Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека

На правах рукописи

КЛИМОВИЧ

Владимир Борисович

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА

(14.00.36 —АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности Российской Федерации.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор СОФРОНОВ Б. Н. доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН ЯРИЛИН А. А. доктор медицинских наук ДЕНИСЕНКО А. Д.

Ведущее учреждение: Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Защита состоится « {о »^^ЯЕ^Я 1996 г. в часов на засе-

дании Диссертационного совета (Д 001.23.02) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. академика И. И. Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан «

а »ОКГЯбРЯ 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л. А. БУРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В организме иммуноглобулины (Ig) функционируют как антитела-рецепторы антигенных субстанций. Они могут выступать в роли гуморальных факторов внутренней среды или компонентов клеточных мембран [Putnam F.W., 1985]. Интерес фундаментальной иммунологии и иммунохимии к исследованию Ig определяется способностью этих молекул распознавать широкий спектр антигенов, обеспечивать высокий уровень специфичности распознавания и трансформировать энергию реакции связывания антигена в сигналы, регулирующие работу физиологических систем организма [Zavodszky Р. et al., 1986]. Интерес практической медицины к изучению Ig определяется их ролью в поддержании равновесия между антигенными факторами внешней И внутренней среды, а также участием в формировании и эволюции патологических процессов [Burton, D., 1987]. Понимание роли Ig как одного из ключевых элементов системы гомеостаза определило использование их в медицине в качестве стимулируемых вакцинацией защитных факторов [Brines R., 1996], лечебных препаратов [Schumacher К., 1986], индикаторов иммунного статуса и маркеров ряда заболеваний человека [Ling N., 1983]. Поэтому решение многих актуальных задач прикладной и фундаментальной иммунологии немыслимо без применения арсенала средств изоляции, идентификации и анализа молекул Ig человека. В течение последних 10-15 лет за рубежом создан ряд препаратов моноклональных антител (МКАТ) против Ig человека [JefFeris R. et al., 1985, 1992] и налажен их промышленный выпуск [Linscott's Directory, 1992]. Однако, большинство созданных МКАТ против Ig человека принадлежит репертуару иммунного ответа мышей BALB/c, поэтому спектр распознаваемых ими детерминант ограничен иммунодоминантными эпитопами и далеко не исчерпывает разнообразия антигенных маркеров Ig человека. Кроме того, доступ отечественных лабораторий и клиник к этим реагентам весьма ограничен.

ЦЕЛЬ настоящей работы состояла в создании МКАТ, которые

1. распознают типы, изотипы и субизотипы Ig человека,

2. дополняют спектр эпитопов, выявляемых ранее созданными МКАТ,

3. обладают совокупностью свойств, необходимых для конструирования тест-систем детекции и определения концентраций Ig и их фрагментов.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Создать коллекцию миеломных парапротеинов, представляющую разнообразие типов, изотипов и субизотипов ^ человека, и позволяющую устанавливать специфичность получаемых МКАТ.

2. Создать независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки штамм миеломных клеток-партнеров для гибридизации.

3. Для создания гибридом выбрать в качестве доноров иммунных лимфоцитов мышей инбредной линии с репертуаром иммунного ответа, отличающимся от такового у мышей ВАЬВ/с.

4. Получить семейства гибридомных штаммов-продуцентов МКАТ против типов, изотипов и субизотипов 1§ человека.

5. Исследовать свойства полученных МКАТ, включая их эпитопную специфичность, антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе и присоединении ферментной метки, а также способность связывать ^ в растворе, в составе иммунных комплексов или при адсорбции на твердой фазе.

6. Исследовать возможности применения полученных МКАТ в качестве компонентов тест-систем детекции или определения количества человека в жидких средах организма.

7. Провести экспертизу специфичности МКАТ и апробацию на клиническом материале лабораторных вариантов тест-систем, основанных на применении полученных реагентов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ

Впервые для создания гибридом использован новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбри-ональной сыворотки.

Впервые получены семейства МКАТ против ^ человека на основе иммунных лимфоцитов мышей линии БЛЛ.

Из полученных МКАТ впервые сформирована панель, обеспечивающая идентификацию и количественное определение свободных к- и X-цепей, ^ к- и Х-типов, основных изотипов (а, у, е, ц) и субизотипов (а1, у1, у2, уЗ, у4), а также детекцию антител перечисленных разновидностей.

Впервые исследован профиль антиген-распознающей активности МКАТ против изотип-специфичных эпитопов ^ человека и отобраны реагенты, равномерно связывающие все 4 подкласса

Получены МКАТ против антигенных маркеров Х-, у2-, у4-, 8- и ц-цепей человека, не имеющие аналогов по эпитопной специфичности и (или) серологической активности.

Впервые на основе МКАТ разработаны иммуноферментные тест-системы типирования миеломных парапротеинов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

Применение усовершенствованных приемов гибридомной технологии позволило получить семейства МКАТ, направленных против Ig человека.

В результате отбора по критериям специфичности и серологической активности сформирована панель МКАТ, распознающих консервативные, конформационно-устойчивые антигенные маркеры типов, изотипов и субизотипов Ig человека.

В панель включены МКАТ, сохраняющие антиген-связывающую активность при адсорбции на твердой фазе и присоединении ферментной метки.

Экспрессия эпитопов, распознаваемых МКАТ, сохраняется при формировании иммунных комплексов, что позволяет с помощью иммуносор-бентного метода исследовать изотипические спектры антител, направленных против определенных антигенов или аллергенов.

Комплементарные сочетания меченых и иммобилизованных МКАТ позволяют с помощью двухдетерминантного метода ИФА выявлять и определять концентрации Ig четырех изотипов (IgA, IgG, IgM, IgE) и пяти субизотипов (IgAl, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), а также свободных легких цепей к- и Х-типов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Апробацией на клиническом материале установлена пригодность полученных МКАТ для диагностики гаммапатий, инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Результаты работы были представлены на национальных и международных конгрессах, конференциях и симпозиумах:

2nd Meeting of European Haematology Association, Paris, 1996; 3rd Annual Congress of British Society of Immunology, Brighton, 1995; "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация", Москва,1995; "Актуальные вопросы гематологии", С.-Петербург, 1995; International conference "Biotechnology, St-Petersburg94", С-Петербург, 1994; XV Intern. Congress of Allergology & Clinical Immunology, Stockholm, 1994; II Congress of International Society of Neuroimmunology, Paestum, Italy, 1993;

"Современные достижения медицинской радиологии." С.-Петербург, 1993; "Нейроиммунология на пороге XXI века", С.-Петербург, 1993; International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad, 1991; International symposium on Allergy and Clinical Immunology. Moscow, 1990; "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1988 и 1990; 2-й Национальный конгресс по аллергологии. София, 1989; "Применение иммуноферментного анализа в медицине", Харьков, 1989;" Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований", Москва, 1989; "Диагностика и лечение лимфом", Всесоюзный симпозиум, Ленинград, 1981.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации отражены в 47 публикациях, среди которых 4 авторских свидетельства.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

МКАТ против IgE используются в ИФА тест-системах, выпускаемых предприятием "Аллерген" (г. Ставрополь) согласно научно-технической документации, утвержденной ГИСК им. Тарасевича. МКАТ против IgM и IgG применяются в тест-системах, подготовленных к промышленному выпуску предприятиями ЦНИИВС им.И.И. Мечникова (Москва), НИИ гриппа РАМН и НИИ вакцин и сывороток (С-Петербург).

Основанные на применении МКАТ тест-системы используются в лабораториях С-Петербургского ГМУ им. И.П.Павлова, неврологической клиники Военно-Медицинской Академии, НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова, НИИ ортопедии и травматологии им. P.P. Вредена, Государственной педиатрической медицинской академии, Клинического центра передовых медицинских технологий (больница № 31), Областной детской клинической больницы (С-Петербург), а также ЦНИИВС им. И. И. Мечникова и Института иммунологии (Москва).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на.йЭ.6 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, содержащих обоснование цели и задач работы и описание материалов и методов, семи глав изложения и обсуждения результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация содержит 58 рисунков и 29 таблиц. Библиографический указатель включает .6.5 источников на русском и.53Рна иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Антигены и антитела. Для иммунизации мышей, первичного скрининга гибридом, установления специфичности полученных МКАТ и изучения их свойств была собрана коллекция образцов сыворотки и мочи от пациентов с множественной миеломой,' макроглобулинемией Вальденстрема и болезнью тяжелых цепей. Образцы содержали белки Бенс-Джонса к- и X-типов, а также гомогенные ^ всех изотипов (таблица 1). Наряду с этим в качестве референс-антигенов были использованы доступные коммерчески или полученные из других лабораторий препараты ^ человека, протео-литические фрагменты их, свободные легкие и тяжелые цепи и рекомби-нантные пептиды, воспроизводящие первичную структуру доменов е-цепи. Ряд препаратов легких цепей и ^О четырех подклассов был получен в лаборатории из сывороток пациентов или здоровых доноров с помощью сочетания методов гелевой, ионообменной и аффинной хроматографии.

