Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Использование дендритных клеток в иммунотерапии меланомы

Актуальность темы ,

Меланома кожи является одним из самых агрессивных онкологических заболеваний с неблагоприятным прогнозом (1). Даже при полном хирургическом иссечении опухолевой массы при IIB и III стадиях заболевания до 80% больных погибают от последующего прогрессирования в течение 3 лет (81). В последние годы было проведено большое количество клинических исследований, посвященных адьювантному лечению меланомы. Несмотря на довольно широкий спектр химиопрепаратов, применяемых в адьювантном режиме, полученные результаты противоречивы (4, 8). В одних случаях регистрировали улучшение показателей выживаемости, тогда как в других -наблюдали противоположный эффект. Сложность адьювантного лечения меланомы во многом связана со свойствами самих опухолевых клеток. Так, клетки меланомы могут длительное время не пролиферировать, и в этом , случае проводимая адьювантная химиотерапия не будет оказывать повреждающего действия на существующие микрометастазы. Другим способом борьбы с оставшимися после операции опухолевыми клетками является активация иммунной системы больного (7, 62). К активаторам иммунитета относятся рекомбинантные цитокины, например интерферон-а. Данный препарат может оказывать действие как на сами опухолевые клетки, подавляя пролиферацию и увеличивая их антигенность, так и на иммунную систему, активируя различные звенья противоопухолевого иммунитета. Тем не менее, данные клинических исследований адьювантного применения интерферонов при меланоме как в монорежиме, так и в комбинации с химиопрепаратами имеют противоречивый характер и не позволяют говорить о высокой эффективности данного подхода (128).

Дендритные клетки впервые были описаны в 70х годах прошлого века (124). Между тем изучение: их свойств и функциональных характеристик началось лишь в начале 90х годов (18, 104). Дендритные клетки являются специализированными и наиболее мощными антиген-презентирующими клетками, с помощью которых можно получить направленный иммунный ответ (33, 111). Когда была разработана методика культивирования дендритных клеток in vitro и изучена их функциональная активность, на них стали возлагать большие надежды в отношении терапии онкологических заболеваний (20, 38, 97). Первые исследования, посвященные клиническому применению дендритных клеток в онкологии, относятся ко второй половине 90х годов прошлого века (82, 130). Наибольший интерес ученых обращен к терапии меланомы, так как, во-первых, для данной нозологии охарактеризовано наибольшее количество опухолеспецифических антигенов (64), и, во-вторых, сама по себе меланома является иммуногенной опухолью, а также показана принципиальная возможность получения противоопухолевого иммунного ответа на нее (117). Таким образом, разработка способов использования дендритных клеток в иммунотерапии меланомы является актуальной темой в современной онкологии.

Цель исследования

Целью настоящей работы является разработка подходов к иммунотерапии меланомы с помощью дендритных клеток.

Задачи исследования

1. Отработать условия культивирования и нагрузки дендритных клеток опухолевыми антигенами. Адаптировать методику культивирования дендритных клеток из периферической крови для клинического применения.

2. Отработать методику криоконсервации мононуклеаров периферической крови для последующего получения дендритных клеток.

3. Определить безопасность, токсичность и переносимость противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток в процессе вакцинотерапии больных меланомой.

4. Определить противоопухолевый иммунный ответ у больных меланомой на фоне вакцинотерапии дендритными клетками.

Научная новизна исследования

Отработан и адаптирован метод культивирования дендритных клеток из моноцитов периферической крови для клинического применения. Отработан метод криоконсервации мононуклеаров периферической крови для дальнейшего получения из них дендритных клеток. Проведены клинические исследования по применению дендритных клеток у больных меланомой.

Практическая значимость исследования

Отработанный метод получения дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, позволяет более широко применять данный подход в онкологической практике. Использование противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных клеток для профилактики рецидивов может стать новым способом адьювантного лечения меланомы.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Несмотря на бурное развитие биологии и медицины в последние 15-20 лет, поиск новых способов терапии онкологических заболеваний остается актуальной проблемой современной онкологии. На сегодняшний день в онкологической практике широко применяются три основных подхода:

1. хирургия

2. химиотерапия (лекарственная терапия)

3. ионизирующее излучение

Биотерапия - относительно новое, но интенсивно развивающееся направление в онкологии. Применение биотерапевтических подходов в клинике стало возможным благодаря успехам, достигнутым в иммунологии и молекулярной биологии за последние десятилетия. Четкой классификации биотерапии не существует, так как спектр применяемых препаратов и подходов очень широк, и с каждым годом он становится все больше. Препараты на основе моноклональных антител (МКА) (Ритуксимаб, Герцептин и др.) (67, 89), цитокины (интерлейкин-2, интерферон-а, и др.) (2, 5, 122) широко применяются в клинике, различные противоопухолевые вакцины (41, 58), терапия на основе лимфокинактивированных киллеров (83, 84), антисмысловые последовательности к онкогенам (60) и др., проходят различные фазы клинических исследований. Одной из составных частей биотерапии является иммунотерапия. Основной отличительной особенностью иммунотерапии от других подразделов биотерапии является то, что ее главная задача заключается в активации противоопухолевого иммунитета больного. К иммунотерапевтическим подходам относится применение цитокинов, иммуностимуляторов, противоопухолевых вакцин (2, 74).

Несмотря на то, что сам термин - «вакцина» не совсем корректно использовать в онкологии, так как классически считается, что вакцинацию проводят для предотвращения заболевания, а не для лечения уже существующей болезни, он вошел в научную терминологию, и характеризует определенное направление в иммунотерапии опухолей. Главной задачей вакцинотерапии рака, отличающей ее от других биотерапевтических подходов, является генерация специфического иммунного ответа на вводимые компоненты, которые в той или иной степени представляют собою опухолевые антигены.

Классификация противоопухолевых вакцин

Классифицировать противоопухолевые вакцины можно по различным признакам: по способу доставки антигенов; по природе антигенов; по широте применения.

По способу доставки можно выделить четыре основных подхода:

1. вводится сам антиген (пептид, белок или опухолевый лизат);

2. вводятся антиген-презентирующие клетки нагруженные антигенами;

3. вводятся облученные опухолевые клетки (как правило, модифицированные);

4. вводится генная конструкция, кодирующая опухолевый антиген.

После введения антигена в организм он должен быть захвачен антиген-презентирующими клетками (АПК), процессирован и представлен в виде пептидных фрагментов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Главным недостатком данного подхода является то, что введенные опухолевые антигены преимущественно захватываются макрофагами и клетками Лангерганса, что в конечном итоге приводит к развитию гуморального ответа (90). В случае применения антигенных пептидов захват и переработка не требуются, так как пептиды способны непосредственно взаимодействовать с соответствующими аллельными формами МНС на поверхности клеток самого больного, и, таким образом, —быть-представленными-Т-лимфоцитам-(141).Лем-не менее, использование-антигенных пептидов сопряжено с рядом проблем. Так, для нормальной активации Т-лимфоцитов, помимо взаимодействия Т-клеточного рецептора со специфической пептидной последовательностью антигена, представленного молекулами МНС, необходима костимуляция, которая осуществляется за счет молекул CD80 и CD86. Костимулирующие молекулы экспрессируются в основном на АПК, при этом в большей степени на зрелых дендритных клетках (134). В связи с этим для генерации адекватного иммунного ответа в месте введения антигенных пептидов должны находиться в достаточно большом количестве АПК. Без соблюдения этого условия использование пептидов 8 может приводить к генерации слабого иммунного ответа или даже к анергии (132, 133).

Введение нагруженных дендритных клеток позволяет избежать всех сложностей, описанных выше. Дендритные клетки можно нагружать как опухолевыми антигенами (лизатом) (28), так и антигенными пептидами (24). В первом случае нагружают незрелые ДК, которые способны захватывать экзогенные антигены, процессировать и представлять их пептидные фрагменты в комплексе с молекулами МНС, тогда как во втором случае антигенные пептиды нагружают на уже зрелые дендритные клетки.

