Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Управление эпитопной специфичностью иммунохимического анализа антибактериальных соединений

на правах рукописи

Буркин Максим Алексеевич

УПРАВЛЕНИЕ ЭПИТОПНОИ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

3 П ЯНЗ 2014

МОСКВА-2013

005544612

005544612

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты:

Еремин Сергей Александрович, доктор химических наук, профессор, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник

Свешников Петр Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения», генеральный директор

Фирсов Александр Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе» Российской академии медицинских наук, директор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится 17 апреля 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Яковлева Ирина Владимировна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Огромное число низкомолекулярных физиологически активных соединений являются важными эндогенными субстанциями организма, используются в качестве лекарственных средств или же, напротив, токсичны и неблагоприятно влияют на здоровье человека, домашних и диких животных, растения и экосферу в целом и, в связи с этим являются предметом пристального внимания и изучения. Особое место среди этих соединений занимают антибиотики, которые служат терапевтическим средством в медицине и ветеринарии, используются для профилактики инфекционных заболеваний и стимуляции роста животных и растений, а также могут присутствовать в качестве контаминантов в продукции животноводства, воде, загрязнять почву, проникать в растения и использоваться как консерванты. Создавая определенный фон в окружающей среде, эти соединения оказывают влияние на экологию, способствуют селекции резистентных микроорганизмов, являются фактором, изменяющим иммунологическую реактивность населения, вызывают аллергические реакции. Рост антибиотикорезистентности среди патогенной микрофлоры вызывает серьезную обеспокоенность у клиницистов и требует создания новых активных препаратов, оптимизации и контроля за применением существующих лекарственных средств (Страчунский JL и др. 2002; Волосовец А. и др., 2007; Heuer Н. et. al, 2011; Wright G. 2012; WHO, 2012).

Анализ, использующий антитела в качестве специфического детектора таких соединений, остается наиболее чувствительным, сравнительно недорогим и широко используется в медицинской диагностике, для проведения лекарственного и экологического мониторинга, контроля качества продуктов питания и ветеринарно-санитарного контроля, в научных исследованиях и смежных областях. Высокая чувствительность и возможность выявления определенного антибиотика среди других соединений с антибактериальной активностью выгодно отличают

иммунохимические методы анализа от рутинно используемых для этих целей микробиологических тестов. Однако, специфичность определения низкомолекулярных соединений с помощью иммунохимических методов анализа тесно связана с проблемой перекрестной активности структурных аналогов, которая влияет на правильность измерения основного аналита, затрудняет идентификацию и является причиной ложнопозитивных результатов. В тоже время этот «недостаток» активно используется при создании экономически оправданных скрининговых тестов с групповым распознаванием структурно родственных молекул (Loomans Е. et al., 2003; Pastor-Navarro N. et al., 2007; Wang Z. et al., 2007; Cao L. et al., 2009; Guo Y. et al., 2010; Jiang W. et al., 2013). Конструирование иммуноанализа со строго селективным определением единственного соединения или обладающего наиболее выраженной групповой специфичностью в отношении нескольких аналитов возможно при условии использования эпитоп-специфических антител. Однако, получение антител, способных выявлять различия между сходными соединениями или распознавать их общие черты, связано с рядом трудностей. Гибридомная технология, фаговый дисплей и аффинная хроматография позволяют реализовать такую задачу. Принцип селекции эпитоп-специфических антител основан на выделении искомого варианта из репертуара В-клеток, библиотек V-генов или сывороточных антител определенной специфичности. Однако, трудоемкая процедура многоэтапного скрининга сопровождается потерями потенциальных редких продуцентов или утратой активности антител в ходе их выделения.

В настоящем исследовании предложен новый подход селекции эпитоп-специфических антител из иммунных сывороток животных - за счет создания условий для избирательного взаимодействия антител определенной эпитопной направленности. Избирательность такого взаимодействия обеспечивалась уникальностью структуры антигена, несущего детерминанты гаптена, общие для группы соединений или индивидуальные. Созданию

таких антигенов и изучению их влияния на специфичность иммуноанализа антибактериальных соединений посвящено настоящее исследование.

Цель исследования - экспериментальное обоснование возможности управления эпитопной специфичностью иммуноанализа низкомолекулярных соединений посредством структурной модификации конъюгированных антигенов и использование этого подхода для группового и избирательного определения антибактериальных препаратов.

Задачи исследования:

1. Создать панель реагентов для иммунохимической детекции антибиотиков различных фармакологических групп: синтезировать конъюгированные антигены на основе антибиотиков, получить специфичные к ним иммунные сыворотки и моноклональные антитела.

2. Разработать на основе приготовленных иммунореагентов варианты иммуноанализа для группового/селективного определения антибиотиков и изучить их аналитические характеристики.

3. Оценить вклад структуры иммуногена в спектр специфичности антител и влияние структурного дизайна иммобилизованного антигена на параметры специфичности анализа.

4. Провести сравнительный анализ характеристик иммуноферментных тестов на основе моноклональных и поликлональных антител.

5. Исследовать влияние матрикса вероятных объектов экспертизы на иммунохимическую реакцию, разработать процедуру пробоподготовки исследуемых объектов и адаптировать разработанные тесты для их анализа.

6. Оценить содержание антибиотиков в вакцинных препаратах, биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях, а также в продуктах питания животного происхождения.

Научная новизна

Впервые предложен и экспериментально обоснован подход, позволяющий управлять эпитопной специфичностью иммуноанализа антибактериальных соединений на основе поликлональных антител посредством презентации ключевых эпитопов на конъюгированных антигенах.

• Экспериментально доказано, что принцип предложенного подхода основан на избирательном связывании сывороточных антител с определенной эпитопной направленностью. Наличие в иммунной сыворотке антител различной специфичности подтверждено при разделении антисыворотки к рибостамицину на аффинных сорбентах с гетерологичными гаптенами апрамицином и неомицином. Установлено, что фракции антител, несвязанных с сорбентом, отличны от исходной антисыворотки по профилю перекрестной активности со структурными аналогами.

• Показано, что дизайн иммобилизованного антигена влияет на характер специфичности иммуноанализа, позволяет настраивать его как на селективность в отношении основного аналита, так и на групповое распознавание ряда соединений. Выявлено, что на профиль перекрестно-реагирующих соединений оказывает влияние главным образом тип гаптена, входящего в структуру конъюгата, тогда как метод синтеза и сайт конъюгирования имеют второстепенное значение, а наличие и длина спейсера не являются значимыми факторами.

• Впервые показано, что эквивалентная перекрестная активность структурных аналогов тилозина и тилмикозина позволяет проводить их совместное количественное определение.

• Впервые синтезированы конъюгированные антигены гликопептидных антибиотиков эремомицина и ристомицина, макролида кларитромицина, соединений группы фторхинолонов гемифлоксацина и спарфлоксацина, к ним получены антитела и созданы иммуноферментные системы анализа этих соединений.

Предложены оригинальные способы синтеза конъюгированных антигенов на основе фторхинолонов (формальдегидная конденсация), тетрациклинов (взаимодействие с периодат-окисленным гликопротеином по амидной группировке), аминогликозидов (периодатное окисление рибостамицина, глутаральдегидная полимеризация неомицина) и амфениколов (конъюгирование глюкуронида левомицетина методом активированных эфиров). Продемонстрирована эффективность их использования.

• Показано, что иммунореагенты на основе конъюгированных антигенов с множественной ориентацией гаптена, обеспечивают селективность анализа. Подтверждением являются разработанные иммуноанализы аминогликозидов гентамицина, канамицина, неомицина, апрамицина и стрептомицина.

• Разработаны тесты группового иммуноферментного определения тетрациклинов (тетра-, хлортетра-, окси- и доксициклина с перекрестной активностью в диапазоне 100-25%), аминогликозидов (нео-, кана- и гентамицина, 100-9%), фторхинолонов (энро-, ципро-, геми-, пе-, нор, о-, ломе-, лево- и спарфлоксацина, 108-9%), макролидов (кларитро-, рокситро- и эритромицина, 150-100%, тилозина, тилмикозина, (100%), тилозина, спиромицина, 100-50%) линкозамидов (клиндамицина и линкомицина, 111100%) и гликопептидов (ристо-, ванко-, эремомицина и тейкопланина, 10037%) с показателями групповых характеристик, не уступающими и даже превосходящими описанные в литературе для аналогичных систем анализа.

• Впервые созданный иммуноферментный анализ эремомицина позволил изучить фармакокинетические параметры этого нового гликопептидного антибиотика после его инфузионного введения здоровым добровольцам и установить корреляцию с данными высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Практическая значимость

• Разработанный подход для регулирования специфичности иммуноанализа дает возможность более эффективно использовать потенциал иммунореагентов, позволяя на основе одного препарата антител создавать как селективные, так и групповые тесты.

Разработанные оригинальные схемы синтеза конъюгированных антигенов могут служить основанием для дальнейших работ по конструированию конъюгатов соответствующих гаптенов.

• Разработаны методы иммуноферментного анализа антибиотиков 7 фармакологических групп - с групповым распознаванием фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, аминогликозидов, 14-членных макролидов, макролидов с 16-членным лактонным кольцом, гликопептидов подгрупп ванкомицина и ристомицина, а также селективным распознаванием гемифлоксацина, левомицетина, канамицина, гентамицина, неомицина, апрамицина, стрептомицина, тилозина, эремомицина, тейкопланина и ристомицина с чувствительностью на нанограмовом уровне.

