Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Экологические и микробиологические аспекты эпидемиологического надзора за холерой (по материалам Сибири и Дальнего Востока)

КУЛИКАЛОВА Елена Станиславовна

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ХОЛЕРОЙ (по материалам Сибири и Дальнего Востока)

14.02.02 - эпидемиология

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 3 ОЕЗ ¿011

Иркутск-2010

4853727

Работа выполнена в ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, ст. науч. сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, ст. науч. сотрудник

Балахонов Сергей Владимирович Урбанович Людмила Яковлевна

Ботвинкин Александр Дмитриевич Андаев Евгений Иванович

Ведущая организация:

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « 1Ц » ПрусАййА 2010 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.038.01 при Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН по адресу: 664025, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3. Почтовый адрес: 664025, г. Иркутск, а/я 539.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН.

Автореферат разослан « 2-4 » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, ст. науч. сотрудник

Коган В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Холера является особо опасной инфекционной болезнью с диарейным синдромом, даже единичные случаи которой в свете Международных медико-санитарных правил (ММСП, 2005 г.) могут рассматриваться как чрезвычайная, нередко имеющая международное значение, ситуация.

Чрезмерная продолжительность седьмой пандемии (вызванной Vibrio cholerae el-tor), по сравнению с шестью предыдущими (этиологическим агентом которых явился V. cholerae cholerae), объясняется как изменением биологических свойств возбудителя (возможность длительного существования в водной среде, изменение вирулентности), так и формированием обильного вибриононосительства, по-видимому, обеспечивающего беспрепятственное прохождение носителей и больных стертыми формами через пункты пропуска на Государственной границе. В конце 1992 г. в Индии, а затем в Бангладеш и Таиланде зарегистрированы вспышки клинически сходного с холерой тяжелого диарей-ного заболевания, вызванного ранее неизвестным эпидемическим холерным вибрионом 0139 (Бенгал), продуцирующим типичный холерный энтеротоксин. С 1996 г. холерный вибрион 0139 существует вместе с вибрионом эльтор и в ряде районов Индии и Бангладеш занимает доминирующее положение (Sinha S. et al., 2002).

Анализ эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России вместе с информацией о действующей вспышке холеры на Гаити с высокими показателями летальности свидетельствуют о том, что прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным, и существует реальная возможность завоза из эндемичных стран.

В регионе Сибири и ДВ последнее эпидосложнение по холере (обусловленное заносом инфекции из Китая в гг. Уссурийск и Южно-Сахалинск с последующим накоплением возбудителя в водоемах и развитием вспышек в гг. Владивостоке и Южно-Сахалинске) зарегистрировано в 1999 г.

В отношении холеры общая эпидобстановка характеризуется ежегодным (в летне-осенний сезон) выделением холерного вибриона из поверхностных водоемов. И хотя в регионе такие штаммы являются нетоксигенными, видимо, существование интенсивного антропогенного воздействия на водоемы (загрязнение недостаточно очищенными и необеззараженными сточными водами) способствует превращению их в резервуары для размножения вибрионов с опасностью реализации водного пути передачи инфекции при попадании микроба в водоем во время заноса.

Поэтому представляется приоритетным изучение способствующих адаптации, существованию и накоплению холерного вибриона в водной окружающей среде экологических факторов. Все это требует постоянного эпидемиологического надзора за холерой, включая наблюдение за циркуляцией микроорганизмов рода Vibrio в поверхностных водоемах. При этом разработка способа сигнальной детекции холерного вибриона, направленного на оперативное выявление одновременно генетических детерминант возбудителей 01 и 0139 серогрупп, также актуальна.

Заслуживает внимания тот факт, что холерный вибрион в водоемах подвержен многообразной изменчивости, степень которой адекватна условиям среды. Вибрион в окружающей среде может пребывать в разных формах, обладает значительной гетерогенностью, а потому его способность к адаптации в среде обитания требует специального изучения.

Цель исследования: Комплексная оценка эпидемиологической ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным эпидемиологического, микробиологического, молекулярно-генетического, санитарно-гигиенического и экологического мониторинга.

Задачи исследования:

1. Дать оценку динамики развития эпидемиологической ситуации по холере в Сибирском и Дальневосточном Федеральных округах РФ в последнее десятилетие текущей пандемии.

2. Провести анализ абиотических и биотических факторов, влияющих на выживаемость холерного вибриона в поверхностных водоемах.

3. Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов холерного вибриона \vb01, \vh0139 и регуляторного гена 1охЯ, апробировать данный метод для ускоренного выявления антигенов холерного вибриона в сочетании с методом иммунофлуоресценции.

4. Охарактеризовать биоразнообразие V. сИо1егае на основе комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов в условиях эпидемиологического благополучия.

5. Изучить способность V. сИо1егае разных серогрупп к образованию биопленки в условиях эксперимента.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Установлена закономерность обнаружения атоксигенных холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в мелких полузамкнутых малопроточных водоемах, а также в местах сброса ливневой канализации с неблагоустроенных участков селитебной территории.

Показана роль и значение усовершенствованных методов лабораторной диагностики (комплекса методов - разработанной М-ПЦР на обнаружение генов холерного вибриона 01 и 0139 и реакции иммунофлуоресценции на определение специфических антигенов 01 и 0139) для изучения экологии холерного вибриона и микробиологического мониторинга поверхностных водоемов.

Показано преимущественное значение применения комплекса методов - мультиплексной ПЦР и РИФ для детекции V. сИо!егае 01 и 0139 серогрупп перед бактериологическим методом, что позволяет вести целенаправленный поиск указанного микроорганизма.

Представлена эпидемиологическая оценка изолированных, в регионе штаммов холерного вибриона по комплексу фенотипических и молекулярно-генетических методов.

Показана более выраженная адаптационная способность токсигенных штаммов холерного вибриона из поверхностного водоема во время вспышки холеры к формированию биопленки в сравнении со штаммами от больных.

Установлено существование скрытого периода накопления токсигенного возбудителя в благоприятных участках поверхностных водоемов в случае заноса, что обусловливает в ряде случаев внезапное возникновение эпидосложнений по холере и подтверждает роль мелких полузамкнутых малопроточных водоемов как возможного резервуара инфекции. Получены новые данные о способности вибрионов разных серогрупп образовывать биопленку и описаны морфологические признаки ее формирования.

Практическая значимость. Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы: методические указания «Лабораторная диагностика холеры» МУК 4.2.2218-07, утв. руководителем Роспотребнадзора Главным государственным са-

нитарным врачом РФ в 2007 г.; санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации» СП 3.1.1.2521-09, утв. руководителем Роспотребнадзора Главным государственным санитарным врачом РФ в 2009 г. Депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» экспериментально полученный RO вариант токси-генного V. cholerae cltor KM 258. Разработан и внедрен в практику эпиднадзора за холерой метод мультиплексной ПЦР, основанный на одновременном определении в пробе генов холерного вибриона Ol, 0139 серогрупп и глобального регуляторного гена toxR. Метод в комплексе с реакцией иммунофлуоресценции по данным многолетнего применения внедрен в практику экологического мониторинга. Методические рекомендации «Детекция холерных вибрионов в исследуемом материале с применением мультиплексной ПЦР и иммунофлуоресценции» одобрены Ученым Советом Иркутского НИПЧИ (протокол № 4 от 29.03.2007 г.), утверждены директором института. «Методические рекомендации по получению и морфологической оценке структуры образуемой холерным вибрионом биопленки» одобрены Ученым Советом (протокол № 2 от 05.03.2010 г.), утверждены директором института. Выделенные штаммы с характеристикой их биологических свойств, указанием мест и времени их выделения внесены в таблицу-шаблон в программе Microsoft Access для создания информационной базы данных V. cholerae, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока с глубиной ретроспективы в 8 лет (2001-2008 гг.).

Сформированная коллекция штаммов позволяет изучать их фенотипические свойства и структуру генома с применением современных методов и технологий и получать новые данные для понимания механизмов эволюции эпидемического процесса при холере. Материалы настоящей работы используются в учебном процессе на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям в ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ситуация по холере в регионе определяется регистрацией заносов с накоплением в ряде случаев возбудителя в поверхностных водоемах, развитием в последующем острых вспышек инфекции (1999 г.) и длительной ежегодной циркуляцией нетоксиген-ного холерного вибриона в водной окружающей среде.

2. Длительному пребыванию нетоксигенного холерного вибриона в поверхностных водоемах способствует сброс в них неочищенных хозяйственно-бытовых сточных вод и наличие благоприятных биотических и абиотических факторов водной окружающей среды. Обнаружение нетоксигенного холерного вибриона эльтор главным образом в мелких малопроточных водоемах (места неорганизованного отдыха населения) и чрезвычайно редкие находки его в санитарных поясах водозаборов и в гарантированных зонах рекреации в условиях региона обусловливают выбор стационарных точек забора проб также в местах несанкционированного использования водоемов (для купания, рыболовства и летних видов спорта).

3. Предлагаемый вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов V. cholerae 01, 0139 серогрупп (wbOl, wb0139) и toxR позволяет оперативно обнаружить ДНК холерного вибриона соответствующей серогруппы и в комплексе с реакцией иммунофлуоресценции повышает эффективность индикации холерного вибриона и своевременного установления границ контаминации поверхностного водоема.

4. Холерные вибрионы, выделенные из поверхностных водоемов в благополучный по холере период, характеризуются вариабельностью культурально-морфологических, агглютинабельных и фаголизабельных свойств; их чувствительность к некоторым антибактериальным препаратам изменяется в динамике. Штаммы не содержат в своем геноме основных генов вирулентности, входящих в состав профагов CTXip (ctxAB, zot), RSlcp (rstC), острова патогенности VPI-1 (tcpA). Холерные вибрионы эльтор и 0139 серогруппы различаются по наличию в их геноме детерминант персистенции и генов, отвечающих за формирование структуры биопленки.

