Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Связывание C1Q-ингибирование, активация комплемента, опсонизация иммунных комплексов

БИЧУЧЕР Анна Мироновна

На правах рукописи

СВЯЗЫВАНИЕ С1<2 - ИНГИБИРОВАНИЕ, АКТИВАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТА, ОПСОНИЗАЦИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ииа452672

Москва-2008

003452672

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Козлов Леонид Васильевич

Ляшенко Всеволод Андреевич Мягкова Марина Александровна

Ведущая организация: Государственный научный центр

«Институт Иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Зашита диссертации состоится « ^^ » 2008 г. в ¿^часов

на заседании специализированного совета Д 208.046.02 ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ.

[« У*

Автореферат разослан « 5 < » ¿¿-^ _2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Комплемент является передовым и неспецифическим барьером в защите организма от внешней агрессии и внутренних нарушений. Важным звеном в запуске каскада активации наиболее мощного классического пути комплемента является узнавание первым компонентом комплемента - его Clq субкомпонентом - активаторов: иммунных комплексов в антителозависимом ответе и в антителонезависимом ответе некоторых структур, являющихся индикаторами патологического процесса.

Поскольку каскад активации комплемента в конечном итоге приводит к уничтожению клеток, опознанных агрессивными или патологическими, и развитию реакций воспаления, становится понятным желание регулировать действие комплемента, особенно в тех случаях, когда по ряду терапевтических соображений процесс, определенный комплементом как патологический, оказывается для организма полезным. Явлениями с участием комплемента, которые необходимо отменить, являются, например, отторжение трансплантата или воспаление при аутоиммунных заболеваниях (Roos A., Daha M.R., 2002).

Циркулирующие в кровотоке иммунные комплексы как результат проявления иммунной защиты или аутоиммунной агрессии являются индикатором иммунного процесса, а также частью патологического звена. Свои функции иммунные комплексы проявляют при воздействии на комплемент, а именно при узнавании их субкомпонентом Clq (Schumaker V.N., 1986). Поэтому мерилом патогенности циркулирующих иммунных комплексов является их опсонизация Clq.

Защита комплементом от инфекций и инвазий может начинаться даже при отсутствии в организме антител к aipeccopy. В этом случае определенные поверхностные структуры последнего могут опознаваться непосредственно Clq или участниками альтернативного пути (Haeney M.R., 1998, Nauta A.J. et al., 2002). Необходимо понимание роли ангителонезависимой защиты от различных возбудителей инфекции и инвазии.

Одним из важных способов контроля функционирования комплемента является блокирование активации его классического пути (Roos A. et al., 2001). Такое блокирование достигается ингибированием реакции связывания Clq с активатором комплемента, в частности с иммунными комплексами. Поскольку на сегодняшний день известны многие соединения, способные в той или иной степени ингибировать связывание комплемента, целесообразно при создании лекарственных веществ - ингибиторов комплемента осуществлять поиск ингибиторов среди уже имеющихся препаратов, разрешенных к применению.

Все изложенное выше свидетельствует о необходимости создания методов для изучения реакции связывания СЦ с активатором, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует СЦ. Поэтому исследование: «Связывание СЦ - ингибирование, активация комплемента, опсонизация иммунных комплексов» является актуальным.

Цель настоящего исследования

Создание методов и изучение с их помощью связывания СЦ с активаторами классического пути системы комплемента, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует С1 д.

Задачи исследования

1. Разработать иммуноферментные методы определения ингибирования связывания СЦ с активаторами классического пути системы комплемента. Сравнить результаты определения констант ингибирования, вычисленных с помощью иммуноферментных методов, с данными, полученными гемолитическим методом и в опытах на модельных животных.

2. Исследовать механизм связывания СЦ с на соединениях, имитирующих обоих участников реакции.

3. Определить константы ингибирования связывания С 1ц некоторыми лекарственными веществами с целью обнаружения потенциальных регуляторов системы комплемента.

4. Изучить способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Разработать иммуноферменгный метод количественного определения СЦ-связывающих иммунных комплексов и сравнить его с другими методами определения ЦИК на реальном материале.

6. Разработать иммуноферментный метод определения антител, способных образовывать с антигенами иммунные комплексы, связывающие комплемент.

Научная новизна

1. Впервые разработан иммуноферменгный метод определения ингибирования связывания СЦ с активаторами классического пути системы комплемента. Метод применен для изучения механизма связывания СЦ с Показана роль ионных взаимодействий.

2. Определение констант ингибирования связывания СЦ некоторыми лекарственными веществами выявило механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Разработан экономичный иммуноферментный метод количественного определения С1я-связывающих иммунных комплексов.

4. Установлена способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Полученные результаты позволили углубить знания о природе взаимодействия СЦ со своими мишенями и о взаимосвязи между структурой веществ и их ин-гибирующей активностью.

6. Впервые разработан иммуноферментный метод определения СЦ-связывающих специфических антител.

Практическая значимость

• Иммуноферментный метод количественного определения С ^-связывающих иммунных комплексов с использованием поликлональных антител позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод пригоден для использования в практической медицине для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

• Созданная методика определения констант ингибирования связывания С1я позволяет проводить поиск ингибиторов СЦ среди лекарственных и нелекарственных веществ.

• Практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.

Положения, выносимые на защиту

• Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания СЦ с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Определение констант ингибирования связывания СЦ некоторыми лекарственными веществами позволило выявить механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента, и позволило предложить метод поиска потенциальных регуляторов системы комплемента.

• Иммуноферментные методы количественного определения СЦ-связывающих иммунных комплексов и определения СЦ-связывающих специфических антител могут использоваться для оценки клинической роли специфических антител и их иммунных комплексов.

Апробация работы

Апробация проведена на заседании секции «Общая и прикладная иммунология» Ученого Совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ 23 июня 2008 года, протокол № 4. Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Цитокины, воспаление, иммунитет» (Санкт-Петербург, июнь 2002), международной конференции, посвященной 80-летию института им. ЛЛастера (С.-Петербург, 2003), научно-пракгаческой конференции «Имму-ноглобулгаовые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003), Ш Международном симпозиуме «All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (TVIG)» (Плевна, Болгария, 2005), X Европейском конгрессе «Complement in Health and Disease» (Хайдельберг, Германия, 2005), IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005), IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 262 источника, в том числе 27 на русском языке. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе были использованы сыворотки крови пациентов КДЦ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ и нормальная донорская сыворотка (ГВКГ им. Н.Н. Бурденко), кроличья сыворотка с поликлональными моноспецифическими антителами к Clq субкомпоненту комплемента человека, препарат Clq собственного изготовления, пероксидазные конъюгаты анти-Clq, анти-СЗ, анти-IgG, белка А собственного изготовления, сыворотка крови норок стандартной коричневой породы (зверосовхоз «Салтыковский»), эритроциты барана, антигены герпеса I типа, кори, цитомегаловируса, субклеточная дифтерийная вакцина Кодивак, перокси-даза хрена, алифатические диамины и дикарбоновые кислоты, ряд лекарственных веществ из аптечной сети.

