Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль дендритных клеток мыши в ответе на Т-независимые антигены 2-го типа

005011175

На правах рукописи

ХОЧЕНКОВ Дмитрий Александрович

РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ В ОТВЕТЕ НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

14.03.09 - «Клиническая иммунология, аллергология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005011175

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Сидорова Екатерина Владимировна Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Ахматова Нэлли Кимовна

Доктор биологических наук, профессор,

академик РАЕН Ярилин Александр Александрович

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 15 марта 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан « {0 » февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Ирина Владимировна Яковлева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Дендритные клетки (ДК) - семейство лейкоцитов костномозгового происхождения. Особенно много их в местах взаимодействия с окружающей средой (кожа и слизистые оболочки). ДК являются основными антиген-презентирующими клетками [Banchereau, 2000]. Они наделены способностью индуцировать первичный иммунный ответ, участвуют в формировании иммунологической памяти и в поддержании толерантности. Помимо презентации клеткам антигенов (Аг), «встроенных» в МНС, активированные ДК продуцируют цитокины, стимулирующие наивные Т лимфоциты [Villadangos, 2005].

Большая часть касающихся ДК данных получена при изучении их роли в ответе на Т-зависимые антигены (ТЗ Аг). Известно, однако, что многие Аг относятся к Т-независимым (ТН Аг), ответ на которые осуществляется без участия Т хелперов [Mond, 1995]. Это связано с тем, что ТН Аг неспособны встраиваться в МНС и презентироваться таким способом Т лимфоцитам [Defrance, 2011]. В число ТН Аг входит большинство бактериальных поли- и липополисахаридов, а также синтетические полимеры с повторяющимися Аг-эпитопами (например, поливинилпирролидон с мол. массой 350 кДа, полимеры D-аминокислот) [Bachmann, 1993]. ТН Аг подразделяются на ТН-1 Аг, обладающие митогенной активностью и являющиеся поликлональными активаторами В клеток, и ТН-2 Аг. ТН-2 Аг митогенами не являются. Иммуногенность ТН-2 Аг относительно невелика [Mond, 1995].

Основными продуцентами антител (Ат) к ТН Аг являются В-1 лимфоциты и клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-B клетки). Эти субпопуляции обладают рядом характерных особенностей, отличающих их от «обычных» или конвенциональных В-2 клеток [Сидорова, 2006].

Ответ В-1 и MZ-B клеток на проникшие в организм патогены не требует формирования зародышевых центров и клонов Аг-специфичных Т и В лимфоцитов, поэтому он начинается практически сразу и приводит к образованию IgM Ат [Baumgarth, 2011]. Более специфичный и мощный

адаптивный иммунный ответ, обусловливаемый В-2 клетками, развивается позднее, приводя как к образованию Ат, так и к появлению клеток памяти. Таким образом, В-1 и М2-В лимфоциты обеспечивают первую линию защиты организма от патогенов и относятся к клеткам, соединяющим врожденный и адаптивный иммунитет [Вег1апс1, 2002].

Значительную роль в иммунном ответе играют клеточные взаимодействия. Так, ДК необходимы для активации наивных Т клеток и индукции ответа на ТЗ Аг [ВапсЬегеаи, 2000]. Клеточные и молекулярные механизмы иммунного ответа на ТЗ Аг хорошо изучены. Механизмы «запуска» В клеток ТН-2 Аг исследованы значительно хуже. Известно, что для ТН-2 ответа необходимо наличие повторяющихся Аг-детерминант, высокий молекулярный вес, «жесткость» структуры и т.д. [Мопс1, 1995]. В то же время неясно, какие механизмы обеспечивают пролиферацию и дифференцировку В-1 клеток под влиянием ТН-2 Аг; не исследованы клеточные взаимодействия и факторы, участвующие в процессе; неизвестна роль ДК в ответе и т.д. Ответ на все эти вопросы существенен для развития представлений об иммунитете. Вместе с тем до сих пор этот вопрос даже не ставился. Выяснение роли ДК в ответе на ТН-2 Аг может представлять определенный интерес и с практической точки зрения. Не исключено, что использование ДК позволит увеличить иммуногенность бактерильных ТН-2 Аг и найдет применение при создании «дендритных вакцин». Все это и определяет актуальность настоящей работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является изучение роли ДК в иммунном ответе мышей на Т-независимые антигены 2 типа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

• Получить наивные ДК из костномозговых предшественников;