• Применение разработанных систем анализа позволило выявить в ряде образцов вирусных вакцинных препаратов против кори, краснухи и паротита гентамицин, неомицин и канамицин. Контроль сырья (птичьих эмбрионов, сред, сывороток), используемого для наработки вакцинного вируса, выявил в яйцах кур и перепелов присутствие антибиотиков 5 групп - левомицетина, тетрациклина, бацитрацина, фторхинолонов и неомицина.

• Разработанный иммуноферментный анализ эремомицина может быть использован в лабораторных и клинических условиях для исследования фармакокинетики антибиотиков в биологических жидкостях организма.

• Предложены схемы пробоподготовки и новые пути преодоления матрикс-эффекта продуктов животного происхождения, основанные на использовании имитаторов матрикса.

Моделирование температурного воздействия на аминогликозиды, левомицетин, линкомицин, тилозин при стерилизации и термической

обработке продуктов питания показало стабильность иммунохимической активности антибиотиков.

• При скрининговом исследовании продуктов питания с помощью созданных иммунотестов получены данные о распространенности и степени контаминации продукции антибиотиками. Полученные сведения могут являться ориентиром при рассмотрении вопроса о нормировании нерегламентированных в РФ антибиотиков в продуктах питания и послужить стимулом для дальнейших направленных исследований этого вопроса.

• Разработанные системы анализа пригодны для контроля содержания антибиотиков в вакцинных препаратах, для проведения лекарственного мониторинга, осуществления контроля за безопасностью продуктов питания, экологического мониторинга и в других областях, где необходимо чувствительное и специфичное определение антибиотиков, относящихся к группам фторхинолонов, тетрациклинов, амфениколов, линкозамидов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Презентация ключевых эпитопов на иммобилизованных антигенах позволяет управлять эпитопной специфичностью анализа на основе поликлональных антител и конструировать тесты для селективного и группового выявления низкомолекулярных соединений.

2. Получены иммунореагенты и разработаны методы иммуноферментного определения антибиотиков, представителей 7 фармакологических групп: фторхинолонов, тетрациклинов, линкозамидов, фениколов, аминогликозидов, макролидов и гликопептидов.

3. Разработанные системы иммуноферментного анализа пригодны для измерения концентрации анализируемых соединений в иммунобиологических препаратах, биожидкостях организма человека и продуктах питания животного происхождения.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XII Международном конгрессе MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. (Москва, 2010), Международной конференции «Пчеловодство - 21 век. Пчеловодство, апитерапия и качество жизни» (Москва, 2010), XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье» (Москва, 2010), Шестом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 2011), XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), III Съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии токсикологии и фармации» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), Xlth International Conference on AgriFood Antibodies (ICAFA) (Vienna, Austria, 2012).

Апробация диссертации состоялась 31 октября 2013 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Публикации результатов исследований.

По теме диссертационной работы опубликовано 28 печатных работ, в том числе 11 статей в российских журналах и 6 статей в зарубежных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источников, из которых 42 - отечественных и 243 - зарубежных. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 60 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антибиотики: Фтор/хинолоны (ципрофлоксацин, энрофлоксацин, норфлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин, гемифлоксацин и налидиксовая кислота). Тетрациклины (тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, миноциклин, лимециклин, метациклин). Линкозамиды (клиндамицин, линкомицин). Аминогликозиды (гентамицин, сизомицин, нетилмицин, канамицин, тобрамицин, амикацин, неомицин В, неамин, рибостамицин, стрептомицин, дигидрострептомицин, апрамицин, спектиномицин). Амфениколы (левомицетин, левомицетин основание, левомицетин сукцинат, левомицетин глюкуронид, тиамфеникол, флорфеникол). Макролиды (тилозин, тилмикозин, спирамицин, эритромицин, рокситромицин, азитромицин. Десмикозин и О-микаминозилтилонолид получены из НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского). Макролиды кларитромицин и карбоксиметилоксим кларитромицина, а также гликопептидные антибиотики эремомицин, ванкомицин, тейкопланин и ристомицин А получены из ФГБУ «НИИНА» РАМН).

Макромолекулярные носители. а1- кислый гликопротеин из бычьей плазмы, ботулинический анатоксин типа А, бычий сывороточный альбумин, гемоцианин улитки, глюкозоксидаза, желатина, кроличий сывороточный альбумин, кроличий гаммаглобулин, липополисахарид В ЕзсНепсЫа.соИ

026:В6, пероксидаза хрена, трансферрнн человека, фетуин, яичный альбумин. ТХУ-преципитат среды культивирования Bordetella, pertussis шт. 475 (ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова»),

Вакцинные препараты: Против клещевого энцефалита (ФСМЕ-ИММУН и ФСМЕ-ИММУН Джуниор). Против гепатитов А и В (Хаврикс, Эувакс В и Регевак В). Против гриппа (Ваксигрипп, Моногриппол плюс, Гриппол, Пандефлю, Агриппал S1, Инфлювак). Против полиомиелита (Имовакс полио). Против Hemophilus influensae тип В (Акт-ХИБ). Против дифтерии, столбняка и коклюша (АДС-М, Инфанрикс). Против кори, краснухи, паротита (Приорикс, Вакцины паротитная, паротитно-коревая, против краснухи, живая паротитная и культуральная живая коревая вакцины. Среды культивирования вакцинного вируса паротита и вируса кори получены из ФГУП НПО «Микроген»),

Биожидкости человека. Образцы сывороток крови от 6 здоровых добровольцев (7-13 образцов от каждого добровольца), участвовавших в клинических испытаниях антибиотика эремомицина, получали из ФГУ «ГНИ центр профилактической медицины» Минздравсоцразвития. Образцы сывороток крови и мочи для проведения тестов на открытие получали в консультативно-поликлиническом отделении ФГБУ «НИИВС им. И.И.Мечникова».

Продукты питания. Использованы образцы из розничной торговой сети: молоко и сливки (140 образцов), произведенное на территории европейской части РФ и ближайшего зарубежья в 2008-2012 гг. Куриные и перепелиные яйца (86 образцов) из 38 птицеводческих хозяйств европейской территории РФ, произведенные в период 2010-2011 гг. Мед (122 образца) различного ботанического происхождения, российского и зарубежного производства 2009-2012 гг, а также образцы куриного, говяжьего и свиного мяса и субпродуктов.

Животные. Кролики породы шиншилла (2.5-3 кг) и мыши линии ВАЬВ/с (15-20 г) были получены из питомников НЦ биомедицинских технологий РАМН (филиал «Электрогорский» и «Андреевка»),

Методы синтеза конъюгированных молекул использовали для создания антигенных структур с презентацией эпитопов-мишеней. Всего в работе было синтезировано более 200 конъюгированных антигенов. Для их приготовления использовали антибиотики 7 фармакологических групп (31 гаптен), которые конъюгировали с 14 крупномолекулярными носителями в 8 реакциях органического синтеза - карбодиимидной (кди) и формальдегидной (ф) конденсации, реакции активированных эфиров (аэ), восстановительном аминировании альдегидов, периодатном окислении (пи), при использовании сшивающих агентов глутаральдегида (га), диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (дэ), дигидразида адипиновой кислоты (адг). Конъюгирование проводили по 6 функциональным группировкам гаптена (карбоксильным, фенильным, резорциловым, альдегидным, гликольным и аминогруппам) и использовали различные мольные соотношения носитель:гаптен (1/5 — 1/300). Кроме того, в ряде случаев белок-носитель модифицировали введением дополнительных карбоксильных или аминогрупп, а в качестве связующего звена между гаптеном и носителем использовали 6 различных спейсеров с длиной цепи 2,4, 5, 6, 10 и 12 атомов.

Спектрофотометрический анализ использовался для уточнения концентрации соединений по известным показателям экстинкции (е), подтверждения и оценки эффективности конъюгирования, а также для вычисления гаптенной нагрузки - соотношения гаптен : белок в конъюгате. Спектры для соединений и их конъюгатов, обладающих характерным и выраженным поглощением в УФ и видимой области спектра регистрировались с помощью сканирующего спектрофотометра НкасЫ-557 (Япония).

Гипериммунные сыворотки к антибиотикам получали в результате иммунизации кроликов конъюгированными антигенами 3-9-кратно с

месячными интервалами. В качестве адъюванта использовали полный адъювант Фрейнда. Развитие иммунного ответа оценивали в ИФА по чувствительности определения аналита.

Гибридомная технология. Процедуру получения моноклональных антител (МкАт) выполняли в соответствии с классической методикой. [Kohler G.& Milstein С. 1975; Свиридов В.В. и др. 1986]. Мышей BALB/c иммунизировали по индивидуальным схемам, на 4е сутки после заключительного введения иммуногена осуществляли гибридизацию иммунных спленоцитов с миеломными клетками линии P3-X63-Ag8.653 в соотношении 10:1 - 5:1 с помощью ПЭГ 1550. В исследованиях использовали МкАт в виде сульфат-аммонийных преципитатов среды культивирования или в виде асцитических жидкостей.

Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) использовали для подтверждения образования конъюгата гаптена с носителем, первичного скрининга гибридных культур, исследования активности препаратов полученных моноклональных (МкАт) и поликлональных антител (ПкАт), определения класса иммуноглобулинов МкАт и оптимальных концентраций иммунореагентов, а также матричного эффекта объектов экспертизы.

