Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Углеводные компоненты иммуноглобулина G: роль в связывании Clq компонента комплемента



ч 4

'ч *ч

Вт прявлх рукописи

ЛЕБЕДЕВА Татьяна Васнльевна

УГЛЕВОДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА О: РОЛЬ В СВЯЗЫВАНИИ С1Ч КОМПОНЕНТА КОИПЛЕМЕНТА.

14.00.35 Аллергология а иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соиссамяе учено» степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1995

Работа выполнен» ■ Институте ревматология РАМН.

«лучные руководители: - академик РАМН Несомое« В.А,

- доктор биологических неук, профессор Алеикин В.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических неук.

профессор Козлов Л.В.

- доктор медицинских н»ук, профессор Ярнлнн A.A.

Ведуцее учреждение! - Российский Государственный Медицинский

Университет минздравиедпрома Р*.

Заимта диссертации состоится < 28 > декабод 1991 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 176.01.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского ГК санэпиднадэора Р* по адресу; 125212 Москва, ул. адиироль Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробыоло-ии им. Г.Н.Габричевского ГК санэпиднадэора РФ.

Автореферат разослан <<_>>___1995 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук О.В.Котельникова

ОВЗДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВОТЫ.

Лкттвльиость пооЯлумм.

В патогенезе большинства аутоиммунных заболеваний, в ток числе ревматических, значительная роль принадлежит процессам хронического воспаления, медиаторами которых являются преимущественно компоненты системы комплемента (СК) я иммуноглобулины. В настоящее время установлено) что развитие патологического процесса может опосредоваться не только дефицитом указанных факторов, но и нх избыточной концентрацией и активностью. Нарушение естественной регуляции активации СК и опосредования ею . клиренса иммунных комплексов также может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний. Ключевым звеном выведения чужеродного материала из организма является активация СК по классическому пути комплексами антиген-антитело, на первом этапе которой происходит связывание С1ч компонента СК с 180 в составе иммунных комплексов. Несмотря на обширные и длительные исследования, направленные на изучение процессов образования и клиренса иммунных комплексов, механизмы активации и регуляции. СК остаются недостаточно изученными, а частности, до сих пор остается открытым вопрос об участке связывания С1ц компонента СК на поверхности ^а.

Большинство сывороточных протеинов является И-гликоэнлнро-ванныин, т.е. содержит в своем составе ковалентно-свяэанные олигЬсахариды, прикрепленные К остатку аспарагиНа. Интерес К структуре и функциям углеводных компонентов гликопротекнов, значительно возрос в последнее время, что связано с развитием представлений об участии гликанов в механизмах биологического распознавания. Типичные представители глякопротеинов, иммуноглобулины, являются хорошо наученной группой белков. У 1^0 на каждую тяжелую цепь прКХоднтся 1 гликан, расположенный в Сн2 домене и образованный остатками галактозы, ианноэы, фукозы, Н-ацетилглю-козачина И сиаловой кислоты. Углеводные компоненты 1вС необходимы Не только ДЛ* Поддержания необычной конфорыации Сн2 домена, йо могут Также Принимать участие в формировании эпнтопов на поверхности Рс-фрагмента для взаимодействия с разнообразными растворимыми и мембрано-связ&нными Рс-рецепторами. в том числе представлять участки связывания и активации компонентов СК,

Изменение структуры олигосахаридных цепей может являться одним нэ звеньев патогенеза ряда заболеваний. В частности« при ревматоидном артрите (РА), хроническом аутоиммунном заболевании неизвестной этиологии с преимуцественным симметричным поражением периферических.суставов и их эрозией, обнаружено нарушение глнкоэилнровання углеродных цепей [рО, характеризую«ееся увеличением количестве глнканов, терминированных N-ацетнлглюКоэамн-ном, а не галактозой. Изменение структуры IgO м^жет являться одной из причин нарушения связывания и активации компонентов СК и такие дефектные молекулы представляют собой удобную мидель для изучения взаимоотношений структуры и функций биомакромолекул и исследования роли углеводного компонента Ig0 в реализации его биологнческнх свойств. Аномальное гликоэилнрование приводит к появлению молекул IgG, способных к самоассоцнацни и образованию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с высоким патогенным потенциалом, повреждение тканей при РА может происходить также за счет постоянной неэффективной активации СК такими ЦИК. Кроме того, в последнее время на поверхности эндотелиальных .клеток выявлены рецепторы к Clq компоненту СК, регулирующие активации ск на уровне С) компонента, и показано, что нарушения данной рецепторной системы опосредуют развитие васкулита. Таким Ьбраэом, исследование связывания Clq компонента СК представляет важный этап в изучении механизмов воспаления.