Для выполнения исследований применялись следующие коммерческие наборы: набор для микроанализа циркулирующих иммунных комплексов с помощью осаждения полиэтиленгликолем (Набор реагентов для определения циркулирующих иммунных комплексов "Микроанализ ЦИК", ООО "НПО СИНТЭКО, Россия), тест-набор CIC-C1Q ELISA (BUhlmann Laboratories AG, Швейцария) для определения иммунных комплексов.

В работе использованы разработанные иммуноферментные методы определения константы ингибирования связывания Clq с активаторами, метод количественного определения комплементсвязывающих иммунных комплексов.

Иммуноферментный анализ проводился в микропанелях для иммунологических реакций с использованием автоматического ридера «Multiskan ЕХ» (ThermoLab-systems).

В ходе работы были использованы компьютерные программы по вычислению: средних значений, среднестатистического отклонения, линейной регрессии (Microsoft Office), константы ингибирования К„ количества белка по диаметру кольца преципитации (JI.B. Козлов).

Ряд разделов работы выполнен с участием соавторов: B.JI. Дьякова (выделение IgG3), З.П. Белкина (эксперименты на мышах), С.В. Буреевой (синтез некоторых ингибиторов Clq), Т.А. Мамаевой (определение антител к вирусу кори), Е.А. Шмелевой и Ю.А. Парамоновой (определение антител к Кодиваку), Л.И. Новиковой (определение антител к герпесу I типа), Г.В. Бобылевой (определение антител к цитомегалови-русу).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуноферментные методы определения ингибирования связывания Clq с активаторами классического пути системы комплемента

Определение функциональной активности Clq

Для определения функциональной активности субкомпонента Clq первого компонента комплемента была использована способность функционально активного Clq связываться с активаторами классического пути комплемента. Способ, в котором в качестве активаторов были использованы иммуноглобулины G и М человека, сорбированные на микропанели для иммуноферментного анализа, был разработан ранее и на него был получен патент. Количество связавшегося функционально активного Clq определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена IgG антител против Clq человека.

Мы также показали, что и другие активаторы классического пути комплемента, например, липополисахариды (пирогенал), цитомегаловирус, могут быть использованы для иммуноферменгного определения функциональной активности субкомпонента С1я.

При использовании в качестве активатора миеломного моноклонального который, как известно, лучше других связывается с С^, было проведено сравнение метода ИФА с количественным определением С1я методом радиальной иммуно-диффузии с использованием стандартной сыворотки с известным содержанием СЦ (РИД) и гемолитическим методом определения функциональной активности СЦ в 9 сыворотках пациентов. Результаты приведены на рис. 1.

О Гемолиз

у = 0.901х+17.05 И2 - 0.952

□ РИД

у = 0.935Х +11.45 й2 = 0.906

100 150 200 250

С1с|, мкг/мл (ИФА)

300

Рис. 1. Сравнение иммуноферментвого метода определения функционально активного с гемолитическим методом определения активности и метода радиальной иммунодиффузни определения количества С^

Данные, полученные методом ИФА, вполне сопоставимы с результатами определения количества СЦ методом РИД и функциональной активности гемолитическим методом.

Разработка иммуноферментных методов определения ингибирования связывания С1я

Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом СЦ комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания С1ц с сенсибилизированными эритроцитами барана, т.е. ингибировании инициации каскада активации комплемента, завершающегося лизисом эритроцитов. Гемолитический метод, используемый в этом способе, не отличается высокой степенью воспроизводимости и связан с необходимостью приготовления гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того, метод требует удаления из системы исследуемого

ингибитора после стадии связывания СЦ с антителами, поскольку нельзя исключить возможности действия ингибитора на поздних этапах каскада активации, что усложняет процесс определения ингибирующего действия.

Для изучения ингибирования связывания СЦ с активаторами классического пути было предложено два подхода, основанных на использовании иммунофермент-ного метода анализа. В первом случае предварительно инкубировали смесь ингибитора в различных концентрациях с раствором чистого СЦ в одной определенной концентрации или с сывороткой крови, содержащей СЦ, в подобранном разведении. Затем инкубационные смеси вносили в лунки микропанели для ИФА, в которых был сорбирован активатор классического пути - ^вЗ или липополисахарид (ЛПС). Связавшийся СЦ после инкубации и отмывания лунок от несвязавшегося СЦ определяли с помощью конъюгата с пероксидазой хрена кроличьих антител против СЦ человека.

В другом подходе ингибитор в различных концентрациях вносили в лунки микропанели, в которых был предварительно сорбирован СЦ, в смеси с конъюгатом неспецифического человека с пероксидазой хрена. Во всех случаях определяли максимальное связывание в отсутствие ингибитора и ^ - связывание в присутствии ингибитора в концентрации [I]. Константу ингибирования К-, определяли по линейному уравнению 1/ щ = [Щго^ч) + 1/го], строя график зависимости 1/ ^ от [I] (рис. 2).

дисульфофенилантрон

Концентрация ингибитора, мг/мл Рас. 2. Определение £1 для ингибирования связывания СЦ дисульфофенилантровом:

Результаты определения ингибирования связывания СЦ разными методами приведены в таблице 1.

Табл. 1. Ингпбироваппе связывания С1д, определенное методами ИФА

Ингибитор Ки мг/мл

наС1д на 1^3 на ЛПС

гексаметилендиамин 0.185 ±0.016 0.214 ±0.017 0.191 ± 0.022

глутаровая кислота 0.493 ±0.025 0.534 ±0.024 0.709 ±0.038

Как следует из данных таблицы, наблюдается практическое совпадение констант, определенных разными методами, что свидетельствует об адекватности этих методов.

Новые методы давали также сопоставимые по порядку величин результаты и с разработанными ранее гемолитическими методами (табл. 2). Однако в гемолитическом методе константы ингибирования были ниже, чем определенные методом ИФА. Причиной этого может бьпъ разное соотношение партнеров связывания (СЦ и иммуноглобулинов) в этих двух методах.

Табл. 2. Ингибировапие связывания С1ц, определенное методом ИФА н

гемолитическим методом

Ингибитор ИФА Гемолитический метод

лизоцим (OiO^lO^M (2.9±0.9)-10"4М

дисульфат бетулина (42.2±2.6)-10"éM (8.6±1.8)-10-*М

сульфат бетулиновой кислоты (57.3 ± 12.2)-Ю^М (М^З^-Ю^М

Сравнение ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo

Обнаружение ингибирующего действия вещества на комплемент и определение константы ингибирования этим веществом активации комплемента на стадии связывания Clq в опытах in vitro, является лишь первым этапом на пути создания лекарственных веществ, блокирующих действие комплемента. Важным является знание действия веществ на комплемент на уровне организма. Чтобы изучить влияние вещества in vivo, необходима животная модель. В литературе описана модель (Higgins PJ, 1997), в которой морской свинке внутривенно вводят кроличью иммунную сыворотку, содержащую антитела к эритроцитам морской свинки.

Для сравнения ингибирующего действия на комплемент в опытах in vitro и in vivo мы воспользовались разработанным ранее способом, позволяющим определять ингибирующее действие веществ на комплемент на модельных животных. В качестве модельных животных использовали беспородных мышей, а в качестве источника комплемента и антител к клеткам крови животного сыворотку крови норок, комплемент которой обладает высокой активностью и в которой присутствуют в высоких титрах естественные антитела к эритроцитам мышей. В контрольных группах животным вводили в ретроорбитальное венозное сплетение 0.06-0.08 мл сыворотки крови норки, доведенной до объема 1 мл раствором 0.15 М NaCl. В опытных группах животных в этом растворе дополнительно содержалось 10 мг ингибитора. В одном из опытов 10 мг ингибитора в объеме 0.5 мл вводили за 2 мин до введения сыворотки норки также в общем объеме 0.5 мл. Число погибших животных подсчитывали через сутки. В контрольной ipynne без ингибиторов наблюдалась 100 % гибель мышей.

10

Было проведено изучение действия сурамина и гепарина на гибель мышей в результате парентерального введения им сыворотки норки. При этом в опытах одновременно с сывороткой норки мышам вводили соответствующий ингибитор в различных количествах. Введение 10 мг ингибиторов на мышь полностью отменяет гибель животных. Изучение дозозависимости отмены гибели животных под действием ингибиторов показало, что частичная гибель мышей начинает наблюдаться при введении 0.1 мг на мышь гепарина или 1 мг на мышь сурамина. Если учесть общий объем крови мыши 1-2 мл и 1 мл вводимого физиологического раствора, содержащего ингибитор и сыворотку норки, то достигаемые концентрации ингибиторов в условиях частичной гибели животных соответствуют константам ингибирования, полученным в опытах in vitro (для сурамина К\ 411 ± 29 мкг/мл, а для гепарина 36.4 ± 1.7 мкг/мл).

Таким образом, действие гепарина в опытах in vitro и in vivo по сравнению с сур амином в 10 раз сильнее в весовом соотношении. Такая корреляция свидетельствует о том, что в опытах на мышах причиной их гибели является действие комплемента, а ингибирование последнего приводит к выживанию животных.

Роль электростатических взаимодействий при связывании Clq с активаторами

Роль ионных взаимодействий между Clq и IgG при связывании хорошо известна. Важно было установить, наличие каких зарядов (положительных или отрицательных) следовало бы ожидать в связывающих цешрах молекулы Clq и ее лиганда и наиболее благоприятные расстояния между этими зарядами. Для этого было проведено определение констант ингибирования связывания Clq с его активаторами для ряда гомологичных диаминов и дикарбоновых кислот.

Ингибирование связывания Clq с IgG3 диаминами и дикарбоновыми кислотами изучали методом ИФА с сорбированным IgG3 человека в лунках микропанели и сывороткой крови в качестве источника Clq. Результаты показаны в табл.3 и на рис.3. Табл. 3. Константы ингибирования диаминами и дикарбоновыми кислотами связывания Clq с

Ингибитор Расстояние между заряженными группами, нм ÁT¡, мМ

1,3-Диаминопропан 0.49 59.30 ±5.70

1,4-Диаминобутан 0.59 17.70 ±2.20

1,5-Диаминопентан 0.75 8.33 ± 0.23

1,6-Диаминогексан 0.87 1.06 ±0.09

1,7-Диаминогептан 1.00 1.76 ±0.64

1,10-Диаминодекан 1.39 1.26 ±0.04

Малоновая кислота 0.44 8.73 ±2.21

Янтарная кислота 0.51 0.66 ±0.05

Глутаровая кислота 0.66 0.49 ±0.08

Адипиновая кислота 0.71 1.15 ±0.20

Пимелиновая кислота 0.89 3.01 ± 0.21

Пробковая кислота 0.94 3.71 ±0.44

И —йг-ди» ШЯ*||

-

р -•©Дикт

^^ « В / Л

0.4 0.В М 1 1.1 1.4

Расстояния между заряженными группами, им

Рис. 3. Зависимость констант ингиби-ровапня взаимодействия СЦ с иммуноглобулином вЗ от расстояния заряженных групп в ингибиторах.

Полученные результаты показали, что как для диаминов, так и для дшсарбоно-вых кислот существуют расстояния между заряженными группами, обеспечивающие наилучшее ингибирование связывания. Это 0.87 нм для диаминов и 0.66 нм для ди-карбоновых кислот. Можно предположить, что ингибитор, блокируя взаимодействие двух партнеров связывания, имитирует какой-либо один из них. Мы провели измерения констант ингибирования связывания СЦ с активатором, используя различные активаторы классического пути и преинкубацию ингибитора с различными партнерами такого взаимодействия без отмывки ингибитора после инкубации и с отмывкой. Результаты исследования приведены в таблице 4.

Табл. 4. Константы ингибирования гексаметилендиамнна и глутаровой кислоты в зависимости от способа определения.

Способ измерения Гексаметилендиамин Глугаровая кислота

К\, мг/мл Я2 Отношение констант К-,, мг/мл К1 Отношение констант

НаС1р 0.184 ±0.016 0.99 2.2 0.493 ± 0.0249 0.99 4.4

На С1д с отмывкой 0.413 ±0.075 0.91 2.19 ±0.38 0.94

НаДО 0.214 ±0.017 0.98 5.0 0.534 ±0.024 0.99 36

На ^ОЗ с отмывкой 1.07 ±0.13 0.96 19.2 ±1.0 0.99

НаЛПС 0.191 ±0.022 0.98 1.9 0.709 ±0.038 0.99 9.8

На ЛПС с отмывкой 0.353 ±0.101 0.86 6.97 ±0.07 0.99

НаЦМВ 0.733 ±0.010 0.99 2.4 3.21 ±0.10 0.99 -

На ЦМВ с отмывкой 1.79 ±0.087 0.99 - -

В таблице приведены результаты экспериментов по определению констант ин-гибирования для гексаметилендиамина и глутаровой кислоты. В первых двух строках в иммуноферментном методе анализа на СЦ, сорбированном на микропанели, показано связывание конъюгата человека с пероксидазой хрена в присутствии ингибитора и после отмывки преинкубированного в лунках планшета ингибитора. Во вторых двух строках представлено связывание СЦ с сорбированным на микропанели ^вЗ человека. Связавшийся СЦ определяли с помощью коньюгата кроличьих антител против СЦ с пероксидазой хрена. Точно также определяли связывание с ЛПС и цитомегаловирусом (ЦМВ), сорбированными на микропанели. Эти данные подтвердили способность СЦ связываться с ЛПС и ЦМВ антителонезависимым способом.

Как следует из данных таблицы по отношению констант, при отмывке преинкубированного гексаметилендиамина, последний лучше связывается с СЦ, ЛПС и ЦМВ, по сравнению с 1§СЗ. В случае ЛПС гексаметилендиамин, по-видимому, блокирует две фосфатные группировки липида А, необходимые для связывания с СЦ, как это происходит при блокировании этим диамином связывания липида А с рецептором ЛПС по данным литературы. Для ЦМВ ответственной за связывание с С1ц, по-видимому, является ДНК вируса, при этом связывание с вирусом глутаровой кислоты маловероятно. Это позволяет предполагать наличие в связывающем центре СЦ как положительно заряженных групп (ответственных за связывание с ЛПС и ЦМВ), так и отрицательно заряженных (существенных для связывания с иммуноглобулинами).

Глутаровая кислота задерживается после отмывки лучше всего на С 1ц, что характеризует наличие положительно заряженных групп в связывающем центре СЦ и, возможно, моделирует отрицательно заряженные группы в комплементсвязывающем участке иммуноглобулина. Данные о преимущественном связывании глутаровой кислоты с СЦ коррелируют с полученными ранее в нашей группе результатами по ин-гибированию полиметакриловой кислотой гемолитической активности комплемента вследствие преимущественного связывания с СЦ.

Исследование действия лекарственных веществ на комплемент

Лекарственные вещества могут оказывать действие на систему комплемента (Козлов Л.В., 2007). Исследованию способности ингибировать классический путь активации комплемента подвергли разнообразный набор лекарственных веществ, включающий нестероидные противовоспалительные препараты, вещество растительного происхождения, антибиотик, дезинфицирующие, антилепрозное, ангималярийное и антипротозойное средства. Результаты приведены в таблице 5.

Табл. 5. Константы ингнбировання связывания комплемента лекарственными веществами.

Максимальная

Лекарство К, Clq, Необходимая суточная тера-

мкг/мл доза, мг певтическая доза, мг

сульфетрон 0.06 ±0.01 0.3 1500

мирамистин 0.10 ±0.03 0.5 ?

дериват 4.45 ±0.19 20 75

куркумин 5.29 ±0.17 27 665

лизоцим 6.71 ± 1.76 35 150

диклофенак 19.0 ±2.9 95 50

слабилен 25.5 ±1.64 128 167

гепарин 36.4 ±1.7 180 280

мелоксикам 11б± 18 580 15

кромогликат 349 ±33 1750 5000

сурамин 411 ±29 2055 1600

делагил 544 ±178 2720 1000

гентамицин 47200 ±3100 236000 80

Для того чтобы можно было сравнить ингибирующее действие веществ по их эффективности, в таблице приведены максимальные терапевтические дозы этих лекарственных соединений и необходимая доза принимаемого препарата для достижения эффекта половинного ингибирования комплемента, рассчитанная из концентрации в крови, равной константе ингибирования, и общего объема крови 5 л. Конечно, такой расчет не всегда правилен. Для исследованных веществ его нельзя применять для мирамистина (препарата наружного применения) и проблематично для кромогли-ката натрия (ингаляционного препарата). Тем не менее, можно было бы ожидать, что в случаях, когда необходимая доза ниже максимальной терапевтической, должно наблюдаться подавление функциональной активности комплемента на стадии его активации. Если исключить из рассмотрения уже упомянутые мирамистин и кромогликат натрия, то выпадают из потенциально активных гентамицин, сурамин, мелоксикам, диклофенак и делали. Гентамицин существенно различается по необходимой и максимальной дозам. Что касается мелоксикама, делагила и диклофенака, как известно обладающих противовоспалительным действием, то следует отметить, во-первых, интересующие нас необходимая и максимальная дозы для диклофенака и делагила в принципе сопоставимы, а во-вторых, можно предполагать, что эти соединения, как и большинство нестероидных противовоспалительных препаратов, активны на другой стадии активации комплемента и блокируют образование СЗ/С5-конвертаз. Описанные в литературе константы половинного подавления гемолитической реакции для классического пути комплемента для слабилена, сульфетрона и куркумина практически совпадают с нашими данными по определению константы ингибирования первой стадии процесса активации комплемента.

Предложенный метод определения действия лекарственных веществ на систему комплемента на первой стадии процесса активации позволяет обнаружить и оценить эффективность исследуемых веществ в их воздействии на комплемент.

Метод полезно использовать для поиска препаратов, обладающих способностью ингибировать комплемент, а также для изучения побочного действия лекарственных веществ.

Антителонезависимая активация комплемента антигенами гельминтов

Гельмшггозы сопровождаются гуморальным иммунным ответом, что объясняется возможным контактом паразитов или их антигенов с кровью или слизистой хозяина. Важным критерием развития иммунного ответа является способность комплемента опсонизировать антиген, узнавая его ангителонезависимым способом. Система комплемента антителонезависимо активируется: 1) классическим путем при прямом связывании компонента Clq с активатором без посредства антител; 2) альтернативным путем, если активатор способен связывать на себе активированный компонент СЗ.

Исследована способность секреторно-экскреторных антигенов Trichinella sp., Opisthorchis felineus, Toxocara sp., Echinococcus sp. активировать систему комплемента ангителонезависимым способом по двум из перечисленных выше путей. Для этого были использованы полистироловые планшеты, содержащие сорбированные секре-торно-экскреторные антигены трихинелл, описторхисов, токсокар, эхинококков, производства «Векгор-Бест» и нормальная человеческая сыворотка, не содержащая антител ни к одному из указанных гельминтов. Для изучения связывания комплемента и его активации в лунках планшетов с антигенами инкубировали сыворотку крови человека в условиях активации классического пути комплемента (с ионами Са2+ и Mg24) и альтернативного пути (с ионами Mg2+ в отсутствие ионов Са2+). После инкубации с помощью конъюгатов соответствующих антител с пероксидазой определяли связывание на сорбированных антигенах компонентов Clq и СЗ. Связывание Clq свидетельствовало об антителонезависимом узнавании антигена классическим путем активации комплемента, а связывание компонента СЗ - об активации классического или альтернативного путей.

Полученные данные приведены в таблице 6. Табл. б. Определение активации альтернативного и классического путей комплемента на

поверхностных антигенах гельминтов.

Антигены гельминтов Альтернативный путь Классический путь

Связывание СЗ, у.е. Связывание СЗ, у.е. Связывание Clq, у.е.

Trichinella 32 58 53

Opisthorchis 510 27 69

Echinococcus 106 51 30

Toxocara 223 14 28

Все исследованные антигены оказались способными связывать Clq и активировать оба пути комплемента. Соотношения в эффективности антигенов трихинелл, описторхисов, эхинококков и токсокар, в связывании Clq приблизительно соответствовали 5:7:3:3, в активации классического пути - 6:3:5:1 и альтернативного пути -1:16:3:7. Активация комплемента не только приводит к лизису клеток, несущих антиген, но и к включению других защитных систем организма хозяина - выбросу цито-кинов, инициированию реакции воспаления, лейкоцитозу. Полученные данные свидетельствуют о вероятном участии комплемента в защите от паразитарных инвазий.

Иммуноферментвый метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов

На сегодняшний день существует множество методов определения ЦИК, различных по сложности и стоимости. Однако практически все методы плохо согласуются между собой, и часто рекомендуется использовать несколько из них (Van Ноеу-veldE.,2000).

В данной работе предложен иммуноферментный метод определения ЦИК, основанный на способности иммунных комплексов связывать компонент Clq комплемента. В предлагаемом методе иммуноферментный планшет покрывали моноспецифическими полшслональными кроличьими антителами против Clq человека. Иммунные комплексы, опсонизированные Clq, из сыворотки крови связываются с сорбированными антителами, и их количество определяли с помощью коньюгатов с перокси-дазой антител против IgG, IgM или IgA.

В работе проводится сравнение предлагаемого метода с наиболее применяемыми в настоящее время, и обсуждаются возможные причины наблюдаемых различий результатов определений реальных ЦИК.

Из многих имеющихся на сегодня методов определения ЦИК в нашей стране наиболее распространен в клинической практике метод обнаружения комплексов, осаждаемых полиэтиленгликолем и измеряемых по светорассеянию (далее метод ПЭГ). За рубежом популярны иммуноферментные методы анализа (ИФА), основанные на связывании Clq-несущих ЦИК с мышиными моноклональными анти-Clq-антителами, сорбированными в лунках микропанели, с детектированием мечеными пероксидазой Р(аЬ')-антителами к IgG человека (далее MAb-Clq метод). Иногда и у нас и за рубежом используют метод ИФА, в котором для связывания ЦИК на мшфо-панели сорбируют Clq. Одной из разновидностей последнего метода является коммерческий набор CIC-C1Q ELISA (Btihlmann Laboratories AG, Швейцария), строго говоря, не являющийся иммуноферментным (далее метод CIC-C1Q). Он основан на связывании ЦИК с сорбированным на микропанели Clq и оценке количества связавшихся иммунных комплексов с помощью коньюгата белка А с щелочной фосфатазой.

Дня получения адекватных результатов определения комплементсвязывающих ЦИК с использованием более дешевых реагентов был предложен рассматриваемый здесь метод. Он основан на связывании СЦ-несущих ЦИК с кроличьими моноспецифическими поликлональными анти-СЦ-антителами, сорбированными в лунках микропанели, с детектированием мечеными пероксидазой козьими моноспецифическими поликлональными антителами к (1(5М или человека (далее анти-СЦ метод).

Методом анти-СЦ было проведено определение содержания ЦИК в сыворотках здоровых доноров крови и больных ревматоидным артритом. Результаты определения приведены в таблице 7.

Табл. 7. Результаты определения комплементсвязывающих ЦШС у доноров крови и больных ревматоидным артритом (РА).

Параметр Доноры Больные РА

Среднее ± станд. откл.,_мкг/мл 7± 12 47 ±32

Максимум, мкг/мл 35 137

Норма (ср. + 2 ст.откл.), мкг/мл до 31

Число сывороток 24 20

Превышение нормы, чел. (%) 2 (8%) 14 (70%)

По литературным данным (Reckel R.P., 1984), среднее содержание ЦИК у нормальных доноров крови составляет 3.8 ± 15.3 мкг/мл, а норма (ср. + 2 ст. откл.) до 34 мкг/мл. Результаты, полученные предлагаемым анти-Clq методом (7 ± 12 мкг/мл и до 31 мкг/мл), практически совпадают с литературными.

По литературным данным, повышенное содержание ЦИК обнаруживается у 86% или 81.1% (Antes U., 1991) больных РА при определении по MAb-Clq методу, 77.2% (HaSkovi V., 1978) при определении с осаждением ПЭГ и 67% (Antes U„ 1987) при использовании метода ИФА, в котором для связывания ЦИК применяли сорбированный Clq.

Следует отметить, что метод MAb-Clq может давать завышенные результаты, поскольку в крови человека могут присутствовать антитела к иммуноглобулинам мыши (Olds L.C., 1984). Можно также ожидать завышения результатов при использовании ПЭГ метода из-за возможного осаждения помимо ЦИК других высокомолекулярных комплексов и белков. Таким образом, данные, полученные предлагаемым анти-Clq методом (70%) приближаются к данным, в которых отсутствует завышение определяемых ЦИК.

Предлагаемый метод анти-Clq был проверен сравнением с ПЭГ методом на модельных ЦИК (термически агрегированных неспецифических IgG человека), опсо-низированных Clq (рис. 4). Было найдено полное совпадение результатов. Следует отметить, что определение модельных ЦИК, опсонизированных Clq, коммерческим методом CIC-C1Q дает при линейной калибровочной линии существенно заниженные результаты (рис. 5).

