Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Участие полиморфноядерных лейкоцитов в патогенезе нарушений сосудистой проницаемости при некоторых патологических состояниях

^ МИНЯЙТЕРСТБО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ • РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Нз правах рукописи

ЛИПАТОВА ВЕРОНИКА АНАТОЛЬЕВНА

УЧАСТИЕ П0ЛИШР4ЯСЩЕИШ ЛЕЙКОЦИТОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ НАРУШЕНИЙ СОСУДИСТОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

14. 00. 23 - гистология, цитология, эмбриология 03.00.04 - биохимия

Автореферат'

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медигинских наук ' ' • # .

Москва, 1903

а

л

/

Работа выполнена в Российском государственном медицинской университете

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Е В. Банки

доктор медицинских наук Л. Г. Коркина

Официальные оппонентш доктор биологических иаук, ,

лауреат Государственной премии, профессор Б.ЕВлорин

доктор медицинских наук, профессор ~ Р. Т. Тогувов

Ведущее учревдение - Российский Университет Дру*Яы народов

Защита состоится " "____ 1693 г. в спецсовете

Д. 084.14.04. при РГМУ в _ час. .

(117869, Мэсква, ул. Островитянова, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в биОлюхе:« университета Авторефэрат разослан " 1993 г.

Ученый секретарь споцсовога

доктор медицинских наук, профессор А. й. Тихомиров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТМ

Актуальность проблемы. Конкретные механизмы повреждения эндотелия микроеосудов при остром воспалении, ведущего к нарушениям сосудистой проницаешсти, вэ многом остаются неясными. В настоящее время полагают, что в развитии воспаячтелмых реакций весьеа важное значение имеют активные формы , кислорода ( АФЮ, генерируемые активированными нейтрофилат, и лейкоцитарные про-теавы, юторые они секретируот (Vard P.A. et al., 1086; Ozakl У. et al., 1985). Существует также достаточно обоснованное мнение. что собственно повреждают}«« действием на гкани среди АФК обладает перекись водорода и продукты миэлопсроксидааной реакции нейтрофильных' полиморфнолдерных лейкозов (Brlgham K.L. et al., 1984; NfcCormlck J. R. et al., 1981; Vard P. A. et al. . 1983). Увеличение сосудистой проницаемости удается предотвратить предварительно вызванной гранулоцитопенией (Heflin А. С. а Brîjrham К. L., 1931; Coohrane С. О. et al., I960, Ward P. А. a Coohrarw. С. S., 1066).

Несмотря на имеющиеся свидетельства участия полиморфчоядер-ных лейкоцитов в возникновении нарушений сосудистой проницаемости при самых pasличных патологических состояниях, нет явных доказательств непосредственного участии (Ш в гтих процессах. При некоторых заболеваниях , в том числе таких, как энОолия легочной артерии или геморрагический васкулит, способность нейт-рофильннх лейкоцитов генерировать . А® вообще на исследована, фи других, например, при эндотоксемии, неясен сам механизм активации нейтрофилоэ.

Целью настоящего исследования явилось изучение ро5и поли-иорфноядерньос, лейкоцитов в ..»ханизмах повреждений яндотелия микрососудов и их способности продуцировать АФК при некоторых патологических состояниях равной этиологии.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие Задачи-

1) провести электронномикроскопическов исследование микрососудов а) области кожных петехий детей о болезнью Шанлей-на-Геноха; б) альвеолярных капилляров при моделировании эндо-токеемии и массивной эмболии легочной артерии;

2) оценить, изменение сосудистой проницаемости под влиянием перекиси водорода

3) сравнить проницаемость венулярных иикрососудов в контрольных условиях к у животных, получавших антиоксидант рутин;

4) иэучить окислительный метаболизм полиморфноадерных лейкоцитов при перечисленных выше патологических сосюяниях.

Научная новизна Выявлено, что в области кояных петеяий у больных геморрагическим васкулитом детей отмечаются, наряду с другими клетками крови, полиморфноядерные лейкоциты с признака-, ми актиьации, а также разрушенные лейкоциты. Поврездепия эндотелия кгакрососудов сопровождаются отетом окружающих ткачей. Участки деструкции клеточных мембран эндотелия альвеолярных иа-пилляров при эндого1ссемии и массивной эмболии легочной артерии в основном соответствовали области адгегии ШШЯ. Проницаемость посткашшярных венул брыгейт: крыс для флуоресцоина натрия существенно увеличивалась при воздействии перекиси водорода к была достоверно шив контрольных еначэшШ после предваргаельного приема кивотныии анткоксиданта рутина. Было показано, что активирующее вдяяние- эндотоксина на окислительный ызтаболкеи полн-ыорфноядорных лейкоцитов опосредовано п^авкешшми факторами. 'Установлено, что характер активации окислш-йльного мэтиболичш полшэрфноядерных ¡лейкоцитов и ь:оиону>слеаров детей с болеокьв ШэнлеЯна- Геноха меняется в зависимости ст «ишичэскй:-: «?здий болезни н типа стимуляторе. Способность к Генерации ЛЖ поли-ыорфноядерныш лейкоцитами, выделенными по крови в полости кра-' вого велудочка сердца, висе, чем не левого.

