культивирования .

С помояью ДИА определяли крайне малые количества ХТ в среде 10 пкг/мл), фильтруя образцы через НЦФ, локальво (в центре) сенсибилизированные МКА-СВ. Этот прием можно использовать как для индикации холерного токсина н культураль.чцх и биологических хкдкостях, так к для количественной оценки холерогенности исследуемых итакнов.

В настоящее время весьнз актуальной является проблема взаимозаменяемости диагностических препаратов с !>ель» унификации различных методов зкспресс-анадкза. Колекуяа иммуноглобулина :(С1ет присоединять к себе химические соединения, • пе утрачивая при этой способности специфически реагировать с гомологичным антигеном. Кроме того, сохраняется способность меченой молекулы иммуноглобулина участвовать в других иммунологических реакциях, например, в реакции агглютинации и преципитации [Михайлов И.С., 1968]. Проведенные нами исследования показали прннцнпиальнуг возможность использования флуоресцирующих иммуноглобулинов . по-ликлональных сывороток для обнаружения и идентификация бактерий а непрямом варианте НФА [Веренков М.С. с соавт., 199А]. подобные исследования били проведены с НКА-СЗ, в результате чего бала доказана возмосяость использования ПТС-ККА-СВ в пеарямих вариантах И5А и ДИА, а МКА-СВ' - в непрямом НФА.

Следуиаям этапом в разработке ун1!фкцнрованних диагностических препаратов било создание коп'ыгата ИКА-СВ с двойной меткой

(флуорохромом к пероксидазой). Нами била подобрана веследоеа-телыгость ковгвгкрования, позволяичся 'получать высокоактнБиш-для сбоях методов (МФА и ИФД) хопъюгат:.,. В результате использо-ганка копъвгатов с двойной меткой повлеклась экономическая оф-Узктпеность ислользоваклл М ал 1: открылась перспектива создания у лл г. г осаль пых тест-систем для экспрессного поиска антигенов, характер использования которых зоаисит 'л: инструментального сс-лавенкя лабораторий,

Получека панель глГ-ркдои , с ллгл тл ру юл их чо но кл о нал ь ¡;ые л.нгпт'лла к отдельные зплтопам В с у' : д;; л ц холерного токсина, обладамяк.х различие.'! перевкваеностьп ь организма милей линии СЛЬВ/с и спецк^лчсслой .активность«) прл ^занмсденстпни с холерным токсином л его В субъеднлнле« классического и зльтор зкбри-слол обоих сероллр^ацтоз в ПС-А, Д;!Л и

2. С поноцыо ант!:зптеротоксг;ческ[;х молоклонаяышх антнгел усовершенствована экспресс-диагностика эпидемиологически значимых стаммои позбуднтеля холеуи ь различии;-: варкакта:: И'*А к

3. Па основе МКАтСБ разработала дий.ГЕостич<;схи.£ нкмуиофь*.— .чпнтл.ая тсст-сн'стека, псзЕоляпдая обкгруьквать 0,2-0,5 нг/мл холерного токекка к 9х105 КОЕ/кл толз;:гуц;;ил Ета;;коЕ холерного пибриока.

4. Создана универсальная схема конкурентного К. А для определения уровня холерних антитокеьков в сиЕорг.тке крови и других Гл:олагкчесхкх хкдкостях людел: к гквоткых любого ьнда.

5. Дохазанд поверхностно-клеточная локализация холерного токскиа на ра::них этапах культкгл;роиания холерных вибрионов на хядких и плотных питательных ерьдэ:: при кспользозалпи НПА-СВ инму:«лэлектронной микроскопии.

6. Разработано несколько способов раннего скрининга токсе-чопродуцирукакх втаи;;аь холерного пнбрце.ча п дот-ик^уиоаналпзе с помощ.з МКА, а такге предложен конплеценыв иодход е обнарухе-нкн свободксго, связанного чвнутриклеточного токекка при идентификации культур возбудителя холера.

7. МКА-СВ могут бить использована для определения активности хояеркык закцкн, вцяплекг.е изменений в антпгепвом строении хо-

лерогена в процесса анатокенпообраэования, а т¿-.кхе токспнспрс;-дукциругзей способности генпоипзекерных атакиов п штаммов холерных вибрионов, поделенных на различных территориях прн злг--добследоЪаиии.