у-0Л№*1Дг17

и-аяш уо.|1мх*о1«м я-о.дв«т

о антяед »ПЭГ

Рис. 4. Определение иммунных комплексов методом анти-С1я п методом ПЭГ на модельных комплексах, полученных тепловой агрегацией человека.

Рве. 5. Определение иммунных комплексов методом С1С-С1<} на модельных комплексах, полученных тепловой агрегацией человека.

Полученные данные можно объяснить тем, что опсонизация комплексов субкомпонентом СЦ мешает связыванию с СЦ, сорбированным на микропанели. Следовательно, и при определении реальных ЦИК в сыворотке опсонизация комплексов эндогенным СЦ может мешать их связыванию на микропанели.

Было проведено сопоставление данных, полученных тремя методами, при определении реальных ЦИК в 31 сыворотке крови обследуемых пациентов. На рис. 6 показано, что данные определения методом ПЭГ и методом анти-С^ обнаруживают по крайней мере два типа ЦИК, проявляющихся по-разному в двух различных методах. Такая же картина наблюдается при сравнении методов ПЭГ и С1С-С1С2 (рис. 7). Отличия ЦИК, дающих различные картины при сравнении метода осаждения ПЭГ с иммуноферментными методами, в основе которых лежит связывание иммунными комплексами С^, могут состоять в размерах этих иммунных комплексов.

Рис. б. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом анти-С^ и методом ПЭГ в сыворотках крови обследуемых пациентов.

Рис. 7. Определение циркулирующих иммунных комплексов методом С1С-С10 н методом ПЭГ в сыворотках крови обследуемых пациентов

Более удовлетворительные данные были получены при сравнении близких методов анти-СЦ и С1С-С1(2 (рис. 8). В последнем случае 7 из 31 точки (около 20%) выпадают из общей тенденции. Кроме того, концентрации ЦИК, полученные методом С1С-С1(}, ниже, чем для метода анти-СЦ. О возможных причинах этого говорилось выше.

Одной из положительных особенностей метода анти-СЦ является его пригодность для определения не только ^в-содержащих иммунных комплексов, но также и для 1(»А-ЦИК и ¡цМ-ЦИК, поскольку, как уже было сказано, СЦ связывается, кроме также и с ¡¿рЛ и 1§Д. Правда, в последнем случае такие иммунные комплексы не способны активировать классический путь комплемента, а только альтернативный. Для того чтобы метод анти-СЦ применить для определения 1;*А-ЦИК и 1§М-ЦИК, достаточно лишь поменять анти-^О конъюгат, на анти-1|>А или анти-1§Д1

Рас. 8. Определение циркулирующих им- Рис. 9. Корреляция содержания 1йА-

мунных комплексов методом С1С-С1<2 и ЦИК и 1оМ-ЦИК с ^&ЦИК при опре-

аптп-С1я в сыворотках крови обследуе- делении методом анти-С1ц в сыворот-

мых пациентов. ках крови обследуемых пациентов.

На рис. 9 показана корреляция содержания 1|>А-ЦИК и 1{»М-ЦИК с ^б-ЦИК при определении методом анги-СЦ в сыворотках крови обследуемых пациентов. Интересно отметить, что увеличение содержания ^в-ЦИК приводит также к повышению содержания 1§А-ЦИК. Обратная корреляция ^й-ЦИК и 1§М-ЦИК объяснима тем обстоятельством, что первоначально иммунный ответ развивается в виде 1{>М антител, а затем происходит переключение на синтез антител. Поэтому с ростом специфических антител содержание специфических антител должно падать. Очевидно, что такая тенденция должна проявляться и для иммунных комплексов.

Все изученные методы дают одинаково хорошие результаты при исследовании модельных ЦИК. Однако результаты определения реальных ЦИК в испытуемых сыворотках не вполне совпадают при определении разными методами. Одной из причин этого может быть влияние размеров комплексов на результаты количественных определений ЦИК этими методами. Метод, предлагаемый в данной работе, основан на оп-

ределении иммунных комплексов, связанных с СЦ. Поскольку связывание СЦ может приводить к активации комплемента, то патогенность ЦИК определяется именно этим обстоятельством. В связи с этим, а также с его относительной дешевизной метод можно считать предпочтительным для клинического применения.

Определение содержания СЦ-связывающих специфических антител

Описанный выше метод определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов был применен для обнаружения специфических антител в составе ЦИК, создаваемых путем добавления в тестируемую сыворотку специфического антигена. Этот подход напоминает традиционную реакцию связывания комплемента, в которой гемолитический метод заменен иммуноферментным. Привлекательность такого подхода состоит в том, что, имея одну лишь тест-систему для определения иммунных комплексов, можно было бы определять любые специфические антитела при наличии специфического антигена. Возможность такого подхода была апробирована с использованием вирусных и бактериальных антигенов.

Была исследована зависимость количества в иммунных комплексах (образующихся при добавлении антигена к иммунным сывороткам крови), содержащих СЦ и связывающихся на микропанели, покрытой антителами к СЦ, от количества иммунных определяемых в тех же сыворотках с помощью микропанелей со связанным антигеном.

Было найдено, что специфические иммунные комплексы различаются способностью опсонизироваться комплементом. То есть, число специфических иммунных комплексов, опсонизированных СЦ, не дает однозначной линейной зависимости от числа иммунных антител, а обнаруживается несколько линейных зависимостей. Такая гетерогенность антител дискретна и ограничена небольшим набором типов, что, по-видимому, может быть использовано для характеристики индивидуального иммунного ответа для каждого пациента.

Для определения количества специфических иммунных антител класса были использованы коммерческие или сконструированные собственные ИФА тест-системы, в которых на микропанели сорбировали антиген, в лунки микропанели добавляли испытуемые сыворотки в подобранном разведении и количество связавшихся иммунных антител определяли с помощью конъюгата антител против человека.

Для определения количества специфических иммунных антител класса, способных формировать комплементсвязывающие иммунные комплексы с исследуемым антигеном, проводили преинкубацию испытуемых сывороток с подобранным количеством антигена. Полученные опсонизированные эндогенным СЦ иммунные комплексы связывались на микропанели с сорбированными антителами против СЦ

человека. Количество специфических иммунных антител в составе иммунных комплексов определяли с помощью конъюгата антител против человека.

Для проверки адекватности определения количества специфических иммунных антител класса вторым методом результаты, полученные им, наносили на график против результатов, полученных первым методом. Полученные графики показаны на рис. 10.

Во всех случаях с иммунными сыворотками против вакцины Кодивак (а), вирусов герпеса I типа (б), кори (в) и цигомегаловируса (г) графики представляли собой набор прямых линий (от двух до четырех), которые свидетельствовали о гетерогенности специфических иммунных антител класса, существующих в разных типах иммунных сывороток. При этом всегда обнаруживалась популяция антител, которая при их низком содержании по данным прямого определения показывала наличие высокого содержания опсонизированных СЦ иммунных комплексов, образованных специфическими иммунными антителами. Эту популяцию антител из-за их низкой концентрации мы склонны отнести к «базовым», существующим до развития индуцированного ответа и исчезающим после накопления в более высоких концентрациях «иммунных» антител. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами по вакцинации против менингококка: до вакцинации в сыворотках обнаруживались антитела к наиболее сильному эпитопу, а после вакцинации эти антитела исчезали, зато появлялись антитела к слабым эпитопам.

Причина наблюдаемой гетерогенности специфических антител пока не ясна. Можно лишь предполагать, что в более крупных иммунных комплексах может обнаруживаться предлагаемым методом меньшее количество антител, что обусловлено стерическими препятствиями. Тем не менее, можно говорить о различиях в типе иммунного ответа различных индивидуумов и таких типов ответа существует для данного антигена ограниченное число.

§ 0.8 5 о.в

04

0.2 0

100 200 300 400 500 600 Специфич. ДО, усл.ед.

) 2 3

Специфич. ДО, ед. ОП

Антитела к вирусу кори

Антитела к ЦМВ

0.2 -,

Специфич. 1дв, ед. ОП

0.1 0.2 0.3 0.4 Специфич. 1дв «Д. ОП

Рис. 10. Зависимость количества С^-связывающих специфических иммунных комплексов от количества специфических иммунных антител против вакцины коднвак (а), вирусов герпеса (б), кори (в), цитомегаловируса (г) в сыворотках иммунных больных.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны иммуноферменгные методы определения констант ингибирования связывания С1ц с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Показана роль электростатических взаимодействий при связывании СЦ с активаторами.

2. Определены константы ингибирования связывания С1я некоторыми лекарственными веществами. Предложен механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Выявлена способность паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента без участия антител.

4. Разработан иммуноферменгаый метод количественного определения СЦ-связывающих иммунных комплексов. Метод позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов.

5. Разработанный нммуноферментный метод определения специфических антител к вирусным и бактериальным антигенам показал гетерогенность этих антител в отношении образования Clq-связывающих иммунных комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Козлов JI.B., Дьяков В.Л., Романов С.В., Jlaxmrn В.М., Бтучер A.M.. Андина С.С., Колесникова Е.А. Функциональная активность компонентов комплемента - новый диагностический критерий// Материалы третьей международной конференции посвященной 80-летию Ин-та им. Пастера. С.-Петербург. 2003. С. 167.

2. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л., Романов С.В., Бичучер A.M. Действие иммуноглобулинов различных классов на систему комплемента// Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтераль-ного и внутривенного применения». Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». 2003. С. 10-11.

3. Козлов Л.В., Белкин З.П., Бичучер A.M.. Баталова Т.Н., Дьяков В.Л. Сравнение действия ингибиторов комплемента в опытах in vitro и in vivo: нммуноферментный метод изучения ингибирования субкомпонента Clq и ингибирование действия комплемента на модельных животных// Биомедицинская химия. 2003. Т.49. №3. С.284-290.

4. Козлов Л.В., Романов С.В., Андина С.С., Бичучер A.M.. Колесникова Е.А., Дьяков

B.Л. Влияние наличия в крови IgG антител к патогену на изменение функциональной активности компонентов комплемента// Патогенез. 2004. № 4. С. 47-52.

5. Бичучер A.M.. Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Иммуноферменгный метод определения комплемент-связывающих иммунных комплексов// Иммунология Урала. 2005. №1(4).

C. 184-185.

6. Bureeva S.V., Bichucher A.M.. Andia-Pravdivy J.E., Igumnov M.A., Moskaleva V.V., Rukosueva N. V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Kozlov L. V., Kaplun A.P. Synthetical immunomodulators: inhibition of Clq-IgG interaction by negative charged low weight compounds// Abstracts of 1П International Symposium "All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)" Pleven. Bulgaria 2-5 June 2005. C.53.

7. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Bichucher A.. Orishchenko D., Kaplun A. QSAR of inhibition of classical pathway of complement activation by dicarboxylic acids// Mendeleev Commun. 2005. № 6. P. 253-256.

8. Bichucher A.M.. Kozlov L. V. The inhibition of binding Clq to aggregated IgG by aliphatic diamines and dicarboxylic Acids//Mol. Immunol. 2006. V.43. P.151.

9. Bureeva S. V., Andia-Pravdivy J.E., Bichucher A.M.. Igumnov MA., Moskaleva V. V., Rukosueva N. V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Popenko V.I., Kozlov L. V., Kaplun A.P. Neg-

23

ative charged low weight compounds inhibit classical pathway of complement activation blocking Clq-IgG interaction. // Mol. Immunol. 2006. V.43. P.188.

10. Козлов JI.B., Романов C.B., Андина C.C., Бичучер A.M.. Колесникова Е.А., Дьяков B.JI. Влияние сывороточных IgG антител к Chlamydia trachomatis на функциональную активность компонентов комплемента//ЖМЭИ. 2006. №3. С. 81-86.

11. Бичучер A.M., Козлов JI.B. Антотелонезависимая активация комплемента секре-торно-экскреторными антигенами гельминтов// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. 2007. Т. 3. С. 13-14.

12. Бичучер A.M.. Козлов JI.B., Новикова Л.И., Парамонова Ю.А., Шмелева Е.А. Определение содержания специфических антител к инфекционным агентам унифицированным методом// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, мшфобиологов и паразитологов. Москва. 2007. Т. 3. С.252-253.

13. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Symon A., Bichucher A.. Moskaleva V., Popenko V., ShpakA., Shvets V., Kozlov L., Kaplun A. Selective inhibition of the interaction of Clq with immunoglobulins and the classical pathway of complement activation by steroids and triter-penoids sulfates.//Bioorg. Med. Chem. 2007. V.15. P. 3489-3498.

14. Бичучер A.M.. Козлов JI.B. Исследование действия лекарственных веществ на комплемент. Ингибирование связывания субкомпонента Clq с мишенью// Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т. 70. №6. С.25-28.