По сути, введение убитых опухолевых клеток онкологическому больному схоже с введением опухолевых антигенов, так как предполагается, что после инъекции опухолевые клетки будут захвачены АПК, процессированы и представлены в виде антигенных пептидов в комплексе с молекулами МНС. В настоящее время в научных центрах мира проходят исследования по применению противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток (91). Для генерации более мощного иммунологического ответа опухолевые клетки трансфецируют геном, который кодирует тот или иной цитокин, например гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (118). Перед введением опухолевые клетки облучают, чтобы они не пролиферировали, тем не менее, в них проходят жизненно важные процессы, в том числе и синтез белка, а значит и соответствующего цитокина, который определенным образом должен активировать иммуннокомпетентные клетки. В основном при создании подобного рода вакцин используют аллогенные опухолевые клетки, т.к. создание аутологичной вакцины сопряжено с рядом трудностей. Во-первых, не всегда удается из опухолевого материала больного получить клеточную линию, а во-вторых, время получения опухолевой культуры занимает, как правило, несколько месяцев, не говоря уже о трудностях в трансфекции и отборе клонов с наибольшим уровнем синтеза цитокина. При использовании аллогенной вакцины решается проблема со временем и трудностью получения клеточной линии, но появляется проблема отторжения трансплантата и выработки трансплантационного иммунитета. Так как при вакцинотерапии необходимо многократное введение опухолевых клеток, то каждое очередное введение будет стимулировать не противоопухолевый, а трансплантационный иммунитет. Возможным решением данной проблемы может быть использование набора опухолевых клеточных, линий, то есть вначале вводится одна опухолевая линия, в. следующий раз другая и т.д. Но, пожалуй, самый главный вопрос это - адекватность использования аллогенных опухолевых клеток для лечения или профилактики рецидивов онкологических заболеваний. Известно, что опухоль одного и того, же гистогенеза у одного больного будет отличаться от опухоли другого больного по спектру экспрессируемых опухолевых антигенов. Безусловно, при подборе опухолевых, клеточных линий для создания вакцины отбирают те линии, которые экспрессируют наибольшее количество известных опухолевых антигенов. Но встает вопрос, а, сколько еще антигенов остается не идентифицированными? Таким образом, эффективность лечения, при прочих равных условиях, будет зависеть от степени перекрывания опухолевых антигенов, экспрессирующихся на вводимой клеточной линии и опухоли самого больного.

Введение генетической конструкции, кодирующей тот или иной опухолевый антиген, в клинике широко не применяется (36). Тем не менее, суть этого метода заключается в следующем: после попадания гена в составе вирусного вектора в клетку происходит синтез белка, в даннолл случае опухолевого антигена, и его пептидные фрагменты будут представлены в комплексе с молекулами МНС I класса, как это бывает со всеми белками, синтез которых идет в клетке. Введение генетической конструкции можно осуществлять непосредственно в ткань пациента, например в мышцу, или в культуру дендритных клеток. Для развития клеточного иммунного ответа на опухолевый антиген, помимо представления пептидной последовательности в . комплексе с молекулами МНС, необходимы костимулирующие сигналы и участие интерлейкина-12 (ИЛ-12) (116). Мышечная ткань не может обеспечить эти условия, в связи с этим развитие иммунологических реакций на опухолевые антигены, после введения соответствующей генной конструкции, по-видимому, связано с презентацией захваченных антигенных пептидов антиген-презентирующими клетками. Если трансфекцию проводят в дендритные клетки, то в этом случае все необходимые условия для развития иммунного ответа будут реализованы самой дендритной клеткой (110).

Главным преимуществом использования дендритных клеток, при создании противоопухолевых вакцин, по сравнению с другими подходами является то, что in vitro можно получать антиген-презентирующие клетки с определенными характеристиками, которые необходимы для адекватного развития противоопухолевого иммунного ответа. Между тем для реализации остальных трех подходов требуются определенные условия, а именно: представление антигенов в комплексе с молекулами МНС I и II классов; присутствие костимулирующих молекул (CD80 и CD86); секреция ИЛ-12. Все эти условия реализуются дендритными клетками (112).

По своей природе используемые антигены могут быть синтетическими, рекомбинантными или нативными, т.е. выделенными из опухолевого материала самого больного. Синтетическим способом получают пептидные последовательности опухолеассоциированных антигенов. Антигенные пептиды вводятся либо непосредственно больному (23), либо их предварительно нагружают на дендритные клетки (113). И в первом и во втором случае для использования синтетических пептидов необходимо проводить HLA-типирование больных, так как пептидные последовательности могут взаимодействовать только с соответствующими аллельными формами МНС.

Рекомбинантные опухолеассоциированные антигены получают путем трансфекции соответствующего гена в бактерию, после чего наработанный -белок подвергается очистке. Одним - из -наиболее-часто -используемых- — рекомбинантных белков является муциноподобный антиген Mucl, который экспрессирован в довольно широком спектре опухолей (57). При использовании рекомбинантных антигенов для нагрузки дендритных клеток HLA-типирование больных не требуется, так как захваченный белок будет процессирован антиген-презентирующими клетками и представлен в виде пептидных последовательностей в комплексе с молекулами МНС.

Когда речь идет о нативных антигенах, то в этом случае чаще всего подразумевают опухолевый лизат (ОЛ), который получают из опухолевого материала больного (28). Опухолевый лизат состоит из большого набора

11 белков, гликопротеинов и т.д., которые высвобождаются во время лизиса опухолевых клеток. Для обоснованного применения того или иного синтетического или рекомбинантного антигена необходимо получить подтверждение, что у больного опухоль экспрессирует данный антиген. При использовании ОЛ этого не требуется, так как в этом случае используется опухолевый материал самого больного.

По широте применения вакцины могут быть универсальными и индивидуальными. К индивидуальным можно отнести те вакцины, в приготовлении которых используют опухолевую ткань самого больного. Другими словами, для пациента готовится своя собственная вакцина с индивидуальным набором опухолевых антигенов (125). Универсальные вакцины могут применяться у различных больных в рамках одной или нескольких нозологий. Так, белок Mucl, который является опухолеассоциированным антигеном нескольких опухолей (рак яичников, рак молочной железы и т.д.), может быть применен при различных нозологических формах рака (88).

Классификация опухолевых антигенов

Опухолевые антигены можно разделить на две основные группы -опухолеспецифические и опухолеассоциированные (TSA и ТАА, соответственно). Главное отличие между этими группами заключается в распространенности антигенов в организме. Наибольшее количество опухолевых антигенов описано и охарактеризовано для меланомы, поэтому некоторые подгруппы опухолеассоциированных антигенов характерны только для этой нозологии (64, 86).

Опухолеспецифическими являются антигены, которые экспрессируются только опухолевыми клетками, и не встречаются в организме взрослого индивидуума. К ним относятся: во-первых, антигены, образовавшиеся в результате точковых мутаций нормальных генов, изменения в которых связаны с неопластической трансформацией. Во-вторых, эмбриональные антигены, которые могут экспрессироваться опухолевыми клетками, в-третьих, антигены, полученные в результате нарушения механизма сплайсинга. И, в-четвертых, антигены, представляющие собою слитые белки, полученные вследствие транслокации участков хромосом (табл. 1) (93).

Таблица 1. Меланомные опухолеспецифические антигены.

Подгруппы TSA Примеры антигенов p-Catenin/m

CDK-4/m

Точковые мутации генов MUM-1,-2, -3

Myosin/m

Ошибка сплайсинга TRP-2/INT2

Слитые белки LDLR/FUT

К опухолеассоциированным относятся антигены, которые экспрессируются как опухолью, так и нормальными тканями организма. В этой большой группе можно выделить несколько подгрупп. Наибольшей, по количеству охарактеризованных антигенов, является подгруппа раково-тестикулярных антигенов. Эти антигены, помимо опухолевых клеток, экспрессируются сперматоцитами и сперматогониями. Антигены MAGE-3, MAGE-4 и GAGE могут быть экспрессированы в плаценте, а NY-ESO-1 обнаруживается в нормальных клетках яичника (табл. 2) (30).

Таблица 2. Раково-тестикулярные антигены, экспрессируемые меланомой.

Антигены Распространенность среди других опухолей

MAGE-1,-2, -3, -4, -6,-12 Рак молочной железы, карцинома толстой кишки, немелкоклеточный рак легкого, карцинома мочевого пузыря, карцинома щитовидной железы.

BAGE Карцинома мочевого пузыря, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого.

GAGE-1,-2,-3, -4,-5, -6, -7В, -8 Немелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, семинома, лимфома, рак толстой кишки, рак простаты

DAM-6,-10 Рак молочной железы, рак яичников, карцинома легких, семинома.

В-клеточная лимфома, гепатома, карцинома

NY-ESO-1 щитовидной железы, рак молочной железы, рак простаты, карцинома легких, карцинома щитовидной железы.

Во вторую подгруппу входят меланоцитарные дифференцировочные антигены. Помимо меланомы, данные антигены также экспрессируются нормальными меланоцитами. К меланоцитарным дифференцировочным антигенам относятся: MART-l/Melan-A, gplOO, tyrosinase, TPR-1 и TPR-2 (15).

К третьей подгруппе относятся антигены, которые имеют распространение, как среди широкого спектра нормальных тканей, так и при различных нозологических формах онкологических заболеваний (табл. 3) (9, 98).

Таблица 3. Опухолеассоциированные антигены, э кспрессируемые меланомой.

Антигены Распространенность среди нормальных тканей

CAMEL Семенники, плацента, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа. hTRT Гемопоэтические стволовые клетки, базальные кератиноциты, тимоциты, В-клетки терминальных центров.

HER2/new Эпителиальные клетки.

PRAME Семенники, эндометрий, яичники, надпочечники, почки, мозг, кожа.

P15 Семенники, селезенка, тимус, печень, почки, легкие, надпочечники.

RU1, RU2 Семенники, сердце, почки, кожа, мозг, яичники, печень, легкие, тимус.

Для всех, описанных выше, опухолеспецифических и опухолеассоциированных антигенов известны пептидные последовательности, которые способны взаимодействовать с соответствующими аллелями МНС. Больше всего пептидных последовательностей описано для раково-тестикулярных и дифференцировочных антигенов меланомы. В таблице 4 приведено распределение эпитопов антигенов, в зависимости от того, в каком контексте HLA-локусов они могут быть распознаны CD8+ Т-лимфоцитами (93).

Таблица 4. Распрелеление антигенных эпитопов в зависимости от HLA-локусов.

Антиген Количество эпитопов HLA-A HLA-B HLA-C

MAGE-1, -2, -3, -4, -6,-10,-12 24 13 (54%) 7 (29%) 4 (17%)

GAGE-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7В, -8 8 5 (62,5%) 0 3 (37,5%)

MART-1 6 4 (67%) 2 (33%) 0 gpioo 12 11 (92%) 0 1 (8%) tyrosinase 6 5 (83%) 1 (17%) 0

Несмотря на то, что охарактеризовано большое количество опухолевых антигенов, какие из них применять для иммунотерапии меланомы, остается насущным вопросом современной онкологии. С одной стороны, лучше всего использовать опухолеспецифические антигены, так как это позволит получить более мощный иммунный ответ с минимальным риском развития аутоиммунитета, это связано с тем, что у организма нет толерантности к данной группе антигенов. С другой стороны, точечные мутации довольно редкое явление, поэтому широкое применение TSA невозможно. Тот или иной опухолеассоциированный антиген практически всегда экспрессируется клетками меланомы, поэтому в большинстве исследований именно эта группа антигенов используется в качестве мишени (23, 51, 130). Опухолеассоциированные антигены в то же самое время являются нормальными антигенами организма, поэтому получить иммунный ответ против них довольно сложно. Как известно, в тимусе происходит негативная селекция высоко-аффинных аутореактивных Т-лимфоцитов, поэтому, если в организме и существуют Т-лимфоциты специфичные к опухолеассоциированным, т.е. нормальным антигенам, то они являются низко-аффинными, и при этом на них воздействуют механизмы периферической толерантности (145). Для развития иммунного ответа, низкоаффинному Т-лимфоциту необходимо гораздо больше условий, чем высоко-аффинному лимфоциту. Например, для лизиса клетки-мишени низко-аффинному Т-лимфоциту необходима более высокая экспрессия антигена на клеточной поверхности (76). Следуя логике, можно предположить, что раково-тестикулярные антигены более предпочтительны в использовании для иммунотерапии меланомы, по сравнению с другими опухолеассоциированными антигенами. Так как, во-первых, тестикулярные антигены скрыты от иммунной системы гемато-тестикулярным барьером, а во-вторых, сперматоциты и сперматогонии не экспрессируют МНС I. Таким образом, центральная и периферическая толерантность в отношении раково-тестикулярных антигенов, по-видимому, не имеет такого жесткого характера, как для других опухолеассоциированных антигенов, которые довольно широко представлены в нормальных тканях. Это обстоятельство находит отражение в тех клинических исследованиях, в которых иммунотерапию меланомы проводили с использованием пептидных последовательностями MAGE-антигенов, что приводило к генерации специфических CD8+ Т-лимфоцитов, секретирующих интерферон-у (113, 51).

Характеристика дендритных клеток

Дендритные клетки являются наиболее мощными антиген-презентирующими клетками, контролирующими иммунный ответ посредством взаимодействия с лимфоцитами, при этом, представляют собою гетерогенную популяцию клеток костномозгового происхождения. Для всех подтипов дендритных клеток можно выделить три основных этапа их развития: стадия предшественников, стадия незрелых и стадия зрелых ДК (18). Содержание дендритных клеток в периферической крови человека, как правило, не превышает 1%, и на основании экспрессии поверхностных антигенов их можно разделить на два основных типа. Так, плазмацитоидные ДК высоко экспрессируют рецептор к интерлейкину-3 (CD123) и не экспрессируют антиген CDllc, тогда как миелоидные ДК наоборот экспрессируют CDllc, но слабо экспрессируют CD123. Плазмацитоидные дендритные клетки распространены как в крови, так и в лимфоидных органах и являются основными продуцентами интерферона-а. Относительно их функции однозначно сказать что-то сложно, так как некоторые работы указывают на активирующую их роль в противовирусном и противоопухолевом иммунном ответе (103), тогда как другие исследования говорят об угнетающем действии плазмацитоидных ДК на развитие противоопухолевого иммунного ответа (142). Миелоидные дендритные клетки находятся во многих тканях, и их можно разделить на две большие группы: клетки Аангерганса, обладают характерными внутриклеточными органеллами - гранулами Бирбека, располагаются в эпидермисе и слизистых оболочках рта, дыхательного и генитального трактов. И интерстициальные, дермальные или подслизистые дендритные клетки (названия могут меняться в зависимости от места локализации ДК) (39). В большинстве исследований, посвященных вакцинотерапии онкологических заболеваний, применяют именно последний тип дендритных клеток, поэтому, дальнейший обзор свойств и характеристик ДК будет основан на описании миелоидных интерстициальных дендритных клеток.

Дендритные клетки способны поглощать вирусы, бактерии, мертвые клетки, белки, иммунные комплексы за счет фагоцитоза, эндоцитоза или пиноциоза. Для этого ДК экспрессируют широкий спектр поверхностных рецепторов, способствующих захвату внешних антигенов (табл. 5) (84).

Таблица 5. Рецепторы ленлритных клеток, способствующие захвату внешних антигенов.

Класс рецептора Пример Лиганд

Лектино-подобные CD209 Вирусы рецепторы Маннозный рецептор Молекулы, содержащие маннозу

Fc-рецепторы FcyRI (CD64) Иммунные комплексы и

FcyRII (CD32) опсонизированные клетки

Интегрины CDllb Опсонизированные антигены

Скавенджер- CD36 Погибшие клетки рецепторы

• Комплекс пептида с белком

Другие CD91 теплового шока

Очень важной отличительной особенностью дендритных клеток от других АПК является способность к кросс-презентации внешних антигенов. Кросс-презентация - это процесс, в результате которого, экзогенный антиген, который обычно представляется в комплексе с молекулами МНС класса II, презентируется вместе с молекулами МНС класса I (55).

Дендритные клетки процессирует антигены и представляет их пептидные фрагменты в комплексе с молекулами МНС I и II классов, которые могут быть распознаны антиген-специфичными CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитами, соответственно. Классически считается, что внутренние антигены, т.е. белки синтезируемые клеткой, процессируются в цитоплазме, при этом они проходят деградацию в протеосомах и переносятся ТАР-белками в эндоплазматический ретикулум, где происходит ассоциация пептидных фрагментов антигенов с соответствующими молекулами МНС I класса, после чего, комплекс с пептидом может быть представлен на поверхности клетки (70). Деградация экзогенных антигенов, после поглощения антиген-презентирующими клетками, происходит в ранней и поздней эндосомах. После слияния поздней эндосомы, содержащей антигенные пептиды, и везикулы, содержащей ар-гетеродимеры II класса, ассоциированные с инвариантной цепью, образуется МНС II класса компартмент (МПС). В МПС происходит удаление инвариантной цепи, катализируемое молекулой HLA-DM, и нагрузка антигенного пептида на молекулу МНС II класса, далее, комплекс может быть представлен на поверхности АПК (44).

При кросс-презентации, захваченный антиген вначале попадает в раннюю эндосому. Затем, уже в поздней эндосоме, за счет снижения рН идет активация протеаз (катепсинов), в результате чего начинается деградация антигена. Далее, содержимое поздней эндосомы попадает в цитоплазму, и в протеосоме происходит дальнейшая деградация антигена. После этого, фрагменты антигенов переносятся с помощью ТАР-белков в эндоплазматический ретикулум, где пептиды связываются с соответствующими молекулами МНС I класса и затем могут быть представлены на клеточной поверхности. В процессе кросс-презентации очень важны характеристики поглощаемого антигена (46). Например, процессинг иммунных комплексов идет эффективнее, нежели чистых антигенов. Захват и переработка дендритными клетками опсонизированных антителами облученных опухолевых клеток осуществляется более интенсивно, чем просто облученных клеток.

Особую роль в кросс-презентации антигенов отводят белкам теплового шока (БТШ) (HSP70, др96), которые, взаимодействуя с рецептором CD91, поглощаются дендритными клетками (37, 83). Данные белки связывают клеточные пептиды, в том числе и антигенной природы, а после попадания в АПК, пептиды могут быть представлены на МНС I класса. При стрессорных воздействиях или клеточной гибели происходит высвобождение БТШ-пептидных комплексов, которые могут быть захвачены антиген-презентирующими клетками. Было показано, что иммунизация дендритными клетками, которые были нагружены белками теплового шока, выделенными из опухолевых клеток, приводила к развитию специфического противоопухолевого иммунного ответа. Помимо связывания и переноса пептидов БТШ способствуют дифференцировке дендритных клеток, в результате чего происходит усиление экспрессии на клеточной поверхности МНС, костимуляторных молекул CD40 и CD86 (140). Следует отметить, что лизаты опухолевых клеток содержат намного больше белков теплового шока, чем лизаты нормальных тканей. В связи с этим, несмотря на сложности, связанные со стандартизацией ОЛ, применение опухолевого лизата в качестве источника антигенов является перспективным (119).

Липидные и гликолипидные антигены дендритные клетки представляют Т-лимфоцитам в комплексе с молекулами CD1 (а, Ь, с, d), которые структурно схожи с МНС I класса, но презентируют липиды, а не пептиды. Антигены, ассоциированные с CD1 молекулами, могут быть представлены различным субпопуляциям Т-лимфоцитов, в частности НКТ-клеткам. Если для адекватной презентации антигенных пептидов на МНС необходима дифференцировка дендритных клеток, то для представления липидных антигенов на CD1 молекулах этого не требуется. Даже на стадии незрелых ДК, после захвата липидного антигена, происходит его процессинг и презентация Т-лимфоцитам (27).

Как известно,, для активации Т-лимфоцитов пептидные фрагменты антигенов должны быть представлены в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости I или II класса. Отличительными особенностями дендритных клеток по сравнению с другими антиген-презентирующими клетками (макрофагами, В-лимфоцитами) являются:

1. более высокая плотность молекул главного комплекса гистосовместимости и костимулирующих молекул на поверхности клетки, а значит и более высокая сила иммунного ответа при прочих равных условиях (33).

2. способность активировать наивные CD8+ Т-лимфоциты, с последующим их превращением в цитотоксические Т-лимфоциты (138).

3. захваченный экзогенный антиген может быть представлен в виде пептидных фрагментов с молекулами главного комплекса гистосовместимости как II, так и I класса (10, 46).

Условно принято разделение ДК на незрелые и зрелые формы. Такое разделение основано на различии функциональных свойств клеток. Незрелые ДК (нДК) способны к захвату экзогенных антигенов, при этом они обладают слабой стимулирующей активностью в отношении Т-лимфоцитов по сравнению со зрелыми ДК (зДК) (139). Напротив, зДК теряют способность к захвату антигенов, однако их иммуностимулирующая активность резко возрастает. Располагаясь на периферии, нДК захватывают и перерабатывают антигены, источником которых могут быть погибшие опухолевые клетки, вирусинфицированные клетки и т.д. После поглощения антигенов и воздействия на нДК так называемых «сигналов опасности» (провоспалительные цитокины) дендритные клетки начинают мигрировать в периферические лимфатические узлы. В процессе миграции происходит дифференцировка (созревание) ДК и в результате в лимфатическом узле зДК взаимодействует со специфическими Т-лимфоцитами, что в конечном итоге приводит к генерации клеточного или гуморального ответа на захваченный антиген (18). Во время созревания дендритных клеток на их поверхности начинает экспрессироваться хемокиновый рецептор - CCR7, который обуславливает миграцию зДК в лимфатический узел, на нДК данный рецептор отсутствует (107, 108). Основные различия между зрелыми и незрелыми дендритными клетками представлены в таблице (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительная характеристика незрелых и зрелых ленлритных клеток.

Показатель незрелые ДК зрелые ДК

CDllb ++ +

CD14 -

CD40 + ++

CD54 ++ +++

CD80 - +

CD83 - +

CD86 ++ +++ маннозный рецептор +++ +

МНС 1 ++ ++

МНС II ++ ++

CCR7 - + захват антигенов +

Какой ответ на поглощенный антиген будет преобладать в организме -клеточный или гуморальный, зависит от различных факторов, в том числе и от самих дендритных клеток, представляющих антиген на своей поверхности, а в частности от спектра секретируемых ими цитокинов (42, 78). Так, в опытах in vitro показано, что для генерации клеточного иммунного ответа необходимо, чтобы дендритная клетка представляющая антиген Т-лимфоциту секретировала интерлейкин-12 (120). В зависимости от условий культивирования дендритных клеток на выходе можно получить микроскопически схожие, но по своим свойствам, а в частности по способности стимулировать клеточный ответ, различные популяции ДК (138). Поэтому, если речь идет о противоопухолевых вакцинах на основе ДК, то при подборе условий культивирования необходимо тщательно охарактеризовывать получаемые дендритные клетки, и лишь микроскопического исследования в данном случае недостаточно, необходимо, по крайней мере, проводить иммунофенотипирование клеток. Наиболее важными маркерами, по которым можно судить о ДК, являются CD83 - маркер зрелых дендритных клеток и костимулирующие молекулы CD80 и CD86.

Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток

Ранее было показано, что функциональная активность ДК в организме онкологического больного значительно снижена, и одной из причин этого является неспособность дифференцировки ДК в зрелые формы (13, 14, 47). Это может быть обусловлено как факторами секретируемыми самой опухолью (интерлейкин-10, трансформирующий фактор роста-p, фактор роста эндотелия) (48, 49, 123), так и факторами вырабатываемыми самим организмом (глюкокортикоиды) в ответ на присутствие опухоли, которая является хроническим стрессорным фактором (65, 92). Общая схема создания противоопухолевых вакцин на основе ДК заключается в следующем. Культивирование ДК больного и ((нагрузка» опухолевыми антигенами происходит вне организма (in vitro), что позволяет получить зрелые ДК нагруженные антигенами, которые с одной стороны способны активировать иммунный ответ, а с другой стороны устойчивы к супрессорному влиянию агентов указанных выше.

На сегодняшний день в экспериментальной онкологии используются следующие подходы для «нагрузки» дендритных клеток:

1. инкубация дендритных клеток с синтетическими или нативными пептидами, которые непосредственно взаимодействуют с молекулами главного комплекса гистосовместимости (105, 114).

2. «нагрузка» дендритных клеток опухолевым лизатом (смесью белков, полученных при замораживании и оттаивании опухолевых клеток) (17).

3. «нагрузка» дендритных клеток рекомбинантными опухолеассоциированными антигенами (135).

4. захват убитых опухолевых клеток дендритными клетками (129).

5. трансфекция дендритных клеток нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК), несущими в своем составе гены опухолевых антигенов (66).

6. слияние дендритных клеток с опухолевыми клетками (16).

В клинической практике наиболее часто используют подходы 1 и 1, тогда как оставшиеся способы применяются намного реже.

Рассматривая использование пептидов для «нагрузки» дендритных клеток необходимо ответить на вопрос, какие пептиды использовать - синтетические или нативные (выделенные с поверхности опухолевых клеток)? Пожалуй, единственное преимущество использования синтетических пептидов перед нативными заключается в неограниченности их количества, так как синтезировать можно сколько угодно, тогда как доступность опухолевой ткани (хирургического материала) - источника нативных пептидов - всегда ограничена. Синтетические пептиды - это фрагменты охарактеризованных опухолевых антигенов, как правило, состоящие из 8-12 аминокислотных остатков, и способные взаимодействовать с высоким аффинитетом с определенными аллелями главного комплекса гистосовместимости. Ограничением на применение синтетических пептидов является то, что не для всех аллельных форм МНС существуют антигенные пептиды. Это означает, что использовать синтетические пептиды можно у очень узкого круга больных, обладающих соответствующими аллельными формами главного комплекса гистосовместимости. Но главный недостаток заключается в том, что большая часть опухолевых антигенов не известна, и, соответственно, не могут быть использованы синтетические пептиды. Таким образом, применение синтетических пептидов в конечном итоге может привести к селекции опухолевых клонов, не обладающих соответствующими антигенами (96). Сложностью данного подхода также является определение аллелей главного комплекса гистосовместимости, которые есть у больного и экспрессии опухолевых антигенов, пептидные фрагменты которых планируется использовать.

Преимущество применения нативных пептидов состоит в следующем. Источником пептидов являются опухолевые клетки самого пациента, следовательно, набор потенциально антигенных пептидов у каждого больного будет индивидуальным и более широким, по сравнению с синтетическими пептидами. С одной стороны это приведет к генерации более широкого спектра цитотоксических Т-лимфоцитов, а с другой стороны это будет способствовать иммунному ответу на не идентифицированные индивидуальные опухолеспецифические антигены.

Методика получения опухолевого лизата относительно несложная. Опухолевые клетки сначала замораживают, а затем размораживают, эту процедуру повторяют три - четыре раза, после чего поврежденные клетки осаждают центрифугированием. В результате в супернатанте находятся различные внутриклеточные белки, в том числе и опухолевые антигены. Недостатки подхода с использованием дендритных клеток «нагруженных» опухолевым лизатом заключаются в следующем. Во-первых, ограниченность хирургического материала - источника опухолевого лизата. В принципе возможно использование аллогенных опухолей того же гистогенеза или даже опухолевых линий (102), так как опухолевые белки будут процессированы дендритными клетками и соответствующие пептиды будут представлены в комплексе с молекулами МНС. В этом случае иммунный ответ будет развиваться преимущественно на опухолеассоциированные, а не на опухолеспецифические антигены, поэтому данный вариант не совсем подходит. Во-вторых, состав опухолевого лизата в основном состоит из белков, которые не являются опухолевыми антигенами, таким образом, процент дендритных клеток, способствующих развитию противоопухолевого иммунитета, будет невысоким. Также одним из возможных осложнений данного подхода могут быть аутоиммунные реакции, так как наряду с опухолевыми антигенами в опухолевом лизате присутствуют и нормальными белки (127).

Применение рекомбинантных опухолевых антигенов в какой-то мере схоже с использованием синтетических пептидов. Преимуществом данного подхода заключается в том, что нет необходимости определять аллельные формы МНС пациента, как в случае использования синтетических пептидов, так как рекомбинантный антиген будет поглощен и процессирован дендритными клетками (106). Недостатком данного метода по сравнению с применением пептидов являются более сложный и трудоемкий технологический процесс получения рекомбинантных белков (3). Общий недостаток этого способа «нагрузки» дендритных клеток, как и при использовании синтетических пептидов - вероятность получения узкоспецифичного иммунного ответа, что опять же приведет к селекции опухолевых клонов, не обладающих данным антигеном. Сложностью данного подхода также является обязательное определение у больного экспрессии опухолевого антигена, рекомбинантный аналог которого планируется использовать.

Наиболее близким к процессам, происходящим в организме, можно считать захват антиген-презентирующими клетками погибших опухолевых клеток (11). Для индукции гибели опухолевые клетки облучают, после чего инкубируют их с фагоцитирующими дендритными клетками. Дендритные клетки процессируют фагоцитированный материал и представляют его в комплексе с молекулами МНС. Недостаток данного подхода, как и в случае нативных пептидов и опухолевого лизата - ограниченность опухолевого материала. Для клинического применения этого способа «нагрузки» дендритных клеток должны быть соблюдены ряд условий. Во-первых, забираемый опухолевый материал должен быть стерильным, во-вторых, из полученного хирургического материала должна быть получена первичная опухолевая линия, клетки которой будут использовать при «нагрузке» ДК. Достоинство этого метода заключается в индивидуальности создания вакцин на основе дендритных клеток.

При рассмотрении следующего подхода, а именно трансфекции дендритных клеток нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) возможны два варианта. Трансфекцию можно проводить геном (генами), кодирующим опухолевый антиген, в этом случае иммунный ответ будет направлен против клеток экспрессирующих данный антиген (40). Преимуществом этого метода «нагрузки» дендритных клеток состоит в том, что трансфецировать можно дендритные клетки любого больного. Помимо трансфекции определенными генами дендритные клетки можно нагружать РНК, выделенной из опухолевых клеток (63)-. В этом случае встают проблемы сходные с проблемами использования опухолевого лизата. Это ограниченность опухолевого материала с одной стороны и подавляющее преимущество генов, кодирующих нормальные белки, по сравнению с генами, кодирующими опухолевые антигены, с другой стороны.

Метод слияния дендритных клеток с опухолевыми клетками является наиболее трудоемким и сложным (54). В 2000 году была описана клиническая работа, в которой больным с карциномой почки вводили гибриды опухолевых и дендритных клеток (68). При этом опухолевые клетки были самого больного, а дендритные клетки - здорового донора. В данном случае дендритные клетки служили источником костимулирующих молекул, необходимых для активации Т-лимфоцитов, тогда как пептидные фрагменты опухолевых антигенов представлялись самими опухолевыми клетками. Для того чтобы при повторных введениях гибридов не происходило их быстрого отторжения (за счет аллогенных дендритных клеток) приходилось каждый раз подбирать новых доноров, не перекрывающихся по комплексам гистосовместимости с предшествующими донорами. В упомянутой работе были получены хорошие результаты, которые выражались в довольно высоком проценте полных и частичных ответов на проводимую терапию, но впоследствии данная статья была отозвана авторами из печати (69).

Несмотря на достаточно большой мировой опыт применения дендритных клеток в онкологической практике, вопрос о том, какими качествами и свойствами должны обладать вводимые ДК остается открытым. Пожалуй только одна характеристика в отношении дендритных клеток, которые используют при вакцинотерапии онкологических заболеваний на сегодняшний день не вызывает споров. Это степень дифференцировки (зрелости) дендритных клеток. В ряде исследований было убедительно показано, что введение незрелых дендритных клеток ((нагруженных» антигеном здоровым донорам приводило к специфическому подавлению иммунного ответа на данный антиген (34, 61). При этом авторы наблюдали появление специфических клонов Т-лимфоцитов, подавляющих ответ на данный антиген. Одной из причин ингибирования иммунного ответа незрелыми ДК является отсутствие костимулирующих молекул на поверхности клеток. Костимулирующие сигналы необходимы Т-лимфоциту для нормальной активации после специфического взаимодействия Т-клеточного рецептора с пептидной последовательностью антигена, представленного молекулой МНС дендритной клетки. Другой причиной неэффективности применения незрелых дендритных клеток является отсутствие экспрессии хемокинового рецептора CCR7, обуславливающего миграцию ДК в лимфатические узлы (32). В ряде клинических работ применяли, судя по описанию, незрелые ДК и при этом наблюдали специфический иммунный ответ (82). Возможным объяснением данного факта может быть то, что дендритные клетки культивировали в среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. При таких условиях на поверхности нДК присутствуют костимулирующие молекулы CD80 и CD86, их экспрессия значительно ниже, чем на зДК, но, тем не менее, данного уровня, по-видимому, достаточно для индукции иммунного ответа.

Способы культивирования дендритных клеток

На сегодняшний день описано два способа получения дендритных клеток in vitro. Первый способ - культивирование ДК из моноцитов периферической крови и второй - культивирование ДК из костномозговых предшественников (CD34+ клеток) (43, 131). Достоинством второго способа является то, что стволовые клетки в процессе культивирования могут пролиферировать, в результате чего на выходе можно получить большее количество ДК. Недостатками данного подхода являются трудности в получении CD34+ клеток. Необходимо производить костномозговую пункцию, что является непростой и болезненной манипуляцией, либо проводить лейкоферез предварительно простимулировав пациента соответствующими цитокинами для выхода костномозговых предшественников в кровяное русло. Данный метод является более дорогим и трудоемким, по сравнению с культивирования ДК из моноцитов. Поэтому для получения дендритных клеток человека в подавляющем большинстве случаев используют методику, основанную на культивированием ДК из моноцитов периферической крови.

Ключевыми цитокинами, которые применяют при культивировании ДК из моноцитов, являются ГМ-КСФ и интерлейкин-4 (ИЛ-4), В присутствии этих двух цитокинов происходит дифференцировка прикрепленных на пластик моноцитов в незрелые дендритные клетки, что сопровождается откреплением клеток от поверхности чашки Петри, увеличением в размерах, появлением отростков (дендритов) на клеточной поверхности (20). На стадии незрелых ДК клетки способны захватывать экзогенные антигены, но обладают относительно слабой иммуностимулирующей активностью. Для полного созревания к незрелым дендритным клеткам добавляют индукторы дифференцировки. На сегодняшний день известно довольно много агентов вызывающих дифференцировку дендритных клеток: CD40 - лиганд, кондиционированная среда моноцитов, липополисахарид и др (97). В экспериментальной и клинической практике часто используют 4х-компонентную систему состоящую из: фактора некроза опухоли-а (ФНОа), интерлейкина-ip, интерлейкина-6 и простагландина Ег (ПГЕг) (35). Между тем было показано, что для дифференцировки дендритных клеток достаточно присутствие только ФНОа и ПГЕ2 (95).

Важным вопросом при выборе методики культивирования дендритных клеток является присутствие ксеногенных белков в питательной среде. При культивировании клеток очень часто используют эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) (126). Это обусловлено, во-первых, присутствием в ней ростовых факторов, а во-вторых, доступностью. Первоначально, при разработке методики, дендритные клетки культивировали исключительно в питательной среде, содержащей ЭТС. Между тем, в случае клинического применения ДК недопустимо присутствие ксеногенных белков в среде. Как бы тщательно ни отмывали клетки перед введением больному, все равно, какое-то количество чужеродных белков будет сорбировано на клеточной поверхности. Помимо этого, в процессе культивирования клеток белки ЭТС будут захвачены, процессированы и представлены на поверхности ДК вместе с молекулами МНС. То есть, помимо иммунного ответа на опухолевые антигены, которыми предварительно нагружают ДК, будет развиваться ответ и на ксеногенные белки. Были описаны случаи развития аллергических реакций и, даже, анафилактического шока после введение дендритных клеток, которые культивировали в питательной среде содержащей ЭТС (77). Таким образом, одним из обязательных условий получения дендритных клеток, пригодных для использования в клинической практике, является культивирование клеток в питательной среде, не содержащей белков нечеловеческого происхождения. Возможны два варианта решения данной проблемы, либо культивировать клетки в среде содержащей человеческую сыворотку (или плазму), либо работать с бессывороточной средой, например EX-VIVO 15 (97). В некоторых клинических работах для получения дендритных клеток использовали питательную среду, содержащую сыворотку больных, которым планировалось вводить ДК (79). То есть для каждого пациента была индивидуальная культуральная среда. Скорее всего, такой подход был выбран лишь по одной причине, а именно из-за опасности заражения вирусными инфекциями, например ВИЧ, при использовании донорской сыворотки. Безусловно, все компоненты крови тестируются на наличие вирусных инфекций, но, тем не менее, если донор стал ВИЧ-инфицированным относительно недавно, то те стандартные тесты, которые применяют в центрах переливания крови, могут не выявить заболевания. Главными недостатками использования сыворотки онкологических больных для культивирования дендритных клеток является то, что в крови пациентов могут присутствовать факторы, которые препятствуют созреванию клеток (интерлейкин-10, фактор роста эндотелия и др.) (50). С другой стороны, с технической точки зрения, очень неудобно работать с индивидуальными культуральными средами, особенно при большом количестве пациентов, которым проводят вакцинотерапию. Решение данной проблемы, а именно, уход от работы с индивидуальными сыворотками и минимизация риска заражения пациентов при использовании донорской сыворотки или плазмы -это работа с компонентами крови, которые получены от одного и того же донора. Безусловно, этот донор должен периодически проверяться на наличие особо опасных инфекций (ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис) и не должен входить в группу риска.

Клиническое применение дендритных клеток в онкологии

Наибольшее количество клинических работ, в которых использовали дендритные клетки, было посвящено терапии меланомы кожи (19, 85, 87). Такой выбор обусловлен несколькими причинами, во-первых, описаны случаи спонтанного регресса опухоли, т.е. показана принципиальная возможность организма развить противоопухолевый иммунитет (22, 25) и, во-вторых, на сегодняшний день охарактеризовано наибольшее количество опухолеассоциированных антигенов меланомы (64), что упрощает регистрацию иммунного ответа пациента на проводимую вакцинотерапию (143).

Общим для всех клинических работ является схема создания вакцины, а именно то, что культивирование и нагрузка дендритных клеток опухолевыми антигенами проводят вне организма. В остальном же практически все клинические работы отличаются друг от друга, и для того чтобы сравнить результаты, полученные в разных исследованиях необходимо учитывать множество факторов. Все различия можно разделить на три группы: 1. качество применяемых дендритных клеток, которое во многом зависит от условий культивирования и используемых опухолевых антигенов; 2. способ применения вакцины (режим введения, дозировка и т.д.); 3. характеристика больных (количество и размер метастазов, предшествующая терапия и т.д.).