5. Штаммы V. cholerae eltor обладают широким диапазоном формирования биопленки в отличие от V. cholerae 0139. Порошкообразный и коллоидный хитин, а также микрокристаллическая целлюлоза усиливают образование вибрионом биопленки. Ток-сигенный вибрион эльтор, выделенный из поверхностного водоема во время вспышки холеры, в сравнении с таковым от больных холерой, обладает выраженной способностью к образованию биопленки.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на научной конференции «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения» (Москва, 2004); 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007); IX Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области» (Иркутск, 2007); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии» (Иркутск, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ» (Волгоград, 2008); 2-ом межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2008); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней» (Иркутск, 2009); научно-практической конференции, посвященной 60-летию со дня образования республиканской санитарно-эпидемиологической станции (Улан-Уцэ,

2009); Проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2003-2010); заседании Иркутского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Иркутск, 2010); 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (Vienna, Austria,

2010); международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: Чтения памяти профессора М.М. Кожова» (Иркутск, 2010), а также на научно-практических конференциях Иркутского НИПЧИ (2007-2010 гт.).

Личный вклад автора. Сбор данных в ходе эпидемиологического надзора за холерой, отбор и исследование проб из объектов водной окружающей среды, исследование биологических свойств штаммов холерного вибриона, в т.ч. с применением молекулярно-генетического метода, постановка экспериментов, анализ результатов и подготовка публикаций проведены при непосредственном участии автора. 6

Работа выполнена в рамках двух плановых тем: «Экологические аспекты эпид-надзора за холерой на территории Сибири и Дальнего Востока» и «Оценка ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным экологического мониторинга и результатам молекулярно-биологического исследования циркулирующих V. cholerae» (№№ государственной регистрации 0120.0013 861, 0120.0511209).

Публикации но теме исследования. Материалы исследования изложены в 36 опубликованных научных работах, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертационных работ, 1 - в зарубежной печати и в одном заключительном отчете.

Структура к объем диссертации. Диссертация изложена на 189 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 197 ссылок, из них 106 отечественных и 91 зарубежных авторов и приложения. Работа содержит 20 таблиц и 42 рисунка.

Благодарность. Выражаю глубокую признательность моему Учителю, выдающемуся эпидемиологу и замечательному человеку д.м.н. профессору Александру Семеновичу Марамовичу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материал и методы. В основу ретроспективного эпидемиологического анализа легли информационные материалы противочумных станций, первичные документы (паспорта штаммов, журналы идентификации культур, паспорта стационарных точек забора проб), научные отчеты, публикации. Сбор материалов, предоставленых Управлениями Роспотребнадзора по Иркутской, Новосибирской, Кемеровской областям, Забайкальскому, Приморскому и Хабаровскому краям, Республикам Алтай, Саха (Якутия), проводился по разработанным ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (с нашими модификациями) таблицам высеваемости холерного вибриона при исследовании более чем 40 тыс. проб из поверхностных водоемов с 2000 по 2007 гг. Детальный мониторинг проведен в отношении поверхностных водоемов г. Иркутска и его окрестностей, исследовано 9190 проб. Точки отбора ежегодно согласовываются и утверждаются специалистами Управления Роспотребнадзора по Иркутской области. Координаты точек отбора проб зарегистрированы GPS-навигатором «Garmin». Для апробации комплекса ускоренных методов с целью сигнальной детекции в них холерного вибриона в 2004-2006 гг. исследовано 495 проб из объектов окружающей среды, в т.ч. воды - 320, иловых отложений - 158, водорослей

- 12 и гидробионтов - 5.

Исследовано 309 штаммов V. cholerae eltor, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке при разных эпидемиологических ситуациях: 10 - от больных холерой и из объектов водной окружающей среды во время эпидосложнений по холере (1999 г.); 299

- из поверхностных водоемов в период эпидблагополучия, в том числе 3 8 - RO-вариант (1999-2008 гг.). Кроме того, исследовано 11 штаммов V. cholerae 0139, из которых 4-музейные от больных и 7 - из объектов окружающей среды региона в благополучный по холере период (2000-2008 гг.). В качестве контрольных использованы штаммы V. cholerae eltor М878 и V. cholerae 0139 Р16063.

Исследован материал от 41 больного с клиникой острой кишечной инфекции, поступивший из Иркутской областной инфекционной клинической больницы.

Ретроспективный и оперативный анализ данных, полученных в ходе эпидемиологического надзора за холерой в период VII пандемии с 1999 по 2008 гг. на административных территориях Сибири и Дальнего Востока проводился с использованием описательно-оценочного и аналитического (с применением приемов формальной логики и статистики) методов [Зуева Л.П., Яфаев Р.Х., 2006].

Оценка санитарного состояния поверхностных водоемов осуществлялась по санитарно-химическим и санитарно-бактериологическим показателям на соответствие требованиям СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод» и ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические, технические требования и правила выбора». Исследования проводились на базах санитарно-гигиенической и санитарно-бактериологической лабораторий ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в субъекте».

Исследование фитопланктона проводилось (2006-2008 гг.) в трех стационарных точках водоемов, расположенных в черте г. Иркутска: р. Ангара (залив у острова Юность, Шишиловская протока, отшнурованная от р. Ангары) и болотно-озерный комплекс в микрорайоне Ново-Ленино. Пробы объемом 0,5 л отбирались из поверхностного слоя воды, подвергались консервированию раствором Утермеля, обрабатывались осадочным методом и просматривались с использованием световых микроскопов - Laboval фирмы Carl Zeiss Jena и Leica DMLB.

В процессе бактериологического исследования проб из поверхностных водоемов и материала сгг больных острыми кишечными инфекциями применялись разработанный нами вариант М-ПЦР д ля детекции генов toxR, wbOl и wb0139 и реакция иммунофлуоресценции - РИФ с использованием люминесцирующих сывороток для обнаружения V. cholerae Ol (РосНИПЧИ «Микроб», ФИТЦ-МКА F8612, РостНИПЧИ1) и V. cholerae 0139 (ФИТЦ-МКА, экспериментальная серия, РостНИПЧИ) отдельно и в комплексе друг с другом.

Изучение культурально-морфологических, биохимических, серологических свойств, чувствительности взятых в исследование штаммов к диагностическим бактериофагам и антибактериальным препаратам проводилось согласно МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».

Штаммы изучены в М-ПЦР на наличие генов холерного токсина (ctxA), токсинкоре-гулируемых пилей адгезии (tcpÄ) и глобального гена-регулона toxR, в однопраймерной ПЦР на детекцию генов zot (профаг СТХф), rstC (профаг RS 1 ), папН(остров патогенности VPI-2), trip 0183, deo 0175 (остров пандемичности VSP-1), pro 0490,pro 0496 (остров пандемичносги VSP-2), mshA и mshQ (остров персистенции EPI), а также отр U, attRS, hapA, vps, vpsR и mbaAl, mbaA2 (расположены в составе консервативной части хромосомы).

Для исследования биопленки на 23 штаммах вибриона эльтор, 11 - холерного вибриона 0139 разной эпидемической значимости и 1 - не 01/0139 проведено пять серий опытов: подбор субстрата для прикрепления вибрионов; исследование способности вибрионов к образованию биопленки при культивировании в бульоне Хотгингера (пробирочный опыт); количественное определение способности холерных вибрионов к формированию биопленки в бульоне Хотгингера; исследование способности вибрионов к образованию биопленки в автоклавированной речной воде; выявление формируемой холерным вибрионом биопленки с использованием метода светооптической и люминесцентной микроскопии.

1 - ФИТЦ-МКА 01 (Р8612) к V. сЛо/егае 01 и ФИТЦ-МКА 013Э к V. сШегае 0139 любезно предоставлены зав. лабораторией МКА Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института профессором Л.П. Алексеевой, за что автор приносит ей благодарность.

Для оценки достоверности различий между группами штаммов при описании их биологических свойств использованы относительные показатели в процентах [Сави-лов Е.Д., 1993], критерии х2 и t [Реброва О.Ю., 2006]. Для непараметрической оценки связи между двумя группами выборок использован критерий Манна - Уитни [Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006]. Для характеристики варьирования значений в выборке вычислялось стандартное отклонение и дисперсия [Ашмарин И.П., 1962]. Статистическая обработка результатов опытов проводилась с использованием программы Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Inc.) и Statistica 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экологические предпосылки длительной циркуляции вибриона эльтор в объектах окружающей среды. Регион Сибири и Дальнего Востока имеет развитые международные транспортные связи. Здесь особое значение в плане заноса холеры из соседних стран Азии принадлежит Дальневосточному торговому пути - на Дальний Восток, а также (через республики Средней Азии и Казахстан) в Сибирь, куда посредством железнодорожного транспорта в прошлом десятилетии (1997 г.) произошел занос холеры в гг. Ачинск и Иркутск.

При рассмотрении в ходе ретроспективного анализа эпидемических осложнений по холере на Дальнем Востоке в 1999 г. установлено, что острые местные вспышки холеры (гг. Владивосток и Южно-Сахалинск) начались спустя две-три недели после выявления первых заносных случаев в гг. Уссурийске и Южно-Сахалинске. В г. Уссурийск холера завезена тремя заболевшими шоферами большегрузных автомобилей, оттуда одного больного в силу тяжести клинической картины транспортировали в г. Владивосток, где был установлен окончательный диагноз. Через три недели в г. Владивостоке возникла вспышка холеры (23 больных и 5 вибриононосителей), которая продолжалась в течение 33 дней (с 23.08 по 26.09.1999 г.). В г. Южно-Сахалинске эпидемические осложнения возникли через 2 недели после установленного факта заноса инфекции двумя туристами, вернувшимися из Китая и выявленными активно при обследовании авиапассажиров. За период вспышки (с 23.08 по 11.09) выявлено 11 больных и 11 вибриононосителей. В том и другом субъекте наличие скрытого периода накопления токсигенного возбудителя в благоприятных участках поверхностных водоемов обусловило одновременное внезапное взрывообразное возникновение эпидосложнений.

Анализ фактических материалов по расследованию заносных очагов холеры в Приморском крае свидетельствует о том, что инфицированные лица в пунктах пропуска через границу выявляются крайне редко [Марамович А.С. и др., 2006,2008,2009; Мурначев Г.П. и др., 2009]. Прохождение вибриононосителей и больных стертыми и легкими формами через санитарно-карантинный контроль и несвоевременность лабораторной диагностики обеспечивают их существенное значение в качестве скрытых первоисточников инфекции, затрудняя выявление заносных случаев. Несмотря на отсутствие обнаруженных инфицированных лиц, попадание токсигенного штамма холерного вибриона в благоприятные для его сохранения и размножения участки поверхностных водоемов определяет реализацию водного пути передачи инфекции при использовании их в рекреационных целях, чем может быть объяснен генез заносных эпидемических вспышек [Марамович А.С. и др., 2002]. Анализ повторных эпидемических осложнений при временном укоренении холеры в других регионах страны также свидетельствует о предварительном накоплении возбудителя в по-

верхностных водоемах, подтверждаемом изоляцией вирулентного вибриона эльтор в предэпидемический период за 5-10 дней до появления первых инфицированных лиц [Мединский Г.М. и др., 2000].