15. Козлов JI.B., Бичучер A.M.. Дьяков B.JI. Заявка на изобретение № 2006125176 «Способ и набор иммуноферментного определения комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов» // Бюллетень изобретений № 19 10.07.2008.

Патенты:

1. Козлов JI.B., Бичучер A.M., Дьяков B.JI., Баталова Т.Н., Гузова В.А. патент РФ № 2190219 на изобретение «Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента Clq» // Бюллетень изобретений № 27.27.09.2002.

2. Козлов JI.B., Бичучер A.M.. Дьяков B.JI. патент РФ № 2313094 С1 на изобретение «Способ и набор для иммуноферментного определения действия веществ на связывание субкомпонента Clq комплемента» II Бюллетень изобретений №35 20.12.2007.

Типография "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. 152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность проблемы

Комплемент является передовым и неспецифическим барьером в защите организма от внешней агрессии и внутренних нарушений. Важным звеном в запуске каскада активации наиболее мощного классического пути комплемента является узнавание первым компонентом комплемента, его Clq субкомпонентом, активаторов: иммунных комплексов в антителозависимом ответе и в антителонезависимом ответе некоторых структур, являющихся индикаторами патологического процесса.

Поскольку каскад активации комплемента в конечном итоге приводит к уничтожению клеток, опознанных агрессивными или патологическими, и развитию реакций воспаления, становится понятным желание регулировать действие комплемента, особенно в тех случаях, когда по ряду терапевтических соображений процесс, определенный комплементом как патологический, оказывается для организма полезным. -Явлениями с участием комплемента, которые желательно отменить являются, например, отторжение трансплантата или воспаление при аутоиммунных заболеваниях [188].

Циркулирующие в кровотоке иммунные комплексы как результат проявления иммунной защиты или аутоиммунной агрессии являются индикатором иммунного процесса, а также частью патологического звена. Свои функции иммунные комплексы проявляют при воздействии на комплемент, а именно при узнавании их субкомпонентом Clq [204]. Поэтому мерилом патогенности циркулирующих иммунных комплексов является их опсонизация Clq.

Защита комплементом от инфекций и инвазий может начинаться даже при отсутствии в организме антител к агрессору. В этом случае определенные поверхностные структуры последнего могут опознаваться непосредственно Clq или участниками альтернативного пути [99, 166]. Необходимо понимание роли антителопезависимой защиты от различных возбудителей инфекции и инвазии.

Одним из важных способов контроля функционирования комплемента является блокирование активации его классического пути [190]. Такое блокирование достигается ингибированием реакции связывания Clq с активатором комплемента, в частности с иммунными комплексами. Поскольку на сегодняшний день известны многие соединения, способные в той или иной степени ингибировать связывание комплемента, целесообразно при создании лекарственных веществ - ингибиторов комплемента организовать поиск ингибиторов среди уже имеющихся препаратов, разрешенных к применению.

Все изложенное выше свидетельствует о необходимости создания методов для изучения реакции связывания Clq с активатором, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует Clq. Поэтому исследование: «Связывание Clq - ингибирование, активация комплемента, опсонизация иммунных комплексов» является актуальным.

Цель исследования

Создание методов и изучение с их помощью связывания Clq с активаторами классического пути системы комплемента, ингибирования этого связывания и блокирования патологических процессов, в которых участвует Clq.

Задачи исследования

1. Разработать иммуноферментные методы определения ингибирования связывания Clq с активаторами классического пути системы комплемента. Сравнить результаты определения констант ингибирования, вычисленных с помощью иммуноферментных методов, с данными, полученными гемолитическим методом и в опытах па модельных животных.

2. Исследовать механизм связывания Clq с IgG на соединениях, имитирующих обоих участников реакции.

3. Определить константы ингибирования связывания Clq некоторыми лекарственными веществами с целью обнаружения потенциальных регуляторов системы комплемента.

4. Изучить способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Разработать иммуноферментный метод количественного определения Clq-связывающих иммунных комплексов и сравнить его с другими методами определения ЦИК на реальном материале.

6. Разработать иммуноферментный метод определения антител, способных образовывать с антигенами иммунные комплексы, связывающие комплемент.

Научная новизна

1. Впервые разработан иммуноферментный ме год определения ингибирования связывания Clq с активаторами классического пути системы комплемента. Метод применен для изучения механизма связывания Clq с IgG. Показана роль ионных взаимодействий.

2. Определение констант ингибирования связывания Clq некоторыми лекарственными веществами выявило механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Разработан экономичный иммуноферментный метод количественного определения Clq-связывающих иммунных комплексов.

4. Установлена способность бактериальных, вирусных и паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента антителонезависимым путем.

5. Полученные результаты позволили углубить знания о природе взаимодействия Clq со своими мишенями и о взаимосвязи между структурой веществ и их ингибирующсй активностью.

6. Впервые разработан иммуноферментный метод определения Clq-связывающих специфических антител.

Практическая значимость

• Иммуноферментный метод количественного определения Clq-связывающих иммунных комплексов с использованием поликлональных антител позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод пригоден для использования в практической медицине для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

• Созданная методика определения констант ингибирования связывания Clq позволяет проводить поиск ингибиторов Clq среди лекарственных и нелекарственных веществ.

• Практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.

Положения, выносимые на защиту

• Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания Clq с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Определение констант ингибирования связывания Clq некоторыми лекарственными веществами позволило выявить механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента, и позволило предложить метод поиска потенциальных регуляторов системы комплемента.

• Иммуноферментные методы количественного определения Clq-связывающих иммунных комплексов и определения Clq-связывающих специфических антител могут использоваться для оценки клинической роли специфических антител и их иммунных комплексов.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны иммуноферментные методы определения констант ингибирования связывания Clq с иммунными комплексами и другими активаторами классического пути. Показана роль электростатических взаимодействий при связывании Clq с активаторами.

2. Определены константы ингибирования связывания Clq некоторыми лекарственными веществами. Предложен механизм их противовоспалительной активности, обусловленный действием на систему комплемента.

3. Выявлена способность паразитарных антигенов инициировать классический путь комплемента без участия антител.

4. Разработан иммуноферментный метод количественного определения Clq-связывающих иммунных комплексов. Метод позволяет адекватно оценивать наличие патогномоничных циркулирующих иммунных комплексов.

5. Разработанный иммуноферментный метод определения специфических антител к вирусным и бактериальным антигенам показал гетерогенность этих антител в отношении образования Clq-связывающих иммунных комплексов.