• Синтезировать флуоресцентный конъюгат а(1—>3) декстрана;

• Отработать нагрузку полученных ДК ТН Аг 1-го и 2-го типов;

• Охарактеризовать фенотипически наивные ДК, и ДК нагруженные ТН-2 Аг;

• Получить и охарактеризовать субпопуляции В-1 клеток перитонеальной полости и В-2 клеток селезенки мышей;

• Отработать условия совместного культивирования ДК со спленоцитами, В-1 и В-2 клетками;

• Определить число антитело- и иммуноглобулин-образующих клеток в культурах спленоцитов, В-1 и В-2 клеток при инкубации их с ДК, нагруженными ТН-1 и ТН-2 антигенами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

• Впервые показано прямое связывание ТН-2 Аг наивными ДК, выращенными из костномозговых предшественников,

• Впервые исследовано взаимодействие ДК, нагруженных и не нагруженных ТН-2 Аг, с В-1 и В-2 лимфоцитами мыши в системе in vitro,

• Впервые продемонстрирована иммуногенность ТН-2 Аг, связанных с ДК, и установлено, что она выше таковой самих Аг,

• Впервые показано, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, индуцируют как появление антитело-образующих клеток, так и увеличение числа клеток, продуцирующих поликлональные иммуноглобулины. При этом поликлональная активация ниже, чем при ответе на нативные ТН-2 Аг,

• Впервые показано, что xid-мутация не влияет на способность ДК, презентировать ТН-2 Аг, и индуцировать иммунный ответ в системе in vitro,

• Впервые установлено, что в образовании антитело- и иммуноглобулин-продуцентов, индуцированных ТН-2 Аг, связанными с ДК, существенную роль играют контактные взаимодействия между клетками,

• Впервые показано, что основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 лимфоциты.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований. Использован новый подход в изучении механизмов иммунного ответа на ТН-2 Аг - выяснение в этом процессе роли ДК.

Данные об особенностях активации ДК полисахаридными ТН-2 Аг, входящими в состав ряда микроорганизмов, имеют значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенов с иммунной системой хозяина. Выявление влияния ДК на функциональную активность В-1 и В-2 клеток и роли в этом процессе контактных взаимодействий расширяют наши представления о взаимодействиях лимфоидных и миелоидных клеток.

Выявленное повышение иммуногенности полисахаридных Аг при связывании их с ДК, открывает перспективы при разработке ДК-вакцин.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. ТН-2 Аг (а(1—>3) декстран, полисахарид S3 и поливинилпирролидон 360 кДа), связанные с ДК, индуцируют иммунный ответ в культуре спленоцитов. Для индукции ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК, требуется непосредственный контакт В лимфоцитов и ДК.

2. Поликлональная активация В лимфоцитов, индуцированная ТН-2 Аг связанными с ДК, ниже таковой при ответе на нативные ТН-2 Аг.

3. ДК, полученные из костномозговых предшественников xid-мышей под действием GM-CSF, по исследованным параметрам не отличаются от ДК, выделенных из костного мозга нормальный мышей.

4. Основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 клетки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации обсуждены на конференции молодых учёных НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международном симпозиуме «В Cells and Protection: Back to basics» (Сан

Фелиу-де-Гишольс, Испания, 2010), конференции FOCIS (Бостон, США, 2010), 4-й международной конференции «В клетки и аутоиммунитет» (Осака, Япония, 2010).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Апробация диссертации состоялась 7 декабря 2011 г. на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 17 рисунками. Библиография включает 122 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. В опытах использовали самок мышей линии СВ А весом 1618 г, полученных из НЦ биомедицинских технологий РАМН, филиал “Андреевка”. Мыши линии CBA/N (самки 16-18 г) были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Антигены. В качестве ТН-2 Аг использовали: а(1—>3) декстран (Деке) из Leuconostoc mesenteroides, любезно предоставленный д.м.н. М.Е. Преображенской (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН); полисахарид Streptococcus pneumoniae type 3 (S3), любезно предоставленный проф. Бейкером (США), и поливинилпирролидон с молекулярной массой 10 и 360 кДа - ПВП-10 и ПВП-360, соответственно (“Sigma”, США). В качестве ТН-

1 Аг использовали липополисахарид из Escherichia coli (“Sigma”, США).

Флуоресцентный конъюгат Деке с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) получали по ранее описанной методике [de Beider, 1973] с незначительными изменениями.