В этих условиях особое значение имеет мониторинг поверхностных водоемов с целью обнаружения холерного вибриона и оперативной оценки его эпидзначимости. Так, за последние десять лет (1999-2008 гг.) из объектов окружающей среды на территории региона изолировано 354 штамма нетоксигенного вибриона эльтор и 11 - 0139 серогруппы с тенденцией к увеличению высеваемости культур на Дальнем Востоке (рис. 1). Наибольшее количество культур - из водоемов Приморского (55 %), Забайкальского (11 %) краев, Иркутской области (19 %) .

Установлено, что исследование проб (согласно СП 3.1.1086-02) на обнаружение холерного вибриона из стационарных точек в местах водозабора и гарантированных зонах рекреации водных объектов в условиях региона малоэффективно, хотя исключать подобные исследования из-за их особой эпидемиологической значимости нецелесообразно. Крупные сибирские реки, служащие источником централизованного водоснабжения, как правило, по качеству воды соответствуют требованиям ГОСТа 2761-84, а редкие находки в них вибриона эльтор в застойных участках являются следствием впадения мелких рек с высокими показателями высеваемости данного микроорганизма.

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Годы

Рис. 1. Динамика высеваемости штаммов холерного вибриона, выделенных из поверхностных водоемов на территориях региона (1999-2008 гг.).

Ежегодный микробиологический мониторинг поверхностных водоемов в г. Иркутске и его окрестностях проводился в шестнадцати эпидемиологически обоснованных точках. За летне-осенний сезон с 2000 по 2007 гг. из объектов окружающей среды (вода, иловые отложения, водоросли, моллюски, рыба, фито- и зоопланктон) из 9190 исследованных проб изолировано 56 штаммов вибриона эльтор, 6 - холерного вибриона 0139, 451 - холерных вибрионов не 01/0139, 30 микроорганизмов рода Aeromonas, 40 - Plesiomonas.

Чаще холерные вибрионы обнаруживаются в воде поверхностных водоемов, затем - из проб ила; вибрион эльтор выделен также из рыбы. Установлена закономерность обнаружения нетоксигенных холерных вибрионов 01 и 0139 (89,3 % от выделенных штаммов, среднемноголетняя высеваемость - 7,7 за 2000-2006 гг.) в мелких полузамкнутых малопроточных водоемах, использующихся для отдыха, а также в местах сброса ливневой канализации с неблагоустроенных участков селитебной территории (рис. 2).

ш и я ^ с О о 1П

Рис. 2. Данные о доле разных мест (А) и частоте (Б) выделения холерного вибриона эльтор из поверхностных водоемов г. Иркутска и его окрестностей (2000-2007 гг.).

В 2001 г. вибрион эльтор обнаружен в зоне санитарной охраны водозабора г. Иркутска (в 2,0 % проб). В 2006 г. вибрионы 0139 серогруппы и ЯО-варианта изолированы из проб, взятых в месте сброса сточных вод правобережных очистных сооружений (1,8 и 1,3 % проб, соответственно). Места выделения этих штаммов характеризуются превышением показателя бихроматной окисляемости (ХПК - до 39 мг02/дм3), биологического потребления кислорода (БПК5- до 34 мг02/дм3) и рН воды (до 9,66), а превышение нормативов содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий достигает 60 и 100 крат соответственно (при норме для водоемов 2 категории - 500 и 100 КОЕ/мл). Учитывая данные о загрязнении ливневого стока бактериальными патогенами [Гуськов Г.В. с соавт., 1989; 0'8Ьеа М.Ь. е1 а!., 1992] и интенсивность сброса в водные объекты сточных вод (только в Иркутской области - около 1100 млн м3/год) [Безгодов И.В. соавт., 2002], можно судить об их антропогенном загрязнении хозяйственно-бытовыми, промышленными и ливневыми сточными водами.

В процессе санитарно-гигиенического надзора за поверхностными водоемами причины контаминации их холерным вибрионом, как правило, не выявляются. В то же время обследование береговой линии мелких проточных или замкнутых водоемов в связи с обнаружением вибриона эльтор позволяет установить факты аварийных сбросов в них сточных вод канализационно-напорных станций или слива содержимого ассенизационных машин. Обнаружение микроорганизмов рода ИЬпо в поверхностных водоемах в период эпидблагополучия по холере на фоне существенных нарушений санитарно-гигиенических требований к качеству их воды является показателем загрязнения водных объектов недостаточно очищенными хозяйственно-бытовыми сточными водами. Поэтому целесообразно при выделении нетоксигенного холерного вибриона 01 и (или) 0139 серогрупп в системе эпидемиологического надзора за холерой предусмотреть эпидрасследование с целью установления источника контаминации водного объекта и проведение целенаправленных мероприятий по санитарной охране водоемов, используемых для купания и отдыха.

Установлено, что холерный вибрион 0139 обнаруживается в водоемах крупных городов Сибири на путях интенсивных международных туристических потоков, связанных с Южной Азией. В то же время в поверхностных водоемах Дальнего Востока до настоящего времени вибрион этой серогруппы не обнаружен, хотя в Китае в 2004 г. и в последующие годы холера лабораторно подтверждается выделением возбудителя 0139 серогруппы более чем в 50 % случаев [N№11, 2005]. Это служит основанием для предложения при выборе точек отбора проб обращать особое внимание на водоемы вдоль трансграничных автомагистралей и считать обязательным исследование водоемов не только в местах сброса сточных

ВЗоны санитарной охраны водных объектов

□ Места сброса сточных вод

ШМеста неорганизованного отдыха населения

□ Другие объекты (рыба)

89,3

Места выделения

вод, но и ниже по течению на 50-500 м. Для оценки состояния водоемов в стационарных точках отбора проб и, особенно, в местах выделения холерного вибриона эльтор и 0139, обоснована необходимость привлечения результатов как санитарно-гигиенических, так и санитарно-бактериологических исследований проб воды.

Внесено также предложение о включении в санитарные правила СП 3.1.1.252109 положения в отношении составления карт-схем населенных пунктов с указанием расположения канализационно-напорных станций, очистных сооружений и наиболее опасных по степени загрязнения участков водоемов с отметкой мест обнаружения в них холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп.

Определение видового состава фитопланктона как благоприятного фактора для развития патогенной микрофлоры, в частности, холерного вибриона, и выявление степени антропогенной нагрузки на городские водоемы показало (табл. 1), что во всех исследованных водоемах - в Шишиловской протоке, заливе р. Ангары у о. Юность и, особенно, в болотно-озерном комплексе в микрорайоне Ново-Ленино г. Иркутска в большом количестве обнаруживаются живущие в сточных водах представители отдела Cryptophyta (С. caudata, С. compressa, С. ovata, С. reflexa, С. rufesceus), присутствие которых является индикатором загрязнения водоемов сточными водами.

Таблица !

Фитопланктон некоторых водоемов г. Иркутска в местах, наиболее коптамипированных холерным вибрионом

Наименование водоема Видовой состав фитопланктона Характеристика экологической обстановки Годы выделения холерного вибриона

р. Ангара, о. Юность (городской пляж) (М 52.27089, Е 104 28512) обычные для оз. Байкал виды (байкальская диатомея), отсутствие эвгленовых водорослей благоприятная 1997 V. cholerae 01 2000 V. cholerae 0139 2002 V. cholerae 01 2005 «-«

Шишиловская протока (отшнурована от р. Ангары) (М 52.27040, Е 104.28577) зеленые {Platimonas порядка Volvocales), эвгленовые (Buglena ornata) Слабая проточность, загрязненность органическими веществами 1997 V. cholerae Ol 2002 V. cholerae 01 2003 «-«

Болотно-озерный комплекс с впадающей в неё р. Сарафановкой, район Ново-Ленино (И 52.33044, Е 104.22214) сине-зеленые (Microcystis aeruginosa, Gloecapsa, Gomphosphaeria, Merismopedia tenuissima), зеленые (Scenedesmus acuminatus, Scenedesmus quadricauda, Pediastrum boryartum, Dictyosphaerium pulchellum, Coelastrvm pseudomicroporum), эвгленовые (Euglenophyta) и криптомонады (виды рода C/ypfomonas: С. caudaîa, С. compressa, С. ovata, С. reflexa, С. rufesceus) Наибольшая степень антропогенной нагрузки, загрязненность органическими веществами и сточными водами 1997 V. cholerae 01 1998 «-« 1999 V. cholerae 0139 2001 V. cholerae 01 2003 «-« 2005 «-«

Указанные водоемы характеризуются высокой обсемененностью представителями семейства Vibrionaceae. Массовое развитие цианобактерий и обилие хлорококковых зеленых водорослей в болотно-озерном комплексе свидетельствует о том, что этот водоем испытывает наибольшую антропогенную нагрузку. Здесь пик развития хроокок-ковых и гормогониевых (Microcystis и Anabaena) водорослей закономерно совпадает с периодом обнаружения вибрионов. По данным исследователей [Colwell R.R. et al., 1999; Islam M.S. et al. 1989, 1999] существует тесная связь между V. cholerae, водорослями

(Volvox sp., RhizocIonium fontanum и зелеными водорослями), муциновой оболочкой Anabaena (цианобактерии) и водными растениями [Shukla B.N. et al., 1995], что приводит к мысли об использовании вибрионами некоторых представителей водной флоры или продуктов их метаболизма в качестве питательного субстрата.