Целью настоящей работы явилась исследование значения содержащих галактозу углеводных остатков мономеркык молекул IgG IttlgG) н модельных иммунных комплексов (МИК> для связывания Clq компонента ск.

Дл>? осуществления поставленной цели было необходимо ревить следуюдце задачи; I), получить различные виды МШС, 2) оценить доступность углеводных детерминант в составе МНК и MlgGc помощью лектина клещевины обыкновенной (КСА), специфичного к концевым,остатках галактозы, 3) определить эффективность связывания RCA с ЦИК в зависимости от их молекулярной массы (ММ) 4) вцде-лить нормальный а аномально галактоэилированный IgG из сыворотки крови доноров.» больных РА в установить содержание галактоэ-них остатков в подученных препаратах, 5) выявить эиаченне углеводного компонента IgG в связывании.Clq б) оценить влияние ММ МИК не связывание Clq, 7) определить ММ н концентрацию ЦИК, концентрацию и функциональную активность некоторых компонентов СК в сыворотке обследованных больных РА.

: той ММ растет и величина углового коэффициента. Поскольку в условиях нашего эксперимента с увеличенной MM ftTlgO уменьшается их молярная концентрация. \ коэффициент диффузии обратно зависит or ММ рассеивающих частиц, полученный результат следует интерпретировать как увеличение эффективности взаимодействия aTlgO с RCA с ростоы их МИ, Вероятно, что при образовании aTlgG происходит увеличение доступности связанных с галактозоП эпнто-пов иолекули Igo млн возрастание плотности указанных эпитопов на поверхности атIgO с ростоы их ММ.

Рис. 1. А - Зависимости относительных приростов светорассеяния al от времени в растворах arlgG комплексов с Заданными ММ в присутствии RCA. В' - Линии регрессии начальных участков зависимостей М от времени для aTlgO в присутствии RCA. Цифрами обозначены aTlgO с различными относительными средними ММ: 1-12 молекул IgO в агрегате, 2 - 8, 3 - 6.

Для исключения влияния тепловой обработки на хонформацион-ное состояние молекулы IgO в области присоединения содержащих галактозу гликанов, нами исследоиано связывание eilgG с RCA. Оказалось, что содержащие галактозу гликаны ealgO также, как и гликаны aTlgO, взаимодействуют с RCA. Таким образом, вряд ли тепловая обработка молекул IgG приводит к увеличению доступности N-гликанов молекулы. Скорее всего, сближение молекул IgG в ограниченном объеме пространства и образование кластеров угле-вод-содержа»цих детерминант IgO является определяющим фактором в способности aTlgG взаимодействовать с RCA.

а

ТАБЛИЦА 1.

угловые коэффициенты. в линий регрессии начальных участков

за'зисимостей относительных

ПРИРОСТОВ СВЕТОРАССЕЯНИЯ М ОТ ВРЕМЕНИ t ДЛЯ ¿TlgO В ПРИСУТСТВИИ RCA.

ТАБЛИЦА 2.

УГЛОВЫЕ КОЭФФИЦИЕНТЫ В ЛИНИЙ РЕГРЕССИИ НАЧАЛЬНЫХ УЧАСТКОВ ЗАВИСИМОСТЕЙ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ПРИРОСТОВ СВЕТОРАССЕЯНИЯ Al ОТ ВРЕМЕНИ t ДЛЯ KClgO В ПРИСУТСТВИИ КСА.

KaTlgO/MuIgO В

12 1.17

8 1. 13

6 0.17

MscIgO/MuIgO В

15 2.78

9 1.95

5 0.84

3 0.073

Примечание; UarlgG/MulgQ (MKcIgO/MuIgO) - относительная ММ STtgO и KcIgO, вырахеннса числом »юлекул IgG в комплексе.