Получение дендритных клеток. ДК выделяли по методу Lutz М.В. с незначительными модификациями [Lutz М.В., 1999]. Клетки костного мозга мышей культивировали в чашках Петри для суспензионных культур (“Coming”, США), в течение 10 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС и GM-CSF 25 мкг/мл (“Biosource”, США). Исходная концентрация клеток при внесении в культуру составляла 250 х Ю3 клеток/мл. На 3-й день культивирования в чашки добавляли равное количество среды. В дальнейшем каждые 2 дня заменяли 50% среды. На 10 день клетки собирали, осаждали и подсчитывали количество живых и мертвых клеток в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего (“Gibco”, США) в 0,9% растворе NaCl (“Serva”, Германия). Полученные ДК использовались в дальнейших экспериментах, в том числе для нагрузки Аг.

Нагрузка ДК ТН-2 Аг. Для нагрузки ТН-2 Аг наивные ДК инкубировали с Аг в концентрации 100 мкг/106 ДК в С02-инкубаторе в течение 24 ч при 37°С и 5% СО2. Для получения неспецифически активированных ДК клетки инкубировали с ЛПС Е. coli в концентрации 2 мкг/106 ДК в течение 24 час.

Получение суспензии спленоцитов. Моноклеточную суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI 1640. Клетки осаждали центрифугированием при +4°С, на 1500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком. После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPMI-1640. Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего в 0,9% растворе NaCl.

Получение В-1 и В-2 клеток мыши. В-1 клетки выделяли из брюшной полости мышей, а В-2 клетки - из селезенки. Для получения перитонеальных В-1 клеток использовали метод позитивной иммуноселекции с помощью

магнитных бус фирмы Miltenyi Biotec (“Miltenyi”, США), покрытых антителами крысы к CD 19 мыши.

Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 7 мл ФСБ с 0,5% БСА (“Serva”, Германия) и 2 мМ ЭДТА (“Serva”, Германия). Клетки инкубировали с магнитными бусами, покрытыми крысиными Ат к CD 19 мыши (15 мин при +4°С). Перитонеальные В лимфоциты (смесь В-1 и В-2 клеток) выделяли на MACS® колонке. В-2 популяцию отделяли последовательно инкубируя перитонеальные В-клетки вначале с биотинилированными Ат к CD23 мыши (20 мин при +4°С), а затем со стрептавидиновыми магнитными бусами (“Dynal”, Дания) (30 мин при +4°С при постоянном перемешивании). В результате такой обработки получали В-1 лимфоциты.

В-2 лимфоциты выделяли из суспензии спленоцитов при помощи магнитных бус, покрытых Ат к CD 19. После этого, последовательно инкубируя полученную В клеточную популяцию с биотинилированными Ат к CD5 и CD43 мыши (20 мин при +4°С) и стрептавидиновыми магнитными бусами (30 мин при +4°С), удаляли из суспензии В-1 лимфоциты.

Культивирование клеток in vitro. Для определения иммуногенной активности ТН-2 Аг, связанных с ДК, в лунки 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов (“Nunc”, Дания) вносили по 10 х 105 спленоцитов и

2 х 103 ДК (соотношение 5 : 1) и культивировали клетки при +37°С, 5% С02 в течение 4 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС. По окончании инкубации клетки собирали и дважды отмывали средой RPMI 1640 с 2% ЭТС. В полученных суспензиях определяли число антитело- и иммуноглобулин-образующих клеток (АОК и ИГОК, соответственно) методом клеточного иммуноферментного анализа (ELISPOT). В качестве контроля использовали культуры, содержащие только спленоциты, спленоциты и ТН-2 Аг, ненагруженные ДК и спленоциты.

При изучении клеточных взаимодействий аналогичным образом культивировали ДК с В-1 клетками перитонеальной полости и В-2 клетками селезенки.

Для раздельного культивирования ДК со спленоцитами использовали поликарбонатные мембранные вставки Millicell (“Millipore”, США) и 24-луночные плоскодонные планшеты (“Nunc”, Дания). В лунки 24-луночного планшета вносили по 60 х 10s спленоцитов в объеме 1900 мкл полной среды RPMI-1640, а в мембранные вставки - 12 х 105 ДК в объеме 600 мкл полной среды. Вставки помещали в лунки планшета и культивировали смесь клеток в полной среде при +37°С, 5% С02 в С02-инкубаторе в течение 4 суток.