Таблица 1.

Панель парапротеинов и белков Бенс-Джонса, использованных

Парапротеины Число образцов

Белки Бенс-Джонса к-типа 34

Белки Бенс-Джонса Х-типа 20

IRA 58

IgG 51

IsM 13

IRE 5

Типирование миеломных парапротеинов и белков Бенс-Джонса, определение состава получаемых в лаборатории препаратов ^ и их фрагментов осуществляли с помощью поликлональных антисывороток против легких и тяжелых цепей ^ человека. При определении специфичности МКАТ в качестве референс-препаратов также использовали препараты МКАТ, предоставленные коллегами из сотрудничающих отечественных и зарубежных лабораторий.

Штамм культивируемых клеток миеломы. Одна из задач подготовительного этапа работы состояла в получении культивируемого штамма миеломных клеток, независимого от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Это устраняло трудности, связанные с нестандартностью и малой доступностью фетальной сыворотки, и открывало возможности полу-

чения стабильных гибридомных линий, приспособленных к эксплуатации в качестве продуцентов МКАТ. Исходным материалом служил происходящий от мышей BALB/c, устойчивый к 8-азагуанину штамм культивируемых клеток миеломы X63Ag8.653, который отличается от других линий-партнеров для гибридизации утратой экспрессии генов Ig [Kearney J. et al., 1979]. Клетки штамма, выращенные на среде с сывороткой эмбрионов коров, были одномоментно перенесены в среду с 20% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС). После гибели основной части популяции единичные жизнеспособные клетки пересевали на питающий слой макрофагов, на котором их пролиферация возобновлялась, и размножали до достижения плотности 10^ клеток в I мл среды, после чего в течение 8-ми пассажей культивировали без фидерного слоя. На 9-м, 20-м и 30-м пассажах культуры клонировали на фидерном слое, отбирали активно растущие клоны, объединяли их и размножали в среде с 20 мкг/мл 8-азагуанина для устранения клеток-ревертантов. На протяжении всего периода селекции, который длился более 15 месяцев, использовали питательную среду с 20% СКРС. После последнего клонирования часть клеток была подвергнута криоконсервации, другую часть на протяжении 55 пассажей размножали в среде с 20% СКРС, испытывая их способность давать стабильные гибриды с продуцентами антител. В ходе испытаний были получены гибридомы, синтезирующие МКАТ против эритроцитов барана и против пероксидазы из корней хрена.

Животные-доноры иммунных лимфоцитов. Одна из задач настоящей работы состояла в выборе линии мышей, которые отличались бы от линии BALB/c репертуаром вырабатываемых антител и могли бы служить донорами иммунных лимфоцитов, а их потомки от скрещивания с мышами линии BALB/c - носителями гибридомых асцитов. Анализ данных литературы [Kumar R. 1983] и собственных исследований [Климович В., 1981] позволил остановить выбор на мышах линии SJL/J, которые несут комлекс антигенов гистосовместимости (H2S), отличный от комплекса BALB/c (Н2^), синтезируют IgG-антитела иного (Ighb), чем BALB/c (Igha), аллотипа [Herzenberg L. et al.,1974, Appleby P. et al., 1985] и практически не способны продуцировать IgE [Levine В., 1973]. Для животных этой линии характерны признаки повышенной активности В-клеточного звена иммунной системы: клональная пролиферация плазматических клеток [Mclntire K.R., 1967], продукция гомогенных Ig [Wanebo H.J. et al., 1966] и высокий уровень синтеза антител против некоторых антигенов, в частности против пероксидазы из корней хрена [Kovatchev D. et al., 1983]. Это позволило предположить, что у мышей SJL/J ослаблен контроль экспансии клонов В-

лимфоцитов и потому они могут быть полезны в качестве доноров иммунных лимфоцитов при создании гибридом. В то же время, поскольку мие-ломный штамм происходит от линии BALB/c, носителями гибридомных клеток должны служить животные генотипа Fi(SJL/JxBALB/c). Мыши указанных линий и межлинейные гибриды происходили из инбредных колоний, которые поддерживаются в виварии института.

Методы иммунизации. В большинстве опытов животных иммунизировали введением первой дозы антигена (10-200 мкг) в полном адъюванте Фрейнда подкожно или внутрибрюшинно. Спустя 7 дней такую же дозу антигена вводили в неполном адъюванте Фрейнда. На 12, 14 и 16-й дни внутрибрюшинно вводили 10-50 мкг антигена в 0,5 мл физиологического раствора. В течение 15-го дня пробы сыворотки крови исследовали на содержание антител искомой специфичности. Если титр превышал 1:5 000, на 17-й день клетки селезенки мышей использовали для гибридизации. В случае низкого уровня антител цикл иммунизации повторяли 1 или 2 раза с интервалом 3-6 недель. Для получения МКАТ против слабоиммуноген-ных детерминант в ряде случаев ответ животных на иммунодоминантные эпитопы подавляли путем создания у них пассивного иммунитета с помощью инъекций поликлональных антисывороток или МКАТ с установленной эпитопной специфичностью [Ling N. et al., 1987].

Приемы получения и селекции гибридом соответствовали общепринятым [Goding J., 1983]. Культуры, содержащие клетки-продуценты антител, клонировали методом лимитирующих разведений [Лефковитц И., 1981] на слое перитонеальных макрофагов мышей.

Для скрининга гибридом и изучения свойств МКАТ использовали ряд приемов твердофазного ИФА: непрямой, прямой, ингибиторный, конкурентный и двухдетерминантный. Выявляющими реагентами служили меченые пероксидазой аффинно-очищенные кроличьи антитела против Ig мышей, меченые тем же ферментом антигены (Ig человека), МКАТ или стафилококковый белок А. Субстрат-хромогенная смесь содержала перекись водорода и о-фенилендиамин. Для измерения оптической плотности использовали планшетный фотометр Мультискан-МС, а для графической и статистической обработки данных - компьютерные программы "Immunoassay" [Войцеховский Б., 1983] и "Sigma-Plot" [Jandel Scientific],

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Отбор первичных гибридомных клонов.

Выявление культур, содержащих гибридные клетки-продуценты МКАТ, осуществляли с помощью непрямого ИФА с адсорбированным на твердой фазе иммуногеном или его аналогом. На этом же этапе исключали из числа изучаемых культуры, синтезирующие антитела против альтернативных иммуногену изо- или субизотипов. Из нескольких тысяч исходных культур в результате первичного скрининга было отобрано 76 клонов-продуцентов МКАТ искомой специфичности. Как показано в таблице 2, в большинстве случаев удалось получить семейства гибридом, послуживших исходным материалом для отбора продуцентов МКАТ с требуемой совокупностью свойств.

Таблица 2. Семейства гибридом-продуцентов МКАТ против полипептидных цепей ^ человека.

Специфичность Число первичных

МКАТ клонов

к-цепь 10

Х-цепь 12

а-цепь 19

у-цепь 10

71-цепь 1

у2-цепь 5

уЗ-цепь 2

у4-цепь 4

е-цепь 9

ц-цепь 4

2. Отбор МКАТ против изотип-специфичных эпитопов.

Для уточнения специфичности полученных МКАТ исследовали характер их взаимодействия с миеломными парапротеинами, несущими легкие цепи к- или Х-типа, либо принадлежащими к разным субизотипам. Как известно, некоторые варианты ^ несут конфигурационные антигенные детерминанты, образованные прилегающими друг к другу участками тяжелых и легких цепей. Реагенты, направленные против этих эпитопов, выявляют 1§ и антитела к- или Х-типов и на практике могут применяться лишь для решения узко специальных задач. Так, более половины ' МКАТ, первично идентифицированных как aнти-IgA, оказались направленными против конфигурационных эпитопов (таблица

3). Аналогичным образом были обнаружены МКАТ, распознающие конфигурационные детеминанты Реагенты такого рода исключали

из числа подлежащих дальнейшему изучению.

Таблица 3.

Взаимодействие МКАТ с миеломными 1кА к- и Х-типов.