Для доказательства специфичности связывания RCA с aTlgO было проведено ингнбироваиле их взаимодействия содержащим- галактозу дисахармдоц - лактозой (глюкоза-галактоза), являющимся иростейцши апологом концевой последовательности гликанов 1е<3.

ВРЕМЯ ««и» •

Рис. 2. Иигибнрование взаимодействия RCA с arleO лакгоэой. При-ведени аапислиостн дшгашии д! от прсыенн в растворе aTlgQ комплексов со средней относительной ММ равной 13 ыолекулам. Цифрами обозначена конечная концентрация лактооы в реакционной снес : 1 - контроль, 2 - 0.01 иМ, 3 - 0.1 мМ, 4 1 иИ.

На рисунке 2 предстаалены зависимости Д1 от t в растворах aTlgO с относительной средней МИ рапной 12 после добавления RCA в присутствии возрастающих количеств лактозы. Эффект ингибирова-пия зависел от количества добавленной лактозы, при этой конечная концентрация лактозы в 1 иМ приводила к полному ингибирова-ншо взаимодействия IgO с RCA.

Взаиыадействпе KcIgO с RCA. Для проведения более точного анализа доступности связанных с галактозой эпигопов на поверхности ГвО модельных иммунных комплексов были получены KcIgO, которое представляют собой химически стабильные агрегаты IgO. 11а рисунке 3 представлена картниа разделения KcIgO. Относительные средние ММ каждой фракции, определенные методой светорассеяния, обозначены на рисунке.

Рис. 3. Получение KClgO кбмплексов. А - гель-фильтрация KcIgO на колонке с био-гелем А5п. Обозначены фракции, .содержащие xclgo, которые были сконцентрированы и использованы для рехро-Яатографии. В - рехроыатография препарата KcIgO на сефакриле S-300. В каждой фракции определены средние относительные ММ методом светорассеяния (обозначены на рисунке как количество поле-кул IgO в агрегате).

Для независимой оценки MM xclgO была проведена калибровка колонки с сефакрилои s-300 высокомолекулярными маркерами, в качестве которых были использованы! голубой декстран (ММ - 7.000 кДа), ионоклональный IgM (971 ¡ЕДа), тирорлоОулин (660 кДа), ферритии (450 кДа), каталази (240 кДа), Кльдолаэа (140 кДа), ulgG (150 кДа), сывороточный альбумин человека (59 кДа). Результаты фракционирования iccIgG и белковых; маркеров представлены

на рисунке *, Такхе был построен график зависимости зон алюции маркерных молекул от логарифма их ММ и определены участки линейного фракционирования кс!еа (рис. 4 Л). Очевидно, что результаты определения'ММ двумя независимый)! методами, хорошо согласуются. Таким образом, метод светорассеяния позволяет точно определить МИ модельных 1еО комплексов и может быть использован для определения МЫ макромолекул в растворе.

Для изучения сцяэыаоикя с КСА были использованы кс!еО со средними относительными ММ равными 3, 3, 9, 13. Графики эаоиси-

od280

ts

ае

O.G

аз

27

3)

"55

за

43

1ШМЕР ФРАКЦИИ

Рис. 4. Определение Ш иоделышх IgO комплексов с помощью доух независимых подходов. Представлен профиль фракционирования препарате ксIgO со средней относительной ММ равной 7. ЫМ в каждой фракции определена методом светорассеянии и Dupaxeiia числом поло кул IgO в комплексе. Обозначены зоны элюдии стандартов ММ: 1 - голубой- декстран (2000 КДа), 2 - иоиоклоиалышй IgM (971. кДа), 3 - тироглобулии (660 кДа), 4 - феррит»« (450 кДа)» 5 -каталаза (240 кДа). А - зависимость коэффициента доступности Kav от логарифма МИ выбранных стандартов, позволяющая определить интервал линейного фракционирования. Величина Kav характер ризует движение хроматографической зоны вдоль колонки прнгель-фальтрацин и определяется соотноцеииеы Kav = (Vr - Vo)/ (Vt -Vo), где Vo - свободный объем колонки* Vt - общий объем колонки, Vr - объем элюата к моменту выхода пика соответствующего маркера (Остерман Л.^. Хроматография Белков и нуклеиновых кислот. 1985).