Определение числа АОК и ИГОК с помощью ELISPOT. Количество антитело-образующих клеток (АОК) и иммуноглобулин-образующих клеток (ИГОК) определяли с использованием нитроцеллюлозных планшетов (“Millipore”, США), которые сенсибилизировали ТН-2 Аг (для выявления АОК) в концентрации 100 мкг/мл или козьими Ат к иммуноглобулинам (IgA, IgM, IgG) мыши (“Caltag”, США) (для выявления ИГОК) в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в течение 18 часов. Сенсибилизацию Деке и S3 проводили в цитратно-фосфатном буфере при +20°С. Сенсибилизацию ПВП-10, ПВП-360 и козьими Ат проводили в карбонат-бикарбонатном буфере при +4°С.

После сенсибилизации планшеты отмывали ФСБ. Свободные сайты связывания, блокировали 1% раствором БСА в ФСБ. Клетки (105 для выявления АОК и 104 - для ИГОК) культивировали в среде RPMI-1640 с 2% ЭТС, 24 ч. По окончании инкубации клетки удаляли, нитроцеллюлозные фильтры отмывали и последовательно добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к ц-цепям IgM мыши, пероксидазный конъюгат Ат к IgG кролика и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол, этанол, трис-буферный раствор и Н202. Число окрашенных зон (ИГОК и АОК) подсчитывали на фильтрах под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.

Фенотипирование клеток при помощи проточной цитометрии.

Фенотип клеток определяли методом проточной цитометрии после окрашивания клеток флуоресцентными конъгатами Ат к поверхностным маркерам. В опытах были использованы Ат к поверхностным маркерам: ФИТЦ-1-Ак и PE-CDllc (“BD Pharmingen”, США), PE-CD80 и PE-CD86 (“Caltag”, США) - для ДК; ФИТЦ-С05, ФИТЦ-СОЗ, PE-CD19, ФИТЦ-СБ23 (“BD Pharmingen”, США), ФИТЦ-Р4/80 (“Caltag”, США) - для В-1 и В-2 клеток.

Анализ фиксированных окрашенных клеток проводили на проточном цитометре Beckman Coulter EPICS XL. Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (“Beckman Coulter”, США) и FCS Express 3.0 (“de Novo software ”, США).

Статистическая обработка результатов экспериментов. Результаты экспериментов представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения (М ± s). Проверка нормальности распределения производилась при помощи метода Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий результатов опытов по совместному культивированию различных клеток исследовали при помощи дисперсионного анализа. Множественное сравнение средних проводили при помощи критерия Даннета. Различия рассматривались как значимые при р<0,001. Статистическая обработка проводилась при помощи программы Graph Pad Prism v.5.0 (Graph Pad Software Inc, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нагрузка ДК ФИТЦ-конъюгатом Деке. Для выявления прямого взаимодействия ТН-2 Аг с ДК использовали культуру ДК на 10 день культивирования. К ДК добавляли ФИТЦ-Декс в концентрациях 15, 25, 50, 75, 100 и 125 мкг/мл (на 1 млн ДК). Культивирование ДК с ФИТЦ-Декс производили в течение 24 ч при +4°С. Взаимодействие ФИТЦ-Декс с ДК

И

оценивали по количеству ФИТЦ-позитивных клеток методом проточной цитометрии. Результаты приведены на рис.1.

Как и следовало ожидать, с увеличением концентрации внесенного в культуру конъюгата, пропорционально увеличивалось и количество ФИТЦ-позитивных клеток, т.е. ДК, связавших Аг. При концентрации конъюгата 75100 мкг/мл увеличение числа ДК, связавших конъюгат, выходило на стационар ный уровень, достигая максимума при 100 мкг/мл, поэтому в дальнейших опытах было решено использовать ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн.

Рис.1. Зависимость количества ФИТЦ+-ДК от концентрации ФИТЦ-Декс

Активация ДК ТН-2 Аг. Для определения иммуногенных свойств ТН-2 Аг ДК нагружали Деке, БЗ и ПВП-350 в концентрации 100 мкг/млн ДК. Показано, что если исходно культуры ДК содержали 96, 84, 13 и 46% клеток (рис.2А), позитивных по МНС-И, СВ 11с, СБ80 и СБ86, соответственно, то после добавления Деке количество позитивных по этим маркерам клеток составило 93, 82, 22 и 96% (рис.2Б).