ГРУППЫ МКАТ ЧИСЛО МКАТ В ГРУППЕ СВЯЗЫВАНИЕ МКАТ С

1ЕА1-к 1§А1- X 1§А2-к 1§А2-X

I 6 + + + +

II 2 + + - -

III 6 + - + -

IV 5 - + - +

Связывание МКАТ с адсорбированными на твердой фазе IgA к- или X-типа выявляли с помощью меченых пероксидазой кроличьих антител против ^ мыши. Знаки "+" или "-" означают соответственно наличие или отсутствие связывания МКАТ с антигеном.

При отборе МКАТ против изотип-специфичных детерминант наряду с исключением реагентов, распознающих кофигурационные эпитопы, представлялось необходимым выявить те, которые одинаково эффективно связывают молекулы всех четырех подклассов. Среди десяти первично выявленных реагентов только пять отвечали данному критерию и были отобраны для дальнейших исследований (рисунок 1).

Рисунок 1. Связывание МКАТ, выявленных в результате первичного отбора, с Цй четырех подклассов. Для выявления связывания МКАТ с иммобилизованными ^О четырех подклассов (см. обозначения штриховки) использованы меченые пероксидазой антитела против ^ мыши. По оси абсцисс - шифры МКАТ. По оси ординат - величины оптической плотности при длине волны 450 нм.

3. Отбор МКАТ против консервативных эпитопов Те.

Поскольку для иммунохимического анализа важно, чтобы используемые МКАТ были направлены против наименее изменчивых эпитопов представлялось необходимым установить, в какой мере полученные реагенты отвечают данному критерию. Для этого исследовали связывание каждого из МКАТ с рядом иммобилизованных на твердой фазе индивидуальных миеломных белков соответствующего типа, класса и подкласса. В качестве примеров ниже приведены данные испытаний МКАТ против 1§А и против подклассов Исследование отобранных на предыдущем этапе МКАТ (таблица 3, группы I и II) против класс-специфичных детерминант IgA (таблица 4) позволило сделать вывод о постоянстве экспрессии эпитопов, распознаваемых реагентами этой группы. Изучение МКАТ, специфичных в отношении 1§А1, потребовало расширения тестирующей панели до 55 образцов. Различия между МКАТ А-2В5 и А-ЗС10, оказались значительными: первый из реагентов связывал около 90% образцов, тогда как второй реагировал лишь с 50% парапро-теинов. Полученные данные послужили основанием для исключения МКАТ А-ЗС10 из числа исследуемых реагентов.

Таблица 4.

ШИФРЫ МКАТ ПОДКЛАССЫ И ЧИСЛО ОБРАЗЦОВ СПЕЦИФИЧНОСТЬ

irai IgA2 МКАТ

А-ЗЕЗ 21(21) 3(3) IgAl+IgA2

А-ЗЕ11 21(21) 3(3) IrA1+IrA2

А-1Н7 19(21) 3(3) IgAl+IgA2

А-1Н9 21(21) 3(3) IgAl+IgA2

А-ЗВ7 21(21) 3(3) IgAl+IgA2

А-1В12 20(21) 3(3) IrA1+IrA2

А-2В5 48 (55)* 0(3) irai

А-ЗС10 23 (55)* 0(3) irai

* Панель парапротеинов содержала образцы сывороток 56 пациентов с миеломной болезнью и 2-х - с болезнью тяжелых а-цепей. Перед скобками - количество образцов парапротеинов, связывающих МКАТ, в скобках - количество использованных образцов.

Среди МКАТ против подклассов (таблица 5) многие реагировали со всеми включенными в' панель парапротеинами соответствующего подкласса и не взаимодействовали с альтернативными антигенами. В то же время были выявлены реагенты, которые либо реагировали не со всеми парапротеинами одного субизотипа, либо связывали наряду с антигеном-

мишенью тот или иной миеломный белок альтернативного подкласса. Можно предполагать, что использованные парапротеины либо экспрес-сировали дополнительно детерминанты, не свойственные в норме данным субизотипам, либо утратили один из субизотип-специфичных эпитопов.

Таблица 5.

Связывание МКАТ против подклассов с миеломными __парапротеинами.__

ШИФРЫ МКАТ ПОДКЛАССЫ И КОЛИЧЕСТВО ОБРАЗЦОВ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКАТ

1(?01 1й02 1йОЗ 1й04

01-2С11 17(17) 0(5) 0(5) 0(8) У-1

02-2А8 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) у-2

С2-ЗС7 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) 1-2

02-9Р10 0(8) 9(9) 0(3) 0(6) У-2

С2-ЗЕ9 0(8) 2(5) 0(6) 0(4) У-2

С2-2Н6 0(8) 2(5) 0(6) 0(4) у-2

03-5012 1(8) 0(8) 9(11) 0(8) у-з

03-1С11 1(8) 0(8) 9(11) 0(8) у-з

в4-5С7 1(9) 0(9) 0(9) 14(14) у-4

04-4(36 0(8) 1(9) 0(9) 10(10) у-4

04-1Н2 0(4) 1(4) 0(5) 4(9) у-4

04-2В5 0(4) 0(5) 0(3) 6(6) у-4

Перед скобками - количество образцов парапротеинов, связывающих МКАТ, в скобках - количество использованных образцов.

4. Отбор МКАТ. распознающих конформационно-устойчивые эпитопы.

Молекулам ^ свойственна конформационная изменчивость, которая определяется гибкостью шарнирного участка и отсутствием жесткости во взаимной ориентации сегментов [Кату Р.,1987]. Поскольку для скрининга гибридом как правило используют методы иммуноанализа с адсорбированным на твердой фазе существует вероятность отбора МКАТ, которые распознают "артефактные" эпитопы конформационно измененных, а не нативных молекул 1%. Поэтому необходимым этапом селекции было выявление МКАТ, распознающих конформационно-устойчивые эпитопы и отбраковка тех, которые направлены против изменчивых детерминант Реагент, относящийся к последней категории, был обнаружен (рисунок 2) среди МКАТ против изотип-специфичных маркеров (0-406). Все МКАТ против подкласс-специфичных

маркеров распознавали конформационно-устойчивые эпитопы.

Аналогичным образом были исследованы МКАТ против остальных

изотипов Реагенты, направленные против конформационно-зависимых эпитопов были обнаружены также среди МКАТ против ^М. Конформационная устойчивость МКАТ против легких цепей была установлена с помощью электрофореза препаратов белков Бенс-Джонса с последующим переносом разделенных фракций на нитроцеллюлозу и выявлением их мечеными МКАТ.

5ЕЗ 5F2 5А9 4D6 3D3 2С11 9F10 2А8 ЗС7 1С11 5G12 4D6 5С7

Рисунок 2. Связывание меченых МКАТ против изотип- и субизотип-специ-фичных эпитопов IgG с гомологичными антигенами в растворе. Меченые пероксидазой МКАТ инкубировали с растворами антигенов (1) или с фосфатно-солевым буфером (2), после чего смсси переносили на твердую фазу с иммобилизованными антигенами. МКАТ, связавшиеся с твердой фазой выявляли с помощью субстрат-хромогенной смеси. По оси абсцисс - специфичности и шифры МКАТ. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

5. Эпитопная специфичность МКАТ и картирование эпитопов Ig.

Изучение эпитопной специфичности позволило во-первых сгруппировать реагенты, распознающие идентичные или пространственно близкие детерминанты молекул Ig, а во-вторых - выявить МКАТ против участков, топографически удаленных друг от друга, что послужило предпосылкой для конструирования иммунометрических тест-систем детекции и определения концентраций Ig [Hales J., Woodhead J., 1980]. Основным приемом анализа служил вариант ИФА, при котором оценивали конкуренцию меченых и немеченых МКАТ за связывание с адсорбированным на твердой фазе антигеном. В ряде случаев с помощью препаратов фрагмен-тированных Ig, рекомбинатных полипептидов и референс-образцов МКАТ удалось установить положение эпитопов, связывающих МКАТ.

На основании данных о связывании с целостными молекулами ^ и с белками Бенс-Джонса (таблица 6) в пределах семейства МКАТ против легких цепей были выявлены реагенты двух типов:

1) распознающие эпитопы, скрытые в целостных молекулах и экспессированные только на свободных легких цепях,

2) специфичные к детерминантам, присутствующим как на свободных легких цепях, так и на молекулах

Таблица 6.

Взаимодействие МКАТ против легких цепей ^ с белками Бенс-Джонса (ББД) и 1дО человека.

Количество образцов МКАТ Обратные титры МКАТ при взаимодействии с

к-ББД Х-ББД ДО

4 5*105-106 0 5*Ю5-10б

6 6*104-10б 0 0

8 0 6*104-5*Ю5 6*104-10б

4 0 4*Ю5-5*105 0

На твердой фазе адсорбировали очищенный ^О человека или белки Бенс-Джонса одного из альтернативных типов. Для выявления связавшихся МКАТ использованы меченые пероксидазой кроличьи антитела против ^ мыши.