мостейМ ог времени о растворах к с IgO после добавления РчСА представлены на рисунке 5 А. Начальные участки графиков, были

аппроксимированы лннейныыи зааисниостяии как описано вьяге (рисунок 5 В). Как видно из представленных зависимостей, скорость нарастания параметра dl /1мик, определяемая величиной углового коэффициента В линий регрессии, зависит от ММ (<ИК (таблица 2). Такни образом, чем болыае МИ кс1а, тей быстрее'скорость нарастания aI'/Iuiik. Полученный результат, как н в случае с BTlgO, следует интерпретировать как увеличение эффективности взаимо-дейстпия модельных IgO комплексов с RCA с ростом их ММ.

Рис. 5. Л - Зависимости относительных приростов светорассеяния д1 от времени в растворах KClgO комплексов с известными ММ а присутствии RCA. В - Линии регрессии начальных участков зависимостей д1 от времени для г. с IgO в присутствии КСА. Угловые коэффициентов количественно характеризуют »ффектпвкость взаимодействия ксIgO различной ММ с RCA. Цифрами обозначены KcIgO с разными средний» относительный« KM; t - 15, 2-- 9, 3 - 5, 4 - 3 иолокули IgO в комплексе.

ВзаниодеЛстене icIgO комплексов с. RCA было высоко специфично, поскольку полиостью отменялось в присутствии лактозы (рисунок б). Била обнаружив положительная корреляция между концентрацией лактозы, необходимой для полного ингибнровання связывания KcIgO сRCA п НИ kcIbG (таблица 3).

Увеличение концентрации лактозы, вызывающей полное ингиби-ррпанне взаимодействия MIIK с RCA с ростом ММ МИК, указывает на возрастание числа доступных содержащих галактозу эпитопов на

поверхности МИК, что является важной причиной увеличения эффективности связывания МИК с RCA с ростом их ММ.

Для исследования доступности, содержащих галактозу детерминант в составе iilgo было проведено изучение взаииодепствип ulgO с RCA при более высоких концентрациях ulgO и RCA (конечные концентрации 0.8 и 1.0 иг/мл соответственно), поскольку при инкубации реакционной смеси, содержащей 50-200 икг/ыл ulgO И 90 мкг/мл RCA, в течение 1 часа не отмечалось их взаимодействия (более длительная ннкубация показала наличие- их взаимодействия

ТАБЛИЦА 3.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ЛАКТОЗЫ, НЕОБХОДИМАЯ ДЛЯ ПОЛНОГО ИНГИВИРОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ RCA С KClgO РАЗЛИЧНЫХ ММ.

ВО 10

ВРЕМЯ (МИМ)

Рис. 6. Ингибирование взаимодействия rca с Kclgo комплексами лактозой. Представлены зависимости для KClgO с относительной средней ММ рьИной 12 после добавления лактозы и rca. Обозначена конечная концентрация лактозы: 1 - контроль, 2 - 0.01 мМ, 3 - 0.1 мМ, 4 - 1 иМ, 5-10 мМ.

MKcIgO/MHlgO* Конечная концентрация лактозы (мМ)

15 s • 15 "

12 ■ ю

5 ■ J

Примечание: MkcIgQ/MiiIgo -относительная MM KcfgQ, выраженная числом молекул IgO в комплексе.

через 12 часов после начала инкубации). При использовании более ° высоких концентраций реагентов было зарегистрировано их связывание в течение 1 часа инкубации. Отсутствие взаимодействия при. низких концентрациях и ПСА может Сыть объяснено следующими фактами:

(1) моль мЦО содержит около 2.8 молей олигосахаридных цепей, а в Гс-фрагменте один из двух гликанов всегда только ыоногалакто-

зил^рован, гак что имеется возможность связывания RCA только с концевой галактозой альфа1 1 ветви другого 1лиеана.

(2) Известно также, что более 20* гликанов Fe-области агалакто-эилированы, то ссть не имеют детерминант для связывания с RCA.

(3) В составе-нормального IgO около 12% олигосахаридных цепей моносиалировано, а наличие концевых сиалооих кислот препятствует взаимодействию RCA с бета-галактозой гликана IgQ.