Экспрессия маркеров МНС-И и СБИс под влиянием Деке не менялась. Очевидно, что характерным маркером активации ДК в опытах с Деке является С086, поскольку наиболее значительные изменения при нагрузке клеток ТН-2 Аг наблюдаются именно в увеличении числа СБ86+ ДК.

Рис.2. Влияние разных ТН-2 Аг на созревание ДК. (По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс -интенсивность флуоресценции.Темный контур - изотипический контроль, светлый контур - экспрессия

характеристических маркеров)

В опытах с нагрузкой ДК S3 количество позитивных по MHC-II, CD1 lc, CD80 и CD86 клеток составило 95, 83, 62 и 97% (рис.2В). Следует отметить, что в отличие от Деке, S3 вызывает более сильную активацию ДК, что выражается в значительном увеличении экспрессии не только CD86, но и CD80.

Увеличение числа CD80- и СБ86-позитивных клеток более чем в 2 раза свидетельствует об активации ДК. Активация ДК при нагрузке ПВП-360 была менее значительной; число CD80- и СБ86-позитивных клеток не превышало 20% и 57% соответственно (рис.2Г). Таким образом, активация ДК при нагрузке ПВП-360 была значительно ниже, чем под действием микробных полисахаридов.

Установлено также, что чем сильнее активированы клетки, тем больше снижена экспрессия F4/80 по сравнению с таковой на ненагруженных ДК. Так, в норме в ДК выявляется около 83% F4/80+ клеток, а при нагрузке ДК Деке и S3 количество F4/804 клеток составляет 71% и 63%, соответственно. ПВП-360, стимулирует ДК слабее, и количество F4/80+ клеток оказывается сравнимо с таковым в норме - 80%.

Индукция иммунного ответа in vitro Деке и S3, связанными с ДК. Для

выявления иммуногенных свойств ТН-2 Аг, связанных с ДК, клетки, нагруженные Деке в концентрации 100 мкг/млн и 125 мкг/млн культивировали с нормальными спленоцитами мышей в соотношении 1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. Контролем служили культуры, содержащие наивные ДК, спленоциты и Деке, наивные ДК и спленоциты, а также только спленоциты. Иммуногенные свойства ТН-2 Аг, связанных с ДК выявляли по количеству АОК (специфическая стимуляция) и ИГОК (неспецифический поликлональный ответ) в культурах спленоцитов (рис.З).

Пик ответа на Деке при внесении в культуру спленоцитов, нагруженных им ДК, достигается на 4-е сутки культивирования. При этом достоверно увеличивается как число АОК - в 2,5 раза (с 121 ± 12 до 310 ±21 на 106 спленоцитов), так и общее число ИГОК (~на40%). Важно, что повышение

концентрации Деке при нагрузке ДК до 125 мкг/млн, не влечет существенного увеличения числа АОК (330 ± 8 на 106спленоцитов). Это может быть связано с ограниченным количеством В клеток, способных к активации или предельной способностью В клеток к активации. Иммунный ответ специфичен: ДК, нагруженные Деке, ответа на другие ТН-2 Аг (БЗ и ПВП-360) не вызывают. Интересно, что иммунный ответ на Деке обеспечивают только предварительно нагруженные им ДК. Простое внесение в культуру спленоцитов наивных ДК увеличивает ответ не более чем на 34% (162 ±10 на 106 спленоцитов). Нативный Деке вызывает достоверное двукратное увеличение числа АОК (227 ± 17 на 106 спленоцитов). Это означает, что иммуногенность ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, выше, чем иммуногенность только ДК или нативных ТН-2 Аг.

Поликлональная активация В-клеток при этом относительно невелика -число ИГОК, значительную часть которых, очевидно, составляют АОК, возрастает не более чем на 40% (с 5126 ±389 в норме до 7175 ±770 на 106 спленоцитов). Это отличает ответ спленоцитов на Декс-ДК от ответа на нативный Деке (9960 ± 1070 на 10б спленоцитов). Ранее было показано, что иммунизация ТН-2 Аг индуцирует не только появление АОК, но и значительно повышает число ИГОК, т.е. приводит к поликлональной стимуляции В-лимфоцитов [КаШ, 2000]. В настоящих опытах также показано, что нативный Деке вызывает почти двукратное увеличение числа ИГОК. По-видимому, механизм “запуска” В-лимфоцитов ДК, связавшими Деке, более специфичен и эффективен, чем активация В-клеток только нативным ТН-2 Аг.