Изучение связывания МКАТ против с протеолитическими

фрагментами (таблица 7) показало, что три распознаваемых эпитопа локализованы в пределах Рс-области, тогда как два других находятся вероятно в районе разрушающегося при протеолизе шарнирного участка.

Таблица 7.

Взаимодействие МКАТ с фрагментами 1аО

ШИФРЫ МКАТ РЕАКЦИЯ С ФРАГМЕНТАМИ

РаЬ (РаЬЪ Рс

С-5ЕЗ - -

в-5Р2 - - -

в-5А9 - - +

0-4Б6 - - +

О-ЗБЗ - - +

Фрагменты ^О были иммобилизованы на твердой фазе. Для исследования связывания использованы конъюгаты МКАТ с пероксидазой. Знаки "+" и "-" означают соответственно наличие или отсутствие связывания. Реагенты против изотип-специфичных детерминант ^О были использованы и для картирования эпитопов, распознаваемых МКАТ против

подклассов Полученные данные (рисунок 3) позволили заключить, что эпитоп 01-2С11 расположен в Бс-области вблизи детерминанты, связывающей МКАТ О-ЗБЗ, МКАТ против и ^вЗ реагируют с

эпитопами, близкими к шарниру, а маркер находится в Рс-области в удалении от эпитопа О-ЗБЗ. Эпитопы, распознаваемые МКАТ против \%С2 и ^04, не совпадали с детерминантами, связывающими референс-образцы МКАТ из зарубежных лабораторий, что привело к выводу о том, что полученные реагенты не имеют имеют аналогов.

Рисунок 3. Ингибирование немечеными МКАТ связывания меченых МКАТ против подклассов ^О. Аликвоты конъюгатов и немеченых МКАТ смешивали и инкубировали в планшетах с иммобилизованными ^01, ^йЗ или Количество связавшейся с твердой фазой метки

выражали в процентах от позитивного контроля (связывание при отсутствии немеченых МКАТ). По оси X - специфичности и шифры немеченых МКАТ. По оси У - шифры конъюгатов МКАТ. По оси Ъ -величина связывания в %%.

Исследование эпитопной специфичности МКАТ против ^Е показало, что они распознают четыре антигенных участка, из которых один сближен с эпитопом В5\У и идентичен иммунодоминантному эпитопу, связывающему референс-препарат МКАТ 1Т. Три эпитопных кластера референс-образцы не связывали, из чего следует, что направленные против

них МКАТ не имеют аналогов среди наиболее распространенных реагентов (таблица 8).

Таблица 8.

Ингибирование немечеными МКАТ связывания конъюгатов с IgE.

КОДЫ НЕМЕ- КОДЫ МЕЧЕНЫХ МКАТ

ЧЕНЫХ

МКАТ 4F12 4С9 ICI 4F1 №10 5В9 5D4 IT BSW 4F4 Le27

4F12 w/lviv." ШШ

4С9 ■Х'Й'Й' ШШ

ICI

4F1

1Е10 «V.V.V.VJ iV.V.V.V.

5В9

5D4 V.'.V.V//

IT VW.'.V.'

BSW

4F4

Le27 isiSsii

-60-100% }....... 1-30-60% | | -0-30%

Смеси меченых и немеченых МКАТ инкубировали в планшетах с иммобилизованным 1яЕ и оценивали количество метки, связавшейся с твердой фазой. Штриховкой обозначена степень ингибирования связывания метки в процентах от позитивного контроля. Референс-препараты МКАТ Ье27, 1Т и получены из лаборатории Бернского Университета.

Дополнительная информация о расположении связывающих МКАТ эпитопов, стала доступна благодаря применению рекомбинантных полипептидов, воспроизводящих фрагменты первичной структуры Б-цепи. Сумма полученных сведений позволила построить схему расположения эпитопов, связывающих исследуемые МКАТ (рисунок 4).

Се 2

Се3

Се4

ICI 4С9 4F12

4F1

\ |BSW|

5B9

IEÎ0

5D4

IT

[4F4|

.....-»'»Ф^

"^»гкшшйп®*''"

Le27

Рисунок 4. Схема локализации эпитопов, связывающих МКАТ против ^Е.

5. Селекция МКАТ для иммунометрических тест-систем.

Конструирование иммунометрических (двухдетерминантных) систем детекции любых антигенов, в том числе и предполагает использование иммобилизованных на твердой фазе немеченых МКАТ в сочетании со вторыми мечеными МКАТ, направленными к эпитопу, топографически удаленному от первого [ВоБса^ Ь. е1 а1., 1989]. Поэтому поиск реагентов, пригодных для создания указанных систем, включает два этапа: селекцию МКАТ, сохраняющих специфичность и антиген-связывающую активность при иммобилизации, и затем - подбор меченых МКАТ, комплементарных адсорбированным и способных эффективно выявлять захваченный иммусорбентом.

При исследовании МКАТ против изотип-специфичных маркеров способность иммобилизованных реагентов связывать находящийся в растворе антиген испытывали с помощью меченых пероксидазой всех четырех подклассов. Приемлемый уровень активности наблюдали лишь у части препаратов. На втором этапе была сопоставлена эффективность сочетаний иммобилизованных и меченых МКАТ (рисунок 5).

Рисунок 5. Выявление четырех подклассов в двухдетерминантном тесте на основе сочетаний меченых и адсорбированных МКАТ.

По оси абсцисс слева направо - результаты тестов с , 1ё02,1яОЗ и ^4. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

Из представленных результатов следует, что только некоторые сочетания МКАТ равноэффективно выявляют всех четырех

подклассов. На основании этих данных сконструирована тест-система детекции, позволяющая выявлять lgG всех четырех подклассов с равной или сходной чувствительностью, о чем свидетельствуют одинаковые наклоны калибровочных графиков (рисунок 6).

МКАТ МЕЧЕНЫЕ МКАТ

на „ твердой

фазе 5ЕЗ 5Р2 5А9 406 ЗБЗ

5ЕЗ 5Р2 5А9 406 ЗОЗ

ПЖ. [к] |ЦЯ

Лш, л. II

1 п_1

«лад. —

ПгП-1 щъ

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Я

— -И— ДО1 -О- ДО2 -А-ДОЗ —Д— ДО4 а к к

/Л

! ■///!

/ 1 ; Л

и--6 И'

0 0,02 0,08 0,4 2 10

Рисунок- 6. Выявление четырех подклассов с помощью изотип-специфических МКАТ. На твердой фазе адсорбировали МКАТ С-5ЕЗ. Выявляющим реагентом служило МКАТ О-ЗБЗ. Калибраторы - очищенные ДО1, ДО2, ДОЗ и ДО4 фирмы Са1ЫосЬет. По оси абсцисс - концентрация в мкг/мл. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

В ряде случаев первый и второй этапы поиска МКАТ, пригодных для иммунометрических тест-систем, сочетали в рамках одного эксперимента. При изучении семейства МКАТ против ^Е все комбинации меченых и адсорбированных реагентов были испытаны одновременно (рисунок 7).

Рисунок 7. Выявление 1§Е с помощью сочетаний иммобилизованных и меченых МКАТ. По оси X - шифры иммобилизованных МКАТ. По оси У -шифры меченых МКАТ. По оси Ъ - значения оптической плотности.

При этом четко выявились продукты, эффективные в качестве основы иммуносорбента, и их оптимальные сочетания с мечеными реагентами. Одно из таких сочетаний МКАТ (конъюгат Е-4Р4 и иммуносорбент на

основе Е-5Ш) было использовано для создания иммунометрической тест-системы определения концентрации ^Е (рисунок 8).

Рисунок 8. Калибровочный график для определения концентрации IgEc помощью иммунометрического теста. Использованы калибраторы фирмы Kallestad Lab.

По оси абсцисс - концентрация IgE в МЕ/мл.

По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

1000

Выполненные по той же схеме исследования остальных семейств МКАТ позволили разработать системы детекции и определения содержания к- и А,-цепей, I1йА1 и ^М (рисунок 9). В первых двух системах основой имму-носорбента служили МКАТ против эпитопов, которые экспрессированы на свободных легких цепях, но скрыты в структуре целостных молекул Следует отметить, что аналогичных систем выявления свободных Х-цепей не описано. При детекции IgA, IgAl и ^М захват на твердую фазу обеспечивали МКАТ против изотип- или'субизотип-специфичных детерминант. Во всех этих системах в качестве комплементарных выявляющих реагентов были использованы МКАТ против постоянно экспрессируемых эпитопов легких цепей.