Исследование динамики иммунного ответа, определение аналитических характеристик - специфичности, чувствительности (IC50 -концентрации 50% подавления связывания антител,) перекрестной реактивности (ПР) структурно родственных соединений, воспроизводимости и предела определения (1С2о), извлечение анализируемых соединений по методу «введено-найдено» и их определение в объектах выполняли в условиях непрямого конкурентного ИФА.

Аффинная хроматография антисыворотки к рибостамицину на сорбентах с иммобилизованными гетерологичными гаптенами выполнялась для разделения ПкАт по эпитопной специфичности.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию выполняли на хроматографическом комплексе «Waters», США в качестве метода сравнения при определении концентрации эремомицина в пробах плазмы крови добровольцев.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью параметрических методов статистики, средствами программного обеспечения Excel Microsoft 10.0 и Origin Pro 8.0. Достоверными считали различия при уровне р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние структурного дизайна иммуногена на специфичность иммуноанализа

Структура гаптена, а именно презентация его ключевых эпитопов на иммуногене, определяет направленность иммунной реакции организма. В ряде случаев соблюдение этого принципа обеспечивает получение антител нужной эпитопной специфичности, создание на их основе анализа с необходимым спектром распознавания аналитов и не требует коррекции.

Например, в иммуногене БСА-ЛИН (пи) отличительный фрагмент молекул линкомицина (-ОН) и клиндамицина (-С1) (рис.1) был экранирован белком, а экспозиция общих эпитопов способствовала равноценному распознаванию этих линкозамидов индуцированными антителами. Взаимодействие антител с антигенами гетерологичными по гаптену (КЛИН-конъюгаты) и наличию спейсера (1,2-этилендиамина или 1,6-гександиамина) между гаптеном и белком не изменяло групповой специфичности анализа этих линкозамидов.

СВЁЛНГ) 100

Р = С1

линкомицин

я «он

КЛИНДАМИЦИН

:

^ • лин

» клин (111%)

.

о 1СМ= 16.6 18.5

§

[антибиотик], нг/мл :

0,1 1 10 100 1000

Рис. 1. Групповое распознавание линкозамидов линкомицнна и клиндамииина.

Примечание. Здесь и далее. В/Во - относительное связывание антител; Ъ - спенсер между гаптсном и белком; Носитель в иммобилизованных антигенах обозначен • белок (желт.), в иммуногенах - белок (краен.).

Аналогичного результата группового распознавания 14-члснных макролилов удалось достичь с помощью специальной конструкции иммуногена. Молекулы макролидов (рис. 2) имеют в своем составе одинаковые углеводные фрагменты - десозамин и кладинозу. Поэтому для создания фуппового нммуноанализа был специально синтезирован гаптен кмоКЛА. его конъюгация с БСА обеспечила презентацию этих углеводных эпитопов и позволила сфокусировать на них иммунную реакцию организма. Таким образом, достичь группового распознавания макролидов оказалось возможным благодаря правильно-спланированному дизайну иммуногена. Наряду с групповым определением эритромицина (100%), кларитро- и роксигромицнна (150%) полученные нммунорсагенты могли также выявлять 15-членный азитромицин в диапазоне концентрации 1000-0.1 нг/мл.

16

ОН о

ЭРИТРОМИЦИН -о,

'ио V-

Iм0 N

Йед^кг 80;

° кларитромицин ад ^

он

азитромицин

рокситромицин

о

си

40 о

20 о

V

I

0.01 0.1

[антибиотик], нг/мл

Ю„ ПР (нг/мл) |Ч)

• ЭРИ 0.15 - 100

• КЛА 0.10 - 150

• РОКС 0.10 • 150

• АЗИ З.М • 2.6

I

10 100 1000

Рис. 2. Групповой иммуноанализ 14-членных макролидов и азигромицина. Примечание. Структуры иммуногена и иммобилизованного антигена гомологичны.

Иммунохимическое спределение амнногликозидов характеризуется высокой селективностью, причина которой связана с особенностью строения и коньки нрования этих соединений. Наличие нескольких реакционно-способных аминов и гидроксильных групп у и их соединений (рис.3) является причиной образования конъютатов с множественной ориентацией гаптена. Антитела, полученные к таким антигенам, распознают гаптен «всесторонне», что предопределяет избирательность его детекции по сравнению с аналогами (рис. ЗА). Направленный ответ к общей для ряда

аминоглнкозидов детерминанте - 2-дезоксистрсптамину (*) достигался за счет оптимальной экспозиции этого эпитопа на конъюгате рибостамицнна (РС). Такая ориентация этого гаптена на иммуногене обеспечивалась процедурой синтеза при периодатном окислении РС, а полученные антитела

17

могли выявлять аминопыкознды разных семейств - нсомицин, канамицин, гсптаминин и апрамицин с чувствительностью (1С») 1.9, 7.3, 21 и 317 нг/мл. соответственно (рис. ЗБ).

СТРЕЛТОМИЦИН АЛРАМИШ»!

РИБОСТАМИЦИН но мц НН,

I [штибиотии]. иг/мл

0,01 0.1 1 10 1 00 0.1 А селективные иммумоаналиэы

кдмшмин

[антибиотик]. нггыл 1 10 100 1000 групповой иммуноанализ Б

Рис.3. Определение амкногликозидов в селективных (А) и фупповом (Б) ИФА

Примечание. * - общий дл* амнноглнкозидов 2-ДОС фрагмент.

Роль дизайна иммуногена в формировании специфичности анализа иллюстрирует пример нммуноанализа гликопептидов тейкоплаиина (ТПЛ) и ристомицина (РИСТ). Синтез ТПЛ-иммуногсна проводили с целью экспонировать на нем индивидуальные детерминанты гаитена (Рис. 4). Конструкция полученного БСА-ТПЛ (аэ) не предполагала образование антител к общегрупповым энитопам, а селективность распознавания ТПЛ не претерпевала изменений в зависимости от дизайна иммобилизованного антигена.

Для индукции синтеза антител с групповым распознаванием отличительный углеюдный фрагмент РИСТ был подвергнут деструкции в ходе конъюгированкя и экранирован носителем. Анализ на основе полученных ПкАт также был селективным, но лишь при иммобилизации гомологичных конъюгатов. Настроить анализ на групповое распознавание структурных аналогом оказалось возможным при подборе соответствующего гетерологичного антигена (см. ниже).

Рис. 4. Структура гликопептидных антибиотиков и иммуногенов на их основе БСА-РИСТ (пн) и БСА-ТПЛ (аэ).

Таким образом, структурный дизайн иммуногена является фактором, определяющим направленность иммунного ответа, а спектр индуцированных антител может обеспечить необходимую специфичность иммуноанализа. Вносить возможные изменения в специфичность и профиль перекрестно-реагирующих соединений позволяет структура иммобилизованного антигена, несущего целевые эпитопы. Роль различных структурных элементов иммобилизованных конъюгатов в управлении спектром выявляемых аналитов исследовалась в работе.

не

О НО

. РИСТОМИЦИН 0Н ТЕЙКОПЛАНИН

I Л о»

у ^

он

Влияние mua i amena н hmmoôh.ih юнаниых koiii.hii aia\ яя специфичность иичуноанаппа

Механизм влияния иммобилизованного антигена на избирательную сорбцию сывороточных антител с определенной эпитопной направленностью был проиллюстрирован разделением антисыворотки к рибостамицину на аффинных сорбентах с гетсрологнчными гаптенами нсомицином н апрамицином. Профиль ПР исходной антн-БСА-РС сыворотки и антител, полученных в рС1ультате ее истощения, видоизменялся - распознавание одних аналогов улучшалось и ухудшалось для других (табл. I). что подтверждает, во-тервых, наличие в составе антисывороток антител разной эпитопной направленности и, во-вторых, возможности их разделения посредством избирательного взаимодействия с антигенами различного эпитопного состав*.

Таблица I. Распознавание амнногликозидов антисывороткой к БСА-РС(ш) до и после се истоцения на сорбентах с гетсрологнчными гаптенами.

Истощение Анта-БСА-Рибостамнцин на сорбентах Определение амнногликозидов 1С», нг/мл

Неомицин Гснтамицин Канамицин Апрамицгн

До истощения 60±12,6 65±8,3 140±36 550±48

1 leoMHHHH-Sephaiose 150±18 6100*430 2512,0 >10000

А п ра м и ци н - Scpharosc 620±62 >10000 >10000 >10000

Примечание. Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки.

На панели из 10 препаратов фтор/хинолонового (ФХ) ряда показано, что, несмотря на дизайн иммуногена, предполагающий индукцию антител селективной направленности, изменения иммобилизованного антигева позволяют расширить спектр специфичности ИФА за счет лучшего распознавания отдельных соединении (рис. 5).

диапазон значении перекрестного взаимодействия для 10 фтор'хинолонов

У У Сзу^мн-^ У

О О!^^ О ОН О ОН

Жал-ЦФ (а» БСА-ЦФ (ф) ЯА-ЦФ (кди)

у ни-Ц , У нЛ ; У

5 ¿„ 5 —»►мм, о ОН НН.О он

Жал-ГФ (га) ЯА-СФ (га) Жал-СФ (а»

^ чцл Г' у

о он о он о он

Норфлоксацин (НФ) Пафлоксацнм (Пф) Эмрофлоисации (ЭФ)

-М—, о-^ ^п^ о^у* ММ"^ Г

^¿хх-

о он о он о он

Офлоксации (ОФ) Лааофлоксацин (ЛаФ) Ломафпоксацин (ЛоФ)

Рнс. 5. Влияние дизайна иммобили юванных конъюгатов на профиль перекрестного втанмолсйствия фтор/хинолонов в ИФА

В процессе приготовления иммуногена БСА-ЦФ(аэ) (конъюгат 1) происходило экранирование карбоксильной группы хинолона ЦФ -общегруппового эпитопа ФХ, таким образом, на молекуле иммуногена оказывались лучше экспонированы индивидуальные эпитопы ЦФ. Диапазон значений перекрестного взаимодействия для 10 ФХ в гомологичном формате анализа составил 100-0.4%. Гетерологичный конъюгат на основе спарфлоксацина (СФ) (конъюгат 5) изменил спектр антител вовлеченных в связывание, что привело к усилению конкурентоспособности ломефлоксацина, налидиксовой кислоты, левофлоксацина и спарфлоксацина в 5-10 раз. При этом ПР-диапазон для 10 ФХ сократился более чем на порядок (114 - 5.4%) (табл. 2).