Разработка комплексного метода сигнальной детекции холерного вибриона 01 и 0139 в системе эпидемиологического надзора за холерой. Оперативное обнаружение возбудителя холеры и определение его эпидзначимости является одним из первостепенных среди мероприятий по эпиднадзору. Этому в большей степени соответствует применение в ходе бактериологического исследования ускоренных методов, в частности, мультиплексной ПЦР, основанной на одновременной амплификации трех генетических детерминант ctxA, IcpA и toxR генов [Водопьянов С.О. и др., 1999; Парамонов И.В. и др., 1999; Голубинский Е.П. и др., 2001; Baptista M.A.S. et al., 1998]. В настоящем исследовании разработан способ сигнальной детекции возбудителя, направленный на одновременное определение в М-ПЦР детерминант 01 и 0139 серогрупп холерного вибриона (wbO 1, wbO\19) в комплексе с детекцией регуляторного гена toxR (рис. 3). Оптимизированная мультиплексная ПЦР дает возможность оценивать исследуемую пробу как положительную на наличие V. cholerae 01,0139 серогруппы или - холерного вибриона не О I/O 139. Данная тест-система М-ПЦР показала специфичность в пробах с гетерологичной ДНК испытанных восьми микроорганизмов (Aeromonas, Plesiomonas, Brucella abortus 19BA, Esherichia coli, Shigella dysenleriae 248, Salmonella typhimurium, Francissella tularensis 15B, Yersinia pseudotuberculosis). Воспроизводимость подтверждена результатами реакции отдельно с каждой парой праймеров, чувствительность данного варианта мультиплексной ПЦР составляет 104 м.к./мл.

12 3 4 5 6

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации в мультиплексной ПЦР (детекция генов 1¥Ь01 (192 н.п.), №£>0139 (449 н.п.), ШЯ (560 н.п.)): 1 - и/ЬОГ, №Ь0139+, ?охН*, положительный контроль (V. с1ю1егаееНогМ-878 и V. сЬю/егае 0139Р-16063); 2 - №Ь01+, ^Ь0139~, ?охВ+, (V. сГю1егае еПог)\ 3 - ыЬОГ, и/Ь0139+, гохРГ, (V. сЬо1-егае 0139); 4 - \мЬ01 мЬ0139~, (V. с1ю1егаепоп 01/0139), 5 - отрицательный контроль (дистиллированная вода); 6 - маркер молекулярного веса 100-1000 п.н.

Результаты апробации комплекса методов (М-ПЦР и РИФ) для ускоренного обнаружения холерного вибриона на 495 пробах воды, ила, водорослей и гидробионтов в сезон 2004-2006 гг. из поверхностных водоемов в местах обнаружения вибриона эльтор в предыдущие годы показали, что информацию о наличии в пробе генов и антигенов возбудителя удается получить на сутки раньше, чем бактериологическим методом. РИФ и М-ПЦР дают положительный результат в 25,8 % и 22,6 % проб соответственно. В этом

же количестве проб бактериологическим методом V. cholerae OI, 0139 серогрупп или RO-варианта обнаруживаются в 2,8 % (V. cholerae 01-6 штаммов; V. cholerae 0139 -5 штаммов; V. cholerae R0 - 3 штамма) и V. cholerae не 01/0139 - в 18,4 %(91 штамм).

Обнаружение в ПЦР генов whOl и toxR, а также положительный результат РИФ в процессе исследования проб воды и ила при отрицательных результатах бактериологического исследования проб свидетельствует о существовании в них холерного вибриона 01 в некультивируемом состоянии (на что указывает также морфология в мазках) или в такой низкой концентрации, которую традиционным бактериологическим методом определить невозможно.

Получение сигнальной информации о наличии в пробе детерминант холерного вибриона на вторые сутки бактериологического анализа служит основанием для целенаправленного поиска указанного микроорганизма в водоеме и помогает определить наиболее опасные места в зонах водных объектов, используемых для водопотребления и водопользования. Более частое обнаружение холерных вибрионов не 01/0139 может свидетельствовать об их большей устойчивости по сравнению с холерным вибрионом 01 или 0139 серогрупп к неблагоприятным факторам окружающей среды. Интересно, что при использовании традиционных методов культивирования даже в эндемичных очагах часто бывает трудно выделить V. cholerae 01 или 0139 из объектов водной окружающей среды, особенно в межэпидемический период, хотя при этом V. cholerae не 01/0139 обнаруживаются значительно чаще [Huq A. et al.,1990, Hoshino К. et al.,1998; Alam M. et al., 2006].

Для оценки возможности применения метода сигнальной детекции при исследовании поступающего клинического материала апробированы указанным методом искусственно зараженные в разных дозах (1О'-lО6 м.кл/мл) образцы материала от людей (испражнения), при этом положительный результат получен в пробах, зараженных дозой 103 мк/мл. В ходе исследования поступивших в 2004-2006 гг. проб клинического материала от 41 больного острыми кишечными инфекциями из городской инфекционной больницы получен отрицательный результат на обнаружение генов холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп (wbOI, wbOI39, toxR) в ПЦР и антигенных детерминант в РИФ, что согласуется с отсутствием выявленных заносов и осложнений по холере на территории г. Иркутска.

Биологические свойства V. cholerae из объектов окружающей среды. Изучение биологических свойств штаммов (V. cholerae eltor - 260, V. cholerae 0139-7, V. cholerae RO - 38 штаммов), выделенных из поверхностных водоемов почти на всех административных территориях региона в благополучный по холере период (2000—2008 гг.), по эпидзначимости, принадлежности к биовару, серогруппе, наличию способствующих их адаптации в окружающей среде факторов, а также генетической детерминированности перечисленных свойств показало, что они характеризуются высокой вариабельностью культурально-морфологических, агглютинабельных и фаголизабельных свойств.

Анализ фенотипических свойств выявил шесть групп штаммов, достоверно различающихся между собой. Значения / и уровни значимости Р при последовательном сравнении с группой 1 соответственно составляют: 12,7, Р < 0,001; 5,1, Р < 0,001; 2,8, Р < 0,01; 4,1, Р < 0,001; 6,3, Р < 0,001. Среди групп доля вибрионов, агглютинирующихся холерными диагностическими сыворотками до титра, лизирующихся фагами С, Эльтор, СТХ+, СТХ~ и вызывающих гемолиз эритроцитов барана, т.е. типичных вибрионов эльтор из объектов окружающей среды составляет 16,7 ± 2,14 %, в то время как преобладает группа холерных вибрионов (61,3 ± 2,79 %), агглютинирующихся до

титра (или Vi титра) О-холерной и серовароспецифическими сыворотками, но отклоняющихся от типичных по гемолитической активности в пробе Грейга, отношению к фагам С, Эльтор, СТХ+, СТХ".

Чувствительность большого числа культур V. cholerae eltor к фагу СТХ+ (40,0 % из 87 нетоксигенных штаммов) и вместе с тем обнаружение отдельных вибрионов, гемолизотрицательных в пробе Грейга, при определении их эпидемической значимости требует обязательного использования молекулярно-генетического метода для детекции генов холерного токсина (ctxA) и токсинкорегулируемых пилей адгезии (tcpA), с одной стороны, и необходимости дальнейших исследований по оптимизации указанных фагов, с другой.

Исследование чувствительности штаммов холерного вибриона, изолированных из объектов окружающей среды, к антибактериальным препаратам показало их высокую чувствительность к ципрофлоксацину, гентамицину, цефотаксиму, хлорамфениколу, что следует учитывать при выборе терапевтического препарата или антибиотика резерва в случае возникновения заболеваний острой кишечной инфекцией. Наибольшее число резистентных культур (89,2 %) установлено в отношении фурадонина. Доля чувствительной микробной популяции к цефотаксиму из года в год неодинакова и меняется от 75,0 до 100,0%. Установлено, что х2 при значимости р <0,001 для чувствительных к ампициллину культур равен 52,89 (df = 7), стрептомицину - 33,85 (df = 5), тетрациклину - 137,53 (df = 7), доксициклину - 162,50 (df = 8), рифампицину - 172,83 (df = 7), прир < 0,01 значение х2 по отношению штаммов к фурадонину - 20,26 (df = 6). Такие величины критерия соответствия свидетельствуют, что выделенные за период 2000-2008 гг. штаммы достоверно неоднородны по отношению к перечисленным антибактериальным препаратам.

Молекулярно-генетическое исследование 305 изолированных из объектов окружающей среды штаммов с целью определения эпидемической значимости (по основным детерминантам вирулентности - ctxAB, tcpA, toxR) и серогруппы (серогруппоспецифи-ческие детерминанты wbOl и wbOJ39) и 68 штаммов из них - на наличие мобильных генетических элементов: умеренного профага СТХср (ген zot), профага RS1 (фрагмента гена rstC), острова патогенности VPI-2 (папН), острова пандемичности VSP-1 и VSP-2 (tnp 0183, deo 0175 и pro 0490,pro 0496), острова персистенции EPI (mshA, mshQ), a также участков консервативной части хромосомы: сайта для внедрения в хромосому умеренных фагов СТХф и RSI (attRS); генов hap A, mbaAl, mbaA2, vps и vpsR показало, что в геноме взятых в качестве контрольной группы эпидемически опасных культур 01 серогруппы от больных во время вспышки холеры, присутствуют все указанные выше гены (табл. 2). В одном случае от вибриононосителя (1999 г.) выделен ctxA В ' штамм V. cholerae eltor, который наряду с отсутствием детерминант холерного токсина, не содержит и других основных и дополнительных генов патогенности. Геном нетоксигенных штаммов холерного вибриона из водоемов в благополучный период имеет более вариабельную структуру. У всех культур из окружающей среды показано отсутствие основных генов вирулентности, входящих в состав профагов СТХф (ctxAB, zot), RSlcp (rstC) и острова патогенности VPI-1 (tcpA). Однако у большинства штаммов (71,7 %) имеется attRS-сайт, у части изолятов - гены фермента нейраминидазы папН (36,1 %) и белка наружной мембраны ompU (28,6 %). Ген hap А, кодирующий выработку гемаг-глютининпротеазы, способствующей откреплению микробных клеток от эпителия кишечника, обнаружен у 77,6 % нетоксигенных штаммов.

Таблица 2

Результат определения генов вирулентности, пандемичности и персистенции у штаммов холерного вибриона, выделенных в Сибири и наДВ (1999-2008 гг.)

Эпидемиологическая ситуация

Выявляемые гены Расположение эпидблагополучие элидосложнения

генов число ИЗ них число из них

в хромосоме исследован- положи- исследован- положи-

ных штаммов тельно ных штаммов тельно

ctxAB профаг СТХср 68 0 10 9 ±0,3

zot 68 0 9 8 ±0,3

tcpA VPI-1 68 0 10 9 ±0,3

rstC профаг RS1 32 0 9 8 ±0,3

nanH VPI-2 36 13 ±0,5 8 7 ±0,3

tnp 0183 VSP-1 50 11 ± 0,4 10 9 ±0,3

deoО175 50 1 ±0,1 10 9 ±0,3

pro 0490 VSP-2 35 0 10 9 ±0,3

pro 0496 36 6 ±0,2 10 9 ±0,3

mshQ EPI 51 38 ± 0,4 10 10

mshA 52 33 ±0,5 10 9 ±0,3

attRS 46 33 ± 0,5 9 9

toxR 66 56 ± 0,4 10 9 ±0,3

ompU Консервативная часть хромосомы 49 14 ±0,5 10 9 ±0,3

hapA 49 38 ± 0,4 10 10

mbaAl 32 28 ± 0,3 10 10

mbaA2 52 51 ±0,1 10 10

vpsR 48 38 ± 0,4 10 10

vps 44 41 ± 0,3 10 10

У большинства штаммов холерного вибриона (79,2 %) детектирован ген vpsR, кодирующий выработку экзополисахарида (служащего в определенных условиях полимерным матриксом для образования биопленки). Этот ген не обнаружен у вибриона 0139 серогруп-пы, выделенного из водоема г. Иркутска и у 9 из 11 штаммов холерного вибриона эльтор с территории Приморского края. Полноценные острова пандемичности VSP-1 и VSP-2 (Vibrio seventh pandemic islands) у неэпидемических штаммов не определяются, однако у некоторых из них обнаружены гены pro 0496 (у 2,0 % штаммов) и trip 0183 (22,0 % штаммов) краевых фрагментов этих островов. Штаммы V. cholerae eltor содержат гены mshA (63,5 %) и mshQ (74,5 %), в составе острова персистенции EPI (environmental persistence island), кодирующие синтез маннозочувствительных гемаплютинирующих пилей адгезии, необходимых для образования полноценной биопленки, тогда как у V. cholerae 0139 эти гены не обнаружены. Гены mbaAl и mbaA2, кодирующие формирование трехмерной структуры биопленки, выявлены у 87,5 и 98,1 % штаммов вибриона эльтор, соответственно, а вот у 4 вибрионов 0139 из водоема г. Иркутска ген mbaAl не обнаруживается.

Таким образом, в благополучный по холере период штаммы V. cholerae eltor из поверхностных водоемов поликлональны в отличие от моноклональных культур холерного вибриона, изолированных в период вспышки холеры. Выделенные штаммы с характеристикой их биологических свойств, указанием мест и времени их выделения внесены в таблицу-шаблон в программе Microsoft Access для создания проблемно-ориентированной базы данных «Кbrio cholerae. Сибирь и Дальний Восток» с глубиной ретроспективы в 8 лет (2001-2008 г.). Дальнейшей разработкой этого направления является применение ГИС-технологий по курируемым территориям для эпиддиагностики осложнений по

холере с целью определения территории риска, границ очага, возможных причин возникновения осложнений и создания прогнозо-моделирующих систем оценки риска.

Способность холерных вибрионов к образованию биопленки. Исследование в условиях лаборатории возможности выделенных при разных эпидемиологических ситуациях штаммов холерного вибриона формировать биопленку показало, что адаптационная способность вибриона различна и в определенной мере связана с условиями его существования.

В первой серии исследований произведен подбор наиболее подходящего субстрата для образования холерным вибрионом эльтор биопленки, которыми оказались хитин и микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ).

Во второй серии установлена способность холерного вибриона формировать биопленку в богатой питательной среде, что проявляется уже через 24 ч. Выявлена высокая способность прикрепления клеток к стенке пробирок при 22 °С токсигенного вибриона эльтор, выделенного из поверхностного водоема на фоне вспышки в г. Владивостоке (1999 г.), что, по-видимому, указывает на его свойство прикрепляться к объектам окружающей среды, обусловливая выживаемость и относительно длительное сохранение в водоеме. Это подтверждается фактом выделения возбудителя из поверхностного водоема еще в течение несколько дней после прекращения вспышки. Такую же способность при этих же температурных условиях продемонстрировал нетоксигенный вибрион 0139 серогруппы (выделенный из водоема в месте сброса сточных вод городских очистных сооружений), усиливающий образование биопленки в присутствии хитина и МКЦ.

В третьей серии - количественное определение способности вибрионов (22 -V. cholerae eltor, 11 - V. cholerae 0139) разной эпидемической значимости к образованию биопленки при двух температурных режимах на ИФА-анализаторе Multiskan Ascent показало, что почти все штаммы, в той или иной степени, способны к формированию биопленки в течение 24 ч. При этом штаммы V. cholerae eltor обладают очень широким диапазоном способности образовывать биопленку - от еле видимого кольца на границе двух сред со значениями оптической плотности чуть выше фоновых (OD570 " 0,2) до мощной толстой пленки с экстинциями при OD570 до 4,5. Культуры V. cholerae 013 9 проявляют гораздо меньший размах показателей (крайние их значения при OD570 0,53-1,85). Группировка штаммов по степени ее образования (за образование биопленки принимали значение OD570 не менее 0,5) на основании подсчета индекса реакции культур на условия культивирования (отношение оптической плотности при 37 "С к этому показателю при 22 °С) позволила разделить штаммы на пять групп (рис. 4). Первая группа (индекс реакции < 0,7) со способностью к образованию биопленки только при 22 'С - 7 штаммов; 2 группа - (индекс реакции 1,3-3,0) с усиливающейся способностью к образованию биопленки при 37 'С - 9 штаммов; 3 группа (индекс реакции 4,0-7,0) со способностью к образованию биопленки при 37 °С в 4-7 раз интенсивнее, чем при 22 °С - 5 штаммов; 4 группа (индекс реакции 0,7-1,3) со способностью образовывать биопленку при том и другом температурных режимах - 7 штаммов; наконец, 5 группа с величиной OD570 до 0,5, т.е. не способная к образованию биопленки или образующая ее слабо - 5 штаммов.

При попытке сопоставить данные по генетической характеристике штаммов с их группами по степени образования биопленки обнаружено, что образующие биопленку штаммы, в основном, содержат в составе генома остров персистенции EPI (mshA и mshQ); гены, кодирующие архитектуру биопленки mbaAl и тЬаА2, выработку экзополисахарида vpsR; регуляторный ген toxR и отвечающий за экспрессию гематпотининпротеазы hap А.

Рис. 4. Группы штаммов по степени образования биопленки. По горизонтали - штаммы, сгруппированные по индексу реакции культур на условия культивирования, по вертикали - средние арифметические значений оптической плотности в группах.

Таким образом, штаммы холерного вибриона, как правило, образуют биопленку. Однако выявлена группа штаммов, слабо проявляющих эту способность (ОБ570 < 0,5), хотя они обладают тем же наборов генов, а также часть штаммов, не содержащих в геноме некоторых генов из острова персистенции, но образующих биопленку. Это не позволяет с уверенностью определить генетическую детерминированность степени образования биопленки и требует дальнейших исследований.

Б четвертой серии при культивировании штаммов, помещенных в автоклавиро-ванную речную воду, при 22 °С получена фенотипическая изменчивость клеток - на 3 неделе среди типичных колоний в Э-форме токсигенного вибриона эльтор И-1330 обнаружены очень сморщенные, сухие, похожие на ромашку (или розетку) колонии, агглютинирующиеся холерными О и 1Ю сыворотками, весьма стабильные при пассажах на плотной питательной среде, с сохранившимися основными генами вирулентности -сиА гсрА к>хЯ и вызывающие выраженный холерогенный эффект у кроликов-сосунков (рис. 5). Колонии в ЯО-форме обнаружены также у других штаммов (К сИо1егае 01 И-638; V. сИо1егае 0139 И-16), содержащихся в речной воде и физрастворе с хитином и МКЦ при культивировании в условиях комнатной температуры, однако эти субкультуры оказались при пересевах не стабильны.

А Б

Рис. 5. Морфология колоний V. с(та/егаееКогИ-1330, выращенные на казеиново-дрожже-вом агаре (рН 7,2) при 22 "С в течение 24 ч: А - гладкая Э форма; Б - шероховатая ЯО форма, х Ю.

В условиях культивирования при 4 °С происходят более глубокие изменения в морфологии вибрионов (кокковидные с плотной стенкой клетки, очень похожие на не-культивируемыс формы вибриона). Высев в ходе исследования из пробирок на плотные питательные среды показал отсутствие роста микроба на 21 день культивирования у вибриона эльтор И-1330 (физраствор с хитином и физраствор с МКЦ) и вибриона эльтор И-638 (речная вода и физраствор с добавлением МКЦ) с полным переходом на 91 день взятых в эксперименты этой серии штаммов в некультивируемое состояние. В этих пробах при окрашивании акридиновым оранжевым и просмотре препарата «раздавленная капля» обнаруживаются посредством люминесцентной микроскопии подвижные округлой формы клетки, единичные и собранные в конгломераты, имеющие зеленое свечение, а также выявляется в ГТЦР исходный набор генетических детерминант холерного вибриона.

Использование метода светооптической и люминесцентной микроскопии (пятая серия опытов) продемонстрировало способность эпидемических и неэпидемических штаммов холерного вибриона к образованию биопленки с сохранением в ней жизнеспособных клеток длительное время. Признаками формирования биопленки микроскопически следует считать наличие периферически располагающейся (краевой) части с самого начала эксперимента из прилегающих друг к другу вибрионов; полиморфизм вибрионов (наряду с типичными кокковидные и полые формы); тяжи и розоватая или базофильная субстанция (рис. 6). Вероятно, последняя является экзополисахаридным матриксом, в котором находятся вибрионы. Это согласуется с литературными данными о том, что в биопленке бактериальные клетки составляют не более 15 % объема, остальное - экзополисахаридный матрикс [Сергиев В.П. и др., 2007]. Окрашивание препаратов холерной люминесцирующей сывороткой 01 обнаруживает периферическую структуру и отходящие от нее тяжи из специфически светящихся клеток кокковидной, утолщенной с полым центром и типичной формы, кнаружи и к центру - прозрачная зеленоватая субстанция, содержащая специфически окрашенные изолированные клетки и их конгломераты. Поверхность субстрата имеет полости по типу каналов.

Рис. 6. Периферическая структура V. сЬо1егае И1330 через 4 сут. инкубации в воде. * 100.

Кристаллвиолет.

Прижизненная окраска препаратов АО выявляет частички коллоидного хитина, облепленные вибрионами зеленого цвета, которые под током жидкости в препарате движутся относительно субстрата, но не отрываются, что, видимо, следует рассматривать как микроколонию вибриона, а материалом же, не позволяющим бактериям

отрываться от нее, является экзополисахаридный матрикс, описанный Р. БКюсИеу (1994) как структура, которая окружает, закрепляет и защищает прикрепленные к различным поверхностям микроколонии клетки.

Результаты проведенных 5 серий экспериментов позволили наблюдать формирование биопленки и изменчивость холерного вибриона в его основных формах - переход в стабильный шероховатый КО-вариант (с сохранением исходного набора генов патоген-ности) и переход в некультивируемое состояние. Такая пластичность и лабильность к неблагоприятным факторам окружающей среды и широкие адаптивные способности позволяют вибриону приспосабливаться к существованию в случае попадания в водоем и могут зачастую приводить к длительной персистенции здесь. Так, при осуществлении мониторинга поверхностных водоемов г. Иркутска установлен факт неоднократного обнаружения в 2006 г. на протяжении 2,5 месяцев вибриона 0139 серогруппы в пробах воды и ила р. Ангары, взятых не далее 50 м от выпуска правобережных очистных сооружений. При расследовании причин этого многократного выделения холерного вибриона установлено, что его сохранение возможно либо в самом аэротенке, либо в одном или нескольких вторичных отстойниках, откуда он (размножаясь и сохраняясь, вероятнее всего, в составе биопленки, неуязвимый для бактерицидного действия хлора) попадает в составе сточных вод в контактные резервуары для обеззараживания методом хлорирования и далее, в р. Ангару. Поэтому единственной версией столь длительного выделения холерного вибриона 0139 серогруппы (а наряду с этим ЯО-варианта микроба и вибрионов не 01/0139) является его сохранение в иловых отложениях в условиях биопленки на этапах очистки сточных вод КОС.

Все это подтверждает данные Я.М. Ооп1ап, (2002), что в биопленочных сообществах более 99,9 % бактерий растут в естественных водных экосистемах с достаточным количеством питательных веществ не в виде свободно плавающих клеток, а прикрепляются к любым твердым поверхностям абиотической и биотической природы, образуя биопленки. Обнаружение в микропрепаратах вибрионов (кокковидных или имеющих форму овала), скомпонованных в виде конгломератов, отмечено в наших ранних работах [Урбано-вич Л.Я. и др., 2004; Миронова Л.В., 2004; Тафелыптейн Э.Е. и др., 2004] при получении некультивируемых форм вибрионов. В данном исследовании обнаружение таких структур (конгломератов) позволяет рассматривать их как одну из форм образованной вибрионом биопленки. Интересно отметить, что в ходе апробации сигнального метода ускоренного обнаружения холерного вибриона 01 и 0139 из проб водной окружающей среды в сезон 2004—2006 гг. при просмотре препаратов (из сконцентрированных предварительно обогащенных проб), окрашенных флуоресцирующими иммуноглобулинами, оказывается, что клетки V. сИо1егае 01, дающие значимое свечение, располагаются на предметных стеклах не только единично, но и в виде скоплений (флуоресцирующих конптомератов, при этом микробные клетки часто имеют форму кокков или коротких утолщенных палочек).

В жизненном цикле холерного вибриона формирование биопленки, вероятно, имеет огромное значение, поскольку этот процесс способствует резервации вирулентных штаммов в межэпидемический период, по крайней мере, на эндемичных по холере территориях [Литвин В.Ю. с соавт., 2001,2002]. Авторы [Смирнова Н.И., Лозовский Ю.В., 2003; Ерошенко Г.А., 2004; ВЬкевсЬ М. е1 а1., 2007; Каи^г^ Т.К. еГ а1., 2007] предполагают возможность обмена генетической информацией между различными штаммами в составе биопленки с помощью конъюгации и трансдукции, что может привести к образованию патогенного клона с новыми свойствами.

Широкий диапазон способности формировать биопленку, наличие факторов, усиливающих адаптацию холерного вибриона, обусловливает возможность длительного сохранения его в неблагоприятных условиях окружающей среды. Анализ материалов исследования позволяет рассматривать места длительной циркуляции нетоксигенных штаммов холерного вибриона как особую экологическую нишу, где возможно накопление и токсигенных V. cholerae в случае появления на территории заносных штаммов.

Таким образом, в основе эпидемиологического надзора за холерой в регионе (вместе с ранним выявлением больных и вибриононосителей) существенное значение принадлежит мониторингу поверхностных водоемов в связи с их резсрвуарной ролью в экологии холерного вибриона.

ВЫВОДЫ

1. Последние эпидосложнения по холере в регионе (1999 г.) возникли в результате заноса инфекции из Китая, накопления возбудителя в поверхностных водоемах и реализации водного пути передачи. Отсутствие в последующее десятилетие выявленных заносных случаев заболевания одновременно с ежегодным длительным выделением холерного вибриона из объектов водной окружающей среды характеризует эпидемиологическую обстановку по холере в Сибири и на Дальнем Востоке как относительно благополучную. Вместе с тем все возрастающая интенсивность миграционных потоков (из неблагополучных по холере стран), постоянные эпидемические осложнения в близлежащих странах Азии и установленные пути проникновения холеры в регион свидетельствуют о высоком риске заноса инфекции.

2. В местах неорганизованного отдыха населения, не являющихся узаконенными зонами рекреации, но использующихся для купания, обнаружено около 90 % штаммов нетоксигенного холерного вибриона эльтор, что дает основание при мониторинге водоемов для выбора здесь точек забора проб.

3. Закономерное обнаружение микроорганизмов рода Vibrio в поверхностных водоемах в период эпидблагополучия по холере на фоне существенных нарушений санитарно-гигиенических требований к качеству их воды является показателем загрязнения водных объектов хозяйственно-бытовыми сточными водами. Выявление холерного вибриона происходит при определенных показателях температуры и рН на фоне значительной численности и разнообразия сине-зеленых водорослей (Cyanophyta): Artabaena sp., Osciüatoria, видов рода Cryptomonas отдела Cryptophyta и разных форм хитинсодержащего зоопланктона, которые могут быть использованы вибрионами в качестве питательного субстрата.

4. Разработанная мультиплексная ПЦР в комплексе с реакцией иммунофлуорес-ценции в ходе проведения бактериологического анализа дает возможность получить оперативную информацию о наличии в пробе генов и антигенов возбудителя 01 и 0139 серогрупп, причем частота их обнаружения составляет 22,6 % и 25,8 %, что превышает возможность бактериологического метода.

5. Штаммы холерного вибриона из поверхностных водоемов в условиях эпидемиологического благополучия характеризуются высокой вариабельностью культу-рально-морфологических, агглютинабельных и фаголизабельных свойств (количество типичных штаммов составляет 16,7 %). Штаммы холерного вибриона чувствительны к ципрофлоксацину, гентамицину, цефотаксиму, хлорамфениколу. У всех культур отсутствуют основные гены вирулентности, входящие в состав профагов СТХф (ctxAB,

zot), RSl(r.î/Q и острова патогенности VPI-1 (tcpA). По наличию других генетических элементов: острова патогенности VPI-2 (папН), острова пандемичности VSP-1 и VSP-2 (trip 0183, deo Ol 75 и pro 0490,pro 0496), острова персистенции EPI (mshA, mshQ), a также участка консервативной части хромосомы - сайта для внедрения в нее умеренных фагов CTXtp и RSI (attRS) и генов hap A, mbaAl, mbaA2, vps и vpsR эти штаммы вариабельны. Штаммы V. cholerae 0139 из внешней среды не содержат гены mshA и mshQ острова персистенции EPI.

6. Штаммы V. cholerae eltor обладают широким диапазоном способности формировать биопленку (со значениями оптической плотности при OD570 0,2-4,5). Культуры V. cholerae 0139 серогруппы проявляют гораздо меньший размах показателей (значения оптической плотности при OD570 0,53-1,85). Выделенный из поверхностного водоема во время вспышки холеры токсигенный вибрион эльтор, в сравнении с таковым от больных холерой, обладает более выраженной способностью к образованию биопленки. Признаками формирования биопленки является наличие периферической ее части из прилегающих друг к другу вибрионов; их полиморфизм (палочки, кокковидные, полые, округлые неокрашенные) и появление полисахаридного матрикса, выявляемого при световой микроскопии различными методами окраски. В процессе образования биопленки показана изменчивость холерного вибриона в его основных формах - переход в стабильный шероховатый RO-вариант (с сохранением исходного набора генов патогенности) и в некультивируемое состояние.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Динамика изменчивости серо- и фаговариантов Vibrio cholerae eltor, выделенных от людей и из поверхностных водоемов на территории Сибири и Дальнего Востока в 1972-2002 гг. / B.C. Ганин, В.И. Погорелов, Л.Я. Урбанович, ..., Е.С. Куликалова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - Т. 2, № 1. - С. 65-72.

2. Холера в Сибири и на Дальнем Востоке России на этапах 7 пандемии / A.C. Ма-рамович, Л.Я. Урбанович, B.C. Ганин, ..., Е.С. Куликалова II Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - Т. 2, № 1. - С. 11 &-123.

3. Определение геномных маркеров патогенности штаммов Vibrio cholerae, выделенных в Сибири и на Дальнем Востоке / Л.В. Миронова, C.B. Балахонов, Л.Я. Урбанович,..., Е.С. Куликалова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - Т. 2, № 1. - С. 132-13 8.

4. Характеристика биологических свойств некультивируемых форм холерного вибриона и их способности к реверсии в экспериментальных условиях / Л.Я. Урбанович, A.C. Марамович, Л.В. Миронова,... Е.С. Куликалова // Холера и патогенные для человека вибрионы: Сб. материалов пробл. комис. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Рн/Д, 2004. - Вып. 17. - С. 45^48.

5. Эволюция эпидемиологии холеры / A.C. Марамович, Л.Я. Урбанович, Л.В. Миронова, Е.С. Куликалова//Журн. микробиол. -М., 2006. -№ 6. -С. 63-71.

6. Ускоренные методы лабораторной диагностики в системе эпиднадзора за холерой / Л.Я. Урбанович, A.C. Марамович, C.B. Балахонов,..Е.С. Куликалова и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы: Сб. материалов пробл. комис. Координац. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Рн/Д., 2007. - Вып. 20. - С, 43^6.

7. Обнаружение холерного вибриона в поверхностных водоемах в связи с их загрязнением сточными водами / Е.С. Куликалова, A.C. Марамович, Л.Я. Урбанович и др.// Материалы IX съезда ВНПОЭМиП, 2007. - Т. 3. - С. 55.

8. Роль и значение поверхностных водоемов в становлении и развитии VII пандемии холеры / А.С. Марамович, Л.Я. Урбанович, Е.С. Куликалова, Т.Т. Шкаруба // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2009. - № 2. - С. 21-26.

9. Оптимизация методов сигнальной детекции детерминант холерного вибриона в системе эпиднадзора за холерой / Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, Л.В. Миронова и др. // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2009. - № 6. - С. 24-29.

10. Молекулярно-генегические особенности штаммов холерного вибриона, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока во время VII пандемии / С.В. Балахонов, А.С. Кожевникова, Е.С. Куликалова и др. //Журн. инф. патологии. Материалы научн-практич. конф. - Иркутск, 2009. - Т. 16, № 3. - С. 9-16.

11. Способность холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп к образованию биопленки в эксперименте / Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, А.С. Марамович и др. // Журн. инф. патологии. Материалы научн-практич. конф. - Иркутск, 2009. - Вып. 22. - С. 90-93.

12. Эпидемиологический надзор за холерой: анализ миграции населения различными видами международного транспорта в Российской Федерации / Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина, В.И. Прометной, ..., Е.С. Куликалова и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы пробл. комиссии Координац. науч. совета по сан,-эпидемиол. охране территории РФ. - Рн/Д., 2010. - Вып. 23. - С. 13-16.

13. Куликалова Е.С. Фитопланктон некоторых водоемов г. Иркутска в связи с обнаружением в них микроорганизмов рода Vibrio / Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович, Г.И. Кобанова, B.C. Вишняков // Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы пробл. комиссии Координац. науч. совета по сан.-эпидемиол. охране территории РФ. - Рн/Д., 2010. - Вып. 23. - С. 29-31.

14. Molecular-epidemiological diversity of И cholerae strains isolated in Siberian and the Far Eastern regions of Russian Federation / A. Kozhevnikova, S. Balakhonov, E. Kulikalova et al. // 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 9-13 may, 2010, Vienna, Austria. Clinical Microbiology and Infection, 2010. - Vol. 16(s2) - P. 5 09-510.

Подписано в печать 22.11.2010. Бумага офсетная. Формат 60х841/16. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 363-10.

РИО НЦ PBX СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Актуальность проблемы

Холера - острая особо опасная бактериальная инфекция с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, склонная к эпидемическому и пандемическому распространению. В настоящее время при оценке эпидемиологической обстановки в любом регионе она по-прежнему сохраняет свое значение. Обусловливаемая данной инфекцией ситуация в свете новых Международных медико-санитарных правил [44] может рассматриваться как чрезвычайная, нередко имеющая международное значение.

Чрезмерная продолжительность седьмой пандемии, обусловленной холерным вибрионом эльтор 01 серогруппы, по сравнению с шестью предыдущими, объясняется как изменением биологических свойств возбудителя (возможность длительного существования в водной среде, изменение вирулентности), так и формированием вибриононосительства, по-видимому, обеспечивающего беспрепятственное прохождение носителей и больных стертыми формами через санитарно-контрольные пункты. В конце 1992 г. в Индии, а затем в Бангладеш и Таиланде зарегистрированы вспышки клинически сходного с холерой тяжелого диарейного заболевания, вызванного ранее неизвестным эпидемическим штаммом 0139 (Бенгал), продуцирующим типичный холерный энтеротоксин. С 1996 г. холерный вибрион 0139 существует наряду с вибрионом эльтор и в ряде районов Индии и Бангладеш занимает доминирующее положение [130].

Анализ эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России свидетельствует о том, что прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным, что связано с существующей реальной возможностью завоза инфекции из эндемичных стран.

В регионе Сибири и Дальнего Востока (ДВ) последние эпидосложнения по холере (обусловленные заносом инфекции из Китая в гг. Уссурийск и Южно-Сахалинск с последующим накоплением возбудителя в водоемах и развитием вспышек в гг. Владивостоке и Южно-Сахалинске) зарегистрированы в 1999 г.

После 1999 г. общая эпидемиологическая ситуация в отношении холеры обычно характеризуется ежегодным (в летне-осенний сезон) выделением холерного вибриона из поверхностных водоемов. И хотя в регионе Сибири и Дальнего Востока изолируемые штаммы являются нетоксигенными, интенсивное антропогенное воздействие на водоемы - их загрязнение недостаточно очищенными и необеззараженными сточными водами - превращает их в резервуары для размножения вибрионов с опасностью реализации водного пути передачи инфекции при попадании патогенного варианта микроба в водоем во время заноса.

В связи с тем, что обстановка в мире по холере остается неблагоприятной, представляется приоритетным изучение благоприятствующих адаптации, жизнедеятельности и накоплению холерного вибриона в водной окружающей среде экологических факторов. Все это требует постоянного эпидемиологического надзора за холерой, включая мониторинг, направленный на своевременное обнаружение возбудителя (в объектах окружающей среды и среди определенных групп риска) с соответствующей его характеристикой.

Известен ряд подходов к ускоренному выявлению холерных вибрионов, основанных на обнаружении антигенных маркеров микроорганизма в реакции флюоресцирующих антител [39, 108] для обнаружения бактерий в природных водных образцах с подсчетом жизнеспособных клеток под микроскопом [148]. Перспективно прямое выявление генетических детерминант возбудителя в полимеразной цепной реакции (ПЦР), превосходящей (на несколько порядков) иммунологические тесты по чувствительности и специфичности, что позволяет работать с исходным материалом без предварительного выделения культуры [80]. Предложены разные варианты ПЦР для скрининга специфичных фрагментов генов холерного вибриона [65,73, 123].

М. Alam et al. [172, 179] показали, что обнаружение в ПЦР гена ompW или генов rfbOl, rjb0139, ctxA является убедительным подтверждением присутствия в поверхностных водоемах эндемичных районов Бангладеш токсигенных V. cholerae 01 и 0139 серогрупп, хотя методом культивирования данные вибрионы обнаруживаются лишь в 2-3 % образцов из окружающей среды.

В связи с этим остается актуальной разработка способа сигнальной детекции холерного вибриона, направленного на одновременное выявление комплекса генетических и антигенных детерминант возбудителя 01 и 0139 серогрупп.

Заслуживает внимания тот факт, что вегетативные формы холерного вибриона в водоёмах подвержены многообразной изменчивости, степень которой адекватна условиям среды [33]. В межсезонный период в эстуарийных и морских водах Аргентины на юго-западе Атлантического океана обнаружены V. cholerae 01 в жизнеспособном, но покоящемся некультивируемом состоянии [184]. В Бангладеш между сезонными эпидемиями, вызванными токсигенными штаммами V. cholerae 01 и 0139, сочетаниями бактериологического метода, мультиплексной ПЦР и иммунофлуоресценции удалось диагностировать культивируемые и некультивируемые клетки в составе биопленки, служащей дополнительным резервуаром возбудителя в водной окружающей среде [172, 179].

В естественных водоемах формирование биопленки на биотических и абиотических поверхностях обеспечивает персистенцию холерного вибриона при неблагоприятных условиях окружающей среды в виде «условно жизнеспособных клеток», которые in vitro реанимируются, а в кишечнике человека могут реверсировать в вирулентные бактерии. Для образования-биопленки на абиотических поверхностях необходим манноза-чувствительный гемагглютинин, а в формировании её на хитиновых поверхностях ракообразных определенная роль - принадлежит токсинкорегулируемым пилям адгезии. Заражение людей происходит в результате проглатывания подобных скоплений «условно жизнеспособных» вибрионов, что способствует прониканию в организм достаточно высокой дозы возбудителя [180]. Следовательно, холерный вибрион в окружающей среде может пребывать в разных формах, обладать значительной гетерогенностью, а потому его способность к адаптации в разнородной и-изменчивой во времени среде обитания требует специального изучения.

Цель работы. Комплексная оценка эпидемиологической ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным эпидемиологического, микробиологического, молекулярно-генетического, санитарногигиенического и экологического мониторинга.

Задачи исследования.

1. Дать оценку динамики развития эпидемиологической ситуации по холере в Сибирском и Дальневосточном Федеральных' округах РФ в последнее десятилетие текущей пандемии.

2. Провести анализ комплекса абиотических и биотических факторов, влияющих на выживаемость холерного вибриона в поверхностных водоемах.

3. Разработать метод мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов холерного вибриона wbOl, wb0139 и регуляторного гена toxR, апробировать данный метод для ускоренного выявления антигенов холерного вибриона в комплексе с м'етодом иммунофлюоресценции.

4. Охарактеризовать биоразнообразие V. cholerae на основе комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов в условиях эпидемиологического благополучия.

5. Изучить способность V. сЪоЫгае разных серогрупп к образованию биопленки в условиях эксперимента.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Установлена закономерность обнаружения атоксигенных холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп в мелких полузамкнутых малопроточных водоемах, а также в местах сброса ливневой канализации с неблагоустроенных участков селитебной территории.

Для изучения1 экологии холерного вибриона и микробиологического мониторинга за поверхностными водоемами предложен комплекс методов, основанный на разработанной М-ПЦР и реакции иммунофлюоресценции, позволяющий одновременно обнаружить специфические гены и антигены холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп.

Показана эффективность и оперативность применения комплекса 1 методов - М-ПЦР и РИФ для детекции V. ско1егае 01/0139 серогрупп в сравнении с бактериологическим методом', что позволяет вести целенаправленный поиск указанного микроорганизма.

Представлена по комплексу фенотипических и молекулярно-генетиче-ских методов характеристика изолированных в регионе штаммов холерных вибрионов.

Показана более выраженная адаптационная способность токсигенного штамма холерного вибриона из поверхностного водоема во время вспышки холеры к формированию биопленки в сравнении со штаммами от больных.

Теоретическая значимость исследования состоит: в установлении существования скрытого периода накопления токсигенного возбудителя в благоприятных участках поверхностных водоемов в случае заноса, что обусловливает в ряде случаев внезапное возникновение эпидосложнений по холере и подтверждает роль мелких полузамкнутых малопроточных водоемов как возможного резервуара инфекции; в получении новых данных о способности вибрионов разных серогрупп образовывать биопленку и описании морфологических признаков её формирования.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Полученные результаты исследований нашли отражение в следующих документах: методические указания МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», утверждены руководителем Роспотребнадзора Главным государственным санитарным врачом РФ; санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1.2521-09 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации», утверждены постановлением № 43 Главного государственного санитарного врача РФ от 9 июня' 2009 г.; методические рекомендации «Детекция холерных вибрионов в исследуемом материале с применением мультиплексной ПЦР и иммунофлюоресценции» одобрены Ученым, Советом (протокол № 4 от 29.03. 2007 г.), утверждены директором института ФГУЗ' ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ;

Методические рекомендации.по получению и морфологической оценке структуры образуемой холерным вибрионом биопленки» одобрены Ученым Советом (протокол № 2'от 05.03.2010 г.), утверждены директором ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ.

Микробиологический мониторинг поверхностных водоемов в отношении Vibrio cholerae на основе предложенного нами комплекса методов - мультиплексной ПЦР и реакции иммунофлюоресценции -позволяет более оперативно выявить в пробе одновременно серогруппоспецифические гены wbOl, wb0139, глобальный регуляторный ген toxR и антигены этих серогрупп, что необходимо для ведения целенаправленного поиска вибриона в этой пробе.

В Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб" при ФГУЗ РосНИГГШ "Микроб" депонирован RO вариант токсигенного Vibrio cholerae эльтор - КМ 258.

Выделенные штаммы с характеристикой их биологических свойств, указанием мест и времени их выделения внесены в таблицу-шаблон в программе Microsoft Access для создания информационной базы данных V.cholerae, изолированных на территории Сибири и Дальнего Востока с глубиной ретроспективы в 8 лет (2001-2008 г.).

Сформированная коллекция штаммов позволяет изучать их фенотипические свойства и структуру генома с применением современных методов и технологий и получать новые данные для понимания механизмов эволюции эпидемического процесса при холере.

Материалы настоящей работы используются в учебном процессе на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям в ФГУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ситуация по холере в регионе определяется регистрацией заносов с накоплением в ряде случаев возбудителя в поверхностных водоемах, развитием в последующем острых вспышек инфекции (1999 г.) и длительной ежегодной циркуляцией нетоксигенного холерного вибриона в водной окружающей среде;

2. Длительному пребыванию нетоксигенного холерного вибриона в поверхностных водоемах способствует сброс в них неочищенных хозяйственно-бытовых сточных вод и наличие благоприятных биотических и абиотических факторов водной окружающей среды. Обнаружение нетоксигенного холерного вибриона эльтор главным образом в мелких малопроточных водоемах (места неорганизованного отдыха населения) и чрезвычайно редкие находки его в санитарных поясах водозаборов и в гарантированных зонах рекреации в условиях региона обусловливают выбор стационарных точек забора проб также в местах несанкционированного использования водоемов (для купания, рыболовства и летних видов спорта).

3. Разработанный вариант мультиплексной ПЦР для одновременной детекции генов V. ско1егае 01, 0139 серогрупп (-и>Ь(Э1, \vb0139) и ШЯ позволяет оперативно обнаружить ДНК холерного вибриона соответствующей серогруппы и в комплексе с реакцией иммунофлуоресценции повышает эффективность индикации холерного вибриона и своевременного установления границ контаминации поверхностного водоема.

4. Штаммы V. ско1егаеь выделенные из поверхностных водоемов в благополучный по холере период, характеризуются вариабельностью культурально-морфологических, агглютинабельных и фаголизабельных свойств, изменением в динамике чувствительности к некоторым антибактериальным препаратам, не содержат в своем геноме основных генов вирулентности, входящих в состав профагов СТХф (сЬсАВ, К81ф (га/С), острова патогенности УР1-1 (ЮрА). Изоляты холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп различаются по наличию детерминант персистенции и генов, ответственных за формирование структуры биопленки.

5. Штаммы V. ско1егае еНог 01 обладают широким диапазоном формирования биопленки в отличие от V. с1го1егае 0139 серогруппы. Порошкообразный и коллоидный хитин, а также микрокристаллическая целлюлоза усиливает способность вибрионов к образованию биопленки. Токсигенный вибрион эльтор, выделенный из поверхностного водоема во время вспышки холеры, в сравнении с таковым от больных холерой, обладает выраженной способностью к образованию биопленки.

Апробация работы

Изложенные материалы исследований представлены на научной конференции «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения» (М., 2004); 2-ом Байкальском микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007); IX Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (М., 2007); межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области» (Иркутск, 2007); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); научной конференции с международным участием «Актуальные вопросы региональной инфекционной патологии» (Иркутск, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008); 2-ом межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического' мониторинга за острыми кишечными инфекциями» (Иркутск, 2008); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней» (г. Иркутск, 2009); научно-практической конференции, посвященной 60-летию со дня образования республиканской санитарно-эпидемиологической станции (Улан-Удэ, 2009 г.); Проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ (Ростов-на Дону, 2003-2010); заседании Иркутского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Иркутск, 2010 г.); 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, (Vienna, Austria, 2010); международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: Чтения памяти профессора М.М.Кожова» (Иркутск, 2010), а также на научно-практических конференциях Иркутского НИПЧИ (2007-2010 гг.).

Личный вклад автора. Сбор данных, полученных в ходе эпидемиологического надзора за холерой, отбор и исследование проб из объектов водной окружающей среды, молекулярно-генетическое исследование штаммов холерного вибриона, постановка экспериментов, анализ результатов и подготовка публикаций проведены при непосредственном участии автора.

Работа выполнена в рамках двух плановых тем: «Экологические аспекты эпиднадзора за холерой на территории Сибири и Дальнего Востока» (№ государственной регистрации 0120.0013861) и «Оценка ситуации по холере в Сибири и на Дальнем Востоке по данным экологического мониторинга и результатам молекулярно-биологического исследования циркулирующих V. cholerae» (№ государственной регистрации 0120.0511209).

Публикации по теме исследования. Материалы исследования изложены в 36 опубликованных научных работах, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертационных работ, 1 — в зарубежной печати и в одном заключительном отчете.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 189 листах текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 197 ссылок, из них 106 отечественных и 91 зарубежных авторов и приложения. Работа содержит 22 таблицы и 42 рисунка.

ВЫВОДЫ

1. Последние эпидосложнения по холере в регионе (1999 г.) возникли в результате заноса инфекции из Китая, накопления возбудителя в поверхностных водоемах и реализации водного пути передачи. Отсутствие в последующее десятилетие выявленных заносных случаев заболевания одновременно с ежегодным длительным выделением холерного вибриона из объектов водной окружающей среды характеризует эпидемиологическую обстановку по холере в Сибири и на Дальнем Востоке как относительно благополучную. Вместе с тем все возрастающая интенсивность миграционных потоков (из неблагополучных по холере стран), постоянные эпидемические осложнения в близлежащих странах Южной, Юго-Восточной и Центральной Азии и установленные пути проникновения холеры в регион свидетельствуют о высоком риске заноса инфекции.

2. В местах неорганизованного отдыха населения, не являющихся узаконенными зонами рекреации, но использующихся для купания, обнаружено около 90 % штаммов нетоксигенного холерного вибриона эльтор, что дает основание при мониторинге водоемов для выбора здесь точек забора проб.

3. Закономерное обнаружение микроорганизмов рода Vibrio в поверхностных водоемах в период эпидблагополучия по холере на фоне существенных нарушений санитарно-гигиенических требований к качеству их воды является показателем - загрязнения водных объектов хозяйственно-бытовыми сточными водами. Выявление холерного вибриона происходит при определенных показателях температуры и рН на фоне обнаружения значительной численности и разнообразия сине-зеленых водорослей (iCyanophyta): Anabaena sp., Oscillatoria, видов рода Cryptomonas отдела Cryptophyta и разных форм хитинсодержащего зоопланктона, которые (в натуральном виде или в виде продуктов их метаболизма) могут быть использованы вибрионами в.качестве питательного субстрата.

4. Разработанная мультиплексная ПЦР в- комплексе с реакцией иммунофлуоресценции в, ходе проведения бактериологического анализа дает возможность: получить оперативную информацию о наличии' в пробе генов и антигенов возбудителя 01 и 0139 серогрупп,, причем; частота их обнаружения; составляет 22,6 .% и 25,8 %, что заметно превышает возможность бактериологического метода:

5: Штаммы холерного вибриона из поверхностных водоемов в условиях эпидемиологического благополучия характеризуются высокой вариабельностью ^ культурально-морфологических, агглютинабельных. и фаголизабельных свойств (количество типичных штаммов составляет всего 16.7%). Штаммы холерного вибриона чувствительны к ципрофлоксацину, гентамицину, цефотаксиму, хлорамфениколу.: У всех культур отсутствуют основные гены вирулентности; входящие в- состав профагов СТХф (ctxAB, zof), RS1 (rstC) и острова патогенности VPI-1 (tcpA). По наличию других генетических элементов: острова патогенности VPI-2 (папН), острова пандемичности VSP-1 и VSP-2 (tnp0183, deo 0175 и pro 0490, pro 0496), острова персистенции EPI (mshA, mshQ), а также участка консервативной; части хромосомы - сайта для внедрения в неё умеренных фагов СТХф и RSI (attRS) и тгиов карА, mboAl, mbaA2 и vpsR (всего 12 генов) эти штаммы вариабельны. Штаммы V. cholerae 0139 из внешней среды,не содержат гены mshA и mshQ острова персистенции ЕР1.

6. Штаммы V. cholerae eltor обладают широким, диапазоном способности формировать биопленку (со значениями оптической плотности при QD570 0,2 — 4,5). Культуры V. cholerae 0139 серогруппы проявляют , гораздо меньший размах показателей (значения'оптической .плотности при OD570 0,53 — 1,85). Выделенный из поверхностного водоема во время вспышки холеры токсигенный вибрион эльтор; в сравнении с таковым от больных холерой, обладает выраженной способностью к образованию биопленки. Признаками формирования биопленки является наличие периферической её части из прилегающих друг к другу вибрионов; их полиморфизм (палочки, кокковидные, полые, округлые неокрашенные) и появление полисахаридного матрикса, выявляемого при световой микроскопии различными методами окраски. В процессе образования биопленки показана изменчивость холерного вибриона в его основных формах — переход в стабильный шероховатый ЯО-в ар и ант (с сохранением исходного набора генов патогенности) и в некультивируемое состояние.