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

1 - -о- f 3

к р'

А, л }

J К

J

S J

Ч к«

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

O-IgAl -И—IgA. *-IgM

0,1

1

10 100 1000

10 100 1000 10000

Рисунок 9. Калибровочные графики для определения концентраций свободных легких цепей, IgA, и ^М. По оси абсцисс - концентрации в нг/мл, по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

В тест-системах детекции и количественного определения подклассов IgG основой иммуносорбента служили МКАТ против субизотипических детерминант (G1-2C11, G2-3C7, G3-5G12, G4-5C7), а выявляющими реагентами служили МКАТ против класс-специфичных эпитопов 5А9 или 3D3 (рисунок 10).

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

1 1 -■-IgGl —•—IgG2 _ —Д—IsG3 о

< / ., -В

-С »G4 г V

п

А/

Y\

Рисунок 10. Калибровочные графики для определения концентраций четырех подклассов.

По оси абсцисс - концентрация

в мкг/мл. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

0 0,010,02 0,06 0,18 0,551,65 5

6. Экспрессия эпитопов 1е при образовании иммунных комплексов.

Образование комплексов антиген-антитело сопровождается агрегацией молекул ^ и изменениями их конформации [Неутап В., 1990]. Поэтому при исследовании серологической активности МКАТ было важно выяснить, сохраняется ли экспрессия распознаваемых МКАТ эпитопов при включении в состав иммунных комплексов. В каждом из полученных семейств МКАТ были обнаружены реагенты, выявляющие в иммуносорбентных тестах антитела направленные против инфекционных агентов, аутоантигенов и аллергенов. Ниже в качестве примеров приведены результаты испытаний МКАТ, выявляющих IgA-aнтитeлa в назальных секретах (рисунок 11), а также сывороточные ^О-антитела про-

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Рисунок 11. Выявление в назальных смывах вакцинированных волонтеров IgA-aнтитeл против вируса гриппа. Из образцов смывов от 4-х индивидов готовили серийные разведения. 1&А-антитела выявляли с помощью меченых МКАТ А-1Н9. По оси абсцисс - разведения образцов (^2). По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

123456789 10

тив инфекционных агентов и (рисунок 12).

аутоантитела против тиреоглобулина

Рисунок 12. Выявление ^й-антител с помощью меченых МКАТ.На твердой фазе адсорбирован вирус гриппа (1), респираторно-синцитиальный вирус (2) или тиреоглобулин (3). Связавшиеся с твердой фазой ^в-антитела выявляли с помощью меченых МКАТ. По оси абсцисс - шифры выявляющих МКАТ. По оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.

Аналогичным образом были изучены МКАТ против ^М, ^Е и подклассов ^О. Было также установлено, что эффективным реагентом, выявляющим все антитела независимо от их изотипической принадлежности может служить смесь меченых МКАТ против легких цепей к- и Х-типа. Полученные данные позволили заключить, что при формировании иммунных комплексов экспрессия распознаваемых МКАТ эпитопов тяжелых и легких цепей сохраняется. Поэтому изученные реагенты пригодны для исследования с помощью иммуносорбентных тестов изо- и субизотипических спектров антител против чужеродных агентов или ауто-антигенов.

7. Панель МКАТ против Та человека.

Материалы, изложенные в предыдущих разделах, свидетельствуют о том, что полученные МКАТ позволяют выявлять ^ человека с помощью трех вариантов твердофазного ИФА:

1. прямого метода детекции адсорбированных

2. метода выявления антиген- или аллерген-специфических антител,

3. двухдетерминантного иммунометрического метода детекции и определения концентрации ^ и свободных легких цепей к- и Х-типов.

Для выполнения первого и второго приемов анализа были отобраны реагенты, специфичные в отношении изотипов или субизотипов сохранявшие антиген-связывающую активность после присоединения ферментной метки. Для реализации двухдетерминантного варианта ИФА быди найдены комплементарные пары иммобилизованных и меченых МКАТ с разной эпитопной специфичностью. В тест-системах определения концентрации ^04 и 1§М полученные МКАТ оказались универсальными, т.е. могли одновременно выполнять роли как иммобилизованного, так и

меченого реагента. Таким образом, в целом совокупность отобранных МКАТ представляет собой панель реагентов (таблица 9), позволяющих детектировать все типы, изотипы и субизотипы 1% человека (кроме ^О).

Таблица 9. Панель МКАТ против человека.

Специфич- Активность МКАТ

№ КОДЫ ность немеченых меченых

№ МКАТ МКАТ ТФ1 Ат3

1. к-4в7 ^ к-типа + + +

2. К-4С11 к-цепь + - -

3. А,-2<39 Х-типа + + +

4. А,-ЗВ12 Я-цепь + - -

5. А-ЗВ7 а-цепь + - ' -

6. А-1Н9 а-цепь - + +

7. А-2В5 а 1-цепь + + +

8. О-ЗБЗ у-цепь - + +

9. С-5ЕЗ у-цепь + - -

10. С-5А9 у-цепь - + +

11. С-2С11 у 1-цепь + + +

12. 0-9Б10 у2-цепь - + +

13. С-ЗС7 у2-цепь + - -

14. 0-5012 уЗ-цепь + + +

15. 0-5С7 у4-цепь + + +

16. Е-5Б4 е-цепь + - -

17. Е-4Р4 е-цепь - + +

18. М-2В9 ц-цепь + + +

Примечания:

1. - МКАТ сохраняют активность после адсорбционной иммобилизации

на твердой фазе.

2. - меченые МКАТ используются в качестве выявляющего реагента в

двухдетерминантном ИФА.

3. - меченые МКАТ выявляют антитела в составе иммунного комплекса с

антигеном (аллергеном).

8. Экспертиза специфичности МКАТ.

Результаты внутрилабораторного определения специфичности МКАТ, несмотря на то, что при этом был использован' представительный ряд эеференс-препаратов, полученных как на коммерческой основе, так и тутем межлабораторного обмена, не могли рассматриваться как окончательные, поскольку во-первых до сих пор не существует общепризнанных талонов иммунохимической специфичности, а во-вторых системы оценки урологической активности МКАТ имеют ряд особенностей и не

исключают возможности получения противоречивых результатов и неоднозначной трактовки их. Это в свое время послужило основанием для проведения под эгидой ВОЗ и Международного союза иммунологических обществ (ШК) широких межлабораторных испытаний МКАТ против ^О человека рейепБ Я. е1 а1., 1992].

Поэтому проведение независимой экспертизы МКАТ и подтверждение данных об их специфичности рассматривали как этап работы, который непременно должен предшествовать практическому применению реагентов. Для экспертных испытаний препараты МКАТ были переданы в лаборатории, принимавшие участие в упомянутом выше кооперативном исследовании (таблица 10, №№ 1, 2 и 3), а также в три лаборатории, обладающие обширным опытом в изучении человека (№№ 4, 5 и 6).

Таблица 10.

Результаты экспертных испытаний специфичности МКАТ.

ЭКСПЕРТНЫЕ ЛАБОРАТОРИИ* СПЕЦИФИЧНОСТИ ИЗУЧЕННЫХ МКАТ

al-2 al yl-4 Y1 y2 Y3 у4 Е и к X

1 + + + + + + + _ - + +

2 + + + + - + + - _ - -

3 - + + - + + - - -

4 - - - - - - + + _ - -

5 _ _ - _ _ - + + - _

6 +

* - Номерами обозначены перечисленные ниже лаборатории, в скобках указаны руководители лабораторий и участники исследований.

1. Лаборатория иммунологии Медицинской Школы Бирмингемского

Университета (Prof. R.JefTeris, Dr. М. Goodal).

2. Центральная лаборатория службы переливания крови Красного Креста,

Амстердам (Dr. G. de Lange).

3. Лаборатория клинической иммунологии и аллергологии Медицинского

Университета Джона Хопкинса, Балтимор (Dr. R. Hamilton).

4. Лаборатория клинической иммунологии и аллергологии Бернского

Университета (Prof. A. De Weck, Prof. В. Stadler).

5. Лаборатория иммунохимии Института Экспериментальной Медицины

им. Макса Планка, Геттинген, (Prof. N. Hilschmann, Prof. V.Zavazal).

6. Лаборатория вирусологии Института микробиологии им. A.A. Кирхен-

штейна, Рига (Др. В.А.Левицкий). Условные обозначения:

"+" - результаты, подтверждающие специфичность МКАТ. "-" - испытания МКАТ указанной специфичности не проводили.

Экспертиза специфичности МКАТ была проведена путем сравнения с реагентами, охарактеризованными ранее, и изучения взаимодействия с референс-препаратами миеломных парапротеинов. Результаты испытаний показали, что специфичность МКАТ исходно была установлена корректно и расхождений в оценках выявлено не было. Это позволило признать, что созданная панель МКАТ отвечает общепризнанным критериям специфичности, и перейти к практическим испытаниям реагентов в системах имму-нохимической диагностики заболеваний человека.