На примере анализа антибиотиков группы тетрациклинов была продемонстрирована возможность улучшения параметров их группового распознавания антисывороткой к БСА-ТЦ(ф) (рис. 6). Для избирательного связывания антител сыворотки с максимально выраженными свойствами группового распознавания была испытана панель из 16 твердофазных конъюгатов, синтезированных четырьмя способами с использованием основе 7 гаптенов - тетрациклина (ТЦ), хлортетрациклина (ХТЦ), окситетрациклина (ОТЦ), доксициклина (ДЦ), метациклина (МеЦ), миноциклина (МиЦ) и лимециклина (ЛЦ). Изучение влияния дизайна иммобилизованного антигена позволило выявить вариант ИФА с наилучшими групповыми характеристиками. Так, для 7 представителей этой группы антибиотиков ПР-диапазон сократился с 16 до 5 раз. Для 4 препаратов - тетрациклина, хлортетрациклина, окситетрациклина и доксициклина, для которых установлен максимально допустимый уровень (МДУ) содержания в продуктах питания, различия в перекрестной активности сократилась до 4 раз. Кроме того, были найдены условия анализа, при которых ТЦ и ХТЦ (иммобилизованный Жел-ДЦ(ф)), а также ТЦ и ДЦ (иммобилизованный ТФ-ОТЦ(пи)) проявляли иммунохимическую эквивалентность (табл. 2).

Таблица 2. Влияние иммобилизованного конъюгата на профиль

перекрестного взаимодействия анализируемых соединений

Иммуноген Анализируемые соединения Перекрестное взаимодействие, % (1С5о, нг/ мл) при использовании иммобилизованных конъюгатов

БСА-ЦФ (аэ) Жел-ЦФ (аэ) ЯА-СФ (га)

ципрофлоксацин 100 (5.9) 100(1.6)

гемифлоксацин 53.6 34.8

энрофлоксацин 67.8 114

норфлоксацин 40.7 25

пефлоксацин 24 34.8

ломефлоксацин 5.1 41

налидиксовая к-та 0.4 6

офлоксацин 8.5 5.4

левофлоксацин 5 23.5

спарфлоксацин 3.3 34.8

БСА-ТЦ (ф) Жел-ТЦ(ф) ТФ-ХТЦ (пи) ТФ-ОТЦ (пи) Жел- ДЦ(Ф)

тетрациклин 100 (2.8) 100(6.0) 100(22.4) 100(8.1)

хлортетрациклин 36.4 84.5 133 100

окситетрациклин 18.3 25.3 33.5 24.9

доксициклин 16.4 50.4 100 30.9

БСА-ТИЛ Жел-ТИЛ Жел-ДМН Жел-СПИР

тилозин 100 (0.4) 100 (0.9) 100(0.3)

десмикозин 1.7 129 н/о

тилмикозин <0.4 100 0.4

спирамицин 0.4 <0.9 50

ГО-ЭРМ (га) БСА/Жел-ЭРМ (6*) БСА/Жел-ВКМ (6*)

эремомицин 100 (0.9-10.1) 100 (2.6-7.1)

ванкомицин 0.19-1.7 52-100

БСА-РИСТ (пи) Жел-РИСТ (6*) Жел-ТПЛ (пи)

ристомицин 100(12-52) 100 (90)

тейкопланин <0.04-<0.3 37

эремомицин <0.04-<0.3 37

ванкомицин <0.04-<0.3 100

Примечание. В обозначении конъюгатов указан Носитель-Гаптен (Метод конъюгирования). 6* - синтез конъюгатов гликопептидов осуществляли в 6 различных реакциях (см. рис. 9).

ТЦ ХТЦ ОТЦ МеЦ МиЦ ДЦ ЛЦ ПЦ ТЦ ХТЦ ОТЦ МеЦ МиЦ ДЦ ЛЦ ЛЦ

I Г» | | Формлльдегидная конденсация о | | АЭ |

Периодатное окисление гликолротеина (ПИ)

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ НА ОСНОВЕ ГАПТЕНОв И МЕТОДЫ ИХ КОНЪЮГИРОВАНИЯ

диапазон значений перекрестного взаимодействия для 7 тетрациклинов

Рис. 6. Влияние дизайна иммобилизованного антигена на профиль перекрестного взаимодействия тетраииклинов в ИФА.

На примере 16-членных макролидов показана возможность управления специфичностью анализа и использования одних и тех же ПкАт к БСА-ТИЛ для различных аналитических целей. Как видно из табл. 2, использование гомологичного конъюгата Жсл-ТИЛ обеспечило селективное распознавание тилозина (ТИЛ) благодаря участию в связывании всех антител, индуцированных на этот гантсн. Исключение индивидуальных эпитопов ТИЛ и экспозиция общих эпитопов для ТИЛ и тилмикозина (ТМИ) посредством иммобилизации на твердой фазе планшетов дссмикознна (Жел-ДМН) обеспечило их равнозначное распознавание (рис. 7).

В подобранных условиях. при использовании одинаковой концентрации антител и единого калибровочного стандарта (ТИЛ) оба формата анализа могли быть объединены в один тандемный тест для

одновременного совместного и раздельного выявления ТИЛ и ГМН. Данный вариант анализа позволил экспериментально подтвердить тезис о возможном совместном количественном определении аналогов при их эквивалентной иммунохимической активности.

Чтобы распространить специфичность анализа в отношении еще одного макролида, спнрамицина (СПИР), не определяемого в рассмотренных выше вариантах анализа (<1%), необходимо было задействовать в реакции антитела из антн-БСА-ТИЛ, направленные к общему для ТИЛ и СПИР эпитопу. Это было достигнуто посредством иммобилизации конъюгата Жел-СПИР, при этом пер:крестная активность СПИР возросла до 50% (рис. 7).

0.01 0.1

• ТИП (100*)

• . тим(..%)

• сл«404%)

0.4

[антибиотик]. игГыл '

110

:

0.^0 9

10 100

тип (100») тип (100*1 с™Р( •%)

[*ктибиоти<] ИГ/Ш1

ОН 001 0.1

0 30 6

10 100

77

. тил («в*:

• ТМН(04*) . СП*>(50*

[антибио1»|. нг/мга , 001 0.1 1 10 100

Рис. 7. Влияние дизайна иммобилизованного антигена на профиль перекрестного взаимодействия 16-члеиных макролидов в ИФА.

Убедительное свидетельство возможной трансформации специфичности представлено примерами нммуноаналнзов на основе ПкАт к гликопептидным антибиотикам зремомицину (ЭРМ) и ристомицину (РИСТ) (рис. 4, 8). Структура молекул гликопептидов позволила проводив конъюгированне гтих соединений по аминогруппам (рис. 9,10 А,Б). карбоксильным (В. Г), фенил'резорциловым (Д) и гликольным группировкам (Е), изучить влияние 6 различных методов синтеза иммобилизованных конъюгатов и, как следствие, разной ориентации гаптена на ПР анти-ГО-ЭРМ с другими аналогами.

Рис. 8. Структура гликопептидных антибиотиков и нммуногена ГО-ЭРМ (га).

Определение ЭРМ антителами к его конъюгату с глюкозоксидазой (ГО) было строго селективным, и при использовании гомологичных по гаптеиу твердофазных антигенов другие гликопептидиые антибиотики, ваикомицин (ВКМ), тейкопланин (ТПЛ) и ристомицин (РИСТ) не могли выявляться. Однако, иммобилизация на твердой фазе гетерологичного гаптена ВКМ. независимо от его ориентации на носителе, кардинально изменяла его распознаваемость (с 0.19-1.7% до 52-100%), трансформировала селективный анализ в групповой (ЭРМ + ВКМ) (см. табл. 2).

А 100

80

60 О ■

40 а

20

0 0 1

Б'00 . •

80

60 £

40 т

20

0

0.1

100 80 60 40

20 О

0.1

БСА-ЭРМ (га) '00

. ЭРМ

. вкм

80

БСА-ВКМ (га)

60

4-2

нг/мл

о со

10

(17%)

247 м

40 ®

0

■ ЭРМ

■ вкм

(100*)

во во

нг/мл

100 1000

0.1

ЖаЛ(ПИ)-ЭРМ

100

ЭРМ

80

\

09

нг/мл 10

. мм

(019*) ад 470

40

■

20 О

I 10 100 Жал(пи)-ВКМ

2 6 5.0

эрм

8КМ

(42*)

НГ/МЛ

100 1000

0.1

БСА-ЭРМ (иди) 100

• ' . ЭРМ

• вкм 80

• <<1%>

во

10 1 >1000

40

20

нг/мл л

1 10 100 1000 V

1 10 100 . БСА-ВКМ <кди|

1000

. ЭРМ

. вкм

(70 8*)

68,9 6

\

0.1

нг/мл 10 100

1000

I ЭРЕМОМИЦИН | [ вАНКОМИЦИН |

Г 100 БСА-ЭРМ (аэ) • 100 • БСА-ВКМ (аэ)

80 . . ЭРМ 80 < • ЭРМ

. вкм • вкм

60 о • (0.31*) ю о (60 9*)

40 В/В 2.2 711 40 ш со 5 6 «2 •

20 ■ 20

НГ/МЛ ^ — а о нг/мл • •

0.1 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

д 100 »- • есАЭРМ (ф) 100 БСА-ВКМ (ф)

80 • . ЭРМ 80 • ЭРМ

• вкм • вкм

60 о . (17%) 60 о (98 6%)

« 4 3 254 5 7.1-7.2

40 00 • 40 со 1

20 20 •

0 нг/мл о нг/мл •

0.1 1 10 100 1000 01 1 10 100 1000

100 Жал-ЭРМ (пи) 100 а^. Жал-ВКМ (пи)

Е *

во • . ЭРМ 80 • в ЭРМ

• вкм \ • ВКМ

60 о . (0 68*) 60 (92 6*)

§ 4 9 721 5 0 5.4

40 £ 40 оо !

20 „ 20

о нг/мл ■ —. 0 мг/мл •

01 1 10 100 1000 0.1 1 10 100 1000

|ЭРЕМОМИЦИН| |ВАНКОМИЦИН|

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ НА ОСНОВЕ ГЛИКОПЕПТИДОВ

Рис. 9. Влияние типа твердофазного гаптена и метода его конъюгирования с носителем на специфичность ИФА.

Методы конъюгирования - глутаральлегнлный (Л), и нериодатное окисление носителя (Ь). карОодиимидная конденсация (В), метод активированных эфиров (Г), формальдегидная конлснсаиия (Д) и пернодатное окисление гантена (Е).

А 100 80 60 40

20 0

Б100 ВО

во

40

20 О

<г

аз

0.1

100 80 60 40

20 О

Жвл-РИСТ (г«)

. РИСТ(100%)

• ТПЛ (<03%)

• вкМ(<оэ%| . ЭРМге0Э%1

нг/мл 1 10

100 80 60

40 ®

Жсл-ТПЛ (г») Г 100

• РИСТ(1(»

• тал (т

• ВКМ (421 : • ЭРМ (4 4»

11» 154 280 • 2710-

0.1

0.1

100

Ж»л(пи|РИСТ

нг/мл

10 100 1000 10000 Жол(пи)-ТПЛ

• РИСТ (100%)

• ТПЛ («О 04%)

• ВКМ(<004%) 2 ЭРМ («О 04%)

НЕТ СВЯЗЫВАНИЯ

нг/мл 1 10

Ж»Л-РИСТ (кем)

100

РИСТ (100%) ТПЛ (<02%> ВКМ (<0-2%| ЭРМ (<0.2%| нг/мл

18

БСА-ТПЛ (кди)

нет торможения

1

10

100

80 60 40

20 о

100 80 60 40 20 О

100 во 60 40

20 О

Ж«П'РНСТ (») 100

. РИСТ (100%) , . ттгп(ообЧ) 80 . ВКМ (О 05%» . ЭРМ («0 06%) 80 м

» 40

0.1

нг/мл 1 10

Жсл-РИСТ (ф)

100

0.1

. РИСТ(100%) . ТПЛ (<0 3%) . вкм(<03%1

• ЭРМ (<0 3%|

нг/мл

1 ю

3$

100

20 о 100 80 60 40 20 о

Жвл-ТПЛ (»)

" »7 3»

• РИСТ (100%)

• ТПЛ (402%)

• ВКМ (8-1%)

• ЭРМ («36*1

нгТмл

100

100 80

0.1

Жвл-РИСТ (пи)

• РИСТ (100%)

• ТПЛ (<01%)

• ВКМ (<0 1%)

• ЭРМ (<0.1%) 60 12

40

•

20 О

10 100 1000 10000 Жвл-ТПЛ (ф)

§85 393 5300

. РИСТ (100%) • ТТШ (462%)

. ВКМ (7 4%) ■

1 10 100 1000 10000

Жвл-ТПЛ (ли)

• РИСТ(100%)

• ТПЛ (37%)

• ВКМ (100%) : . ЭРМ (37%)

90 40 247 242

нг/мл 1 10

100

10

нг/мл 100 1000 10000

РИСТОМИЦИН

ТЕИКОПЛАНИН

|РИСТОМИЦИН

ТЕИКОПЛАНИН

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ НА ОСНОВЕ ГЛИКОПЕПТИДОВ

Рис. 10. Влияние типа твердофазного гаптена и метода его конъюгнрования с носителем на специфичность ИФА. А - Е - методы синтеза конъюгатов аналогичны приведенным на рис. 9.

ТПЛ и РИСТ, несмотря на принадлежность к единой группе гликопептидных антибиотиков, имеют существенные структурные отличия от ЭРМ и ВКМ. Для создания теста с групповым распознаванием аналогов в качестве иммуногена использовали конъюгат РИСТ с экранированными и подвергнутыми частичной деструкции индивидуальными эпитопами гаптена (Рис. 4). Тем не менее, при использовании иммобилизованных РИСТ-конъюгатов анализ оставался селективным независимо от способа конъюгирования антигенов (рис. 10).

Иммобилизация на твердой фазе ТПЛ-детерминанты способствовала кардинальному изменению распознавания гликопептидов с избирательного на групповое. В данном случае способ синтеза конъюгатов играл более заметную роль. Некоторые ТПЛ-конъюгаты не могли взаимодействовать с антителами (Б), связывание других не могло подавляться свободным гаптеном (В). Анализ на основе остальных вариантов антигенов хотя и характеризовался общим снижением чувствительности определения РИСТ (90-390 нг/мл), но отличался значимым изменением спектра реагирующих аналогов, наиболее выраженным в случае Жел-ТПЛх25(пи) - РИСТ (100%), ТПЛ (100%), ВКМ (37%) и ЭРМ (37%) (рис. 10Е), (табл. 2).

В данных примерах 6 различных методов конъюгирования, которые обеспечивали связь носителя с гаптенами, как минимум по 4 химическим группам гликопептидов, не оказали значимого влияния на специфичность анализа ЭРМ/ВКМ, которая целиком зависела от типа гаптена. В случае РИСТ/ТПЛ влияние метода синтеза конъюгатов было более заметным.

Влияние способа конъюгирования гаптенов на специфичность иммуноанализа изучалось и на других моделях.

Методы синтеза следующих конъюгатов Жел-ЦФ(аэ), БСА-ЦФ(ф), ЯА-ЦФ(кди) и ЯА-СФ(га), Жел-СФ(аэ) предполагали участие разных группировок гаптена в связывании и приводили к различной ориентации ЦФ и СФ на носителе (рис. 5). Исследование влияния этого фактора на ЦФ-

конъюгатах не выявило, вопреки ожиданиям, существенных изменений в профиле ПР фторхинолонов. Изменение ориентации СФ на носителях, достигнутое при ГА- и АЭ-конъюгировании, напротив, существенно изменяло (6-9 раз) ингибирующую активность ЛоФ, НК, ЛеФ, ПФ и СФ на связывание анти-БСА-ЦФ(аэ).

Сравнительный анализ ИФА вариантов на основе антигенов, различающихся по способу конъюгирования - Жел-ТЦ(ф) и ТФ-ТЦ(пи), Жел-ХТЦ(ф) и ТФ-ХТЦ(пи) выявил 2-3 кратные отличия в диапазоне значений ПР для 7 препаратов ТЦ ряда (рис. 6). Для антигенов на основе других гаптенов эти различия были менее существенными.

Способы конъюгирования аминогликозидов (ГА, КДИ, ПИ) не могли влиять на ориентацию гаптена на носителе. Наличие нескольких реакционноспособных аминов и гидроксильных групп у этих соединений являлось причиной образования конъюгированного продукта с множественной ориентацией гаптена.

Итак, процедура конъюгирования может влиять на ориентацию гаптена на носителе и, как следствие, презентацию разных его эпитопов, но этот фактор структурного дизайна антигенов по результатам экспериментов не имел решающего значения.

Влияние спейсера и его длины на специфичность иммуноанализа

Длина спейсера между носителем и молекулой ТЦ: в случае ТФ(пи)-ТЦ- О, Жел-ЛЦ(аэ) - 4, ТФ(пи)-ЛЦ- 8, Жел-ЛЦ(га) - 13 атомов не приводила к значимым изменениям в профиле перекрестной реактивности антибиотиков тетрациклинового ряда (рис. 6). Связующее глутаровое звено (С5), отличающее Жел-ЛЦ(га) от ТФ(пи)-ЛЦ, привело лишь к 2-кратному снижению распознавания отдельных аналитов — МеЦ, МиЦ и ДЦ.

Варьирование спейсером с длиной цепи 0, 7 и 8 атомов между носителем и гаптенами ЛИН, КЛИН не изменяло групповое равноэффективное распознавание этих линкозамидов (рис.1).

Использование антигенных конструкций на основе аминогликозидов (КМ, ГМ, АП), присоединенных к носителям посредством карбодиимидной конденсации (С = 0) и с помощью глутарового альдегида (С = 5), не повлияло на селективность распознавания соответствующих аналитов.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что наличие и длина связующего звена между носителем и гаптеном в конъюгате не являются фактором, способным критически изменять спектр перекрестно-реагирующих соединений.