(4) Возможно) что в связывании с RCA принимают участие н глика-ны Fob-фрагмента, но большая часть этих структур не способна азаимодействовать с RCA, поскольку известно, что 25% олигосахаридных цепей Fab-фрагментов «оно-, а 9Х - днсиалировано.

(5) Константа ассоциации RCA с галактозо-содерж&цимн дисахарн-дами находится в диапазоне Ю'-5»104 1/М. Изолированные гликаны сложного типа связываются с RCA с более высокой константой ассоциации - от 10' до 10' 1/И. Однако« прикрепление тех же оли-госахаридоп с полипептидной цепи IgO может приводить к изменению их аффинности к RCA вследствие углевод-белковых взаимодействий. Углеводные детерминанты в состава IgG, по-видимому, обладают низкий сродством к RCA, что при взаимодействии RCA с ulgO приводит к образованию нестабильных Комплексов, образованных одной молекулой RCA р двумя молекулами IgG.

Таким образом, п в составе «IgG содержащие галактозу детерминанты доступны для связывания с высокомолекулярным лиган-дом - RCA, однако, среди рбцего пула молекул tilgO липь незначительное нх количество содержит доступные остатки галактозы. Увеличение плотности галактозных остатков при образовании МНК приводит к более эффективному их распознаванию и последующему связыванию с RCA. Изменение ММ МНК является критическим фактором, определяющим эффективность связывания гликанов IgG с RCA.

2. Йзанцодейстпие Clq с препаратами ат'Гдв различной ММ.

Монсмерные молекулы IgG, хотя и связываются с Clq, мало

эффективны в отношении активации С1, однако yse днмеры способны активировать С1 в отсутствие антигена. Поэтому была исследована способность arlgG с различными ММ связывать Clq коипонент к иплеиеита. Для изучения связывания Clq с данными МНК использовали метод, позволяющий следить за изменение« связывания Clq

с естественники иммунными комплексами (ЕА) в условиях конкурентного ингибирования различными эффекторами, в качестве которых были выбраны ат!вО с ММ в диапазоне от 2 до 100 молекул 1вО в агрегате, нормальный 1&0, агалактозилированний 1вО> охарактеризованный по содержанию галактоэных остатков, и дисахариды -лактоза, содержащая остаток бета-галактозы, и сахаро.ча. Для адекватного определения константы ингибирования, К1, подбирали диапазон концентраций эффектора, при котором происходит снижение связывания С1ч приблизительно в 2 раза. В присутствии различных концентраций эффектора получали различные значения И (го - в отсутствие), где I - количество гемолитически активных молекул С1ч на один эритроцит, и определяли К1 по формуле:

1 /г! = 1/(гокп + 1/го.

Установлено, что эффективность ингибирования модельным» комплексами связывания С1ч с ЕА зависит от КМ МИК. Для количественной оценки данного взаимодействия были рассчитаны значения энергии связывания ДО и приросты энергий связывания для МИК по сравнению с м1вО согласно уравнению (Кантор Ч., Иимелл П. 1983]

дО = дОо + ЯТГ(п), где дОо = -БТ1пКд - энергия связывания одной молекулы лиганда < одним из активных центров рецептора (Кд - константа диссоциаци) одной молекулы лиганда с одним из активных центров рецептора). л'Цп) - функция, учитывающая влияние взаимодействия между активными центрами рецептора, зависящая от степени их насыщения. Оказалось, что свободная энергия связывания С1ч с и1?0 дОо рав на 6.18-»--О.Об ккал/моль, а зависимость прироста ¿С от нэменени: ММ МИК имеет гиперболический характер, при этом максимальное значение энергии связывания составляет 12.30+-0.17 ккал/моль. Данная величина в 2 раза превышает значение энергии связывания для м1вО, что позволяет высказать предположение, чт<" в случае независимого и равноценного связывания идентичных активных цен тров С1д, несмотря на возрастание степени полимеризации детерминант на поверхности МИК, происходит фактическое связывание только 2 из 6 центров С 1ц, то есть имеет место связывание одно молекулы С1д с 2 молекулами (детерминантами) Аналогичное

значения энергий были получены при исследовании связывания С1ч

зой связывания С1ч с МЯК (ММ » э) представлено на рисунке 7. Использование данного метода не позволило выявить ингибирукяцйй эффект лактозы при связывании МИК с большей КМ с С1<ь однако, ингибирование лактозой связывания С1ч с МИК (ММ я 3) подтверждает участие гликанов в связывании С1я, а зависимость степени ингибироваимя от концентрации лактозы свидетельствует о специфичности данного взаимодействия.