9. Лабораторные испытания диагностических тест-систем.

Апробация МКАТ в тест-системе выявления антител против инфекционных агентов была проведена в ходе обследования группы детей 10-12 лет из экологически неблагополучного региона. Предполагалось, что вакцинации против дифтерии подвергалась только часть детей, поэтому количество и изотипический состав антител у них могли широко варьировать. Было установлено, что среди обследуемых имеются группы с резко различающимися показателями иммунитета против дифтерии. Первая отличалась переменным уровнем 1§М-антител (1/10-1/1000) и отсутствием антител других изотипов. Во второй содержание ^М-антител было в среднем выше и присутствовали и ^С4-антитела (рисунок 13).

Рисунок 13. Изотипические спектры антител против дифтерийного анатоксина в сыворотках детей 10-12 лет. Сыворотки титровали в, планшетах с иммобилизованным антигеном.. Связанные с твердой фазой антитела выявляли с помощью меченых МКАТ против ^М или четырех подклассов. По оси X - шифры исследуемых сывороток. По оси У - изотипы выявляемых антител. По оси Ъ г значения обратных титров антител.

Были обнаружены также сыворотки, в которых содержание ^М-антител не превышало фоновых значений, но выявлялись высокие титры (от 1/100 до 1/1000) антител двух или трех подклассов и

или ^й! и ^04). Антитела подкласса 1§03 не были выявлены ни в одном из изученных образцов.

Таким образом, результаты во-первых подтвердили предположение о том, что часть обследованных не имеет сформированного иммунитета против дифтерии, а во-вторых показали, что полученные МКАТ позволяют исследовать изотипический и субизотипический состав антител против инфекционных агентов.

Для апробации МКАТ в аллергодиагностических тест-системах были использованы сыворотки пациентов с разными проявлениями аллергии, в частности, с поллинозами. Уровень ^Е-антител, специфичных к аллергену амброзии, определяли одновременно с помощью трех меченых реагентов: Е-4Р4, референс препарата МКАТ Ье-27 и конъюгата поликлональных антител против ^Е человека. В параллельном опыте определляли уровень аллерген-специфичных и ^С4-антител (рисунок 14).

4F4

Рисунок 14. Выявление IgE-, IgGl- и IgG4-aimiTen против аллергена пыльцы амброзии. Выявляющими реагентами служили меченые МКАТ (Е-4F4 или Le-27, G1-2C11 или G4-5C7) или поликлональные антитела (Poly) против IgE. По оси X - шифры образцов (К - сыворотка здорового донора). Образцы ранжированы по содержанию IgE-антител. По оси Y -специфичность и шифры выявляющих реагентов. По оси Z - оптическая плотность при длине волны 450 нм

Апробация МКАТ в тест-системе выявления аутоантител была проведена в ходе обследования упомянутой выше группы школьников из экологически неблагополучного региона. Результаты медицинских осмотров позволяли предполагать наличие у части детей патологических изменений в щитовидной железе, что обусловило необходимость обследования с помощью лабораторных тестов. Результаты выявления аутоантител против тиреоглобулина показали, что у большинства детей суммарный титр ^О или ^М-аутоантител был близок к норме, т.е. не превышал 1/100. В то же время у значительной группы, составлявшей около 10% обследуеммх, было обнаружено существенное повышение титров аутоантител. В части случаев (рисунок 15) доминировали аутоантитела изотипа ^М. В другой группе образцов сыворотки наряду с 1§М были обнаружены высокие титры аутоантител всех субизотипов ^О.

Рисунок 15. Выявление с помощью МКАТ изотипического спектра аутоантител против тиреоглобулина. Образцы сывороток титровали в планшетах с адсорбированым тиреоглобулином человека. Выявляющими реагентами служили меченые пероксидазой МКАТ против 1§М, 1§С и подклассов человека. По оси Х- шифры образцов сыворотки.

По оси У - изотипы выявляемых антител. По оси Ъ - обратные титры антител (хЮЗ).

В целом результаты испытаний продемонстрировали возможность применения полученных МКАТ в иммуносорбентных тестах выявления :пецифических антител независимо от природы связывающего антигена.

Апробация МКАТ в тест-системах диагностики гаммапатий была проведена на материале от пациентов, страдающих заболеваниями двух разных типов: рассеянным склерозом (РС) и множественной миеломой. Для первого из них характерно появление в спинномозговой жидкости (СМЖ) повышенных количеств ^ ограниченной гетерогенности, что позволяет рассматривать это явление как доброкачественную олигокло-нальную гаммапатию [Эпштейн Э., 1988]. При РС наряду с присутствием олигоклональных ^ в СМЖ обнаружено увеличение содержания свободных легких цепей (СЛЦ). В норме этот показатель не превышает 10-40 нг/мл, а при РС возрастает в 10 и более раз. [ИлкНск Я. е1 а1.,1986]. В исследовании были использованы образцы СМЖ и сыворотки пациентов, у которых диагноз РС рассматривали как несомненный (70 случаев) или как вероятный (8 случаев). Одновременно были обследованы образцы СМЖ и сывороток крови пациентов с заболеваниями ЦНС, отличными от РС. Контролем служили образцы от больных с поражениями периферических отделов нервной системы и клинически здоровых лиц. Результаты определений (таблица 11) показали, что у пациентов с РС содержание в СМЖ свободных Х-цепей увеличено в 2,5-3 раза, а уровень свободных к-цепей превосходит нормальный в 20 раз.

Таблица, 11.

Содержание свободных легких цепей в СМЖ и индексы их распределения у пациентов с рассеянным склерозом (I), другими

ПАРАМЕТРЫ ГРУППЫ ПАЦИЕНТОВ

I II III

Число пациентов 78 54 20

Уровень к-цепи в СМЖ (нг/мл) 760 + 100 37,0 ± 5,0 36,0 ± 5,0

Уровень А.-цепи в СМЖ (нг/мл) 7.6+1.4 2,0 ±0,3 2,0 ±0.2

Индекс к-цепи 20,19+3,9 0,89±0,20 1,13 ±0,21

Индекс Х-цепи 2,31+ 0,42 0,34 ±0,85 0,34 ±0,08

Индекс альбумина 7,18 ±0,56 14,6 ±4,25 5,72 ±0,75

В таблице представлены средние значения и величины стандартных отклонений. Жирным шрифтом выделены статистически достоверные отличия от контрольных значений (р < 0,05). Для вычисления индексов распределения использовали формулу i = К]УК§: Al / As в которой: i - индекс, Kl - концентрация СЛЦ в СМЖ, Al - концентрация альбумина в СМЖ, К§ - концентрация СЛЦ в сыворотке, As - концентрация альбумина в сыворотке [Fagnart et al., 1988].

Вычисление индексов распределения показало, что повышение уровней СЛЦ в СМЖ при PC является не следствием увеличения их концентрации в сыворотке, а отражением процессов интратекального синтеза. Важно отметить, что в группе пациентов с неврологическими расстройствами, отличными от PC, достоверных сдвигов по изученным параметрам обнаружено не было.

В отличие от рассеянного склероза множественная миелома (ММ) является типичной злокачественной гаммапатией, сопровождающейся продукцией гомогенных Ig-парапротеинов [Андреева Н.Е. и Чернохвос-това Е.В., 1985]. Выявление парапротеинов, определение их изотипической принадлежности и оценка содержания их в сыворотке крови при ММ способствует уточнению диагноза и прогноза, контролю эффективности лечения, своевременному выявлению рецидивов и признаков опухолевой прогрессии. Для выявления парапротеинов при ММ наиболее широко используют метод элекрофореза с иммунофиксацией [Keren D., 1988]. В настоящей работе для этой цели впервые были применены две системы твердофазного ИФА на основе МКАТ. Исследовали образцы сыворотки крови пациентов, у которых наряду с клиническими признаками ММ или макроглобулинемии при электрофоретическом анализе среди белков сыворотки (без иммунофиксации) обнаруживали гомогенную фракцию в зоне гамма-глобулинов.

При типировании парапротеинов с помощью прямого варианта ИФА сыворотки, разбавленные до 10~5 или 10~6 инкубировали в планшетах и затем адсорбированные на твердой фазе Ig выявляли с помощью меченых МКАТ против легких цепей к- или Л-типов, изотипов и субизотипов тяжелых цепей. На рисунке 16 приведены примеры выявления парапротеинов, относящихся к подклассам IgG. Аналогичные результаты получены и при выявлении IgA- и IgM-парапротеинов.

Второй способ оценки парапротеинемических сдвигов состоял в применении двухдетерминантного варианта ИФА. Для этого МКАТ против тяжелых цепей Ig адсорбировали на твердой фазе, а реагентами, выявляющими присоединенные к иммуносорбенту Ig, служили конъюгаты МКАТ против к- или А-цепей. Для определения показателей, характеризующих нормальный уровень Ig, использовали пул сывороток 300 доноров с известным содержанием Ig всех классов и подклассов. Примеры выявления парапротеинов, принадлежащих к IgA, IgM и четырем подклассам IgG, приведены на рисунке 17. Среди 170 обследованных образцов в 57% случаев были обнаружены парапротеины к-, а в 43% -Х-гипа. IgGl-парапротеины были выявлены у 63% обследуемых больных, вторыми по

частоте были 1§А-парапротеины (16%). Среди обследованных образцов не было случаев, не поддающихся типированию, что можно рассматривать как дополнительное свидетельство того, что МКАТ, включенные в панель, распознают консервативные класс- и подкласс-специфичные эпитопы 1%.

к X 7 у2 73 а ц.

ДО 1-Я.

Р .|] Р

к X 7 7! 72 7З 74 а ц

1 л ^ л Е

«п <-1

к X 7 7! 72 7З 74 а ц

к X 7 7! 72 7З 74 а ц

ДОЗ-к

I I ,

к X 7 7! 72 7З 74 а ц

ДОЗ-Х

к X 7 7! у2 7З у4 а ц

1£04-К

к X 7 7! 72 7З 74 а ц

к X 7 7! 72 7З у4 а ц

0

Рисунок 16. Выявление с помощью прямого ИФА ^О-парапротеинов к- и Х-типов в сыворотках пациентов с миеломной болезнью. По оси абсцисс - специфичность выявляющих реагентов. По оси ординат -значения оптической плотности при 450 нм. Штрихованными столбцами показаны результаты анализа исследуемых сывороток, светлымии столбцами - контрольной.

1,5 1

0,5 0

а-к а-Х

N

_ЕШ

у1~к у1-Х N

1

1

.л

уЗ-к уЗ-Х

N

0,5

ц-к ц-Х

_Л1_ N

у2-к у2-Х

N

—1

ш ЕГп

у4-к у4-Х N

к - цепь

X - цепь

Рисунок 17. Типирование парапротеинов с помощью двухдетерминант-ного ИФА. МКАТ против изотип- или субизотип-специфичных эпитопов ^ иммобилизовали на твердой фазе. Сыворотки пациентов инкубировали в планшетах и связавшиеся с твердой фазой ^ выявляли с помощью МКАТ против легких цепей к- или Х-типов. На каждой гистограмме представлены результаты исследования сывороток 2-х пациентов, содержащих парапротеины одного из альтернативных типов, и сыворотки здоровых доноров (К). По оси абсцисс - тип и изотип или субизотип выявленного парапротеина. По оси ординат - значения оптической плотности (450 нм).

Таким образом, результаты апробации на клиническом материале показали, что тест-системы на основе МКАТ могут применяться для диагностики гаммапатий, а также инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека.

ВЫВОДЫ

1. Для создания гибридом-продуцентов МКАТ против Ig человека

• сформирована панель миеломных парапротеинов и белков Бене-Джонса

(180 образцов), содержащая основные варианты структуры Ig человека;

• получен штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

2. Репертуар антигенных детерминант, выявляемых МКАТ на молекулах Ig человека, расширен за счет использования при создании гибридом иммунных лимфоцитов мышей линии SJL/J.

3. Получено более 70 клонов-продуцентов МКАТ, распознающих

• свободные легкие цепи и белки Бенс-Джонса к- и А-типов,

• целостные молекулы Ig к- и А-типов,

• четыре изотипа (а, у, ц, е) и

• пять субизотипов (al, yl, у2, уЗ, у4) Ig человека.

4. Из полученной совокупности в результате отбора по ряду критериев сформирована панель МКАТ, которые

• распознают консервативные эпитопы Ig, устойчивые к изменениям конформации при адсорбции и образовании иммунных комплексов,

• сохраняют антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе или присоединении ферментной метки.

5. Включенные в панель МКАТ позволяют с помощью иммуносорбентно-го метода выявлять типы, изотипы и субизотипы антител против аллергенов, инфекционных агентов и аутоантигенов.

6. Комплементарные сочетания включенных в панель МКАТ позволяют с помощью двухдетерминантного метода выявлять и определять концентрации свободных к- и А-цепей, Ig к- и А-типов, четырех изотипов (IgA, IgG, IgM, IgE) и пяти субизотипов (IgA 1, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4).

7. Специфичность полученных МКАТ подтверждена экспертными испытаниями в зарубежных лабораториях с применением стандартных препаратов антигенов и антител.

8. Апробацией на клиническом материале установлена пригодность диагностических тестов, основанных на применении МКАТ, для

• определения изотипического спектра антител против инфекционных агентов и аутоантигенов,

• определения содержания IgE и выявления спектра антител при аллергических заболеваниях,

• выявления свободных легких цепей в СМЖ при рассеянном склерозе,

• типирования и количественного определения Ig и белков Бенс-Джонса при множественной миеломе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Климович В.Б. Экспериментальная модель лимфогранулематоза, ее возможности и ограничения. "Диагностика и лечение лимфом." Всес. конф., Л., 1981, С. 223-224.

2. Асатурян М.С., Самойлович М.П., Климович В.Б. Изучение иммунологических характеристик лабораторной модели лимфогранулематоза. "Диагностика и лечение лимфом." Всес. конф., Л., 1981, С. 219-220.

3. Климович В.Б., Самойлович М.П. Культивирование клеток плазмаци-том человека. Цитология, 1985, Т. 27, № 11, С. 1215-1227.

4. Климович В.Б. Проблема получения моноклональных антител человека. "Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии." Труды ЦНИИВС им. И.И. Мечникова, М„ 1985, С. 60-76.

5. Самойлович М.П., Грязева И.В., Денисова Г.Н., Казакевич М.Ц., Сирота Н.С., Пашкова С.Ф., Климович В.Б. Получение гибридом на средах с сывороткой крупного ргогатого скота. "Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии." Труды ЦНИИВС им. И.И.Мечникова, М„ 1985, С. 121-129.

6. Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В. и др. Штамм культивируемых клеток животных вида Mus musculus L., миелома мышей, ис-польльзуемая для получения гибридом. Авт. свидетельство № 1381982, 1986.

7. Климович В.Б., Самойлович М.П., Пашкова С.Ф. и др. Штамм культивируемых клеток животных вида Mus musculus L., гибридома, продуцент моноклональных антител против пероксидазы хрена. Авт. свидетельство № 1433977, 1987.

8. Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В. и др. Диагностические тест-системы на основе моноклональных анти-иммуноглобулиновых реагентов. "Современные направления создания медицинских диагно-стикумов." Всес. конф., М., 1988, С. 7.

9. Климович В.Б., Грязева И.В., Желудов В.И. и др. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека в диагностике В-лимфоцитарных неоплазий. "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований." Всес. конф., М„ 1989, С. 39-40.

10. Овсянникова И.Г., Гервазиева В.Б., Климович В.Б., Самойлович М.П. Разработка иммуноферментных тест-систем с использованием моноклональных анти-^Е-антител для специфической диагностики аллергии, "Применение иммуноферментного анализа в медицине." Всес. конф., Харьков, 1989, С. 96.

11. Самойлович М.П., Климович В.Б., Овсянникова И.Г. Использование моноклональных антител к иммуноглобулину Е человека в диагностике аллергии. Труды 2-го Национального конгресса по аллергологии. София, 1989, С. 57.

12. Klimovich V.B., Gryazeva I.V., Pashkova S.F. Monoclonal antibody-based serum Bence-Jones proteins detection. J. of Tumor Marker Oncology, 1990, Vol. 5, №. 3, P. 241.

13. Миролюбова О.Ю., Макаренко M.B., Климович В.Б. и др. Распределение j'25-моноклональных антител к белкам Бене-Джонса в организме животных. Медицинская радиология, 1990, № 6, С. 25-27.

14. Грязева И.В., Климович В.Б., Желудов В.И. и др. Тест-система на основе моноклональных антител для выявления свободных легких цепей иммуноглобулинов человека. "Современные направления создания медицинских диагностикумов." Всес. конф., М., 1990, С. 17.

15. Климович В.Б., Грязева И.В., Желудов В.И. и др. Моноклональные антитела против легких цепей иммуноглобулинов человека. "Моноклональные антитела в медицине и биотехнологии." Труды ЦНИИВС им. И.И.Мечникова, М., 1990, С. 46-56.

16. Klimovich V.B., Samoilovich М.Р., Pashkova S.F. et al. Mono- and bispeci-fic anti-human IgE monoclonal antibodies: epitope specificity and application. International symposium on Allergy and Clinical Immunology, Moscow, 1990, P. 38.

17. Krutetskaya I.Yu., Samoilovich M.P., Gryazeva I.V., Schmidt E.N., Gubina A.Yu., Denisova G.N., Klimovich V.B. Precipitating monoclonal antibodies to polypeptide chains of human immunoglobulin classes and subclasses. International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991, P 2-33.

18. Samoilovich M.P., Pashkova S.F., Sirota N.S., Klimovich V.B., et al. Epitope specificity and immunoanalytic application of mono- and bi-specific monoclonal antibodies to human IgE. International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991, P-2-34.

19. Самойлович М.П., Пашкова С.Ф., Овсянникова И.Г., Крутецкая И.Ю., Полищук Т.Б., Гервазиева В.Б., Климович В.Б. Анализ эпитопной специфичности моноклональных антител против IgE человека. "Современные методы иммунохимии и молекулярно-биологической диагностики в медицине." Труды ЦНИИВС им. И.И. Мечникова, М., 1992, С. 45-53.

20. Samoilovich М.Р., Klimovich V.B., Gervazieva V.B., Ovsjannikova I.G., Pashkova S.F., Polyschuk T.B. A new family of monoclonal antibodies against human IgE. Allergy & Clinical Immunology News. 1992, Vol. 4, № 1, P. 21-25.

21. Климович В.Б., Самойлович М.П., Гервазиева В.Б. и др. Штамм культивируемых клеток животных вида Mus musculus L., гибридома-проду-цент моноклональных антител против иммуноглобулина Е человека. Авт. свидетельство № 1752763, 1992.

22. Климович В.Б., Самойлович М.П., Пашкова С.Ф. и др. Штамм культивируемых клеток животных вида Mus musculus L., гибридома-продуцент моноклональных антител против иммуноглобулина Е человека. Авт. свидетельство № 1776691,1992.

23. Бисага Г.Н., Грязева И.В., Климович В.Б. Диагностическая информативность определения свободных легких цепей иммуноглобулинов при рассеянном склерозе. "Нейроиммунология на пороге XXI века." Материалы рабочего совещания, С-Пб., 1993, С. 10-13.

24. Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В. и.др. Моноклональные антитела в иммунодиагностике последствий действия радиации на человека. "Современные достижения медицинской радиологии." Конф., С-Пб., 1993, С. 226-228.

25. Руденко И .Я., Самойлович М.П., Климович В.Б. и др. Содержание и изотипический состав аутоантител к тиреоглобулину у пациентов,

подвергшихся воздействию ионизирующей радиации. "Современные достижения медицинской радиологии." Конф., С-Пб., 1993, С. 231-232.

26. Найхин А.Н., Михайлов А.А., Кустикова Ю.Г., Цыбалова Л.Б., Климович В.Б. и др. Использование слюны для изучения в иммунофер-ментном анализе поствакцинального и постинфекционного иммунитета к гриппу. Вопросы вирусологии, 1993, № 5, С. 201-204.

27. Totolian N.A., Gryazeva I.V., Klimovich V.B. et al. Free immunoglobulin light chains in cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and other non-infectious neurological diseases. 2nd International Congress ISNIM, Paestum (Salerno), Italy, 1993, P. 342.

28. Totolian N.A., Gryazeva I.V., Klimovich V.B., Freidlin I.S. The immunological tests in differentiation between multiple sclerosis (MS) and other neurological diseases. Allergy (Europ. J. Allergy and Clin. Immunol.), 1993, Vol. 48, № 16 (suppl.), P. 57.

29. Тотолян H.A., Грязева И.В., Климович В.Б., Тотолян А.А. Интрате-кальный синтез свободных легких цепей иммуноглобулинов и его связь с другими иммунными нарушениями у больных рассеянным склерозом. Иммунология, 1994, № 1, С. 54-57.

30. Грязева И.В., Климович В.Б., Пашкова С.Ф. Моноклональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека и их применение в имму-ноанализе. Иммунология, 1994, № 3, С. 31-37.

31. Тотолян Н.А., Грязева И.В., Климович В.Б., Скоромец А.А. Содержание свободных легких цепей иммуноглобулинов в ликворе и значение его определения для дифференциальной диагностики рассеянного склероза. Журнал невропатологии и психиатрии им С.С.Корсакова, 1994, Т. 94, С. 49-53.

32. Klimovich V.B., Gryazeva I.V., Totolian N.A., Bisaga G.N. Monoclonal antibody-based assays for free light chains of human immunoglobulins and its diagnostic applications. "Biotechnology St-Petersburg-94." International conf., 1994, P. 52-53.

33. Zavazal V., Krauz V., Hilschmann N., Samoilovic M.P., Klimovic V.B., Gervazieva V.B., Paskova S.F. Imunologicka charakteristika myelomoveho IgE -VL monoklonalnimi protilatkami. Forum Immunologic, 1994, Vol. 2, P. 111-114.

54. Samoilovich M, Schwetz S., Krutetskaja I., Klimovich V., Pashkova S. Investigation of the immune response against the components of bee venom by means of monoclonal antibodies (Mab). XV International Congress of Allergology and Clinical Immunology, Stockholm, 1994, P. 211.

(5. Klimovich V.B., Samoilovich M.P., Gryazeva I.V., Pashkova S.F., Krutetskaya I.Yu., Gubina A.Yu., Schmidt E.N. Monoclonal antobodies to human immunoglobulins for research and diagnostic applications. "Biotechnology St.Petersburg-94." International conf., 1994, P. 51-52.

16. Климович В.Б., Грязева И.В., Самойлович М.П. и др. Выявление парапротеинов с помощью моноклональных антител. "Актуальные вопросы гематологии." Научн. конф. ВМА, С-Пб., 1995, С. 70-71.

>7. Климович В.Б., Грязева И.В., Пашкова С.Ф., Губина А.Ю. Выявление свободных легких цепей (СЛЦ) и белков Бенс-Джонса с помощью имму-ноферментных тест-систем. Актуальные вопросы гематологии." Научн. конф. ВМА, С-Пб., 1995, С. 69-70.

38. Климович А.В., Самойлович М.П., Климович В.Б., Афанасьев Б.В. Исследование концентрации иммуноглобулина Е после аллогенной трансплантации костного мозга. "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация." М., 1995, С. 106.

39.Klimovich A.V., Klimovich V.B., Samoilovich M P., Aphanasiev B.V. Immunoglobulin E levels in allogenic BMT. "Gene Technology, Stem Cell and Leukemia Research." ed. A.R.Zander et al., NATO ASI Series, Subseriaes H "Cell Biology", Springer-Verlag, 1995, V. 94, P. 513-517.

40.Климович В.Б., Грязева И. В., Самойлович М. П. и др. Выявление парапротеинов с помощью моноклональных антител. "Актуальные вопросы гематологии." Научн. конф. ВМА, С.-Пб., 1995, С. 70-71.

41.Руденко И.Я., Скородок Ю.А., Климович В.Б. Сравнение двух методов определения аутоантител к антигенам ткани щитовидной железы Проблемы эндокринологии, 1995, Т. 41, № 5, С. 21-22.

42. Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Пашкова С.Ф., Сухубаевош Л.П., Климович В.Б. Оценка с помощью моноклональных антител изотопического и субизотипического состава антител против инфеК' ционных агентов. "Иммунологический мониторинг патологически? состояний и иммунореабилитация." М., 1995, С. 33.

43. Руденко И.Я., Климович В.Б. Применение моноклональных антител для оценки состояния щитовидной железы. "Иммунологический мони' торинг патологических состояний и иммунореабилитация." М„ 1995, С 54.

44. Самойлович М.П,, Климович В.Б., Пашкова С.Ф. Профили антиген связывающей активности моноклональных антител к IgG человека Иммунология, 1996 (в печати).

45. Klimovich V., Krutetskaja I., Samoilovich M., Pashkova S, New mono clonal antibodies to human IgG2. Immunology, 1995, Vol. 86, suppl, 1, P, 58

46. Klimovich V., Gryazeva I., Pashkova S. Monoclonal antibody'based ELIS/ for Ig free light chains levels determination. Immunology, 1995, Vol. 86 suppl. 1, P. 147,

47. Klimovich A., van Lint M.T., Samoilovich M., Afanasiev В., Klimovich V The diagnostic and monitoring significance of total serum IgE level in graft versus-host desease after allogenic bone marrow transplantation, British J Haematol., 1996, Vol, 93, Suppl. 2, P. 74.