Практическая значимость. Наши данные позволяет рекомендовать хе1ашомш1есцентный метод для быстрой оценки Функционального состояния фагоцитирующих клеток как в дошатаю эксперимента па мштиых, так. к с процессе лечения больных геморрагическим васкулитом. Определение'функциональной шячгзиооти й'агоцитирук-щнх клеток способно помочь оптимизировать выбор &э|«фствешиа-средств и осуществить контроль в процессе лечения геморрагического васкулота Полученные данные расширяют суюэствувдс представления о патогенезе болезни Шеыхейна-Генохз, иапсэтзкой вмоолии легочной артерии и звдотоксешш. Они могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах гистологии. патологической анатомии и патологической физиология. , •

. Апробация работы. Основные пологьения работы были доложены на 5 Закавказской конференции ысрфологоь (Баку, 1989), научной конференции "Актуальные проблемы лимфологии и ангиологии (ЬЬск-

ва, 1989), на Учредительном международно« конгрессе общества патофизиологов (Москва, 1931).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 9 пе четных работ.

Об'^ем и структура работы. Работа изложена на 1^4 строн/цах машинописного текста, содержит 7 таблиц л ST рисунка (схем, графиков и микрофотографий).

. .. Диссертация созтоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследовании, результатов иссле;;,-;ва-ния, обсуждения полученных результатом, выводов и списка литературы, состоящего :ш L8C источников.

' ЫАТЗРИАЛ И 1£НТ0ДЫ ИССВДОВДНКЛ При проведении работы испольеоваш методы трансмиссионной электронной микроскопии, прижизненная микроскопии, а такуз лк-цииолаависимой хекилминесцепции. Распределение материала представлено в табл. 1.

Участки косных петехиЛ (гпидержс ч вепушШ слой дерт) о голени больных забирались под местной анестезией в первые 24 часа после пслзлзнич ге;юррагич9ских высыпаний. Крыс наркотизировали внутримышечным/введением. (50 мг/ кг; раствора ннмбутяла Эксперименты на собаках проводили в условиях закрытой грудной клетки и естественного дьианил. Премедикавдю очущестзляли внутримышечным введением промедола (10 iv/кг), наркоз - дробным внутривенным введением тиопентал-наария (20 ко?/кг).

tereриал для электронно-'шкроскопического исследования фиксировали 2,5% раствором глютаровего альдегзда. ПсдгстоЕка образцов для трансмиссионной электронной микроскоп«: проводилась по методике, принятой в лаборатории, ¡латериал заключался в аралдит. Для контрастирования срезов принаняли уранилацетат и цитрат свинца

П£И болезни Шенлейна-Геноха активность' окис г.; ¡тельного ¡.¡ета-Золизма нейтрсфилов и ыононукдеарсв, a тагехэ сывороточные изменения оценивались в стадиях клинического ч-риза, улучк-пия и ремиссии. Контролем служили клетки "í сыворогки, взятью от детей того зке возраста, здорозых и больных хроничес;жм гастритом, сроническим гастрсдуоденитом, дискинезией мелчейЫБОдявдх путей. ' Проницаемость венулярных микрососудоз брыяейки крыс опреде-шлась по методике Ванина В. а и Мюллера И.-Ф (1937). Выбира-

, « Табл. 1. Распределение материала.

объет количество

Геморрагические! впекулит Норма Криз Улучшение Ремис&ия человек 24 8916 12

Зндотоксемия Контроль Эксперимент Эндотоксин "in vitro" Контроль Эксперимент крыса крыса Я 6 4 4

ЮЛА Контроль Эксперимент собака 3 . б

Прижизненная микроскопия Контроль Рртин крыса 48 11 Б

Табл. 2. Концентрации клеток и реагентов в itjssig.

болевнь Шенлейна-Генох;» U5J5A Зндотоксе1.(ИЯ К 8Щ1Т0ХСИН -in Ciirj14

клетки 0.5 млн/мл 0.25 млн/мл 0.2-й. 8 tiiH/W

лшинол 2. 0x10 "э М 2.0х10~6М 5x10

аимоБш: 0.10 иг/мл оло кг/мл • -

конканазалин А 0.04 МГ/аШ - -

кварц 0. 50 мг/мл - -

латекс - - 6.6х1071/мл

лись венулы диаметром 10-15 мкч, что соответствовало размеру посткапиллярнлх ценул. Б' качестве флуореоцируххцего трассера использовали флуоросцеин натрия (ММ - 376). Прижизненную микроскопию и оценку проницаемости венулярных иккрососудов проводили г условиях обычного и лшинесцеитного освещения с помощью С с ль cn.ro микроскопа для прншэпенных исследований ("Leitz"), оснащенного фотокамерой "Orthonat". а такче фотометрической насадки ЙВЛ-i и самописца "longraphv' (Raaelkís, Венгрия).