Говоря о качестве применяемой вакцины, в первую очередь необходимо обратить внимание на степень дифференцировки дендритных клеток. В серии работ было показано, что введение незрелых ДК приводит к подавлению иммунного ответа на антиген, которым были предварительно нагружены дендритные клетки (34). В этом плане очень элегантно выглядит работа, в которой одному и тому же испытуемому вводили зрелые и незрелые дендритные клетки, нагруженные разными антигенами (61). При этом подавление иммунного ответа наблюдали на тот антиген, которым были нагружены незрелые дендритные клетки, тогда как на антиген, которым были нагружены зрелые ДК, развивался иммунный ответ. Помимо этого, незрелые дендритные клетки обладают слабой способностью к миграции в лимфатические узлы, и при внутрикожном способе введения практически все остаются в месте инъекции (32). Напротив, зрелые ДК экспрессируют на своей поверхности хемокиновый рецептор - CCR7, способствующий миграции дендритных клеток в лимфоузлы (107). На сегодняшний использование зрелых дендритных клеток при вакцинотерапии онкологических заболеваний день считается «золотым стандартом», однако до сих пор публикуются работы, в которых применяют незрелые ДК (12). Вероятно, это связано с тем, что клинические протоколы и соответственно методики культивирования дендритных клеток в данных исследованиях были утверждены несколько лет назад, когда еще не была показана супрессорная активность незрелых ДК. Однако, следует учитывать и тот факт, что в ряде работ применяли на первый взгляд незрелые дендритные клетки, т.е. после нагрузки антигенами для дифференцировки не использовали факторы, вызывающие созревание дендритных клеток (ФНОа + ПГЕ2, CD40L и т.д.). Между тем, во многих клинических работах ДК культивировали в питательной среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку, в результате чего.на выходе, даже при отсутствии индукторов дифференцировки, получали зрелые дендритные клетки, о чем можно судить по экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 (82). Таким образом, анализируя результаты клинических работ необходимо обращать внимание на условия культивирования ДК.

В клинических работах для нагрузки ДК наиболее часто применяют пептидные последовательности известных опухолеассоциированных антигенов, которые могут нековалентно связываться с молекулами главного комплекса гистосовместимости на поверхности дендритных клеток и впоследствии быть представлены специфическим Т-лимфоцитам (113). О преимуществах и недостатках использования данного подхода нагрузки ДК говорилось выше, между тем такое частое применение синтетических пептидов в клинической практике, скорее всего, обусловлено простотой идентификации специфического иммунного ответа. Существуют коммерческие тест-системы (ELISpot) с помощью которых можно подсчитывать единичные клетки секретирующие определенный цитокин, например интерферон-у, который характеризует клеточное звено иммунитета (143). Добавление антигенных или контрольных пептидов к культуре мононуклеаров периферической крови позволяет выявлять антигенспецифические Т-лимфоциты секретирующие интерферон-у. Таким ' об разомГ'"можно регистрировать изменение процентного содержания специфических Т-лимфоцитов до и после вакцинотерапии. При нагрузке дендритных клеток опухолевым лизатом определение противоопухолевых Т-лимфоцитов становится затруднительным, так как ОД по своему составу гетерогенен и содержит даже нормальные белки.

Следующим по частоте использования идет опухолевый лизат. О преимуществах и недостатках применения ОЛ для нагрузки дендритных клеток говорилось выше. Главные достоинства опухолевого лизата по сравнению с синтетическими пептидами - это более широкий и индивидуальный (в случае аутологичного ОЛ) спектр опухолевых антигенов присутствующих в ОЛ и отсутствие необходимости в определении МНС пациента с последующим подбором антигенных пептидов и идентификации экспрессии антигенов на опухолевых клетках.

Опухолевый лизат трудно поддается стандартизации, за исключением тех случаев, когда ОЛ получают из клеточной линии (102). В этом случае, зная антигенный спектр опухолевых клеток и другие характеристики можно ориентироваться на концентрацию белка в опухолевом лизате. Когда ОЛ получают из хирургического материала, то всегда существует контаминация нормальными клетками в большей или меньшей степени. Исследователь всегда стоит перед дилеммой: бороться за «чистоту» препарата, т.е. избавляться от нормальных клеточных элементов, что неизбежно приведет к потерям опухолевых клеток, или уменьшить потери опухолевых клеток, что в свою очередь приведет к увеличению доли нормальных клеток. Помимо этого, отрицательным моментом в использовании опухолевого лизата является риск аутоиммунных осложнений (127).

Остальные способы нагрузки дендритных клеток: трансфекция ДК генами, которые кодируют опухолеассоциированные антигены; слияние опухолевых и дендритных клеток - в клинической практике встречаются редко.

Рассматривая способ применения вакцины на основе ДК, следует обращать внимание на различия в режимах, дозировках и местах введения дендритных клеток. Вопрос о режиме введения вакцины остается открытым на сегодняшний день. Практически все клинические работы отличаются друг от друга в этом плане. Экспериментальных работ, которые были бы посвящены поиску оптимального режима введения дендритных клеток очень мало. Так, в одной работе было показано, что частое введение ДК (недельный интервал) приводило к подавлению специфического иммунного ответа, тогда как интервал в 2 недели и более не приводил к подобным эффектам (115). Отсюда можно сделать вывод, что интервал между вакцинациями должен быть не менее 2х недель.

Вакцину на основе дендритных клеток можно вводить внутривенно (в/в), подкожно (п/к), внутрикожно (в/к), в лимфоузел и интратуморально. Введение дендритных клеток внутрь опухолевого узла описано в нескольких клинических работах (31, 136). Сам по себе данный способ введения очень сложен, а иногда и невозможен, например, в случае висцеральных метастазов или распространенного метастатического процесса. Помимо представления опухолевых антигенов специфическим Т-лимфоцитам дендритные клетки, введенные в опухолевый узел, могут оказывать и цитотоксический эффект (137). На сегодняшний день данный подход не нашел широкого применения в клинической практике.

Внутривенный способ введения стали использовать почти с самого начала клинического применения дендритных клеток (71). Несмотря на огромное количество вводимых ДК, в десятки раз большее, чем при внутрикожном введении, клинический эффект был незначительным. В работе, посвященной изучению характера биораспределения дендритных клеток, предварительно меченных радиоизотопом, было показано следующее (80). При внутривенном способе введении ДК вначале идет накопление клеток в легких, затем в печени, далее в селезенке и костном мозге. Следует отметить, что в данном исследовании у испытуемого были метастазы опухоли в легком, при этом никакого специфического накопления дендритных клеток в области опухолевых узлов или в регионарных лимфатических узлах не наблюдали. Также в нескольких клинических работах, в которых проводили сравнение внутрикожного и внутривенного способов введения дендритных клеток, было убедительно показано преимущество внутрикожного введения вакцины (26, 45). На сегодняшний день внутривенный способ введения дендритных клеток практически не используется в клинической практике.

Внутрикожное введение эффективнее, нежели подкожное введение дендритных клеток '(80," 94), и~ в "клинической практике применяется именно внутрикожный способ введения вакцины (21, 85, 114). Принято считать, что дендритные клетки реализуют свою функцию, т.е. представляют антиген и активируют специфические Т-лимфоциты, в лимфатическом узле. Иными словами, введенные ДК должны попасть в лимфатический узел для соответствующего развития иммунного ответа, и, в принципе, внутрикожный способ введения адекватен этим требованиям. Если учитывать, что лимфатические узлы распространены по всей поверхности тела, то внутрикожно вакцину можно вводить в любое место.

Введение дендритных клеток в лимфоузел позволяет непосредственно доставить клетки к их конечной цели - лимфатическому узлу (19, 52). Такой способ введения вакцины возможен только под контролем ультразвукового исследования и при наличии у пациента относительно крупных лимфатических узлов. В исследовании, посвященном сравнению действия вакцины при различных способах введения дендритных клеток, было показано, что наибольший иммунологический эффект вызывают клетки, введенные в лимфатический узел, далее шел внутрикожный способ введения, а затем "внутривенное введение (45). Хотя введения вакцины в лимфоузел считается наиболее эффективным, сложности, которые связаны с проведением данной манипуляции, не позволяют широко применять данный способ в клинической практике.

Рассматривая последнюю группу различий, а именно характеристику пациентов, которым проводили вакцинотерапию, необходимо отметить, что в большинстве работ описывается, как правило, первая фаза клинических исследований, которая не подразумевает оценку эффективности проводимого лечения. Другими словами, в большинстве клинических работ вакцинацию проводили больным с распространенным опухолевым процессом после нескольких курсов химиоиммунотерапии (82, 102, 130). Наибольший терапевтический эффект от введения дендритных клеток наблюдался в тех случаях, когда опухолевые узлы были небольшого размера, а предшествующее лечение ограничивалось хирургической операцией (85).