Иммуногенная активность разных ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, неодинакова и может определяться химической природой Аг. Так, БЗ-ДК индуцируют появление АОК, число которых по сравнению с нормой достоверно возрастает примерно в 2,7 раза (с 73 ± 10 до 196 ± 9 на 10б спленоцитов) (Рис.4).

I А

аз 25<Н

О

2

БЗ-ДК, индуцировали также поликлональный ответ - прирост числа ИГОК составил 40% (9140 ± 1284 против 6440 ±512 на 106 спленоцитов в норме).

Установлено, что индукция иммунного ответа ТН-2 Аг, связанными с ДК, требует непосредственного контакта с В-клетками. Разделение ДК и В-клеток полупроницаемой мембраной приводит к снижению числа АОК (112 ±20 на 10s спленоцитов) и ИГОК (6514 ±388 на 10б спленоцитов) в культурах, по сравнению с числом АОК и ИГОК при непосредственном взаимодействии ТН-2 Аг, связанных с ДК и спленоцитов. Следовательно, в индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК принимают участие не только растворимые стимулирующие факторы (цитокины), но и контактные взаимодействия (через клеточные рецепторы).

Индукция иммунного ответа in vitro на ПВП-360, связанный с дендритными клетками. Несмотря на то, что ПВП слабо активирует ДК, проверили, не повысится ли иммуногенность ПВП-360 при связывании его с ДК. Результаты, полученные при совместном культивировании ПВП-360-ДК со спленоцитами, представлены на рис.5.

ПВП-360, связанный с ДК, вызывал образование АОК; их количество возрастало примерно в 2 раза по сравнению со спленоцитами (451 ±22 против 230 ± 16 на 106 спленоцитов) и было сходно с таковым при прямой стимуляции спленоцитов ПВП-360 (432 ± 21 на 10б спленоцитов) (Рис.5А).

Число ИГОК при этом возрастало на 60% по сравнению с числом ИГОК у чистых спленоцитов (6672 ± 798 против 4200 ± 275 на 106 спленоцитов). Разделение спленоцитов и ДК, полупроницаемой мембраной снижало образование АОК, как и в ранее описанных опытах (Рис.5).

Как и в предыдущих опытах, ПВП-360, связанный с ДК, индуцировал меньший поликлональный ответ, чем нативный ПВП-360.

Одной из причин более низкого иммунного ответа на ПВП-360, связанный с ДК, по сравнению с таковым на полисахариды, связанные с ДК,

может являться отсутствие на ДК специфических рецепторов к ПВП-360. Как известно, на ДК имеется ряд рецепторов к полисахаридам, представленных семейством лектинов С-типа, маннозным рецептором [ТгіапаЬоБ, 2001, Zamze, 2002]. Захват Аг, посредством рецепторов, происходит более эффективно по сравнению с неспецифическим эндоцитозом. Возможно, в случаях с полисахаридными ТН-2 Аг захват Аг происходит не только посредством неспецифического эндоцитоза, но и с помощью рецепторов.

А

Сравнение иммунного ответа in vitro на ПВП-10 и ПВП-360, связанные с дендритными клетками. ТН-2 Аг обычно имеют очень большой молекулярный вес, более 100 кДа [Mond, 1995]. Молекулы меньшего размера значительно менее иммуногены. Известно, однако, что ДК могут увеличивать иммуногенность небольших полимерных молекул. Мы сравнили иммуногенность ДК, нагруженных ПВП-360 и ПВП-10 (мол. вес 360 кДа и 10 кДа). Спленоциты, культивированные со свободными Аг, использовались в качестве контроля. Полученные результаты, выраженные в виде прироста числа АОК над их количеством в норме, представлены на рис.6.

% 250-,

Рис.6. Относительный прирост числа АОК, индуцированный нативными ПВП-10 и ПВП-360, атакже ПВП-10 и ПВП-360, связанными с ДК, Число АОК нормальных спленоцитов принято за 100%

Внесение в культуру спленоцитов ПВП-10 увеличивало число АОК по сравнению с АОК спленоцитов не более, чем на 40%, в то время как при иммунизации ПВП-360 это увеличение было в 1,8 раза. В то же время при культивировании спленоцитов с ПВП-10, связанным с ДК, увеличение числа АОК оказалось, таким же, как при ПВП-360, связанным с ДК, т.е. также двукратным. Это свидетельствует о том, что связывание с ДК может увеличивать иммуногенность низкомолекулярного Аг. Механизм этого процесса пока неясен.