Эидоток;емиа вызывали внутривенным введением эндотоксина Е.соН в дозе 1 мг/кг в хвостовую веку крыс. Через 1.5 часа ва-пирались легкие для электрсннсмикроскопического исследования и крсвь для оценю» функциональной активности лолиморфноядерных лгйкоцитов.

Ычссивную емДолио легочной артерии моделировали быстрым (15-20 »/кнут) введением в наружную подвздошную вену 5-11 мышечных эмболов, в качестве которых использовались продольно иссеченные фрагменты портняжной мышцы "собаки (5x50 мм), воспроизво дящие размеры и форму возможных аутогенных тромбоэмболов. Зондирование полостей сердца и аорты осузествляли через периферические сосуды катетерами Эдмана. Экспериментальными критериями массивной эмболии легочной артерии считали увеличение давления в правом желудочке более 70 мм рт. ст.. Кровь из полостей правого и левого желудочка забирали перед началом эмболизащш, а также через S и 6 часов после гмболиэации. Контролем служила аналогично взятая кровь ложно оперированных животных, 1&тьриал для электронномикроскспического исследования забирался через 6 часов после развития эмболии.

Клетки для последумцего определения их функциональной активности выделяли на фикслл-верографиновом градиенте ллстности (Lindaría J. a Burkhardt Н , 1988). Число жизнеспособных клеток определяли в тесле с трипановым синим. Оно составляло 95-98Z до и после инкубации клеток в среде в течение 2 часов при 37°С. Инкубация с эндотоксином незначительно (дс уменьшала количество жизнеспособных клеток..

' Хемилюминесцентный анализ, проводили на люминометре 1251 (LKBr. Швецьл). В кювету доминометра вносили раствор Хеккса (рН 7.33), люмииол, клетки и активатор (конканаг.алнн 4, опсонкзиро-ванний зимсзэн, ¡оарц. или .латекс) в конечных концентрациях, указанных в табл. Р..

В ;>е*шме постоянного перемешивания при 37°С намеряли све-тосумму люмилезцонцки за 1С с. Оценивали спонтанную хемилгоми-Песценцьм, 1?, - до внесения активатора в сроду и активированную хемидоминеоцениию,. после добавления активатора (рис.1).

У 10 больных в стадии криза и 6 больны:: в стадии клинического улучшения на цельной коови был проведен икгибиторный анализ. Контролем слудкла цельная кровь, , взятая у 3 здоровых детей.

При оценке процента иагиоированик хеыишмикесценции измерительная кювета содержала, 1) БОмкл разведенной в 10 раз физ. растворам крови, £) 8С0мкл раствора &нкса рН 7, ЗУ 3) БОмш; Ю'^М раствора лоиинола (рН 7.39) 4.) в качестве активатора использовался латекс &иа.чегром частиц 0,5- 0,8 мкм. Испопьзуемые ингибиторы /емшаоминееценции представлены в табл. 3.

Скачала, проводилось измерение хемилкшнесцэнции цельней крови, затем при новом намерении к крови добавляли ингибитор и и&уеряли активированную хемилюиинеоценцию. Процент лнгибирова-кия счигали по фэршчь: (1- ((1иах1- 15рогЛ1;/( 1пах-1эроп1)), где 1тах1 и 1пах - вьоо'/а пхков кривой стимулированной хемилюми-несценции с ингибиторов к бас, соотзектвеино; 1Брспи и 1эрс^. - значения нестимулироваикой хемитоминесценцки с ингибитором у без, соответственно. ИЬшнения среднего диаметра частиц в сыворотке регистрировали на анализаторе субмикрснных частиц Сои^ёр (модель N 4).

Ш приносим искреенни благодарность сотрудникам кафедры пропедевтики детских болевней педиатрического факультета асс., к. м. н. Цшзал К. Н., доц., к. м. и. Пяахута Т. Г., асс., к. и. н. Спиридоновой Е Н, п. м.н., профессору Мазурину А. В., комплексной исолэдоват«ш>с<юй группе РГМУ (руководитель - доц. А. 0. В^ганский), научному сотруднжу, к. б. н. Тихвинской Е. И. и старшему научному сотруднику отдела эле'егронной микроскопии и микроциркуляции, к. м. н. Сенатовой Л. Д. за предоставленную возможность испсльБовать материал, полученный в совместных исследованиях.

время, i

Рие.1. Кривая хемилшинесценции (схема).

Таб! <5. Яспольяуеыыэ ингибиторы. хемилшияесцзнцик.

• Ыод. вес (О) Механизм действия Конечная концентрация

рутин 648 Ловупка О^1 и Ън 1.3x10-4 М

ЯЛТА 341 Ингибитор лилоксигенагы 1.0x10-6 М

фекигидш» 302 Ингибитор кальциевых каналов 0.7x10-5 М 1.4x10-6 М

- в -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении полутонких среаов, а также электроннограмы участков кожных петехий в стадии криза у больных геморрагическим васкулитом мы обнаружили, что просвет микрососудов практически перекрывался выбухающими в него эндотелиальными клетками, однако повреждений бавалыюй мембраны обнаружено не было. Наблюдался отек эпидермиса с увеличением межклеточных промежутков, а также появление "пустых пространств", лишенных коллагена и клеток, в дерме. В области петехии наблюдалась экстравазация форменных элементов (гоитрощггов, иононуклеаров, тучных клеток). Паравазально находились также полйморфноядерные лейкоциты с электронноплотной цитоплазмой и специфической зернистостью, в такл' разрушенные лейкоциты, характерные для этого типа васку-лита (Saulsbury I., 1984).

По данным Wills j. А. с соавт. (1990), одним из четырех предложенных ими критериев дифференциальной диагностики пурпуры Шэнлейна-Геноха является наличие в биопсийном материале грану-лоцитов в стенке мелких артериол иди венул, которые, как полагают, и ответственны за повреждение сосудистой стенки при васкулите (Сослала С.6. et al., 1969; Knlker V. Т. & Cochrane С. а. 1965; Malech Н. L. 6 Gallln J. I., 1987).

Существует такжэ мновэство работ, свидетельствующих о наличии при этом ваболерании 1еА-1шыунных комплексов (Шига Ц. et al., 1992; Kauffmann R. H. et al., 1980; Какала S. et al., 1990; Levlnsky R. J. & Barratt Т. M., 1979). ibpoco известно тагаз, что иммуногдобулш1Ы относятся к разряду веществ, способных активировать окислительный метаболизм фагоцитирующих клеток, увеличивая продукцию и).1и активных форы кислорода, в том числе порогами водорода (Ward P. A. et al., 1983). В литературе имеются саобвц-ния .об увеличении IgА-циркулирующих иммунных комплексов в активной фазе болезни Шзнлейна-Геноха (Kauffmann R.H. et al.. 1980; Levinsky R. J. & Barratt Т. M., 1979; Havana S. et al.. 1990).

Мы предположили, что счетчик субмикронных частиц позволит нам обнаружить увеличение средних размеров частиц в раствора сыворотки . при появлении в ней циркулирующих иммунных комплексов. Оказалось, что максимальное значение среднего диаметра частиц в сыворотке в наших исследованиях соответствовало стадии клинического улучшения (p<Q,01). В стадии клинической ремиссии

- а -

этот показатель был меньше максимального, однако достоверно больше контроля (р<0,05). Значения этого показателя у больных в кризе от контроля практически не отличались (рис.2А).

Интересными оказались сопоставления изменений в сыворотке с изменением уровня окислительного ьятаболизма фагоцитирующих клеток. Так, средние значения спонтанной хемилшинесценции по-лиморфноядерных лейкоцитов больных геморрагическим васкулитом детей были выше контрольных значений и максимальными в стадии криза. Наблюдалась тенденция к сникенк. уровня окислительного метаболизма нестимулированных нейтрофилов при улучшении и далее, в'ремиссии, однако контрольных значений он не достигал. Спонтанная хемилшинесценция мононуклеаров была максимальной в стадии улучшения (р<0.05), средние значения ее в кризе и ремиссии так*»' были выае контрольных (рис.2Б).

Активированная хемилюминесценция и мононуклеаров, и нейтрофилов в зависимости от стадии заболевания менялась сходным образом (рис.3, А,В,В). Во всех случаях максимальные средние значения хемилшинесценции клеток больных приходились на стадию клинического улучшения. В стадии криза активированная хемилюми-несценция мононуклеаров практически не отличалась от контрольных значений. Несколько иная картина наблюдалась при изучении в кризе активированной хемилюминесценции нейтрофилов. Наши данные. показывает, что и на конканавалин А, и на частицы кварца средние значения хемилюминес-ентного ответа полиморфноядерных лейкоцитов примерно в 2 раза превышали контрольный уровень (в случае конканавалина А р<0,05).

Применение метода люминольь^й хемилшинесценции совместно с кнгиОиторным анализом позволяет изучать механизм генерации активных фогм кислорода в сложных системах (ТакаЬаэЫ Я. вЬ а1., 1891). При атом информативным показателем оказался процент ин-гибирования хемилюминесценции. Данные о проценте ингибирования представлены в табл. 4.