J

5. Дегалактозилированный 1я0 и статус комплемента У больных РА.

Обследованы 12 больных с достоверным диагнозом.РА (все -женщины, в возрасте от 28 до 64 лет), сыворотки которых использовали в качестве источника дегалактозилированного 1$0, с целью выявления взаимосвязи степени агалактозялирования lgO с функциональной активностью компонентов системы комплемента я изучения роли указанных гуморальных факторов в патогенезе проявлений РА. У всех больных отмечено достоверное увеличение функциональной активности всех исследованных компонентов комплемента (С1ч, С1-С5; и повышение общей гемолитической активности СН50 по сравнению с донорами (р<0.001), также было обнаружечб'увеличение концентрации СЗ и С4 компонентов (р<0.01). Наиболее выраженными были отклонения в активности С1, С1я, СЗ компонентов, при этом концентрация СЗ и С4 и активность С1 положительно коррелировали с выраженностью анемии (р<0.001, р<0.002, р<0.05 соответственно), а активность СЗ - с развитием "амиотрофии. При исследовании связи агалактоэилирования 1&0 с другими параметрами оказалось, что снижение галахтозилирования положительно коррелировало с активностью СЗ и СН50, уровнем ревматоидного фактора в латекс-тесте, концентрацией белков острой фазы (серомуконд, СРВ), ММ ЦИК и длительностью заболевания, что подтверждает литературные данные о корреляции степени агалактоэилирования 1к0 с клиническими проявлениями при РА. По-видимому, аномальный I80 также принимает участие в развитии суставного синдрома при РА, поскольку отмечена положительная связь меж,ду концентрацией ЦИК и длительностью утренней скованности, и обратная корреляция ММ ЦИК с суставным индексом Ричи. Интересным является тот факт, что. несмотря на прием больными РА цитостатиков и кортикостеро-идов, подавляющих биосинтез белка, у больных отмечено значительное повышение уровня компонентов хомплемента и что может свидетельствовать о неадекватности проводимого лечения. Полу-

J

г?

• 4. Изучение связывания Cío с МИК различной ММ с помощью твердофазного имиунофермеитного метода.

'Для исследования взаимодействия МИК с Clq были использованы EclgO со средними относительными ММ равными 3 и 16. а также aTlgQ с ММ равной 20 (конечные концентрации 5-300, 1-90, 7-500 мкг/ил соответственно). Вило установлено наличие связывания МИК всех типов с Clq, носившее дозо-зависимый характер, при этом эффективность связывания МИК с Clq в больней степени зависела от их концентрации' для МИК с низкой ММ (3. молекулы igG). При "меиьаении концентрации KCIgO с МИ рваной 3 в 128 раз происходило снижение их связывания более, чей в 2 раза, тогда как при соответствующем уменьшении концентрации KcIgO с ММ равной 16 лишь в 1.S раза, a aTlgO с ММ равной 20 - в 1.2S раза. Добавле-

Рис. 7. Ннгнбнрования связывания С1ц с кс1£<Э с ММ равной 3 молекулам 1еО в присутствии различных количеств рактозы. Обоэна-. чены концентрации МИК: 1 - 0.165, 2 - О.082, 3 - 0.041 мкг/мл.

-ино лактозы на стадии внесения МИК приводило к достоверному сияхению связывания МИК с С1ч для МИК с ММ равной 3, данный эффект также наблюдался и в присутствии 0.1 М сахарозы, однако, эффективность кнгиб.ирования лактозой зависала от ее концентрации в пробе, а значения оптической плотности в пробах, содержащих ^актозу в различной концентрации, были достоверно нихе, чем в пробах, содержащих сахарозу, или пробах без добавления диса-херндов (максимальное ингибирование связывания в присутствии 0.1 М<яактози составляло 315, а 0,1 М сахарозы - 9*). Изменение значения оптической плотности о опытах по мш нбированию ла^то-

колысу при добавлении к смеси максимально возможной концентрации лактозы (100 мМ) происходило ннгибнрование связывания всего на 20Х, рассчитать точное значение константы ингибирования не представляется возможным. Ингибирования связывания сахарозой в том же диапазоне концентраций не было установлено. Таким образом, достоверные различия констант ингибирования нормального и дегалактоэилированного м1вО и наличие ингибирующего эффекта лактозы свидетельствуют о том, что гликаны являются одним из участков связывания С1ч.