Активация ДК при совместной нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС. Известно, что ЛПС является классическим неспецифическим активатором ДК, поэтому важно, было выяснить как влияет на экспрессию характеристических маркеров одновременное связывание ДК ТН-2 Аг (83, ПВП-360) и ЛПС. Для этого ДК одновременно нагружали ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн и ЛПС Е.соИ в концентрации 2 мкг/млн (оптимальная концентрация установленная ранее). Полученные результаты представлены в табл.1.

Согласно полученным данным, ЛПС вызывает сильную активацию ДК. Это выражается в значительном увеличении экспрессии костимулирующих молекул СБ80 (67% против 13% в норме) и СБ86 (94% против 43% в норме). ЛПС также увеличивает экспрессию МНС-П (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 2 раза, число МНС-1Г клеток >95% во всех образцах).

Табл.1. Экспрессия поверхностных маркеров ДК, при нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС

МНС-П СБПс СБ80 С086

ДК (ненагруженные) 96% 82% 13% 43%

ДК (ЛПС) 97% 78% 67% 94%

ДК (ЛПС + 83) 96% 81% 77% 95%

ДК (ЛПС + ПВП-360) 97% 78% 68% 94%

Одновременная нагрузка ДК ЛПС и ЭЗ увеличивала экспрессию маркеров по сравнению с ненагруженными ДК еще больше: экспрессия СБ80+ - 77%, СБ86+ - 95% (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 1,5 раза). Совместная нагрузка ДК ПВП-360 и ЛПС, однако, такого эффекта не давала: экспрессия СБ80 и С086 оставалась сравнимой с таковой под действием одного ЛПС. Количество СБ11+ клеток было > 80% во всех образцах, независимо от ЛПС.

Взаимодействие ДК с В-1 и В-2 клетками. В предыдущих разделах были представлены опыты по индукции образования антител ТН-2 Аг, связанными с ДК в спленоцитах мышей СВА. В то же время спленоциты представляют смесь клеток, продуцентами Ат в которой являются В лимфоциты. Основной субпопуляцией В лимфоцитов в селезенке являются В-2 клетки (около 95% В-лимфоцитов). В-1 клетки составляют минорную субпопуляцию, не превышающую 2%. В составе перитонеальных клеток мышей СВА преобладают В-1 лимфоциты. Ранее было показано, что основную роль в специфическом и поликлональном иммунном ответе на ТН-2 Аг играют CD5+ В-1 клетки селезенки [Sidorova, 2003, Whitmore, 2003].

Полученные нами перитонеальные В-1 клетки экспрессировали: CD 19 > 95%, CD5 -30%, CD3 < 5%, CD23 < 5%, F4/80 < 5%. В-2 лимфоциты характеризовались поверхностными маркерами CD19>94%; CD5 и CD3 < 1%; F4/80 < 3% (Рис.7.).

А

10 91.13% : • 3,56%

ю3 " - *

ю2 К'-'" ' '

м1

Ш’% : . 0.15%

It) 1<? 1І CD23

200 J

150

| 100

О 1

50 I

J \ 93,71%

. -ч

1cf 1tf 1<f 1#

10 28.31% 68,99% 10 0.44% 0,13%

10і ю3

CD19 о 40 |g|f CD5

10 10

2;5s% 0.15% 99,24%:' 0.19%

'V

11?

CD23

1#

1# 1</ 1<f 1(f 1<f CD3

1(Р 1<f 11? 11? 1if

В220

Рис.7. Цитометрическая характеристика перитонеальных В-1 клеток (А) и В-2 клеток селезенки (Б). (По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - интенсивность

флуоресценции)

Чтобы выяснить, какая субпопуляция В клеток мышей СВА участвует в ответе на ТН-2 Аг БЗ, связанный с ДК, смешивали с В-1 и В-2 клетками в соотношении 1:5 и культивировали в полной среде в течение 4 дней. Результаты эксперимента представлены на рис.8.

Под влиянием БЗ, связанным с ДК, в культурах В-1 клеток число АОК увеличивалось в 2,8 раза (с 116 ± 20 в норме до 327 ± 52 на 106 В клеток); в то же время в культурах В-2 клеток, прирост числа АОК был незначителен - на 18% (с 76 ± 11 в норме до 90 ± 14 на 106 В клеток).