Разнонаправленное изменение ингибирования хемилюминесценции цельной крови рутином и НДГА позволяет предполагать, что при болезни Шенлейна-Геиоха меняется качественная картина продукции радикалов, и начинает преобладать продукция радикалов за счет липоксигеназного пути"метаболизма арахидоновой кислота Результаты с фенигидином подтверждают, что полиморфноядерные лейкоциты у больных геморрагическим васкулитом активированы, и в них существенно игменен метаболизм кальция.

" ■•.V/

мм

г

V

о

оиЮ Пп14 ; пав пп11

- 10

1 ! контроль яги криз 1 •

Г?5] УЛУЧШНй«Е

Г771 ремиссия

1№лтя0ф««21

вх20 щЦ4 о=0 паи

Рис. 2. Иешнэния в вависишетк от стадии геыоррагнческого васкулита: Л - днаизтра частиц в сыворотке крови;-Б - сдоц-танной геышииинесцзЕЩШ ьюнонуклеаров и аейтрофшшв.

, ЦОНОНУКЛЕЙРЫ

CslS П=14 оаЭ П--И

t

ив

!

750

ОС

230

нестро^Н/Ю

nuit rialS ne. в nmiO

ькявнгслсдрз

.iri— rurS сцЭ

J

fiCiiKtyKrSrtPtJ

'Г

иО

зо'оо

?.Я30

Л

КЗ

гаоо

ШШ

Г.гтЗ r-'J

ItEOTPOVMna

r.=m с-з uso

-.r:i2 яяЗ SKÍ1

?::с. 3. íí3i/sHer;n гкгиЕкроъоНКоЛ хем1га>.!инесцэнц1ш г нависи -!.«зсти от стадии геморрагического ааекулзяа: Л - сгатаатср конганзвалга А; Б - активатор каарц; Е - активатор еяезни-зяровззный пимозан.

Табл. 4. Ингибирование хемилшинесценции (X).

Контроль Криз Улучшение

рутин 60.5+а в 57. 4+2.4 48. 9+3.3 *

КИТА 26. 4+7. 0 40.2+3.2 29. 8+7.7

фенигидин 0.7x10-5 М 38. 8+5. 4 23. б+а 1 * 23. 4+4. 2 *

фенигидин 1.4x10-5 М 98. 3+5. 4 57.2+7,6** 49.0+5.0**

Приме"тние: * - р<0.05; ** - р<0.01

Изучение прямых эффектов АФК на проницаемость стенок микрососудов мы проводшш на брыжейке тонкой кишки крыс в прижизненных условиях. Строение эндотелиальной, выстилки всех венуляр-ных сосудов брыжейки принципиально одинаково и характерно д.л эндотелия соматического типа, к которому относится и легочный эндотелий.

Подтверждением вклада активных форм кислорода в увеличение сосудистой проницаемости может служить наа эксперимент на животных, в ■ течение 1 месяца получавших аитиоксидант рутин в высокой концентрации. При этом наблюдалось достоверное снижение коэффициента проницаемости сосудистой стенки венул по сравнение с коэффициентами проницаемости венул контрольных животных (0.67+0.06 1/с и 0.87+0.05 1/с соответственно) (р<0.05). Это. говорит о том. что в условиях нашего эксперимента "контрольные" эначения проницаемости являются несколько эавыаенными относительно "нормальных", т. к. прижизненное микроскопирование брыжейки, несмотря на строгое поддержание температуры и рН. происходит в условиях вскрытой брюшной полости и нарушения органных взаимоотношений. Действительно, примерно череа 40 - 60 минут микроскопии на брыжейке замечаются разнообразные нарушения: увеличивается количество пристеночных лейкоцитов, могут появляться микрогеморрагии, запустевать некоторые микрососуда Однако в течение 20 минут наблюдения проницаемость посткапиллярных венул для флуоресцеина натрия не меняется, что свидетельствует об относительной сохранности сосудистой стенки.

Для того, чтобы определить, как действуют кислородные метаболиты непосредственно на сосудистую стенку венулярных микрососудов. мы апплицировали на брыжейку раствор перекиси водорода в концентрации 10-5 М. Изучение проницаемости венулярных микрососудов брыжейки для флуоресцеина Натрия показало, что коэффициент проницаемости через 20 минут посла аппликации перекиси водорода на брыжейку увеличивается примерно на ЗОЛ (р<0.05). Электронномикроскопическсе исследование выявляло участ1Ш повреждения клеточных мембран в периферических истонченных зонах эндотелиоцитов, а такте трансформацию везикулярного аппарата, в том числе появление трансэндотелиальных каналов, которые в норме практически не наблюдались.

Известно, что при развитии массивной эмболии легочной артерии (ЮЛА) и зндотоксинового кока ведущее место занимает право-яэлудочковая недостаточность (Савельев В.С. с соавт., 1081). Как и эмболия легочной артерии, эндотсксемический иок вызывает легочную гипертензюо (Савельев ЕС. с соавт., 1980; Ргагиап А. оЬ а1.. 1981).