ТАБЛИЦА 4.

МОЛЯРНЫЕ СООТНОИЕНИЯ НОНОСАХАРОВ (НА ОДНУ УГЛЕВОДНУЮ ЦЕПЬ) И СОДЕРЖАНИЕ ГЛИКАИОВ В НОРМАЛЬНОМ И ДЕГАЛАКТ03ИЛИР0ВАНН0М 1в0.

Вид препарата М-ацетилглю-козамин Галактоза Фукоза X гликанов

РА 4.48 1.27 1.15 3.0

РА 2 4.68 1.49 0.97 3.2

РА 3 3.98 1.22 о.8;-* 3.4.

РА 4 З.бб 1.12 0.93 3.1

РА 5 3.89 1.44 0.88 . 2.9 '

РА 6 3.96 1.48 1.01 3.0

РА 7 3.56 1.26 0.83 2.4

РА 8 3.88 1.07 0.70 3.7

РА 9 4 .20 1.08 0.79 2.9

РА 10 3.44 1.14 1.00 3.7

РА 11 4.13 1.44 0.97 а.9

РА 12 3.56 1.38 0. 86 3.0

ио доноров 3.95 1.78 1.02. 2.76

'Примечание: РА1-РА12 - препараты 1вО, выделенные из сь'воротки крови больных РА,

с i»IgG и IgO, полимернзоваином на искусственных матрицах (козлов Л.В. , 1984). Авторами данной работы также было показано, что для активации Clq достаточно его связывания с двумя соседними молекулами IgQ. Таким образом, независимо от способа полимеризации IgO и Пространственного расположения его детерминант (лежацих водной плоскости при полимеризации IgO на искусственных матрицах или сгруппированных особым образом в трехмерном пространстве), решающим фактором в аффективном связывании Clq с IgO является близкое расположение 2 детерминант IgG.

3. Связывание С1о с нормальным ГаО. агалактодилированным I»0 и другими эффекторами.

Поскольку в результате проведенных исследований была установлена доступность углевод-содержацих детерминант в составе ulgQ и МНК различных типов* а также обнаружено увеличение доступности данных эпитопов при возрастании ММ МИК,. имеющее характер, кривой с насыщением при графической интерпретации результатов, наряду с аналогичным характером зависимости энергии связывания Clq с МИК от их ЫМ и литературными данными о возможном участии гликанов IgO в связывании Clq компонента комплемента, ревено было изучить связывание Clq-с нормальными и частично дегалактознлнрованными мйлекулами IgQ и провести ингибировцние связывания аналогом терминальной части олигосахаридной-последовательности IgO - лактозой.

Соотношение ионосахаров и процентное содержание углеводов о молекулах IgO больных FA и доноров приведены в таблице 4. При сравнении нормального и дегалактознлнрсванного IgQ, содержащего 1.25 молей•галактозы на одну углеводную цепь (объединенные фракции препаратов РА 1,3, 7) были получены значения констант ин-гибиравания К: равные 29.0+-3.5 и 47.04-3.0 ыкМ соответственно (р<0.01). Полученные результаты хорошо согласуются с результатами исследований, в которых К1 определялась аналогичным образом и составляла для Рс-фрагнента IgOl ЗЭ+-5 мкМ (Сизой М.Ы., 1986). При исследовании ннгнбировання связывания Clq с ЕА ди-сахаридами - лактозой и сахарозой - обнаружен ингибирующчй эффект лактозы в диапазоне концентраций 1-100 ыМ, однако, иос-

ценные сведения расширяют представления о роли гуморальных факторов в патогенезе РА, а примененные подходы и результаты исследования могут быть использованы для оценки состояния больных РА и подборе новых средств патогенетической терапии.

дыигщч

1. Получены 3 вида модельных IgO иммунных комплексов. Химически стабильные ковалентно сшитые IgG комплексы с точными молекулярными массами целесообразно использовать в качестве стандартов лри проведении иммунологических исследований.

2. Содержащие галактозу детерминанты модельных IgO иммунных комплексов доступны для связывания с высокомолекулярным лиган-до,' - лектинои клещевины, RCA. Эффективность взаимодействия модельных иммунных комплексов с RCA возрастает с увеличением числа молекул IgG в комплексе.

3. Связывание RCA с углеводными остатками на поверхности IgO модельных Иммунных комплексов высокоспецифнчно, так как ингибн-руется лактозой. Обнаружена положительная корреляция между молекулярной массой модельных IgQ комплексов и конечной концентрацией лактозы, необходимой для полного ингнбнрования их взаимодействия с RCA.

4. Увеличение доступности гвлвктозных остатков при возрастании нолекуляриой массы коделышх комплексов не зависят от способа их получения и обусловлено повышением пространственной плотности углеводных детерминант. Распознавании глнканов рецепторныии молекулами облегчается в процессе агрегации молекул IgO.

$. Значение энергии связывания мононерного IgO с Clq составляет 6.18+-0.06, а предельное значение энергии связывания модельных комплексов с Clq - 12:30+-0.17 ккал/М, то есть происходит связывание одной молекулы Clq с 2 молекулами (детерминантами) IgO. б. Константы ассоциации с Clq компонентом комплемента мононерного нормального и дегалактозилнрованного IgO* выделенного из сыворотки крови больных ревматоидным артритом, отличаются и составляют соответственно 29.0+-3.5 н 47+-4.0 мкМ. Обнаружен ннгибируюднй эффект лактозы но связывание Clq с естественными и модельными комплексами. Детерминанты IgG, содержащие остаток г&лактозы, принимают участие а связывании с Clq, однако, не являются главным участком подобного взаимодействия.

7. у больных ревматоидным артритом выявлены выраженные нарушения концентрации и активности компонентов комплемента; обнаружена положительная связь степени деголактоэилирования ¡вО с повышением активности СЗ компонента и увеличением обвей гемолитической активности комплемента. Данные показатели являются чувствительными критериями активности аутоиммунного процесса.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Лебедева Т.В., Насонова В.А. Агалактоэнлированный tgO, функциональная активность компонентов системы комплемента у больных ревматоидным артритом. Тезисы юбилейной конференции,- посвяцен-ной 100-летию со дня рождения А.И. Нестерова, Москва, 20-23.11 1995, стр.22.

2. Сыкулев Ю.К., Еронина Т.В. Углеводные компоненты иммуноглобулинов: структура и биологическое значение. Успехи современной биологии 1990, т.110, вып. 2(5) стр.. 204-218.

3. Сыкулев ».К., Еронина Т.В., Острей» К.К., Алеккин В.А. Взаимодействие модельных IgG комплексов с лектином клыдевины обыкновенной в растворе по данным метода светорассеяния. Биохимия, 1990, т.55, вып.5, стр. 856-864.

4. Lebedeva T.V., Sykulev Yu.K., Ostreiko К.К. Accessibility of galactose-containing epitopes on the surface of '-Q model immune complexes in solution for Ricinus Communis Agglutinin. 8 International Congress of Immunology, Budapesht, Hungary, 23-28. 08.1992 Absracts, p.IS.

5. Lebedeva T.V., «assyliev V.I., Nassonova V.A. The functional activity of Clq, C1-C5 components of complement system in pSS patients. CIinicaT Rheumatology, 995, V.14, suppl. N1, p.36

6. Sykulev Yu.K., Yeronina T.V..Ostreiko K.K. Study of interaction of IgG model, immune complexes with Ricinus Communis in aqueous solution as established by light-scattering technique. Clinical Rheumatology, 1988, V.7r N.l р.14б!

7. Sykulev Yu.K., Yeronina T.V., Ostreiko K.K.-, Alyoshkin V.A Galactose-containing epitopes on the surface of IgG model immune complexes are accessible for specific binding with the high molecular weight ligand, Ricinus Agglutinin, in solution. Light-scattering study. Molecular Immunology 1991, V.28, N.10

p. 1105-1111. Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подл, к печати Z1A\ 4S ЗаказU? . Тираж 100