Влияние_структурной_гетерологичности_конъюгатов_на

чувствительность иммуноанализа.

Помимо модификации профиля ПР хорошо известна способность гетерологичных антигенов улучшать такую характеристику анализа как чувствительность. Наиболее яркие примеры такого влияния на анализ антибиотиков самых разных групп представлены ниже. При использовании одних и тех же антител в зависимости от вида иммобилизованного конъюгата показатель 1С50 мог меняться в широких пределах - десятки и сотни раз: ЦФ (0.43 - 12.4 нг/мл), НК (26.8 - 1400 нг/мл), СФ (4.6 - 806 нг/мл), ТЦ (2.1 -22.4 нг/мл), ЛИН (9.2 - 47 нг/мл), НМ (0.3 - 15.4 нг/мл), ГМ (1.8 - 21 нг/мл), КМ (0.5 - 7.3 нг/мл). Диапазон изменений этого показателя для макролидов и гликопептидов измерялся тысячами раз - ТМН (0.87 - >1000 нг/мл), СПИР (0.4 - >10000 нг/мл), ВКМ (6.8 - >1000 нг/мл).

Немногочисленные данные литературы, касающиеся феномена изменения профиля перекрестной реактивности иммуноанализа низкомолекулярных соединений, были дополнены данными настоящего исследования, а фактический материал, продемонстрировал потенциал предлагаемого подхода для управления специфичностью иммуноанализа (см. табл. 2).

Сравнительный анализ подходов к селекции эпитоп-специфических антител

Другим вопросом исследования было сравнение альтернативных технологий селекции антител на примере характеристик ИФА, созданных на основе эпитоп-специфических поликлональных (ПкАт) и моноклональных антител (МкАт).

Для иммунизации ВАЬВ/с мышей использовались конъюгированные антигены, которые служили иммуногенами при получении кроличьих ПкАт или продемонстрировали свою иммунохимическую активность при взаимодействии с ПкАт. Тем не менее, серологическое подтверждение формирования иммунной реакции на гаптен было получено менее, чем у половины иммунизированных мышей. Всего для иммунизации ВАЬВ/с мышей было испытано 27 разновидностей конъюгатов, из них 10 - на основе тетрациклинов, 12 - на основе аминогликозидов, 2 конъюгированных фторхинолона и 3 ЛИН-конъюгата. Из 40 проведенных гибридизаций лишь в 7 экспериментах было отмечено образование гибридных культур, продуцирующих антитела, способные связываться с конъюгированным гаптеном. Только 4 гибридомы могли распознавать свободный гаптен, 3 из которых оказались стабильными.

Ограниченное число клонотипов, формируемых в организме на отдельную детерминанту антигена, сокращается в процессе гибридизации, эффективность которой редко превышает 1%. Кроме того, процесс культивирования, клонирования и хранения гибридом также может сопровождаться утратой жизнеспособности или антителопродукции. Таким образом, результатом экспериментов стали 3 стабильных гибридных клона, специфичных к антибиотикам представителям 3 групп — фторхинолону ГФ, препаратам ТЦ ряда и аминогликозиду КМ.

Сравнение аналитических характеристик ИФА на основе МкАт и ПкАт показало, что чувствительность выявления этих аналитов с помощью МкАт уступала характеристикам иммуноанализов на основе ПкАт (табл. 3).

Таблица 3. Чувствительность выявления антибиотиков в ИФА на основе поликлональных и моноклональных антител

Аналит Чувствительность определения антибиотиков (IC50),* нг/мл

МкАт-ИФА ПкАт-ИФА

ГФ 43±7.1 0.25±0.04

ТЦ 4.5±1.0 2.1±0.4

км 13.6±0.9 0.5±0.11

*- значения М±ш представлены для наиболее чувствительных вариантов анализа.

Спектр конъюгированных антигенов, с которыми реагировали МкАт, был невелик и ограничивался конъюгатами на основе гомологичных гаптенов или их ближайших аналогов. В связи с этим влияние на профиль ПР субстанций со стороны иммобилизованного антигена было крайне ограничено. Поэтому специфичность МкАт-ИФА в отличие от ПкАт-ИФА оставалась практически неизменной и целиком зависела от свойств МкАт. Возможный спектр специфичности МкАт определялся конструкцией иммуногена, а их эпитопная специфичность - случайностью отбора.

При сравнении характеристик МкАт-ИФА и ПкАт-ИФА также оценивали возможность группового определения антибиотиков. Дизайн иммуногенов для получения МкАт и ПкАт - ЛПС(пи)-ГФ и конъюгат 4 (см. рис.5) был сходным. Экспозиция общего для молекул ФХ фрагмента, предопределяла группоспецифический ответ, однако, перекрестное взаимодействие полученных МкАт распространялось лишь на ГФ, ЛеФ, ЛоФ и ЦФ (100, 26, 11 и 6.7%), тогда как ПкАт к иммуногену сходного дизайна ГО-ГФ(га) могли выявлять 10 ФХ (100 -1.4%) (рис.5).

В результате иммунизации Р(дв)2-КГГ-ЛЦ(га) были получены МкАт с групповым распознаванием 7 ТЦ (100-14.5%), но, тем не менее, уступающим характеристикам ПкАт-ИФА (105-19.8%) (рис.6).

Иммунизация комплексом конъюгатов БСА-ГМ(га)+БСА-КМ(га)+ БСА-ТМ(га) расширила спектр специфичности сформированных В-

клонотипов и позволила селекционировать продуценты анти-ГМ и анти-КМ/ТМ/АМ (100-71-8%) МкАт, однако, группового -распознавания аминогликозидов разных семейств с помощью такого подхода достигнуть не удалось. Использование ПкАт к БСА-РС(пи) обеспечило возможность группового выявления аминогликозидов ИМ, ГМ, СЗМ, КМ, ТМ и АП (1002.1%) (рис.3).

Таким образом, результаты сравнения двух подходов для селекции антигаптенных антител определенной эпитопной направленности и создания на их основе иммуноанализа позволяют считать предлагаемый подход антиген-зависимого регулирования специфичности иммуноанализа не уступающим гибридомной технологии и даже превосходящим по чувствительности, характеристикам группового определения и меньшей трудоемкости. Кроме того, несомненным его преимуществом является возможность использования одного препарата ПкАт для выполнения тестов разного назначения (селективных и групповых) вместо получения нескольких МкАт.

Практическое использование разработанных ИФА-систем

Технология производства противовирусных вакцин требует использования антибиотиков, которые могут присутствовать в конечном продукте. Их присутствие может вызывать аллергические проявления у сенсибилизированных лиц. С помощью разработанных систем анализа исследованы 90 образцов вакцин против 8 вирусных патогенов, выявлено присутствие препаратов группы аминогликозидов (гентамицина, неомицина и канамицина) в вакцинах против паротита, кори и краснухи. Отмечено, что совершенствование технологии производства отражалось на содержании антибиотиков. Так, на примере противокраснушной вакцины разных поколений, наблюдалось значительное сокращение содержания антибиотиков и полное их устранение (рис. 11).

чисто образцов содержание антибиотиков

О 5 10 15 20 нг/доза

гепатит А и В полиомиелит клещевой энцефалит грипп корь паротит-корь паротит паротит паротит краснуха краснуха краснуха

■ гентамицин

Рис.11. Результаты скринингового исследования остаточного содержания антибиотиков в вакцинных препаратах (п=90).

Примечание. Содержание представлено средним значением, достоверно отличным от предела определенна анализа соответствующих антибиотиков (р<0.05).

В качестве сырья для наращивания вакцинного вируса могут использоваться птичьи эмбрионы, с которыми могут привноситься остаточные количества ветеринарных препаратов, в том числе и антибиотиков. Разработанные ИФА были адаптированы для определения остаточного содержания антибиотиков в птичьих эмбрионах (яйца кур и перепелов), средний уровень извлечения составил 101 ±16.3%. Скрининговое исследование образцов яиц (п=86) выявило присутствие антибиотиков в 35% образцов - JIM (5), ТЦ (2). ВТ (4). ЦФ (16) и ИМ (3). Содержание некоторых

;П п п меньше предела определения анализа ГМ НМ КМ СТМ <0.1 <0.1 <3.0 <0.1

I

10000-30000

700

F i 4000

F 15000

1 -7

1 <0.1 <0.1 <3.0 <0.1

■ неомицин Вканамицин ■ стрептомицин □ не выявлено

антибиотиков превышало установленный санитарными правилами и нормами МДУ для продуктов питания.

Таким образом, разработанные ИФА пригодны для определения антибиотиков в сырье, используемом в производстве вакцин, и как инструмент контроля безопасности вакцин поданному показателю.

1000

>200 >200 >200 >200 ш

10« 87

левомицетин тетрациклин бацитрацин ципрофлоксацин неомицин

Образцы контаминироваиные антибиотиками

Рис. 12. Результаты скрншнгового исследования остаточного содержания антибиотиков в куриных у перепелиных яйцах (п=86).

Примечание Содержание антибиотиков (М±т) достоверно отличается от контроля и неконтаминированных образцов (р<0.05).

Сфера использования иммунохимических методов анализа распространяется и на область лекарственного мониторинга. Так, разработанный анализ нового гликопептидного антибиотика ЭРМ применялся для исследования фармакокинстики при проведении клинических испытаний препарата на добровольцах при его однократном

инфузионном введении. Параллельное выполнение измерений концентрации препарата в плазме с помощью ВЭЖХ позволило установить корреляционную зависимость (у ■ 95.82х; г2= 0.8126) между этими двумя методами (рис. 13).

100 л

X *

о со

с я

к ж 2

О.

О

10

0,1

0,1

у = 0,9582х 1*2 = 0,8126

10

100

ЭРМ. мкг/мл (ИФА)

Рис. 13. Линейный регрессионный анализ содержания ЭРМ в плазме крови (п » 46), измеренного с помошыо ВЭЖХ и ИФА.

Немаловажной проблемой современной медицины стало развитие и распространение а нтибиотикорезистеятн ос тн. Наряду с некорректным использованием антибактериальны* препаратов в медицине, провоцирующим селекцию устойчивых форм микроорганизмов, известную обеспокоенность вызывает и присутствие антибиотиков в продуктах питания животного происхождения. Созданные нммуноферментные тесты были адаптированы для выявления антибактериальных соединений в продуктах питания, разработаны условия пробоподготовки для устранения матрикс-эффекта. наиболее полного извлечения каждого аналита и выявления его в

целевой концентрации. При измерении содержания антибиотиков в молоке, мясе и субпродуктах, яйцах и меде по методу «введено-найдено» средний уровень выявления составил 97.5±13.5%, 99.4±13.4%, 101±16.3% и 102.7±15.7%, соответственно.

Проведено скрининговое исследование 140 образцов молока, произведенных в 2008-2012 гг в 37 регионах Российской Федерации и стран зарубежья (табл. 4), 86 куриных и перепелиных яиц, произведенных на 38 птицефабриках страны (см. рис.12) и 121 образца отечественного и импортируемого меда. Получены сведения о распространенности и степени контаминации продуктов питания антибактериальными препаратами, регламентированными в РФ и нормирование которых не установлено.

Таблица 4. Уровни содержания антибиотиков в молоке по данным ИФА.

Образцы 2008-2009 (п = 106)

Антибиотик Количество образцов с содержанием антибактериального препарата в концентрациях, нг/мл МДУ*

<1 <10 <100 100-1000 >1000 >МДУ РФ ЕС

ЛМ - 103 3 - - 3 10 -

тц 41 41 15 9 - 24/9 10 100

БТ - 93 13 - - - - 100

ЦФ 95 9 - - - - - 100

ТИЛ/ТМН - 105 1 - - - - 50

ЛИН - 96 5 5 - 2 - 150

км - 68 30 8 - 5 - 150

им - - 49 55 2 1 - 1500

гм - 96 8 - 2 2 - 200

Дополнительная выборка образцов 2011-2012 (п=34)

СТМ - - - - - - 200 500

* - максимально допустимый уровень, установленный в РФ и странах Евросоюза

Исследование образцов меда (п=121) по выявлению 10 антибактериальных препаратов зафиксировало присутствие JIM в 2 образцах (6 и 300 нг/мл), ТЦ обнаружен в 13 пробах, в 5 из которых уровень достигал 100-4000 нг/мл. Содержание БТ в 3, ЦФ в 11, ТИЛ в 7 и ГМ в 2 образцах не превышало 10 нг/мл. В 4 пробах меда определялся ЛИН в диапазоне 10-35 нг/мл, а НМ присутствовал в 3 образцах (2, 35 и 62 нг/мл).

Результаты моделирования температурного воздействия при стерилизации и термической обработке продуктов питания свидетельствуют о стабильности иммунохимической активности ЛМ, ЛИН, ТИЛ/ТМН и аминогликозидов и о возможности их выявления как до, так и после термического воздействия. Экспериментально подтверждена нецелесообразность анализа ЭРИ в меде из-за его быстрой кислотной деградации

Таким образом, использование подхода для регулирования специфичности иммуноанализа низкомолекулярных соединений позволило разработать тесты для чувствительного и специфичного определения антибиотиков, относящихся к группам фторхинолонов, тетрациклинов, амфениколов, линкозамидов, макролидов, аминогликозидов и гликопептидов. Испытание ИФА антибиотиков на реальных объектах продемонстрировало их пригодность для контроля содержания антибиотиков в вакцинных препаратах, проведения лекарственного мониторинга и осуществления контроля безопасности продуктов питания.

ВЫВОДЫ

1. Предложен и экспериментально обоснован подход, позволяющий управлять эпитопной специфичностью иммуноанализа антибактериальных соединений. Применение конъюгированных антигенов с презентацией эпитопов-мишеней позволяет направленно влиять на профиль перекрестного взаимодействия структурных аналогов и создавать на основе поликлональных антител селективные и групповые тесты.

2. Синтезированные конъюгаты гликопептидных антибиотиков эремомицина и ристомицина, макролида кларитромицина, аминогликозида рибостамицина, соединений группы фторхинолонов гемифлоксацина и спарфлоксацина и полученные к ним антитела стали основой первых иммуноферментных систем анализа соответствующих соединений. Предложенные оригинальные способы синтеза конъюгатов на основе фторхинолонов (формальдегидная конденсация), тетрациклинов (взаимодействие с периодат-окисленным гликопротеином по амидной группировке), аминогликозидов (периодатное окисление рибостамицина, глутаральдегидная полимеризация неомицина) и амфениколов (конъюгирование глюкуронида левомицетина методом активированных эфиров) позволили использовать новый структурный дизайн иммобилизованных антигенов для регулирования специфичности иммуноанализа.

3. На основе конъюгированных антигенов и полученных иммунных сывороток создана панель тестов, позволяющая осуществлять иммунохимическую детекцию антибактериальных соединений с групповым распознаванием:

- фторхинолонов - энрофлоксацина, ципрофлоксацина, гемифлоксацина, пефлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина, ломефлоксацина, левофлоксацина и спарфлоксацина с диапазонами перекрестной активности 108-9% и чувствительности (ГС50) 1.3 - 16.2 нг/мл;

- тетрациклинов - тетрациклина, хлортетрациклина, доксициклина и окситетрациклина с перекрестной активностью в диапазоне 100-25% и чувствительностью 6-23.7 нг/мл;

- аминогликозидов - неомицина, канамицина и гентамицина с диапазонами перекрестной активности 100-9% и чувствительности 1.9-21 нг/мл;

- макролидов - кларитромицина, рокситромицина и эритромицина с перекрестной активностью в диапазоне 150-100% и чувствительностью 0.1 -0.15 нг/мл;

- макролидов - тилозина и тилмикозина (100%), а также тилозина и спиромицина, 100 и 50%) с чувствительностью от 0.3 до 0.9 нг/мл;

- линкозамидов — клиндамицина и линкомицина с перекрестной активностью 111 и 100% и чувствительностью 16.6 и 18.5 нг/мл;

- гликопептидов - ристомицина, ванкомицина, эремомицина и тейкопланина, перекрестной активностью в диапазоне 100-37% и чувствительностью определения - 90 - 242 нг/мл;

На основе полученных иммунореагентов разработаны иммуноферментные тесты селективного определения: фторхинолона гемифлоксацина с чувствительностью (1С50) 1.9 нг/мл, амфеникола левомицетина (0.3 нг/мл), аминогликозидов канамицина (14 нг/мл), гентамицина (0.4 нг/мл), неомицина (0.3 нг/мл), апрамицина (0.2 нг/мл) и стрептомицина (1 нг/мл), макролида тилозина (0.4 нг/мл), гликопептидов эремомицина (0.9 нг/мл), тейкопланина (3 нг/мл) и ристомицина (5 нг/мл).

4. На примере ИФА аминогликозидов, линкозамидов, левомицетина и тейкопланина показано, что специфичность теста может не зависеть от дизайна иммобилизованного антигена и определяться только специфичностью используемых поликлональных антител. Системы анализа фторхинолонов, тетрациклинов, макролидов и гликопептидов продемонстрировали зависимость специфичности тестов от дизайна конъюгированного антигена, главным фактором которых, влияющим на профиль перекрестно-реагирующих соединений, является тип входящего в их состав гаптена. Метод синтеза, наличие и длина спейсера имеет второстепенное значение.

5. Иммуноанализы на основе моноклональных антител к фторхинолону гемифлоксацину, тетрациклиновым антибиотикам и аминогликозидам канамицину/тобрамицину по своим аналитическим характеристикам -чувствительности и параметрам группового определения уступали тестам на основе поликлональных антител. Возможность универсального использования антител как для селективного, так и для группового распознавания антибиотиков могла быть реализована только на поликлональных антителах.

6. Предложенные имитаторы матрикса (сухое молоко и сахароза) позволяют преодолеть матрикс-эффект молока и меда и анализировать содержание антибиотиков со средним уровнем открытия 97.5±13.5 и 102.7±15.7%. Влияние матрикса вакцинных препаратов, плазмы крови и мочи человека, яиц и мяса на иммунохимическую реакцию могло быть нивелировано разведением образцов.

7. Скрининговое исследование вакцинных препаратов (п=90) против вирусных патогенов выявило в образцах препаратов против кори (10/10), паротита (21/21) и краснухи (11/31) присутствие гентамицина (10-30 мкг/доза), неомицина (0.7-0.001 мкг/доза) и канамицина (4 мкг/доза). При исследовании сырья для наработки вакцинного вируса - птичьих эмбрионов кур и перепелов (п=86) из 38 птицеводческих хозяйств в трети образцов были обнаружены антибиотики. В 5 образцах выявлен левомицетин (0.6-2.2 нг/мл), в 2 - тетрациклин (6.2 и 47 нг/мл), в 4 - бацитрацин (54-90 нг/мл), в 16 -фторхинолоны (1->200 нг/мл), 3 образца содержали неомицин (100 нг/мл).

8. Впервые разработанный ИФА эремомицина использован для изучения фармакокинетики этого нового гликопептидного антибиотика после его инфузионного введения здоровым добровольцам (п=6). Исследование образцов плазмы крови (п=46) позволило установить корреляционную зависимость с данными ВЭЖХ (у = 95.82х; г2= 0.8126).

9. Исследование остаточного содержания 10 анализируемых антибиотиков в молоке (п=140) из 37 областей и регионов РФ и ближнего зарубежья, свидетельствует о распространенном использовании в практике тетрациклинов, неомицина и канамицина, содержание которых превышало допустимые уровни в 24, 1 и 5 образцах, соответственно. Зарегистрированы единичные случаи превышения МДУ для левомицетина (3), гентамицина (2) и линкомицина (2). Скрининг образцов отечественного и импортируемого меда (п= 121) выявил контаминацию 10.7% образцов тетрациклином (2.5-2800 мкг/кг), левомицетин зафиксирован в 2 образцах (4 и 214 мкг/кг), уровень остальных антибиотиков не превышал 30 мкг/кг.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Burkin М. Enzyme-linked immunosorbent assays of fluoroquinolones with selective and group specificities / M. Burkin // Food and agricultural immunology - 2008. - V. 19. - № 2. - P. 131-140.

2. Буркин M.A. Антитела к ципрофлоксацину в избирательном и групповом иммуноферментном анализе фторхинолонов (ФХ) / М.А. Буркин // Российский иммунологический журнал - 2008. - Т.2. - № 2-3. - С. 141.

3. Буркин М.А. Иммуноферментный метод количественного определения гликопептидного антибиотика эремомицина / М.А. Буркин, А.А. Буркин // Прикладная биохимия и микробиология - 2009. - Т.45. - №2. - С. 232-236.

4. Буркин М.А. Иммуноферментный анализ ципрофлоксацина в молоке / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Пятый Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва 16-20 марта 2009. Материалы конгресса Т.2. - С. 57-58.

5. Burkin М.А. Improved group determination of tetracycline antibiotics in competitive enzyme-linked immunosorbent assay / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Food and agricultural immunology - 2009. - V.20. - № 3. - P. 245-252.

6. Буркин M.A. Использование иммуноферментного анализа для определения остаточного содержания неомицина в молоке / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва 10-11 ноября 2009. - С. 50-51.

7. Буркин М.А. Мониторинговое исследование контаминации молока антибиотиками с помощью иммуноферментного анализа / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Молекулярная медицина - 2010. - №4. - С. 47-51.

8. Буркин A.A. Методы санитарного контроля продукции животноводства 1. Иммуноферментный анализ тетрациклина / A.A. Буркин, Г.П. Кононенко, М.А. Буркин // Сельскохозяйственная биология - 2010. - №4. С. 110-117.

9. Буркин М.А. Использование иммуноферментного анализа для мониторинга факторов, провоцирующих формирование антибиотико-резистентности / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Тезисы XII Международного конгресса MAKMAX/ESCMID по антимикробной терапии. Москва. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия -2010. Т. 12. - №2. - Приложение 1. - С. 19.

10. Гальвидис И.А. Иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител для определения аминогликозидного антибиотика канамицина в продуктах питания / И.А. Гальвидис, М.А. Буркин // Биоорганическая химия - 2010. - Т.36. - № 6. - С. 789-796.

11. Burkin М.А. Development of competitive indirect ELISA for determination of lincomycm in milk, eggs, and honey / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Journal of agricultural and food chemistry - 2010. - V.58. - № 18. P. 9893-9898.

12. Буркин М.А. Иммуноферментный анализ антибактериальных препаратов в меде / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Материалы XII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье», Москва - 2010 - С. 17-18.

13. Буркин М.А. Исследование остаточного содержания антибиотиков в молоке иммуноферментным анализом / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Материалы XII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье», Москва. - 2010. - С. 18.

14. Буркин М.А. Разработка и использование непрямого конкурентного иммуноферментного анализа для определения неомицина в молоке / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Прикладная биохимия и микробиология - 2011. -Т. 47. -№3. С. 355-361.

15. Буркин М.А. Исследование контаминации продуктов питания антимикробными соединениями с помощью иммуноферментного анализа / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Материалы Шестого Московского

международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва - 2011. - Т.2. - С. 112-114.

16. Буркин М.А. Методы санитарного контроля продукции животноводства 3. Иммуноферментный анализ гентамицина / М.А. Буркин, Г.П. Кононенко, А.А. Буркин // Сельскохозяйственная биология - 2011. - №2. - С. 93-98.

17. Буркин А.А. Методы санитарного контроля продукции животноводства 4. Иммуноферментный анализ ципрофлоксацина и его аналогов / А.А. Буркин, Г.П. Кононенко, М.А. Буркин // Сельскохозяйственная биология - 2011. -№4.-С. 108-114.

18. Буркин М.А. Моделирование структуры конъюгированных антигенов как способ регуляции специфичности иммуноанализа низкомолекулярных соединений / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Медицинская иммунология -

2011.-Т.13. - №4-5.-С. 505.

19. Буркин М.А. Иммуноферментный анализ антибиотиков в продукции животноводства / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис // Материалы III Съезда фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии токсикологии и фармации», Санкт-Петербург - 2011. - С. 7980.

20. Гальвидис И.А. Исследование контаминации продукции животноводства антимикробными соединениями с помощью иммуноферментного анализа И.А. Гальвидис, М.А. Буркин // Российсий журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии - 2011. - Т. 2(6). - С. 20-22.

21. Burkin М.А. Simultaneous separate and group determination of tylosin and tilmicosin in foodstuffs using single antibody-based immunoassay / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Food chemistry - 2012. - V.132. - № 2. - P. 1080-1086.

22. Гальвидис И.А, Буркин М.А. Исследование остаточного содержания антибиотиков в вакцинах с помощью иммуноферментного анализа / И.А. Гальвидис, М.А. Буркин // Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва -

2012.-С. 18-19.

23. Буркин М.А. Методы санитарного контроля продукции животноводства 5. Иммуноферментный анализ сульфадимидина / М.А. Буркин, Г.П. Кононенко, А.А. Буркин // Сельскохозяйственная биология - 2012. - №2. -С. 113-118.

24. Burkin M A. Experience in immunoassay specificity tuning using hapten modification. Veterinary macrolide antibiotic case / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Xlth International Conference on AgriFood Antibodies (ICAFA). Vienna, Austria. -2012. -L. 05. - P. 13.

25. Буркин M.A. Методы санитарного контроля продукции животноводства

6. Иммуноферментный анализ левомицетина / М.А. Буркин, Г.П. Кононенко, А.А. Буркин // Сельскохозяйственная биология - 2012. - №4. - С. 113-119.

26. Буркин М.А. Методы санитарного контроля продукции животноводства

7. Иммуноферментный анализ стрептомицина / М.А. Буркин, И.А. Гальвидис, Г.П. Кононенко // Сельскохозяйственная биология - 2012. -№6.-С. 109-115.

27. Burkin М.А. Hapten modification approach for switching immunoassay specificity from selective to generic / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Journal of immunological methods - 2013. - V. 388. P. 60-67.

28. Burkin M.A. Immunochemical detection of apramycin as a contaminant in tissues of edible animals / M.A. Burkin, I.A. Galvidis // Food control - 2013. -V.34. - №2. - P. 408-413.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДГ - дигидразид адипиновой кислоты АМ - амикацин АП - апрамицин БТ — бацитрацин ВКМ - ванкомицин ГА - глутаровый альдегид ГО - глюкозооксидаза ГМ - гентамицин ГФ - гемифлоксацин

ДЭ - диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола

ДМН - десмикозин

ДОС - дезоксистрептамин

ДЦ - доксициклин

Жел - желатина

ИФА - иммуноферментный анализ

КДИ- 1 -этил-3 -(3 -диметил-аминопропил) карбодиимид

КЛИН — клиндамицин

КМ - канамицин

КМО - карбоксиметилоксим

КГГ - гаммаглобулин кролика

ЛеФ - левофлоксацин

ЛИН - линкомицин

ЛМ - левомицетин

ЛПС - липополисахарид

ЛоФ - ломефлоксацин

ЛЦ - лимециклин

МДУ - максимальный допустимый уровень

МеЦ - метациклин

МиЦ - миноциклин

НК - налидиксовая кислота

НМ - неомицин В

НФ - норфлоксацин

ОТЦ - окситетрациклин

ОФ - офлоксацин

ПФ - пефлоксацин

ПИ - периодатное окисление

ПР - перекрестная реактивность

РИСТ - ристомицин А

РС - рибостамицин

СЗМ - сизомицин

СПИР - спирамицин

СТМ - стрептомицин

СФ - спарфлоксацин

ТИЛ - тилозин

ТМ - тобрамицин

ТМН - тилмикозин

ТПЛ - тейкопланин А2

ТФ - трансферрин человека

ТЦ - тетрациклин

Ф - формальдегидная конденсация

ФХ - фторхинолоны

ХТЦ - 7-хлортетрациклин

ЦФ - ципрофлоксацин

ЭРМ - эремомицин

ЯА - яичный альбумин

Заказ № 09-Р/01/2014 Подписано в печать 13.01.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.ги