Однако патогенез развития массивной эмболии легочной арте-ргш связан, предде всего, с гемодияамическями нарушениям!. Изучение морфологических изменений через б часов после моделирования массивной эмболии легочной артерии позволило выявить мембранную трансформация' эндотелиоцитов альвеолярных капилляров, которая выражалась в.двукратном увеличении числа связанных везикул, с тенденцией к увеличению их диаметра. Характерны;,! при развитии массивной змболга! легочной артерии является такгсе увеличение протяженности мембранных повреждений и истонченной зоне зндотелиальных меток, которое было в 3 раза больпэ по сравнению с 1СОНтроле& Увеличение в 2 раза толичества полиморфноядерных лейкоцитов на длину прсфлля сосуда по"сравнения с контрольным материалом, а такте тот факт. что изменения эндотелиоцитов при б-часовой массивной • зкболшг-легочной арт-эрни чат,э всего иожно было зарегистрировать в участках "контакта" энйстадладь-иых клеток с нейтрофилшл!, ногэт слуиггь косвенным подтверждением участия поглшрфяоядерных лейкоцитоз в нарувении целостности ^отолиального пласта через б часов после развития этой патологии. Об шсгивации полиисрфноядорных хейкошгтов свидэ-" тельствоЕзли характерная извитая поверхность й йырсйТё.'Я1(

• ■ - 14 -

орионтированинми к зидотелкахьвой поверхности, . в местах лейко-цетарно-эндотчлтльньэс взаимодействий. Можно предположить поэтов, что мембраннье ьповреждения альвеолярных капилляров обусловлены продакцг.ей активн:~\форм кислорода активированными нейтрофилами, которую можно прямо оценить хзмилюминесцентным методом Для определения степени зтой активации в легких мы в экспериментах с моделирование»; массивной эмболии легочной арте- I рии регкетрировг^ш люмиколзависимую хеыилюминесценцию полиморф-ноядерных лейкоцпов, притекапше к легким (правый желудочек) и оттекалпих от аегких (левый жалудочек), в динамике развития ИЭЛЛ (0. 3 и 6 часов).

Мы обнаружили, что спонтанная хеыидсьшнесценция нейтрофилэв и иа левого, и из правого желудочков изменялась сходным образом (увелмчтаалась к при эмболии, и г. контроле к 3 часам и возвращалась к контрольным значениям к 6 часам акспэримэкта), при тлем отношение ¿.1 правого желудочка и д! левого в течений окпперимента снижались, становясь меньше 1.0.

Более существенными были различия активированной хемилши-несценции нейтрофилов из . правог о дал/дочка. Максимально«» увеличение отмечалось при этом у ¡кмболизировачных животных через 3 часа после змболизации Интересно, что соотношение активированной хечияоминесценцик нейтрофилов правого и левого желудочков достоверно увеличивались через 3 часа после развития массивной эмболии (2.3+0. 59 пс сравнению с 0. 85+0.09 в контроле) (р<0.05. рис.4). Для нейтрофилов левого яздудочкк ивменения хемилши-неецрязки нейтрофилов были не суи»ств«йпаи.

Тагаш образом, полученные морфологические данные при сопоставлен:® с уровнем окислительного метагюлизма полиморфноя-дерных лейкоцитов подтверждает нали предполокэние о той. что в процессе развития дассивноЛ эмболии легочной артерии в альвеолярных капиллярах происходит задержка более функционально активней фракции полиьорфйоядерных лейкоцитов. В то же время наши данные позволяют говорить о том, что лейкоцитарный пул легких ■функционально отличен от пула циркулирующих гранулоцитсв и в норме, так как наблюдается превалирование уровня окислительного ' метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов, поступающих в легкие, кад таковым лейкоцитов, вызедшкх кз легких. . Эти данные хорошо согласуются о результатами других авторов о наличии в легких

3.0.

I

1.0.

0]

5

"Ж?

0ч Зч

1 I КОНТРОЛЬ

ЬЩЗЙЯ мэлд

I

6ч

Рис. 4. Изменение соотношения "правый желудочек"/"левый желудочек"

для активированной хемилхмгаесценцга нейтрофилов в процессе развития шла.

- le -

белее выраженного маргинального пула пел-лморфноядерных лейкоцитов (Doorschuk С. М., ч1 al., . 037; Tonnestn M.U., 1983).

•3 работе Rossi F. с соав/. (19£б) среди агентов, способных актигироза/ь окислительный мэ^аболюм фагоцигирующе: клеток, назза:-: эндотокои>:. Д<;Яствитедчно, в наших зксг.еримент.ах наблюдались морфолс rwuccKi-e ириэт;ки шетнвыщи полиморфноядерных лейто'даов в n;xj'jB'iTe ал'-.геоляггшх к;гиилл*ров П£й развитии эн-дотоисеуии, которые бьли более выражены, чем при .эмболии легочной артерии. Очень су'дэствепы яозрао^ало количество г.элиморф-нояг.ерных лейкчотлв на единлц? длим адгвеолярпьгх капилляров. Волеэ значительно, чем при эм!>ол.;и ле.'очней артерии, увеличивалась лрстнжэнносуь ме.Оранных поьреглелий в истонченных участках андотеллэцитоЕ (a l',5-4 раза), при этом эндотелиальная ъиетилка вдесь иногда лфьэбрвга®* гид "пунктира", а мембраны но выявлялись. Увеличивалась изв1т0:ть клеточной поверхности андо-толиоцитов, в клетках появлялись крупные везикулы и вакуоли.

Однако при иаумкш' у.о>трастртктурчых ^зменокий не всегда можно быть уверенным в активации изучаемых »сеток. Подтоку мы провели игучеш;е астявнос-г»; отж^гедь-чего метаболизма поли--' морфкоядерных лейкоцитов живот-гых о 1,5-чьсовой э.чдотокеемиэй. Хемилюмккесц^нтньй о^вег нейтрефлоп, полученных от животных с . эидототеемичй, Сыл супх-твккно ваше такового иейчрефнлов конт рольных животных, ,'гсо i-oeopwi о вьюокпг, уровне генерации Affli. Уровень спонтанной хеюшадяеидещии клеток при эндотскеемии не менялся (рис.Я, А) Однако полученные данные не дают ответа на волрос, сам ьи эн^отаемш активирует окислительный шт&болиам пс-лжорфкоядерных лейкоцитов, кли ого .действие- опосредовано друтамч факторами. Длл того, wo5ы это выяснить, мы провели еще одну серию экспериментов где инкубировали нейтрефклн здоровых тдоочнах с эндотоксином яри я?°0 в точение 1. 5 часов, - Хемилюми-хесцонтный отгет га активатор регистрировали каждые SO минут. В , контроле яопэльзсвались ть же самче- клетки,. инкубированные без . эндотоксина (рис. 5, Б). Результаты показывают, что хемиитми-дзецентний ответ начинает различаться достоверно только спустя 1 ч о-г начала инкубации клеток в среде Хенчса. Интересно, -что вначения хемклюминесце.чции,; рзггегрируемые при инкубаци/. клето;; -с эндотоксином, практически уьелшиьаигря со временем (пунктирная кривая), а сзстветотвукда, №нтрол»ние значениявозрасти» белее в о раза, Такнн 'обрего*, .в'-налих-э;юлерямек?

р.

рр I—

I

спонг

»5

Ч?ооо

1000

1«

маис

} { КОНТРОЛЬ 4

ЭНДОТОКСЕМИЯ

I

/ —-Т

30

КОНТРОЛЬ

ОМДОТМКСК:!

60 9П минуты

Рис.5. Влияние не уровень окислительного метаболизма а - эндотсчпэ1ми; ъ - и-кубащи их с -,вдо1иксин0м. ^

тох инкубация нейгрофилов с эндотоксином в бессывороточной среде не стимулировала выработку ими активных форм кислорода и не усиливала их продукцию в ответ'на активатор. Ваши результаты согласуются с данными литературы о том, что активация нейтрофи-лов • эндотоксином, может быть опосредована монокинами (факторам:! некроза опухоли, TNF), а также изменением адгезии нейтрофилоз к субстрату (Nathan С.F.. 1089), стеклу (Jacobs RF. et al.. 1986), к эндотелию (BooteJer P. H., 1989).

ШВОДЫ

1. Прямое действие перекиси водорода на стенки иосткапкл-дярных венул приводит к возрастанию их проницаемости (коэффициента проницаемости) для флюоресцентного индикатора Природный флавоноид, антиоксидант рутин в высоких концентрациях уменьшает проницаемость посткапиллярных венул крыс для флуоресцеина натрия.

2. Способность лейкоцитов генерировать АФК различна во фракциях крови, взятой "до" и "после" циркуляции в легких. Льй-коциты, выделенные из фракции крови, полученной йэ левого желудочка сердца, характеризуются более низким уровнем окислительного метаболизма, 1 чем клетки "правожелудочковсй" фракции. При массивной эмболии легочной артерии максимальные различия в способности лейкоцитов продуцировать АФК наблюдаются через 3 часа

3. Массивная эмболия легочной артерии сопровождается задержкой наиболее активной, 6 отношении продукции А®, фракции НПМЯЛ в просвете, легочных капилляров. Адгезия активированных лейкоцитов в малом круге кровообращения сопровождается повреждением эндотелия легких. '

4. Интенсивная адгезия НГШЯЛ к легочному эндотелию, которая, наблюдается через 1,5-2 часа после моделирования зндотоксемии у крыс, приводит к нарушению целостности эндотелнадыюй выстилки альвеолярных капилляров. Развитие гндотоксемии сопровождается повышением окислительного метаболизма НПМЯЛ и повышенной продукцией гаги АФК.

5. Активация лейкоцитов при зндотоксемии опосредована факторами плазмы, поскольку в бессывороточнсй среде m vitro энДс-' токсин не увеличивает уровень продукции АЖ клетками.

6. Инфильтрация иикросоеудоа и скрулаючих ткаке! погимлрф-коядерными лейкоцитами при геморрагичес^.эм гге^улмте (болезни Шзнлейна-Геноха) у детей вызывает псврелщелия эндотелия и резкое увеличение проницав .\íoci и сосудистых ci<ihoi¿.

?. Изменения окислительного катаболизм л ЕШЛ к ыскоцнтоь при Солэзнк Оэнхз^.а-Гепоха характерчзупгз/ щгсличнсстью, которая коррелирует с клинически»: течением эасэ'ллеьания (криз-у^уч-ыекие-ремислия).

0. Епутоиоосудистая стиК''ляуия НПМЯЛ, соптювсвдбющаг"я повышенной продукцией или активны:: (ори гае л рода, является важны?, ( компонентом иьхаькама повреждения энд'.тедигиьнол выстилки микрососудоз при развитии ттс.'огичг-сга'х состояний разного ге-' иеза.

Список работ, опублжэванныл no îs^t-. дпссФУецта.

.1. Роль активнее форк ть.-лореда г, геиез i порре:.<дъни1 сосудистого эндотелия. В ¡tu. : 'Чйрул-ки* mrai чзмов рогуллцзм и их коррекция", 11, 10>yj, III т.: 1048 (cris?. Iawi В. В., Оэттчза IL Д. , Горкина Л Г. )

?.. Роль кейтрофилоэ в ./зханмэиз повреждения' зндотедия -.дай эпдотсксемии. ¿¿перигеи -V Закавказской конференции '¿орфо^огов, Баку, 1D8S: 161-133 (ссавт. Запила?.)

■2. «шгаларфь-оядерше: лойкепктоз ч лз'внепия -эн-

дотелия кровеносных и ли.:фг,.-,ичоск.11з: микрососудоз легкого при эндомгаемуи. 3 гл. "Актуальные зопр.'СЫ лп^'рлс^ии", И., ЦОДО-УБ, 1969: 23 (соалт. Бяикн Е. В., Тизя» некая 2. IL).

4. Ультраетруктурк-дя тршкфркацгя веаудярного эндотелия при .воз,гейс:ва:! хекотерьаг факторов всепа-Ч'.-нг..*. ь' »т-.и toh^pîh-цич *л/икциоиалкая м:.р'1олог;!Я деиеза л-о, кр'Ц-.о< Сргг.^.":т и СхСргц-гкия". Алма-Ата, 1989: 45 (сс-зг.. Сеичтсз И. Д., РзЛ'-ез К. Т., TuxEîucuas 71 И. )

5. С-рганяие. o.w6enrjcTH сегкцпр тралепер: пьсс ..•ул.'гпжедй: зндотедцоцигов м:лфссосудоь ка вогде£ствкз гг.по.-о'.-с:."^ Г col; 3 га. : "Актуальнее вопросы морфологи*", IGÇrt- oí-Ce' (септет, fcb^-сз 3. , T^ntiïûTSiiv: :Z. IL )

6. Рсь:я7;га niserw¡:!ür.¿!i:íE uí-'íóí; л:/.: bc3/.3t<.rr.'m Г-?.:согс-и воспаалпк. Ь-'ат. У! сь*зд гпсто-г.гоъ :t

1ÇS": Cl ¡.еогт.г. СгиБтева Е. Л., Гпр-.!а^ Ï. Л. , Зг."л;?ь "IT., Oki-юта H. R )

- ?.о -

7. Влияние эндототеинэ н^ окислительный метаболизм пол) морфноядерных л-ойксцитоз. Билл. Эксп. Виол. Мед.. 1991, '(4) 401'403

8. -Использование хемилюмкн>. рентных методов для диагностю заболевания легких и отСора фармакологических препаратов. Есесоюеный конгресс но болезням органов дыхания. Киев. 9-12 оь тября 1990; 300 (соавт. Суслов?, Т.Б. , Черемисина 3. IL)

S. Cheines of endothslium and interstitial space volume i lur*S uivfer the aouie rassivd pulmonal eirbol la-mode ling. In "Corat itue.it Congress international Soolety fc Pathophysiology. Moscow. May 20 - June 1. 1081: 140 (соавт. Ba Hiffl R В., Тихвинская U. К., Вирганский А. 0.)

Закчз 105 мрДООгкз. Ротапринт »ffiTXT им,Ломоносова