Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Влияние различных методов хронического ..едения аналогов деморфина и лей-энкефалина на процессы клеточного деления эпителиальной ткани белых крыс

РГБ ОД

1 1 ОКТ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Александр Вадимович

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ХРОНИЧЕСКОГО !ЕДЕНИЯ АНАЛОГОВ ДЕРМОРФИНА И ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА \ ПРОЦЕССЫ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ БЕЛЫХ КРЫС

14.00.23. гистология, цитология, эмбриология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ВЛАДИВОСТОК -1999

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатори Дальневосточного государственного медицинского университета.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор С.С. Тимошин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.М. Черток

доктор медицинских наук, О.И. Кириллов

Ведущая организация: Российский государственный медицинский

университет

Защита диссертации состоится "_" с 1999 год

в_часов на заседании специализированного диссертационногс

совета Д 084.24.01 при Владивостокском государственном медици ском университете (690600, г. Владивосток, ГСП, пр. Острякова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокско государственного медицинского университета (690600, г. Влад! сток, ГСП, пр. Острякова, 2)

Автореферат разослан "¿У" 1999 г.

/• И в оч ^ у '

Ученый секретарь специализированного совета,

доцент Г.М. Холоденк»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Учение о рсгуляторных пептидах - междисциплинарная область знаний, охватывающая важные разделы биохимии, нормальной и патологической физиологии, эндокринологии, фармакологии и других медико-биологических дисциплин (И.П. Ашмарин, М.Ф. Обухова, 1986; Е.Д. Гольдберг. А.М. Дыгай, О.Ю. Захарова. 1990; O.A. Гомазков, 1996; Moore M.R., P.M. Black 1991; P.E. Molina, N.N. Abumrad, 1994).

Обладая чрезвычайно высокой физиологической активностью, подчас на несколько порядков превышающей аналогичное действие непептидных :оединений, регуляторные пептиды могут в зависимости от места их высвобождения осуществлять передачу сигнала от одной клетки к другой, модулировать реактивность определенных групп нейронов, стимулировать или гормозить выброс гормонов, а также, попадая в кровоток выполнять функцию эффекгорных физиологически активных агентов или модуляторов тка-кевого метаболизма (В.Г. Смагин, В.А. Виноградов, С.А. Булгаков, 1983; ЯП. Ашмарин, М.А. Каменская, 1988; Е.О. Брагин,1991; Ю.Б. Лишманов, П.Н. Маслов, 1994; GA Olson, R.D. Olson, A.J. Kastin, 1994).

Изучение рсгуляторных пептидов позволяет расширить представления э способах управления физиологическими функциями. Многие из привычных классических представлений о нейрогуморальных факторах, участвующее в медиаторной или гормональной миссии подверглись пересмотру с тоявлением нового класса этих биологически активных веществ - более разнообразных по своей химической организации, лабильных в химической эдмбинаторике, способных благодаря этим свойствам участвовать в органи-!ации целых регуляторно-функциональных сетей (И. П. Ашмарин, 1987).

Достижения в области молекулярной биологии и физиологии в последние годы во многом связаны с расшифровкой механизма действия регу-гагорных пептидов. Состояние современной пептидной химии открыло пер-шективы создания на основе эндогенных веществ препаратов с заданными :войствами. Практическая сторона проблемы во многом ускорила всесто-юннее изучение свойств рсгуляторных пептидов. Семейство опиатов самое ■шогочисленное среди рсгуляторных пептидов. В настоящее время они и их :интетические аналоги оценивают как потенциальные факторы коррекции шличных патологических процессов. Синтетический аналог лей-(нксфалина - даларгин на сегодняшний день оценивается как один из наибо-iee эффективных противоязвенных препаратов (В.А. Виноградов, В.М. По-юнекий, 1986). Наблюдается расширение показаний к его клиническому 1рименению (Ю.Б. Лишманов, JI.H. Маслов, 1994; H.H. Михайлов, В.Д. Сле-шпкин, 1995). Изучение аналогов, не обладающих сродством к опиатным юцепторам, проведено недостаточно. Один из представителей данной группы веществ является неоплатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ).

В 1981 году семейство ошюидных пептидов пополнилось новым I сом - дерморфинами, обладающими высоким сродством к ц-рсцептс Уникальная химическая структура (наличие правовращающей амином ты), высокая биологическая активность послужили толчком для созд ряда синтетических аналогов дерморфина, некоторые из которых испо; ются в нашей работе.

Цель н задачи исследования. Цель исследования состояла в вьи нии характера влияния синтетических аналогов дерморфина (А-10, седа и неоплатного аналога лей-энкефалина на процессы клеточного деления телиальных тканей белых крыс в хроническом эксперименте при класс ском - внутрибрюшинном методе введения и, весьма перспективном, -траназальном способе введения. Для достижения этой цели были сформ рованы следующие задачи:

1. Изучить характер влияния синтетического аналога дерморфина / являющегося суперселективным агонистом ц-рецепторов, на проц пролиферации эпителиальных тканей белых крыс в хроническом Э1 рименте при внутрибрюшинном и интраназальном методах введения

2. Изучить характер влияния синтетического аналога дерморфина се; на, являющегося смешанным агонистом р.- и 5-опиатных рецепторо процессы пролиферации эпителиальных тканей белых крыс в хрог ском эксперименте при внутрибрюшинном и интраназальном мет введения.

3. Изучить характер влияния неогшатного аналога лей-энкефалина на цессы пролиферации эпителиальных тканей белых крыс в хроничо эксперименте при внутрибрюшинном и интраназальном методах в] ния.

4. Изучить некоторые биохимические и эндокринные механизмы вли исследуемых пептидов на процессы клеточного деления.

Научная иовизпа работы. Впервые установлено в хроническом перименте, что синтетический аналог дерморфина - А-10, являющийа перселективным агонистом ц-рецепторов, вызывает угнетение проли(} Т1шных процессов в эктодермальном эпителии роговицы и языка б; крыс. В эпителии фундального отдела желудка, имеющего энгодермал происхождение как агонисты ц-рецепторов, так и смешанные (х- 6-агон: вызывают стимуляцию пролиферативных процессов. На основании сс венных данных и сведений литературы показана высокая эффективн интраназалыгого способа введения исследуемых аналогов дерморфин процессы клеточной пролиферации, сравнимая с внутрибрюшинным дом введешы. Данные проведенных исследований свидетельствуют о с;

гвовании сложных взаимосвязей между сродством опиатных пептидов к ц-ли 8-рецепторам и характером реакции процессов клеточного деления. Эти :обенности должны учитываться не только в теоретическом аспекте, но и ри исследованиях направленных на клиническое применение этих соедине-!Ш в качестве лекарственных препаратов.

Теоретическая п практическая значимость работы. Аналоги, соз-шные в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра АМН, проходят в настоящее время стадию доклинического исследования, читывал активную вовлеченность опиатов в регуляцию процессов клеточ-эго деления, изучение характера влияния аналогов дерморфина и лей-тефалина на процессы пролиферации имеет существенное теоретическое, 1к и прикладное значение. Дифференцированный характер реакции процес->в пролиферации на лиганды различных субпопуляций опиатных рецепто-зв, изучение реакции процессов клеточного деления на исследуемые веще-ва существенно расширит наши представления о регуляции клеточного :ления.

Особенностью настоящей работы является то обстоятельство, что леющиеся в литературе сведения о характере влияния нейропептидов на эоцессы клеточного деления ограничиваются оценкой однократного или шторного (5 кратного) введения. Между7 тем в клинических условиях при-;няется курсовой метод введения (21 и более дней). В литературе имеются едения, что к целому ряду эффектов опиатов наблюдается толерантность 1.Г. Смаган, В. А. Виноградов, С.А. Булгаков, 1983), поэтому априорно ре-[ггь вопрос о характере влияния исследуемых нами пептидов на процессы еточной пролиферации при хроническом воздействии не представляется зможным.

Интраназальная система доставки лекарственных препаратов приоб-тает в последнее время все большую популярность, особенно для опреде-нного класса фармакологических соединений. Речь идет, прежде всего, о птидах, среди которых можно выделить большое количество веществ, [сгощих важное значение для лечения целого ряда сложных заболеваний, когие из этих соединений проходят стад1по доклинических испытаний, и лученные данные позволят уточнить спектр изучаемых аналогов дермор-[на и НАЛЭ, их побочные эффекты, показания и противопоказания.

Учитывая все выше изложенное, данное исследование, существенно :; ширяет границы наших представлений о регуляции клеточного деления и оадывает возможность модулирования пролиферации в тканях при раз-чных методах введения лигандов опиатных рецепторов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Синтетический аналог дерморфина, являющийся суперселективн агонистом ц-опиатных рецепторов вызывает при хроническом в дешш угнетение пролиферативных процессов в эпителии роговищ языка белых крыс.

2. Синтетический аналог, имеющий сродство как к ц- так и 5-опи ным рецепторам вызывает при хроническом введении стимуляц процессов клеточного деления в эпителии роговицы и языка бел крыс.

3. В эпителии слизистой оболочки желудка оба исследуемых анал вызывали увеличение пролиферативного пула клйок.

4. Хроническое интраназальное введение синтетических аналогов д морфина показало высокую эффективность доставки в организм д ной группы регулягорных пептидов, сравнимую с их внутрибр шинным методом введения при действии на пролиферативные п цессы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации бьгш до жены и обсуждены на объединенном заседании ЦНИИ, кафедр гистолог патологической физиологии Дальневосточного государственного медищ ского университета и лаборатории морфологии ИОМиД СО РАМН, док дывались на II и III съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных раб из них 1 в центральной печати.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав (обз( литературы, описания материала и методов исследования и трех глав, пр ставляющих результаты собственных исследований), обсуждение, вывод практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на : листах машинописного текста и содержит 29 таблиц, 7 рисунков. Указан литературы включает 170 работ отечественных авторов и 162 зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал н методы исследования. В данной работе мы предприняли эпытку выяснить характер влияния синтетических аналогов дерморфина и :опиатного аналога лей-энкефалина на процессы клеточной пролиферации длительном эксперименте, так как в клинической практике, как правило, рименяется курсовое введении нейропептидов. Были использованы вещест-1, любезно предоставленные нам лабораторией синтеза пептидов Кардиоло-неского намного центра (зав. лабораторией профессор М.И. Титов г. Мо-сва). Пегггиды получили условные названия в лаборатории и имели сле-,тощие структурные формулы:

"А-10" - H - Туг - D - Orn - Phe - Gly - ОН "Седатин" -Н - Arg - Туг - D - Ala -Phe - Glv - ОН "НАЛЭ" - Phe - D - Ala - Glu - Phe - Leu - Arg

Все выбранные вещества синтезированы и прошли всестороннюю про-:рку в лаборатории к.м.н. Е.П. Яровой. Результаты этого исследования ус-1новили, что А-10 является суперагонистом ц-рецепторов, а седатин сме-анный агонист как ц-, так и 5-рецепторов. НАЛЭ не обладает сродством к шатным рецепторам. В качестве объекта исследования были выбраны эпн-:лиальные ткани роговицы, языка и фундалыюго отдела желудка белых )ыс. Исследуемые пептиды вводились двумя способами: классическим птрибрюшинным и редко используемым, но интенсивно изучаемым, как шболее простой метод доставки лекарственных препаратов - интраназать->ш методом. Животным контрольной группы, таким же образом вводился 9 % раствор хлорида натрия. Кроме этого имелась группа интактных жи->тных не подвергавшаяся каким-либо воздействиям. Всего в опытах было действовано 380 животных. Продолжительность эксперимента составила i день.

Эвтаназию осуществляли посредством декапитацшг предварительно оголенных крыс. За 1 час до забоя крысам внутрибрюшинно вводили 3Н-[мидин с удельной активностью 1530 ТБк/моль в дозе 0,6 мкКи/г. На рого-щу дополнительно апплицировали 2 мкКи 3Н-тимидина. Процессы клеточ->го деления изучали через 24 часа после заключительной инъекции пепти-

IB.

Для изучения синтеза ДНК использовали авторадиографию с 3Н-[мидином. При подготовке радиоавтографов срезы тканей на предметных еклах депарафинировали и покрывали эм\гльсией НИИХИМФОТО. После спозиции препараты проявляли слабоконтрастным проявителем Д-19, псс1фовали 33 % раствором гипосульфита натрия, промывали проточной дон и окрашивали гематоксилином Лилли-Майера.

Используя сетку окуляра, на препаратах подсчитывали количество : ченных клеток по отношению ко всей клеточной популяции и, таким об зом, определяли процентное соотношение (ИМЯ). Среднее количество зе] над 50 меченными клетками считали за интенсивность метки (ИМ). Опре ление ИМЯ в роговице, языке и желудке производили в генеративных 301 на основании просмотра 2,5 - 3 тыс. клеток. Полученные тотальные пре. раты роговицы служили для подсчета митотического индекса (МИ) - от: шеши числа делящихся клеток к общему числу клеток, который выражал промилле (%о). Просматривали не менее 20 - 30 тыс. клеток. Подсчет ми зов осуществляли дифференцировано по фазам.

Для определения биохимических показателей применялись унифици ванные методики, принятые в ЦНИИ.

Содержание гидроперекисей липидов в плазме крови определяли си трофотометрически по модифицированной методике В.Б. Гаврилова, М Мишкорудной (1983). Определение токоферолов в сыворотке произвол! флюориметричесим методов в этанольном экстракте по методике Z.D. Н sen,W.T. Wariorick(1966).

Содержание катехоламинов (адреналина и норадреналина) в тка] надпочечников определяли унифицированным методом по Э.Ш. Матлин З.М. Киселевой, И.Э. Софиевой (Цит. по: В.В. Меньшиков, 1974).

При исследовании содержания серотонина и гистамина в тканях ф; дального отдела желудка пользовались флюориметрическим определен!: по метод\' В.Н. Сошшского и соавт., 1982.

Содержание тиреоидных гормонов (Т3, Т4,) определяли радиои.мм; ным методом при помощи стандартных наборов. Подсчет производится счетчике ГАММА - 800.

Для каэвдой серии опытов определяли средние значения показател Данные опытных, контрольных и интакгной групп подвергали статисти ской обработке по Стьюденту (П.Ф. Рокитский, 1967). Различия считали д товерными при Р<0,05. Использовали также методику определи "выскакивающих" вариант по критершо Шовене (Д. А. Сепелиеев, 196 Статистическою обработку материала проводили на ПЭВМ Próxima FC 5/] с применением пакета прикладных программ "STATISTICA" (В.П. Боро: ков, 1998).

Результаты собственных исследований

В первой серии экспериментов вещества вводили внутрибрюшинно, з расчета 10 мкг/кг массы животного, в правую область передней брюшной генки.

Изучение гравиметрзгческих показателей показало, что ежедневная нъекция изотонического раствора хлорида натрия приводила к снижению 5щей и среднесуточной прибавки массы в 1,4 раза по сравнению с интакт-ыми животными. По-видимому, это обусловлено стрессорньш эффектом, лзванным инъекцией КаС1. Это совпадает с данными П.Д. Горизонтова и .Н. Протасовой (1968). Введение синтетических аналогов дерморфина А-10 седатина ликвидировало отставание прибавки массы животных. Мы оце-юаем это как проявление антнстрессорного действия, присущего огаюид-ам пептидам. НАЛЭ данной способностью не обладал (таблица 1).

Таблица 1

(лияние хронического внутрибрюшинного введения исследуемых аналогов на изменение прибавки массы тела белых крыс в г.

(X ± тх).

Группа животных Прибавка массы

Общая Суточная

Контроль 43,33 ±3,33" 2,06 ±0,16"

Опыт (А-10) 56,88 ±4,62* 2,71 ±0,22*

Опьгг (седатин) 55,00 ±3,44* 2,62 ±0,16*

Опыт (НАЛЭ) 47,50 ± 1,89" 2,26 ±0,09"

Интактные 60,00 ±3,42 2,86 ±0,16

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

Влияние синтетических аналогов дерморфина и лей-энкефалина ирщессы клеточного деления в исследуемых эпителиях белых крыс и внитрибрюшинном введении. Результаты исследования процессов про-ферации под влиянием введения суперселективного агониста ц,- опиатных цепторов А-10 свидетельствуют, что в эпителии роговицы крыс ИМЯ еныпился в 1,8 раза, по сравнению с контролем и в 1,7 раза, по сравнению интактной группой. МИ при этом увеличился в 2,1 раза и 1,1 раза соответ-

ственно. ИМ, характеризующая скорость синтеза ДНК, также уменьшает а 1,4 и в 1,6 раза. Направленность реакции совпадает с данными, полученн ми при введении дерморфина (М.И. Радавоз, 1991) и данными М.1 Флейшман (1996). Однако в этих исследованиях снижения интенсивное метки не отмечалось. Результаты данного эксперимента представлены в тг шще 2.

Таблица 2

Влияние хронического внутрибрюшинного введения А-10 на процессы кл точного делешм в исследуемых эгаггелиях белых крыс.

Группа животных МИ, %о (Х±шх) ИМЯ, %, (Х±шх) ИМ (Х±шх)

Роговица

Контроль 4,52 ±0,84 8,41 ±0,42 20,06 ± 1,45

Опыт (А-10) 9,57 ±0,82*' 4,63 ±0,14*" 14,17 ±0,82*"

Интактная 5,32 ±0,49 7,83 ± 0,27 23,01 ±2,62

Язык

Контроль - 8,37 ±0,82 22,55 ± 2,42

Опыт (А-10) - 3,88 ±0,26*" 20,391 1,15

Интактная - 7,17 ±0,53 21,56 ±1,26

Желудок

Контроль - 4,68+0,13 15,03 ±0,43"

Опьгг (А-10) - 12,40 ±0,14*" 15,60 ± 1,02'

Интактные - 5,44 ±0,26 12,70 ±0,21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

При изучении влияния синтетического аналога дерморфина А-10 клеточное деление в эпителии языка были получены следующие данн Под влиянием пептида, ИМЯ уменьшился в 2,2 раза по сравнению с конт лем и в 1,9 раза, по сравнению с интакгными животными. ИМ в эпите; языка при этом не претерпевала значимых изменений.

Состояние пролиферативных процессов в эпителии желудка оцени ли на основании показателей синтеза ДНК (ИМЯ и ИМ) в виду кратков менности митоза, малочисленности митотических фигур и затрудненно идентификации профаз. Введение А-10 вызывало увеличение ИМЯ в раза, по сравнению с контролем и в 2,3 раза, по сравнению с интактньп

ивотными. ИМ при этом несколько возрастала, по сравнению с интактны-и крысами.

Таким образом, хроническое внутрибрюшиннос введение исследуемо» аналога А-10 , в эпителии роговицы и языка, являющихся производными стодермы, вызывало угнетение пролиферативных процессов. В эпителии ундального отдела желудка, имеющего энтодермальнос происхождение, 1нный аналог вызыват увеличение пролиферативното ш ла клеток.

Синтетический аналог, условно обозначенный как седатин, наряду с лсокой способностью связываться с ц-рецепторами, обладает достаточно лсоким сродством к 6-рсцспторам. Хроническое внулрибрюшинное введете седатина привело к стимуляции процессов синтеза ДНК в эпителии ро-)вицы. Об этом свидетельствует увеличение ИМЯ в опытной группе в 1,5 1за по сравнению с контролем, и в 1,6 раза по сравнению с интактными жирными (таблица 3).

Соотношение фаз митоза в эпителии роговицы выявило уменьшение пичества метафаз в 1,2 и 1,3 раза, на фоне увеличения процентного соот->шения профаз в 1,3 и 1,7 раза по сравнению с контрольными и интактны-II животными. На наш взгляд это свидетельствует об ускорении прохожде-м клетками митоза. ИЛ/1 не претерпевала существенных сдвигов.

Реакция пролиферативных процессов в эпителии языка при введении датина, как видно из представленной таблицы, по своей направленности не личалась от реакшш полученной в эпителии роговицы. Введение седатина аудировало увеличение ИМЯ в 1,6 раза по сравнению с контролем, и в 1,9 1за по сравнению с интактной группой. ИМ достоверно не изменялась.

В фундальном отделе желудка седатин также привози к усилению юцессов пролиферации. ИМЯ увеличивался в 2,6 раза по сравнению с кон-юлем, и в 2,2 раза по сравнению с интактной группой. ИМ оставалась ста-оьной.

Таким образом, оба синтетических аналога дерморфина в энтодер-1льном эпителии фундатьного отдела желудка активировали пролифера-[вный пул клеток.

Таблица 3

Влияние хронического внутрибрюшинного введения седатина на процессы клеточного деления в исследуемых эпителиях белых крыс.

Группа животных МИ, %о (Х±тх) ИМЯ, %, (Х±тх) ИМ (Х±тх)

Роговица

Контроль 4,52 + 0,84 8,41 ±0,42 20,06± 1,45

Опыт (седатин) 2,49 ±0,37*" 12,63 ±0,34*" 18,50 ±0,34'

Интактная 5,32 ±0,49 7,83 ±0,27 23,01 ±2,62

Язык

Контроль - 8,37 ±0,82 22,55 ± 2,42

Опыт (седатин) - 13,52 ±0,26*" 23,59 ±1,15

Интактная - 7,17 ±0,53 21,56 ±1,26

Желудок

Контроль - 4,68 ±0,13 15,03 ±0,43"

Опыт (седатин) - 12,10 ±0,55*" 14,80 ±0,74

Интактные - 5.44 ±0,26 12,70 ±0,21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

При анализе влияния опиоидных пептидов на процессы клеточнс деления закономерно встает вопрос о соотношении непосредственного опосредованного эффекта. Для решения этого вопроса наряд}- с лиганда опиатных рецепторов нами было взято вещество, которое утратило сродст к оииатным рецепторам (НАЛЭ). Результаты этой части эксперимента пр< ставлены в таблице 4.

Влияние неопиатного аналога лей-энкефалина не вызывало статшг чески значимых изменений пролиферативных процессов в исследуемых Э1 телиях. В то время как опиатный аналог лей-энкефалина (даларгин) оказы ет стимулирующее влияние на клеточное деление в эпителии роговицы, я: ка и желудка (Т.Д. Панькова, 1992).

Таблица 4

Влияние хронического внутрибрюшинного введения НАЛЭ на процессы клеточного деления в исследуемых эпителиях белых крыс.

Группа животных МИ, %о(Х±шх) ИМЯ, %, (Х±тх) ИМ (Х±тх)

Роговица

Контроль 4,52 ±0,84 8,41 ±0,42 20,06± 1,45

Опыт (НАЛЭ) 5,15 ±0,64 8,50 ±0,19 20,24 ± 1,13

Интактная 5,32 ±0,49 7,83 ±0,27 23,01 ±2,62

Язык

Контроль - 8,37 ±0,82 22,55 ±2,42

Опыт (НАЛЭ) - 7,28 ±0,26 22,31 ±0,74

Интактная - 7,17 ±0,53 21,56 ±1,26

Желудок

Контроль - 4,68 ±0,13 15,03 ±0,43"

Опьгг (НАЛЭ) - 4,70 ±0,17 13,74 ±0,74

Интактные - 5,44 ±0,26 12,70 ±0,21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

Наши исследования и результаты опытов с введением данных анадо->в дерморфина на фоне блокатора опиатных рецепторов налоксона, провеянные в ЦНИЛ совместно с М.Ю. Флейшман (1996) дают основание счи-1ть, что реализация эффектов этих пептидов на пролиферацию опссредуют-I через опиатные рецепторы.

Вторая часть нашей работы была посвящена изучению влияния ис-эльзуемых нами веществ, вводимых интраназально. Интраназатьный спо-)б введения регудяторных пептидов весьма удобен для клинического при-енения и в настоящее время интенсивно изучается (A.A. Каменский и coït., 1988; Л.С. Червова и соавт., 1992; О.С. Гладышева и соавт., 1994). Ин-)аназальное введение осуществлялось в дозе 10 мкг/кг веса животного при змощи спещтльного наконечника, надеваемого на микропипетку.

Изучение гравиметрических показателей выявило статистически дос-шерную способность изотонического раствора хлорида натрия к снижению >щей и суточной прибавки массы в 1,3 раза по сравнению с интактными

животными. Интраназально вводимые аналоги дерморфина А-10 и седат: нормализовали прибавку массы у подопытных животных, которая почти отличалась от таковой у интактных крыс (таблица 5).

Таблица 5

Влияние хронического инграназального введения исследуемых аналогов ь изменение прибавки массы тела белых крыс в г. (Х±шх)

Группа животных Прибавка массы

Общая Суточная

Контроль 46,67 ±2,11" 2,22 + 0,10"

Опыт (А-10) 56,11 ±4,70 2,67 ±0,22

Опыт (седатин) 58,75 ±4,88* 2,58+0,23

Опыт (НАЛЭ) 56,75 ±3,63* 2,67 ±0,17*

Интактные 60,00 ±3,42 2,86 ±0,16

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

В отличие от внутрибрюшинного способа введения у животных, г лучавших интраназально НАЛЭ, наблюдалась способность пептида преш ствовать падению прибавки массы, имевшей место у крыс контрольн группы. Эти данные иллюстрируют возможные отличия, описанные ряд авторов при интраназачьном и внутрибрюшинном методах введения (ЕЛ Батурина и соавт., 1988). Выяснение этого вопроса требует дополнительм экспериментов и выходит за рамки нашей работы.

Влияние синтетических аналогов дерморфина и ле энкефалина на процессы клеточного деления в исследуемых эпители белых крыс при интраназалъном введении.

Результаты исследования процессов пролиферации при интраназа" ном введении А-10 показывают (таблица 6) достоверное уменьшение ИШ! роговице крыс в 1,2 раза по сравнению с контрольной группой ив 1,4 ра по сравнению с интактными животными. МИ при этом уменьшается в 1," 1,4 раза соответственно. Интенсивность метки, характеризующая скорос синтеза ДНК уменьшилась в 1,7 раза по сравнению с контролем ив 1,6 рс по сравнению с интактными животными. Соотношение фаз митоза: колич

во метафаз - увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем и в 1,9 раза, I сравнению с интактными крысами. Уровень профаз в подопытной группе 1еныпается почти в 2 раза. Все это свидетельствует о растяжке митоза во вмени, причем полученные данные полностью коррелируют с результата-I внутрибрюшинного введения А-10.

Изучение процессов клеточного деления в слизистой оболочке языка >д влиянием интраназально введенного пептида А-10 также показало его гсокую активность. ИМЯ в подопытной группе уменьшился в 1,4 раза по йвнению с контролем ив 1,5 раза, по сравнению с интактными животны-л. ИМ при этом не изменялась.

Интраназальное введение А-10 в энтодермальном эпителии желудка шводило к увеличению пролиферативного пула клеток. Так ИМЯ увели-ося в 1,6 раза по сравнению с контролем и в 2 раза, по сравнению с ин-ктными крысами. ИМ возросла в 1,8 раза по сравнению с интактной груп-)й животных.

Таблица 6

¡лияние хронического инграназального введения А-10 на процессы клеточного деления в исследуемых эпителиях белых крыс.

Группа животных МИ, %о (Х±шх) ИМЯ, %, (Х±шх) ИМ (Х±шх)

Роговица

Контроль 4.28+0,51 7,05 ±0,19 23.48 ±0.97

Эпьгг (А-10) 7,16 + 0,38* 5,82 + 0,22* 14.18 ±1.00*"

йнтактная 5,32 + 0,49 7,83 ± 0.27 23.01 ±2.62

Язык

Контроль - 6,64 ±0,24 19,46 ±2,72

Эпыт (А-10) I 4.88 ±0,17*" 18,63+3,10

йнтактная | 7,17 ±0,53 21.56 ±1,26

Желудок

Контроль - 7,14 ±0,73" 21.03 ± 1.56я

Эпыт (А-10) - 10,92 ±0,71*" 23.16 ±2.00"

Инлактные - 5,44 ± 0.26 12,70 ±0,21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

Таким образом, интраназальное введение пептида А-10 в эпителии ро-)В1щы и языка вызывало угнетение пролиферативных процессов, а в эпитета фундального отдела желудка увеличение пролиферативного пула кте-ж. Сходную реакцию мы наблюдали и при внутрибрюшинном введении гого аналога.

Хроническое интраназальное введение смешанного ц-5- агониста датина приводило к выраженной стимуляции процессов синтеза ДНК в э телии роговицы крыс (таблица 7). Об этом свидетельствует увеличение И1 в 1,3 раза по сравнению с контролем и в 1,2 раза, по сравнению с интают ми животными. На этом фоне МИ уменьшался в 1,5 и 1,8 раза соответств но. Данные изменения мы трактуем как ускорение прохождения клетка митоза. Соотношение фаз митоза показало почти двукратное уменьши метафаз (24,94%), при увеличении удельного веса профаз (53,54%).

Таблица 7

Влияние хронического интраназального введения седатина на процессы ю точного деления в исследуемых эпителиях белых крыс.

Группа животных МИ, %о (Х±шх) ИМЯ, %, (Х±шх) ИМ (Х±тх)

Роговица

Контроль 4,28 ±0,51 7,05 ±0,19 23,48 ±0,97

Опыт (седатин)) 2,92 ±0,26*" 9,37 ±0,26*" 19,16 ±1,55*

Интактная 5,32 ±0,49 7,83 ±0,27 23,01 ±2,62

Язык

Контроль - 6,64 ± 0,24 19,46 ±2,72

Опыт (седатин) - 14,21 ±0,72*" 23,23 ± 1,55

Интактная - 7,17 + 0,53 21,56 ±1,26

Желудок

Контроль _ 7,14 ±0,73" 21.03 ± 1.56"

Опыт (седатин) - 13,02 ±0,52*" 26,21 ±1,92"

Интактные - 5,44 ±0,26 12,70 ± 0,21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

В эпителии слизистой оболочки языка введение седатина также ин; цировало увеличение пролиферативного пула. ИМЯ возрастает более чем з раза, как по сравнению с контролем, так и по сравнению с интакгными я вотными. ИМ при этом оставалась стабильной.

Состояние процессов клеточной пролиферации в слизистой фунда; ного отдела желудка характеризуется активацией синтеза ДНК. Так РЖ увеличился в 1,8 раза по сравнению с контролем и в 2,4 раза, по сравнении интакгными животными. ИМ при этом также возросла в 1,5 и 2 раза соотв< ственно.

Таким образом, можно заключить, что данный аналог проявляет вы-экую активность при интраназальном введешга. Причем как в эпителии эговицы, так и в эпителии языка, так и эпителии фундального отдела же-рдка процессы клеточной пролиферации идут однонаправлено.

В следующей серш! экспериментов была поставлена цель изучить тияние неопиатного аналога лей-энкефалина (НАЛЭ) при интраназальном зедении на процессы клеточного деления в исследуемых эпителиях. Полу-гнные результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Влияние хронического интраназатьного введения НАЛЭ на процессы клеточного деления в исследуемых эпителиях белых крыс.

Группа ■кивотных МИ, %о (Х±тх) ИМЯ, %, (Х±тх) ИМ (Х±тх)

Роговица

Контроль 4,28 ±0,51 7,05 ±0,19 23,48± 0,97

Эпыт (НАЛЭ) 3,89 ±0,66 6,94 + 0,24" 18,67 ± 1,00*

^нтактная 5,32 ±0,49 7.83 ±0.27 23,01 ±2,62

Язык

контроль - 6,64 ± 0,24 19,46 ±2,72

Эпыт (НАЛЭ) - 7,21 ±0,32 23.08 +1,93

-1нтактная - 7,17 ±0,53 21,56 ±1,26

Желудок

Сонтроль - 7,14 ±0,73" 21,12 ± 1,56"

Эпыт (НАЛЭ) - 7,70 ±0,10° 22,40 ± 1,82"

-Гнтактные - 5,44+0,26 12.70 ±0.21

Примечание: *- отличие от контроля при Р < 0,05

отличие от интактных при Р < 0,05

ИМЯ в эпителии роговицы под влиянием НАЛЭ имел тенденцию к значительному снижению, как по сравнению с контролем, так и по срав-нию с интактными животными. МИ при этом также снижался. Соотноше-;е фаз митоза приближалось к таковому у контрольных крыс.

Картина, отражающая процессы клеточного деления в слизистой обо-чке языка не имела статистически достоверных изменений. ИМЯ не отлился от такового в контрольной и интакгной группе животных. ИМ, имела иденцгао к увеличению по сравнению с показателем контроля.

При изучении процессов пролиферации в энтодермальном эпител фундального отдела желудка мы не наблюдали изменений по сравненш контролем, но в сравнении с интактной группой животных полученные i казатели отличались: ИМЯ увеличивался в 1,4 раза, ИМ в 1,8 раза.

Таким образом, эффект на процессы пролиферации исследуемого ai лога (НАЛЭ) при интраназальном введении практически был не выраже! фактически не отличался от результатов, полученных при внутрибркшп ном введении НАЛЭ. Все это еще раз подтверждает высказанную на мысль, что эффекты А-10, седатина на процессы пролиферации опосредуя ся через опиатные рецепторы, независимо от метода введении исследуем аналогов.

Анализ некоторых механизмов влияния синтетических т логов дерморфина и НАЛЭ на процессы клеточной пролиферации в i следуемых эпителиях белых крыс.

Действуя в низких концентрациях лиганды опиатных рецепторов i зывают в организме широкий спектр нейроэвдокринных взаимодейств) запускающий целые каскады регуляторных реакций, многие из которых j гут быть потенциальными регуляторами клеточного деления (В.Г. Смап В.А. Виноградов, С.А. Булгаков, 1983; Ю.Б. Лишманов, Л.Н. Маслов,199 Действуя в тесном нейроэндокринном контексте, они сами по себе способ оказать существенное влияние на пролиферативные процессы. По этой п] чине мы сочли необходимым исследовать изменение некоторых эндокр] ных показателей, продуктов перекисного окисления липидов, а также бал са местных биологически активных веществ.

Так, проведя количественное изучение гормонов адреналина и : радреналина в ткани надпочечников, была выявлена следующая законом' ность. Введение контрольным животным 0,9 % раствора хлорида нат£ приводило к выраженному уменьшению исследуемых гормонов в ткани i гана в 1,7 и 2 раза при внутрибрюшинном введении и в 1,5 и 1,4 раза i интраназальном способе введения. Согласно общепринятым представлени (Т.Н. Кассиль, Э.Ш. Матлина, 1973; Н. Imura et al., 1984; Sudo Ayako, 19 Y. Takeniro et al.; F.I. Furduy, S.P. Russu, 1991), усиленная секреция кате: ламинов при стрессе сопровождается снижением их концентрации в моз вом слое надпочечников и накоплением в сердце, печени, почках и друт органах. Таким образом, эти результаты являются прямым подтвержден» представлений о том, что введение в организм белых крыс изотоническ< раствора хлорида натрия вызывает у животных хронический стресс.

Хроническое введение селективного ц-агониста А-10 в течение 21 i к концу эксперимента привело к нормализации содержания адреналин: норадреналина в ткани надпочечных желез крыс. Концентрация катехола?

эв фактически не отличалась от показателей у интактных животных. Вве-;ние смешанного атониста ц-5-рецепторов - седатина вызьтает анатогич-ые изменения. Применение НАЛЭ имело такую же тенденцию, но данные лли статистически не достоверны.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что в отли-те от дифференцированной реакции процессов клеточного деления на вве-;ние различных атонистов опиатных рецепторов и НАЛЭ, изменения со ороны гормонов мозгового слоя надпочечников носили однонаправлен->ш, антистрессорный характер. Аргументами в пользу высказанных сужде-ш могут служить так же сведения литературы о способности опиоидных яггидов ингибировать высвобождение катехоламинов из изолированных геток мозгового вещества надпочечников (Р. Вокха е1 а1., 1982; Ь. 5а1аш, А. шс!оШ, 1982) и, кроме того, данные Ю.Б. Лишманова и Л.Н. Маслова 994), свидетельствующие о супрессирующем влиянии энкефалинов на ак-[вность симпатико-адреналовой системы.

Полученные нами данные являются еще одним косвенным свидетель-вом в пользу того, что изменения нейроэндокринного контекста играют помогательную роль в реализации эффектов опиатов на клеточное деле-1е. Несмотря на однонаправленный эффект исследуемых аналогов на хон-ипрашпо катехоламинов в надпочечниках, на процессы пролиферации эти птиды оказывали различное влияние. Это положение нашло подгвержде-[е в последующих экспериментах.

Учитывая особую роль гистамина и серотонина в регу ляции физиоло-ческих процессов в желудке, представляло интерес изучить концентрацию их биогенных аминов в тканях желудка экспериментальных животных. Не ютря на то, что анатоги дерморфина оказывали на процессы пролиферации желудке однотипную реакцию, со стороны изучаемых биохимических по-зателей этого не наблюдалось. Введение седатина, как внутрибрюшинное, к и интраназатьное, приводило к почти двукратному снижению гистамина к по сравнению с контролем, так и по сравнению с ингактными животны-[. Количество серотонина таюке снижалось, но данные не были статисти-ски достоверны. Введение суперселективного агониста ц-рецепторов А-10 прхгоодило к подобном^' эффекту1. По-видимому, снижение гистамина в ани желудка опосредз ется через 8-рецепторы, количество которых в же-дке преобладает (П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, 1987).

Изучение гормоноиродущфлтощей (функции щитовидной железы при гдении исследуемых аналогов выявило, что А-10, седатин и 0,9 % раствор орида натрия приводят к достоверному снижению трийодтиронина (Т3). В время как НАЛЭ практически не изменяет количества этого гормона, по авнению с интактной группой животных. Анализируя количество тирок-

сина (Т4),можно выделить способность А-10 и ссдатина сохранять его ко чество в пределах цифр интакгной группы. Все вьпне перечисленное со ветствует как для Енутрибрюшинного, так и для интраназального введе] пептидов.

Достаточно глубокая проработка имеющейся в нашем распоряж-ei литературы, относящейся к механизмам влияния пептидов на регулятор! процессы в организме, приводит к мысли, что эти вещества выполняют : дуляторную роль в местных рефлекторных реакциях, входят как н ротрансмиттеры в структуры нервной системы и, помимо этого, могут о зьгвать свое действие паракринным способом, что не отрицается в рабо В.Г. Смагина, В.А Виноградова, С.А. Булгакова (1983) и M. Costa, J.B. I ness, I.J. lewelyn-Smith (1987).

В настоящее время большей интерес проявляется к поиску препара для коррекции процессов перекисного окисления дипвдов (ПОЛ) в орган ме (В.Н. Ушкалова и соавт., 1993). В своей работе мы не могли обойти с роной столь важную проблему. Все исследуемые аналоги в той или m степени вызывали активацию процессов ПОЛ не зависимо от метода вве ния. Об этом свидетельствует увеличение концентрации гидроперекн липидов (ГП), малонового диальдегида (МДА) и снижение общих лили; (ОЛ) в сыворотке крови. В то же время все исследуемые вещества привод! к активации антиоксидантной защиты (АОЗ).

Способность опиатов угнетать систему ПОЛ и активировать АОЗ вестна. Возможно, это определяется не сродством к тем или иным опиата рецепторам, а индивидуальным свойством этой группы веществ. Этот прос выходит за рамки данной работы и требует своего дальнейшего peí ния. Хочется отметить, что среди исследу емых аналогов, наибольшей с собностью активировать АОЗ обладал седатин. Количество алы токоферола при введении седатина увеличивалось в 3 раза по сравненш интактными крысами, и 1,5 раза по сравнению с другими эксперимента ными группами. Возможно, на определенных стадиях репаративного npoii са целесообразно применять пептиды, аналогичные седатину. Предварите ная информация у нас на этот счет имеется, однако этот вопрос требует с его отдельного экспериментального решения.

Данные проведенных биохимических исследований могут служ косвенным доказательством непосредственного действия аналогов на п цессы клеточного деления.

Результаты настоящего исследования, а также работы выполнен! на базе ЦНИИ ДВГМУ свидетельствуют, что влияние лигандов опиатш

ецепторов имеет широкий диапазон. Нам представляется, что вовлечен-:ость опиатов в регуляцию процессов пролиферации в условиях целостного рганизма является одним из их фундаментальных свойств.

Инграназальная система доставки исследуемых аналогов показала вою высокую эффективность. Анализируя данные литерату ры можно за-лючить, что эффект имеет в своей основе не один, а несколько механизмов. ! принципе возмолшы следующие варианты: проникновение пептидов через лизистую носоглотки в кровеносные сосуды и затем к органам "мишеням", торой механизм, к настоящему времени практически не изучен, по лимфа-ическим ттям носоглотки к области гипофиза, а оттуда попадать в струк-уры ЦНС, и, наконец, третий - путем аксонального транспорта. Важно, что езультаты по влиянию пептидов на процессы клеточной пролиферации, олученные при интраназатьном введении, полностью коррелировали с дан-ыми внутрибрюшинного введения.

Таким образом, результаты данного исследования помогают объяс-шъ модулирующий характер реакции пролиферативных процессов в иссле-уемых эпителиальных тканях, расширить представления о способах управ-ения физиологическими функциями. Характер реакций зависит от пред-гавленности определенных субпопуляций опиатных рецепторов в тканях, а акже от сродства лиганда к определенному классу рецепторов.

Учитывая все выше изложенное, данное исследование расширяет гра-ицы наших представлений о регуляции клеточного деления, и закладывает озможность модулирования пролиферации в тканях при различных методах ведения лигандов опиатных рецепторов.

Выводы

Синтетический аналог дерморфина, являющийся суперселективным аго-нистом ц-опиатных рецепторов вызывает при хроническом введении угнетение пролиферативных процессов в эпителии роговицы и языка белых крыс.

Синтетический аналог, имеющий сродство как к и- так и 5-опиатным рецепторам вызывает стимуляцию процессов клеточного деления в эпителии роговицы и языка белых крыс.

В эпителии слизистой оболочки желудка оба исследуемых аналога вызывали увеличение пролиферативного пула клеток.

4. Применение неопиатного аналога лей-энкефалина (НАЛЭ) не оказь влияния на процессы клеточного деления в исследу емых эпителию позволяет думать, что выявленные эффекты опосредуются через о ные рецепторы.

5. Инграназальное введение синтетических аналогов дерморфина пок высокую эффективность доставки в организм данной группы регул ных пептидов, сравнимую с внутрибрюшинным методом введение действии на пролиферативные процессы.

Практические рекомендации

1. Результаты, полученные в данном исследовании, должны учитыват процессе создания на базе исследуемых аналогов лекарственных п ратов.

2. Полученные результаты дают возможность прогнозировать сво: вновь синтезируемых опиоидных пептидов в зависимости от сро, вещества к той или той субпопуляции опиатных рецепторов.

3. Следует шире исследовать и использовать интраназальный способ тавки лекарственных веществ пептидной природы.

Список работ, опубликованный по теме диссертации

1. М.Ю. Флейшман, A.B. Кузнецов, М.И. Радивоз и др. Влияние де{ фина и его синтетических аналогов на процессы клеточного де; эпителия белых крыс // Тез. науч. сообщений II съезда физиолога бири и Дальнего Востока, Новосибирск, 15-17 июня 1995 г.- Но бирск, 1995.-Ч.2.- С.461-462.

2. М.Ю. Флейшман, A.B. Кузнецов. Влияние синтетического аналога морфина - седатина на процессы клеточного деления эпителия с крыс // Тез. итоговой науч.- иссл. конф. КГМА, посвященной 40-л КГМА,-Кемерово, 1996,- С. 158-160.

3. A.B. Кузнецов, С.С. Тимошин. Влияние синтетического аналога морфина А-10 на процессы клеточного деления эпителия белых kj Структурно-функциональная организация органов и тканей в норм« тологии и эксперименте / Под ред. Д.В. Баженова. - Тверь: РИО TI 1996,- С.92.

4. A.B. Кузнецов, М.Ю. Флейшман. Влияние синтетических аналогов морфина на процессы клеточного деления эпителия белых кр] Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтоген норме и при воздействии антропогенных факторов / Под ред. И.Н Лунина, Р.И. Асфандиярова. - Астрахань, 1996,- С.99.