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

выводы

1. Разработан метод получения дендритных клеток из моноцитов периферической крови, адаптированный для клинического применения, позволяющий получать зрелые дендритные клетки вне зависимости от тяжести состояния больного и способа забора крови. Зрелые дендритные клетки высоко экспрессировали костимуляторные молекулы CD40, CD80 и CD86, молекулы адгезии CD54, молекулы участвующие в презентации антигена HLA-АВС, HLA-DR, CD1Ь, а также маркер дифференцировки CD83.

2. Разработан метод криоконсервации мононуклеаров периферической крови, который дает возможность продолжительное время хранить клетки, из которых могут быть получены функционально активные дендритные клетки. Использование полиглюкина в качестве криопротектора позволяет стандартизовать условия криоконсервации, а также снизить процентное содержание диметилсульфоксида, входящего в состав замораживающей среды.

3. Вакцинотерапия больных меланомой с помощью дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, безопасна, не вызывает токсических или аутоиммунных осложнений и не стимулирует рост опухоли.

4. Применение дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, у больных меланомой стимулирует противоопухолевый иммунный ответ, что выражается в реакции гиперчувствительности замедленного типа в местах введения вакцины.

5. Предложенный метод использования дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами, может стать новым направлением в противоопухолевой терапии онкологических больных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Когда речь идет о создании индивидуальной противоопухолевой вакцины, то для того чтобы разработанный метод мог быть широко применен в клинической практике, он должен отвечать ряду условий и характеристик.

Во-первых, вакцина должна быть безопасна. При использовании иммунотерапевтических подходов всегда есть риск развития у пациента аутоиммунных осложнений и аллергических реакций. При применении ОЛ в качестве источника опухолевых антигенов большинство белков входящих в его состав имеют нормальную природу. Если вместо опухолевого лизата использовать рекомбинантные опухолеассоциированные антигены или иммуногенные пептиды, то даже в этом случае существует вероятность подобных осложнений, так как в процессе культивирования всегда происходит гибель небольшого количества клеток, которые будут захвачены дендритными клетками. Наш трехлетний опыт клинического применения дендритных клеток для этих целей, показывает, что ни у одного больного не развивалось аутоиммунных осложнений. Использование ДК для вакцинации в диапазоне от 0,5x106 до 31x106 клеток на инъекцию не вызывало токсических явлений у пациентов. На основании этого можно заключить, что отработанная методика получения и нагрузки, дендритных клеток опухолевым лизатом, позволяет получать противоопухолевую вакцину, безопасную для использования у онкологических больных.

Во-вторых, методика культивирования дендритных клеток должна быть относительно несложной и воспроизводимой. Любой метод, состоящий из множества этапов, будет иметь меньше шансов для широкого применения в - - клинике, нежели методика с минимально-необходимым количеством стадий. Говоря о воспроизводимости, необходимо помнить, что вне зависимости от индивидуальных особенностей пациентов на выходе должны получаться ДК, обладающие схожими характеристиками. Методика, адаптированная нами для клинического применения, представлена небольшим числом стадий при производстве противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток. Для ее производства достаточно одного-двух сотрудников обладающих опытом работы с культурой клеток. Отработанный метод позволяет культивировать дендритные клетки из моноцитов доноров, онкологических больных, криоконсервированных МПК и получать на выходе достаточное количество зрелых ДК, нагруженных опухолевыми антигенами.

В третьих, себестоимость получения вакцины должна быть невысокой. Чем ниже цена производства вакцины, тем больше вероятность, что данный метод лечения найдет широкое применение в клинической практике. Себестоимость процедуры в основном определяется типом используемого оборудования и реактивов. Практически все оборудование, за исключением СОг-инкубатора, производит отечественная промышленность, а стоимость в 2-3 раза ниже по сравнению с зарубежными аналогами. При производстве вакцины основная часть затрат будет определяться стоимостью расходных материалов: питательных сред, ростовых факторов, пластиковой посуды. Все материалы, используемые нами для получения вакцины на основе дендритных клеток, за исключением сыворотки человека и ЧСА, были импортного производства. Перечень фирм, предлагающих одну и ту же продукцию довольно широк, что позволяет подобрать материалы необходимого качества и ценового диапазона. При культивировании ДК использовали реактивы высокого качества, что гарантировало воспроизводимость результатов, и при этом относительно недорогие, что позволило при небольших затратах провести I фазу клинических исследований. В результате, себестоимость производства противоопухолевой вакцины, в общем, оказалась невысокой.

В четвертых, самое главное условие, без которого все вышеперечисленные не имеют большого смысла - это способность вакцины стимулировать противоопухолевый клеточный иммунный ответ. После введения дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом, у больных в местах инъекции развивалась реакция ГЗТ, что свидетельствует о развитии клеточного ответа. Реакция была специфична, так как на введение ДК ненагруженных ОЛ гиперчувствительность замедленного типа не развивалась. Наряду с этим было показано, что на фоне вакцинотерапии происходило увеличение доли цитотоксических Т-лимфоцитов специфичных к опухолевому лизату в периферической крови у больных. Следует отметить, эта закономерность была общей и не зависела ни от тяжести заболевания, за исключением больных на терминальной стадии, ни от предшествующей химио/иммунотерапии. У всех пациентов развивались схожие иммунологические реакции ГЗТ, увеличение содержания ЦТЛ в крови в процессе вакцинотерапии. Учитывая это можно заключить, что иммунная система больных сохранила способность к генерации противоопухолевого иммунного ответа даже при запущенном опухолевом процессе с большой опухолевой массой и/или даже после нескольких курсов химиотерапии. В связи с этим возникает вопрос: почему же развитие иммунного ответа у пациентов может не коррелировать с терапевтическим эффектом?

Описано довольно много способов, с помощью которых опухоль способна уходить от иммунного ответа организма (59). Суть всех этих вариантов «ускользания» заключается в том, чтобы не позволить иммунной системе развить специфический противоопухолевый ответ. Это может быть обусловлено: локальной иммуносупрессией, снижением иммунногенности опухоли, подавлением функциональной активности дендритных клеток и т.д. и т.п. В условиях настоящего подхода мы искусственно получаем дендритные клетки, нагруженные опухолевыми антигенами, способные генерировать противоопухолевый иммунный ответ. Процентное содержание цитотоксических Т-лимфоцитов специфичных к лизату опухолевых клеток увеличивается в периферической крови больных в процессе вакцинотерапии и, тем не менее, у большинства пациентов с распространенным заболеванием метастатические узлы продолжают расти. Можно конечно предположить, что растущая опухоль утратила часть из тех антигенных детерминант, к которым имели специфичность ЦТЛ, и поэтому для эффекторных клеток опухоль стала «невидимой». Между тем, в ряде работ - было показано отсутствие корреляции между наличием циркулирующих Т- -лимфоцитов, специфичных к пептидной последовательности опухолевых антигенов, и терапевтическим эффектом (26), и это наблюдалось несмотря на то, что метастатические узлы экспрессировали как опухолевые антигены, так и молекулы МНС I класса (101).

Одним из возможных объяснений несоответствия иммунологического ответа терапевтическому эффекту является то, что, по-видимому, опухоль может проявлять устойчивость к иммунологическим воздействиям, например, формировать резистентность к цитотоксическому действию лимфоцитов (72).

Принимая во внимание, что опухоль гетерогенна по клеточному составу, то вполне вероятно, что среди множества клонов существуют и потенциально устойчивые, и под действием факторов отбора может происходить их селекция. Отбор устойчивых к действию ЦТЛ клонов можно наблюдать и при метастазировании, что было наглядно показано в экспериментальной работе (73). В связи с этим неудивительно, что применение противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток у больных меланомой с отдаленными метастазами в качестве первой линии терапии, не имело выраженного клинического эффекта (109). Учитывая все вышеперечисленные обстоятельства можно сделать вывод, что максимальный клинический эффект от противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток можно ожидать при использовании ее в адьювантном режиме после удаления первичного очага.