8. Доказана познсгность взаимозаменяемости меченых флуорох-ронон или ферментом ЯКА-СВ для проведения"ПСА (ДНА) или постановки МФА. Мснсклснальные холерные антмантеротскснческие антитела с двойной .четкой одинаково эффективны для нммупофлуорес-иентвого в lüiMy íioie рме н тно г о апалпзсз.

9. Определены оптимальные условия гибридизации для получения максимального количества гибридом, -продуцирующих НКА заданной специфичности, относящихся х классу IgG - под брапы ехзыы п долы нмнуннэаппк экспс-ркмзиталышх гл;вот;тх, снихропиэзцпя hhtoso плазмопятонмых клеток, комбинирование культуралышх сред, добавление в среда аирацпвания ш:л;:нон сыворотки яли асцятачесхой зидкости; а такае дрог^евого супернатанта.

СПИСОК РАБОТ, СПУБЛПКОВАШШХ ПО Т2ИБ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Левдарзани З.Л., Пялягии М.В., Алепкпна 7.В., Маторнна H.A., Буларгина Т.В., Северин Е;С., Дуваки« И.А. Применение мо-иокловалышх антител для определения активности холерном пакци-пы и токсина // Тез. 2-ой Зоесогзз. конф. "Бактериальные токсн-íin", Прнала 27-30 ноября 1989 г. - Кркала, 1989. - С. 29.

2. Девдзрнаии З.Л., Пилягин И.Ю., Аленкяна Т.Б., Маторнна H.A. Использование моноклональних антител в TII5A для определения активности холерной вакцины и холерного токсина // Тез. докл. обл. науч. ког.ф. молодых ученик, 17-20 окт. 1939 г. -Ростов-н/Д, 1989. - С. 62-63.

3. Давыдова H.H., Лазаноза Л.Ф., Алеикяяа Т.В., Кдаееев В.П., Полуапла Т.А., Скирноаа П.И. Создание пзогенних птаммов Vibrio chalerae сероткпов Енаба и Огава с повизённой продукцией В субъсдиницы холерного токсина // Генетика, кикробиол. и со-пориеаствованпс методов лаб. диагностики особо опасных инфекций. - Саратов, 1991. - С. 33-37.

4. Никифоров А.К., Дроздов И.Г., Ереняя С-.А., Ерозенко Г.А., Бгов а.Н., Апясямов А.П., Алепхнпа Т.В. Экспрессия капсульного антягепа чумного микроба и B-субъедннаца холерного токсняа в

клетках S.typhimuriaa // Иммунология и специфическая профилакт. особо опасных инф. (Матер. Рос. науч. конф. 21-23 сент. 1993 г., г.Саратов) - Саратов, 1993. - С. 287-288.

5. Величко Л.Н., Аленкина Т.В., Малыхина З.Б., Кокувкин A.M., Копкльцов А.Г. Характеристика итаммоа холерного вибриона, изолированных во время вспыски в Кабадиене // Сб. науч. трудов.

- Новороссийск, 1994. - Выпуск 1. - С. 121-123.

Ь. Аленкина Т.Е., Грачева Л.В., Девдариани З.Л. Обнаружение холерного энтеротоксина на поверхности клеток холенного вибриона методом непрямой нммуноФлуорргценцк:: // Акгуал. вопр. профилакт. чумы и других инфекцнон. заболеваний: Матер. мехгосу-дарств. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы, т Ставрополь, 1994. - С. 117.

7. Аленкина Т.Е., Девдариани З.Л., Грачева Я.В., Заворотных 3.1!. Изучение токсиногекеза холерных вибрионов методом дот-им-.чуноанллиза с использованием антиэнтеротоксических мококлональ-й«:; антител // Актуал. вопр. профнлакт. чумы и других ннфекци-он. заболеваний: Матер, меягосударств. науч.-практ. конф., пос-вякенной 100-летию открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994. - С. 118-119.

8. Аленкина Т.В., Девдариани З.Л., Веренков М.С. Эффективность использования в экспресс-методах унифицированных препарате:; апткзнтеротоксических ионоклокальных антител (МКА) // Проблеск новаторской деятельности ученых, изобретателей и * других творческих работников в условиях реформирования экононнки (Тез. докл. обл. конф., 16 апр. 1996 г., г.Саратов) - Саратов, 1996.

- С. 144-145.

Звглз Z К-." подписано к печатя JS",af.96).

'.Oicr I п.л. Tiipai; /ОС '. ::"сгиздаззльстаа CIV.