Число ИГОК при совместном культивировании увеличивалось в обоих случаях; однако, прирост числа ИГОК был выше в культурах В-2 клеток - 37% (14256 ± 890 против 10370 ± 1950 на 106 В клеток), тогда как в культурах В-1 клеток - 17% (10274 ± 1360 против 8740 ±2180 на 10б В клеток). Таким образом, данные полученными нами, подтверждают ранее сделанный вывод о ведущей роли В-1 клеток в ответе на ТН-2 Аг.

АОК игок

В-1 клетки В-2 клетки В-1 клетки В-2 клетки

□ В клетки ВВ В клетки + ДК

Рис.8. Иммунный ответ В клеток индуцированный БЗ, связанным с ДК, * р <0,001

Всё вышеизложенное свидетельствует о том, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают иммунный ответ спленоцитов при непосредственном контакте с ними. При взаимодействии с ДК, нагруженными ТН-2 Аг, основной отвечающий популяцией являются В-1 клетки.

Индукция образования АОК при помощи ТН-2 Аг, связанного с Х1(1-

ДК. ДК, выделенные из костного мозга СВА/Ы мышей, нагружали Деке и культивировали с нормальными спленоцитами мышей СВА в соотношении

1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. На 4-е сутки в культурах определяли число АОК и ИГОК (Рис.9).

а 400-]

О

Рис.9. Индукция образования АОК Деке, связанным с Х1<1-ДК, р < 0,001

Полученные данные показывают, что Деке, связанный с х1с!-ДК, вызывает образование АОК (329 ± 25 против 132 ± 15 на 106спленоцитов). Эти числа полностью сопоставимы с таковыми в опытах с ДК, выделенными из костного мозга СВА мышей. Очевидно, что наличие х1с!-мутации не влияет на способности ДК к связыванию ТН-2 Аг и стимуляции иммунного ответа на ТН-

2 Аг. По-видимому, х1с!-мутация, функции миелоидных клеток не меняет.

выводы

1. ДК, выращенные из костно-мозговых предшественников, способны связывать ТН-2 Аг.

2. Показано, что полисахаридные ТН-2 Аг, связанные с ДК, обладают иммуногенностыо. При этом в культуре спленоцитов, ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают более сильный и специфичный иммунный ответ, чем нативные ТН-2 Аг.

3. Поликлональная активация В клеток ТН-2 Аг в составе ДК, меньше, чем под действием нативных ТН-2 Аг.

4. Для индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг требуется непосредственный контакт нагруженных Аг ДК и В лимфоцитов.

5. ДК, полученные из костномозговых предшественников xid-мышей, не отличаются по способности связывать ТН-2 Аг и индуцировать иммунный ответ от ДК, полученных от нормальных мышей.

6. При индукции иммунного ответа in vitro на ТН-2 Аг, связанные с ДК, основными продуцентами Ат являются В-1 лимфоциты.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор сердечно благодарит коллектив лаборатории биосинтеза иммуноглобулинов за помощь и поддержку при постановке экспериментов и написании настоящей работы.

Особо следует отметить неоценимый вклад научного руководителя проф. Е.В. Сидоровой в обсуждение результатов и написание диссертации.

Автор выражает признательность Рубаковой Э.И., сотруднице лаборатории экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН, за помощь в освоении метода получения дендритных клеток.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (Грант № 08-04-00233-а).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хоченков Дм.А. Биология дендритных клеток. // Биол. Мембраны. 2008. Т.25. С.403-419.

2. Khochenkov D.A. Biology of dendritic cells. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology. 2008. V.2. P.296-311.

3. Хоченков Дм.А. Роль дендритных клеток в иммунном ответе на Т-независимые антигены типа 2. // Биол. Мембраны. 2010. Т.27. С.307-313.

4. Khochenkov D.A. Role of dendritic cells in the immune response on T-independent antigens type 2. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology. 2010. V.4. P.257-261.

5. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Role of dendritic cells in the immune response on T-independent antigens type 2. ESF Research Symposium В Cells and Protection: Back to basics. 2010. Sant Feliu de Guixols, Spain.

6. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Do dendritic cells participate in the immune response to T-independent antigens type 2. FOCIS. 2010. Boston, Massachusetts, USA.

&...ООО “Цифровичок”, тел. (495) 649-83-30

www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru