Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Цитоксическая активность естественных киллерных клеток у пациенток с первой стадией рака тела матки и ее взаимосвязь с основными прогностическими критериями заболевания

На правах рукописи

ДМИТРИЕВА Ирина Борисовна

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК У ПАЦИЕНТОК С ПЕРВОЙ СТАДИЕЙ РАКА ТЕЛА МАТКИ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ОСНОВНЫМИ ПРОГНОСТИЧЕСКИМИ КРИТЕРИЯМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2005.

Работа выполнена в отделе клинической иммунологии сектора клинического лабораторно-диагностического Федерального Государственного Учреждения Здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Наталия Михайловна Калинина

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук профессор Аза Гасановна Рахманова доктор медицинских наук профессор Наталья Борисовна Серебряная

Ведущая организация: Военно-медицинская академия С.М. Кирова

Защита диссертации состоится "3 " марта 2005 года в /3 часов на заседании диссертационного совета Д 205 001.01 в Федеральном Государственном Учреждение Здравоохранения «Всероссийский центре экстренной и радиационной медицины МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул Лебедева, 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного Учреждения Здравоохранения «Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины» МЧС России.

Автореферат разослан " Zj " февраля 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.С. Апексанин

Актуальность темы

0>686£{

Статистические данные о распространении РТМ также не являются утешительными Рак эндометрия занимает первое место в структуре онкогинекологических заболеваний в странах Европы и Северной Америки [Parkin М et al, 2001].

При раке тела матки (РТМ) особый интерес вызывают факторы естественной резистентности организма, в частности эффекгорная функция естественных киллерных клеток (NK-клеток) Опухолеассоциированные антигены, являясь продуктами собственного генома, не могут быть распознаны иммунной системой, как чужеродные и не вызывают запуска иммунного ответа [Lanier L L , 1998] Особенностью эффекторной активности NK-клеток является отсутствие связи с распознаванием антигенных детерминант Однако, данная функция рестриктирована многими другими параметрами, как самой NK-клетки, так и ее мишенью.

В настоящее время благодаря повышению качества диагностики в 75% случаев выявляется первая стадия заболевания. Чаще всего производится радикальное хирургическое вмешательство (циторедуктивное). Однако даже в первой стадии заболевания существуют различия, как в клиническом течении заболевания, так и в гистопатологических вариантах опухоли

Основными классическими прогностическими критериям РТМ являются' степень дифференцировки ткани аденокарциномы, глубина инвазии новообразования в эндометрий и стадия процесса [Бохман Я. В , 2002].

По данным литературы выявлены и другие прогностически значимые критерии течения онкологических заболеваний, как-то уровень экспрессии про- и противоапоптотических белков в клетках опухоли, экспрессия CD95 антигенов, а также степень кариотипической гетерогенности опухолевых клеток Исследования параметров врожденного и приобретенного иммунитета становятся все более актуальными ввиду доказанных механизмов взаимодействия иммунокомпетентных клеток с клетками опухоли

В работах, посвященных изучению параметров иммунитета при РТМ, некоторыми исследователями ошечается снижение цитотоксической активности NK-клеток [Венедиктова М Г. 2001].

Особый интерес представляет изучение взаимосвязи эффекторной активности NK-клеток, их количественных показателей с ведущими прогностическими критериям изучаемого заболевания, такими, как степень дифференцировки ткани аденокарциномы, глубина инвазии новообразования в эндометрий и стадия процесса. В связи с выше сказанным была сформулирована цель исследования.

Цель исследования: оценить взаимосвязь цитотоксической активности NK-клеток и их количественных характеристик с основными прогностическими критериями аденокарциномы эндометрия, степенью кариотипической гетерогенности, а также уровнем экспрессии клетками аденокарцином проапоптотических и противоапоптотических маркеров

fuc. НАЦИОНАЛЬНА* БИБЛИОТЕКА

Задачи исследования'

1 Изучить экспрессию поверхностных маркеров NK-клеток (СГ>5(Г16", CD56"16+, СТОбЧб*) периферической крови пациентов с I стадией РТМ в сопоставлении с аналогичными параметрами в группе женшин без неопластических заболеваний (группой сравнения)

2 Оценить спонтанную и индуцированную цитотоксическую активность NK-клеток у пациентов с аденокарциномами эндометрия и сопоставить ее с группой сравнения

3 Определить спонтанный и индуцированный уровни продукции JL-2, IL-6, IL-8, TNFa, TFNy мононуклеарами периферической крови (МНПК) пациентов, обследуемых групп и установить их взаимосвязь с цитотоксической активностью NK-клеток.

4 Исследовать влияние фармакопейного препарата IL2 (Ронколейкина) на эффекторную функцию NK-клеток m vitro.

5 Выявить взаимосвязь спонтанной и индуцированной цитотоксической

активности NK-клеток со стадией процесса, морфологией и гистологией аденокарцином у пациентов с I стадией РТМ.

6 Оценить относительное количество клеток аденокарцином, экспрессирующих bcl-2 и CD95 и выявить взаимосвязь полученных значений с уровнем цитотоксической активности NK-клеток.

Научная новизна:

Разработан метод определения цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной ДНК-цитометрии, обладающий воспроизводимостью, точностью, безопасностью

Разработанный метод позволил установить достоверное снижение эффекторной активности NK-клеток у пациентов с I стадией РТМ в сопоставлении с группой сравнения.

Снижение цитотоксической активности NK клеток происходит по мере повышения стадии заболевания, увеличения глубины инвазии опухоли в эндометрий и уменьшения степени дифференцировки адеиокарциномы.

Установлено, что снижение эффекторной активности NK-клеток связано с достоверным снижением субпопуляции клеток с фенотипом CD16*CD56\ обладающей высоким цитотоксическим потенциалом и увеличением субпопуляции CD16"56\ чьей основной функцией является регуляторная Выявлены достоверные корреляционные связи между уровнями спонтанной цитотоксической активности и спонтанной продукции IL2 (прямая) и IL-8 (обратная).

Подтверждена эффективность EL-2 (препарата Ронколейкин) в повышении уровня цитотоксической активности NK-клеток in vitro у пациентов с аденокарциномой эндометрия.

Практическая значимость:

Разработанный метод определения цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной ДНК-цитометрии позволяет еще в дооперационном периоде определить предположительный прогноз заболевания ft оптимизировать послеоперационный мониторинг пациентов с РТМ. Определение спонтанной и индуцированной цитотоксической активности NK-клеток позволяет выявить

потенциал цитотоксической активности клеток-эффекторов и принять своевременное решение о назначении иммуномодулирующей терапии.

Определение повышенных уровней спонтанной продукции IL-8 и TNFa позволяет предположить наличие инвазии аденокарциномы в эндометрий.

Внедрение в практику: метод исследования спонтанной цитотоксической активности NK-клеток внедрен в практику НИЛ клеточного и гуморального ВЦЭРМ МЧС России.

Положения выносимые на защиту:

1 Снижение спонтанной цитотоксической активности NK-клеток обратно умеренно коррелирует с основными прогностическими признаками РТМ' увеличением глубины инвазии, снижением степени дифференцировки и прогрессированим стадии заболевания, что позволяет рассма гривать этот параметр как дополнительный критерий прогноза РТМ.

2 Снижение спонтанной цитотоксической активности NK-клеток на фоне прогресса РТМ обусловлено преобладанием субпопуляции клеток-эффекторов с фенотипом CD16'56\

3 Прирост клеток-эффекторов с фенотипом CD16+56" в группах пациентов с 1а стадией РТМ и/или высокой степенью дифференцировки ткани аденокарцином обеспечивает поддержание референтных значений спонтанной цитотоксической активности NK-клеток в этих группах.

4 Под воздействием препарата Ронколейкин в условиях m vitro происходит повышение цитотоксической активности NK-клеюк у пациентов с I стадией РТМ до референтных значений

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены:

на VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2003»

на VIII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2004»

на объединенном иммунологическом форуме в Екатеринбурге 2004г. на семинаре «Современные лабораторные технологии» (Псков 2004 г)

Публикации: гга теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, Обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Текст диссертации проиллюстрирован таблицами и рисунками . Библиографический список включает источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В исследование были включены 41 пациент с РТМ I стадии и 15 женщин группы сравнения, не отличавшихся по возрасту и соматической патологии В группе пациентов средний возраст составил бб±6,9 лет, который достоверно не отличалося от группы сравнения Всем пациентам после проведения оперативного вмешательства диагноз был подтвержден гистологически. Все новообразования были аденокарциномами эндометрия.

Таблица 1

Характеристика группы пациентов

Стадия заболевания Степень дифференцировки аденокарциномы Глубина инвазии (мм)

С2 вз

(п=10) (п=13) ("=18)

1а п~12 (29%) 10 2 0 0±0,1

1в п=15(37%) 1 9 5 0.61±0,25

1с п=14 (34%) 0 4 10 1,53±0,26

Расширенная экстирпация матки с придатками была проведена только в 5% случаев. Во всех остальных случаях проводилась экстирпация матки с придатками Такой подход к оперативному лечению был связан с сопутствующими заболеваниями Объем оперативного вмешательства (экстирпация матки с придатками) не позволил получить информацию о наличии метастазов в региональные лимфатические узлы (Ых). Проведение полноценного ультразвукового и рентгенологических методов обследования у всех пациентов позволило исключить наличие отдаленных метастазов (Мо).

Предметом изучения явились лимфоциты периферической крови, супернатанты периферической крови, свежий послеоперационный материал (ткань аденокарцинимы).

Характеристика изученных параметров

Показатели Пациенты с РТМ (п=41) Группа сравнения (п=15)

1а стадия (п=12) 1-е стадия (и™ 15) 1-е стадия (п=-14)

Спонтанная цитотоксическая активность % 12 15 14 15

Индуцированная цитотоксическая активность % 12 15 14 15

Фенотипи [роваиие лимфоцитов

CD3 (%) 12 15 14 15

CD4 (%) 12 15 14 15

CD8 (%) 12 15 14 15

CD16 (%) 12 15 14 15

CD20 (%) 12 15 14 15

CD25 (%) 12 15 14 15

HLA-DR (%) 12 15 14 15

CD9J (%) 12 15 14 15

CD56 (%) 12 15 14 15

CD16+56- (%) 12 15 14 15

СТ>16+56+(%) 12 15 14 15

CD16-56+(%) 12 15 14 15

Супернатанты периферической крови

ШР'га спонтанная продукция пг/мл) 12 15 14 15

Г№а индуцированная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

[П^у спонтанная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

[ГОу индуцированная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

[1.-8 спонтанная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

11.-8 индуцированная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

ГЬ-6 спонтанная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

ЕЬ-6 индуцированная продукция (пг/мл) 12 15 14 15

[1.-2 спонтанная продукция (ед/мл) 12 15 14 15

1.-2 индуцированная продукция (ед/мл) 12 15 14 15

Ткань аденокарциномы

CD4S (%) 12 15 14 15

CD95 (%) 12 15 14 15

bcl-2 (%) 12 15 14 15

Количество ДНК 12 15 14 15

Всего проведено 1493 исследований, изучено 28 параметров

В работе использовалась гепаринизированная кровь Выделение мононуклеаров проводили методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Pack (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/см1 [Boyum A. 1968] Жизнеспособность клеток оценивали по окрашиванию трипамовым синим [Ланг Н Р , 1976] она составляла 95-100%

Изучение содержания ДНК и пролиферативной активности клеток аденокарцином эндометрия проведено в 41 образце Для проточно-цитометрического исследования производили забор ткани опухоли размером 0,5-0.7 см и анализировали в тот же день Получение из ткани аденокарциномы суспензии одиночных клеток осуществляли путем механической дезагрегации ткани опухолей [Coita А et а!., 1989, Ljung В -М , 1989]

Фенотипирование мононуклеаров и клеток аденокарцином осуществляли с применением проточной цитометрии, с использованием одно- и двухпараметрических флуоресцентных меток Работа велась с использованием антител, конъюгированных с FITC и направленных к маркерам CD3, CD4, CD8, CD16. CD20, CD95, CD25, HLA-DR, CD56, CD45 производства фирмы «Сорбент», Москва Кроме этого в исследованиях использовалась двойная флуоресцентная метка- anti-CD16-PE и anti-CD56-FITC аититела Во всех случаях объем вносимых антител определялся инструкциями Пробы исследовались на проточном цитофлюориметре EPICS XL (Coulter Corporation, USA) Данные анализировались с помощью программы Coulter System II.

Индукция цитокинов 0,6 мл крови и 2,4 мл кондиционированной среды перемешивали и помещали в планшет для культивирования клеток, в лунки вносили по 100 мкл исследуемого образна крови, 50 мкл RPMI 1640 и 50 мкл индукторов В качестве индукторов использовали PHA-P (Sigma) в дозе IOmki/мл (для 1Г--2), пирогенал в дозе 50мкг/мл (для TNFa, IL-8, IL-6), вирус болезни Ньюкастла с инфекционным титром 8 lg ЭИД/0,2 мл в объеме Юмкл на лунку совместно с PHA-P (Sigma) в дозе IOmki/mji (для IFNy) Культивирование проводили в С02 инкубаторе в течение 24 часов, после чего отбирали супернатанты (надосадки) клеток периферической крови и исследовали на наличие цитокинов Для определения цитокинов использовались отечественные тест-системы, производимые фирмами «Протеиновый контур»« и «Цитокин» (С.-Петербург), основанные на «сандвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента Основы метода проточной ДНК-цитометрии

В основе рассматриваемого метода лежит окраска ДНК клеток флуорохромами связывающими ДНК. В качестве связывающего флуорохрома применялся бромистый этидий. Он, как и другие ДНК связывающие красители, обладает свойством стехиометрии При этом число связанных молекул красителя пропорционально количеству ДНК и, следовательно, интенсивность его флуоресценции, регистрируемая при анализе ядерной суспензии, является количественной мерой содержания внутриклеточной ДНК Данные, полученные в результате анализа ядерной суспензии, регистрируются в виде ДНК-гистограмм

Определение спонтанной цитотоксической активности NK-клеток

В разработанном нами методе определения спонтанной цитотоксической активности принципом разделения клеток-эффекторов и мишеней служит различное содержание ДНК в клетках двух

популяций. Выявить это отличие позволяет метод проточной ДНК-цитометии [Дмитриева И.Б. и соавт., 2003].

В качестве клеток-мишеней была использована эритромиелобластоидная клеточная линия К-562, полученная из банка Института цитологии РАН Клетки линии К-562 являются стандартными клетками-мишенями для изучения спонтанной цитотоксической активности естественных киллерных клеток в условиях in vitro, поскольку они являются чувствительными к цитотоксическому воздействию нормальных киллеров.Клетки-мишени использовали для постановки эксперимента на второй день после пересева, когда они находились в стадии экспотенциапьного роста (преобладание молодых клеток) Среднее количество клеток в G1/G0, S и G2 фазах цикла составило 48,9±10,9%, 42,0±8,9 и 10,1±7,1 соответственно.Известно, что модальное числом хромосом лимфоцитов соответствует 46, а модальное число хромосом клеток К-562 соответствует 64 (согласно паспорту). Таким образом, количество ДНК в клетках культуры К-562 значительно отличается от такового в лимфоцитах.

Согласно разработанному методу [Дмитриева И Б. и соавт., 2003], выделенные мононуклеары периферической крови и клетки-мишени К-562 в соотношении 20:1 инкубировались в течение 4 часов в СОг-инкубаторе Смешанную суспензию клеток-мишеней и клеток-эффекторов обрабатывали раствором тритона, в результате чего получали суспензию ядер, мембрана, которых была повреждена Это давало возможность бромистому этвдию свободно проникнуть в ядро и окрасить нуклеиновые кислоты. Предварительное применение фермента РНК-азы позволяло быть уверенным, что окраске подвергается только ДНК.

После тщательного перемешивания пробы инкубировали в течение получаса при +4-+8\ По окончании инкубации пробы ресуспензировали и анализировали на проточном цитофлкюриметре EPICS XL (Coulter Corporation, USA) Цитометрический анализ ДНК-проб проводился с использованием FL3 фильтра в ДНК-протоколе программы System II. Для анализа полученных результатов была привлечена программа MultiCycle AV ver 3 (Phoenix Flow System).

В результате оценки ДНК-гистограммы исходной пробы гетерогенной клеточной суспензии выявляются два отдельных клеточных цикла с модальными значениями Gi, различающимися в 1,47 раза Первый пик соответствует Gi лимфоцитов с модальным числом хромосом 46, а второй пик G. соответствует клеткам К-562 с модальным числом хромосом 64.

Анализ ДНК-гистограммы смешанной клеточной суспензии после 4-х часовой инкубации также позволяет обнаружить два отдельных клеточных цикла, но по сравнению с исходной пробой выявляется снижение количества клеток К-562. Программа MultiCycle AV ver 3 позволяет провести количественную характеристику обоих клеточных циклов Спонтанная цитоточсическая активность оценивается по изменению содержания количества клеток-мишеней

С использованием новой методики нами была обследованы 15 здоровых лиц. При этом средняя величина цитотоксической активности составила 43,2±8,7%. По литературным данным средние показатели цитотоксической активности NK-клегок периферической крови здоровых лиц в методиках с использованием проточной цигометрии составляют в среднем 44±47% [Radosevjc К et ai. ¡990, Kantakamalakul W„ 2003]

Также был проведен эксперимент, позволяющий оценить воспроизводимость вновь ра ¡работанного метода С этой целью цитотоксическая активность клеток-эффекторов одного донора была оценена в 8 параллельных постановках и составила 41,5±1,2%

При исследовании индуцированной цитотоксической активности в качестве индуктора эффекторной функции NK-клеток использовался IL-2 (фармакопейный препарат Ронколейкин). Индукция осуществлялась внесением до начала инкубации 50IU IL-2 на лунку гетерогенной суспензии

Метод проточной ДНК-цитометрии был также использован для оценки количества ДНК в клетках аденокарцином Суспензия клеток аденокарцином подвергалась такой же обработке и окрашиванию как описано выше. В результате обработки полученных гистограмм определяли плоидность клеток опухоли и количество (%) клеток в различных фазах митогического цикла [Meyer J. et al., 1984]

Для статистической обработки полученных данных использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни для сравнения средних, корреляционный ранговый анализ выполнялся по методу Спирмена и методу гамма Обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v 5 0) Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (отсутствие значимых различий) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

В проведенном исследовании получены данные о снижении спонтанной цитотоксической активности NK-клеток при первой стадии РТМ по отношению к показателям в группе сравнения, что не противоречит результатам других исследователей [Бенедиктова М Г., 2001; (Garzetti G.G 1995]. Нами установлено, что спонтанная цитотоксическая активность NK клеток в группе пациентов с РТМ 16 и 1в стадий достоверно снижена по сравнению с 1а стадией, что также не противоречит данным литературы [Garzetti G G 1995] (Таблица 3).

Таблица 3

Динамика спонтанной цитотоксической активности NK-клеток ipynn пациентов в зависимости от стадии заболевания (М+т)

Группа сравнения (п=15) Стадия заболевания

I-а (в-12) I-б (п=15) Г-в (п=13)

Спонтанная цитотоксическая активность % 38,35±1,3 38,08±1,8 23,4±1,6** 16,4±1,7*

Достоверные отличия от группы сравнения выявлены методом Вилкоксона-Манна-Уитни * р<0,005, **р<0,0005.

В специальной литературе имеются противоречивые данные о цитотоксической активности >ТК клеток при нарастании инвазии аденокарцином в эндометрий. Одни исследователи считают, что спонтанная цитотоксическая активность ЮС-клеток снижается при нарастании инвазии аденокарцином в эндометрий [Мапс1еу111е Я. ег а1, 1997], другие [Оаггей! в в.,1995] - достоверного снижения уровня спонтанной цитотоксической активности МК-кпеток не получили При проведении корреляционного анализа установлена достоверная обратная корреляционная взаимосвязь спонтанной цитотоксической активности МК-клеток и глубиной инвазии аденокарцином в эндометрий Кроме этого показаны корреляционные связи высокой степени достоверности между уровнем спонтанной цитотоксической активности №С клеток, степенью дифференцировки ткани, стадией заболевания (рисунок 1). Самая высокая степень корреляции была выявлена между спонтанной цитотоксической активностью МК-клеток пациентов с РТМ и степенью дифференцировки аденокарциномы эндометрия.

Рисунок 1

Коэффициенты корреляции между спонтанной цитотоксической активностью МК-клеток пациентов с РТМ и основными прогностическими признаками заболевания.

°Г -0,2 ' •0,4 -0.6 ' -0,8 ' -14-"

Приведены значения непараметрического коэффициента связи гамма, значимо отличающиеся от 0 на уровне р<0,001

Перечисленные прогностические признаки однонаправлено, но с различной силой коррелировали со спонтанной цитотоксической активностью. Низкая степень дифференцировки ткани, углубление инвазии в миометрий, повышение стадии заболевания ассоциировались с более значимым снижением спонтанной цитотоксической активности МС-клеток

Все вышеперечисленные прогностические критерии РТМ оказались взаимосвязанными не только с уровнем цитотоксической активности, но и с количественными показателями клеток, реализующих эту функцию (таблица 2) Как видно из таблицы, на фоне снижения степени дифференцировки аденокарцином, углубления инвазии, нарастания стадии процесса возникает обратная корреляционная связь между относительным количеством клеток в периферической крови, экспрессирующих СЮ16+, и прогностически значимыми характеристиками аденокарцином. Единственный прогностический критерий - степень дифференцировки ткани - достоверно прямо коррелировал с относительным количеством С056* лимфоцитов периферической крови.

-г м р ■Степень дифференцировки ткани □Стадия заболевания □Глубине инвазии

1

1

1 -0,62

-0,85

Корреляционные взаимосвязи между количественными характеристиками клеток-эффекторов

в группе пациентов и классическими прогностическими критериями РТМ.

Количество лимфоцитов с фенотипом Степень дифференцировки аденокарциномы (по убыванию) Стадия заболевания (по возрастанию) Глубина инвазии

СШ6+ (%) -0,37 -0,53 -0,43

СО!бЧмм3) -0,33 -0,37 -0,38

С056+ (%) 0,55 0 0

С016+56"(%) -0,34 -0,30 -0,25

СТ>56+16"(%) 0,32 0,27 0,31

Приведены значения непараметрического коэффициента связи гамма, значимо

отличающиеся от 0 на уровне рсО,001

Такая корреляционная взаимосвязь представляется патогене! ически значимой, так как всс остальные классические критерии прогноза опухолевого роста с этим показателем не связаны. Установлена обратная корреляция между относительным количеством МК-клеток с фенотипом СП 16' 56" и всеми прогностически значимыми критериями заболевания Снижение МК-клеток с фенотипом СГ)16*5б", обладающих высоким цитотоксическим потенциалом, в процессе прогрессирования аденокарцином объясняет выявленную обратную корреляционную взаимосвязь высокой степени достоверности.

Численность С016"5б+ субпопуляции ЫК-клеток в свою очередь прямо коррелирует со всеми классическими прогностическими признаками РТМ, нарастает по мере прогрессирования заболевания Как известно, эта популяция обладает более выраженным пролиферативным потенциалом, выполняет регуляторную функцию за счет синтеза цитокинов [Megah А. е1 а1, 2001, В1гоп Я А е! а1, 1999]

Наблюдаемое перераспределение субпопуляций МК-клеток у пациентов при прогрессировании РТМ, характеризуется увеличением пула клеток, обладающих низким цитотоксическим потенциалом,

что в итоге отражается на показателях эффекторной активности МС-клеток. Описанные изменения эффекторной активности МК-клеток характеризуются следующими корреляционными связями, а именно- спонтанная цитотоксическая активность эффекторов в группе пациентов прямо умеренно коррелирует с относительным количеством СП16~56 и СБ 16' - и обратно умеренно с огносшельным количеством СО 16 56* и С056* - лимфоцитов

Рисунок2

е 0,5

* 0,4

0,3

0,2

0,1

0

-0,1

-0,2

-0,3

-0,4

-0,5

Корреляционные связи спонтанной цитотоксической активности с количеством клеток-эффекторов

■ С016+56-0Сй16+ □ С056-16+ ШС056+

Непараметрическая мера связи - ранговая корреляция Спирмена, значимое отличие от нуля р<0,005

В проведенной работе кроме этого было установлено, что спонтанная цитотоксическая активность МК-клеток в группе сравнения не зависела от количества клеток- эффекторов как по данным однопараметрического, так и по данным двухпараметрического фенотипирования клеток-эффекторов Кроме того, эффекторная активность >Ж-клеток группы сравнения не зависела от спонтанных уровней продукции 1Ь-2 и П.-8.

При рандомизации пациентов по степени дифференцировки ткани аденокарциномы или по стадиям заболевания были получены идентичные результаты но изменению уровня цитотоксической активности МК-клеток(таблицы 1 и 5)

Динамика спонтанной цитотоксической активности Ж -клеток пациентов на фоне снижения степени дифференцировки ¡кани аденокарцином эндометрия в сопоставлении с группой сравнения (М±т)*.

Группа Сравнения (п=15) 01 (п=10) в2 (п=18) вз (п=12)

Спонтанная цитотоксическая активность (%) 38,35±1,3 38,08±1,8 24,9±1,6 * 14Д±1,7 **

достоверные отличия от группы сравнения получены по методу Вилкоксона-Манна-Уитни * р<0,001, ** р<0,0001,

При высокодифференцированных аденокарциномах, представленных в 1а стадии РТМ, количество клеток-эффекторов, экспрессирующих СО 16, было резко повышено Такое изменение количества эффекторов сопровождалось одинаковой цитотоксической активностью в группе пациентов и группе сравнения. Можно предположить, что такой прирост ЫК-клеток определяет повышение спонтанной цитотоксической активности в этих условиях (таблица 6) Увеличенное в сопоставлении с группой сравнения, количество клеток, экспрессирующих СО 16, в группе пациентов с высокодифференцированными аденокарциномами, затем уменьшается при снижении дифференцировки ткани неоплазмы, но даже при низкодифференцированных аденокарциномах оно достоверно выше, чем в группе сравнения.

При нарастании стадии заболевания количество этих клеток также снижается, достигает уровня группы сравнения. Выявленные изменения количества СЕЯ 6 лимфоцитов сопровождаются перераспределением субпопуляций №С-клеток, а именно увеличением в 1а стадии клеток с фенотипом СО 16*56", которые обладают максимальным цитотоксическим эффектом, чем и объясняется сохранение полноценной функциональной активности 1ЧК-клеток у этих пациентов

Динамика изменения количества клеток-эффекторов в группах пациентов при снижении степени дифференцировки ткани опухоли в сопоставлении с группой

сравнения (М+тп) *

Количество лимфоцитов с фенотипом Группа Сравнения (п-15) (п=10) в2 (п=18) вз (п=12)

СО 16*5 6% 4,9±0,5 15,8±1,7 (р<0,0001) 10,7±1,5 (р<0,05) 9,4±3,4 (р<0,05)

СШ6+56+% 10,6±1,2 7,6±1,7 (р<0,03) 5,2±0,9 (р<0,05) 4,8±1,2 (р<0,03)

С01б'5б+ % 1,3±0,2 1,4±0,5 2,8±0,4 (р<0,05) 3,6±0,8 (р<0,03)

С016+% 13,9±1,1 23,9*1,3 (р<0,002) 14,8±2,1 15,3±2,6

СЬ56*% 1,7±0,6 2,4±0,7 3,3±0,7 (р<0,05) 6,4±1,5 (р<0,001)

Достоверные отличия от группы сравнения выявлены меюдом Вилкоксона-Манна-

Уитни

Причем максимальное увеличение Ж-клеток с фенотипом С016+56 выявлено у пациентов с высокой степенью дифференцировки аденокарциномы и 1а стадией По мере про! рессирования заболевания или снижения степени дифференцировки ткани субпопуляция КК-кпеток с фенотипом СЭ16 56 уменьшалась (таблица 7). Субпопуляция ЫК-клеток с фенотипом С056+16" резко увеличивалась на фоне прироста лимфоцитов, экспрессирующих С056 при 16 стадии РТМ

Максимальное перераспределение субпопуляций МК-клсток наблюдалось в группе пациентов с умеренно и низко дифференцированными тканями, |де изменение количественных взаимоотношений субпопуляций 1ЧК-клеток привело к достоверному снижению эффекторной активности Субпопуляция клеток, экспрессирующих С056* увеличивалась практически в три раза на фоне снижения дифференцировки ткани неоплазмы и более чем в два раза по мере прогрессирования заболевания по

стадиям Таким образом, снижение степени дифференцировки ткани аденокарциномы и повышение уровня инвазии, приводит к постепенному снижению пула ЫК-клеток с высокой эффекторной активностью.

Таблица 7

Динамика количественных характеристик (%) клеток-эффекторов в группах пациентов с различными стадиями заболевания в сопоставлении с группой сравнения (М+т).*

Субпопуляции ЛК-клеток Группа сравнения (1=15) Стадии заболевания

1а (п=12) 16 (п=15) 1в (п=14)

СО 16*56" 4,9±0,5 15,8±1,7 (р<0,001) 10,1±3,0 (р<0,05) 10,8±2,7 (р<0,05)

СБ 16*56" 10,б±1,2 7,6+0,8 8,2±0,6 3,8±1,0 (р<0,001)

С01656" 1,3±0,1 1,4±0,4 2,2±0,2 (р<0,004) 3,1±0,7 (р<0,005)

СО 16* 13,9+1,1 23,9±1,7 (р<0,005) 17,1±4,3 14,9±2,0

С056" 1,7±0,6 2,4±0,7 3,2±0,9 (р<0,004) 3,7±0,6 (р<0,001)

* Достоверные отличия от группы сравнения выявлены методом Вилкоксона-Маняа-Уитни

Так группе пациентов с 1в стадией РТМ цитотоксическая активность МК-клеток составила 16,4+1,7%, а в группе пациентов с низкодифференцированными аденокарциномами - 14,2+1,7%, то есть различия цитотоксической активности в группах пациентов, по этим независимым прогностическим критериям оказались недостоверными.

При рассмотрении взаимосвязи между продукцией цитокинов мононуклеарами периферической крови и спонтанной цитотоксической активностью ЫК-клеток, было выявлено, что эффекторная активность ЫК-клеток зависела от 11,-8 и 11,-2

Влияние 1Ы! и 11.-2 на эффекторную активность МК-клеток было разнонаправленным. Кроме того, была

установлена взаимосвязь между продукцией 1Ь-8 и 1Ь 2 и классическими прогностическими признаками заболевания Полученные данные не противоречат данным других исследователей. [ТщшкЛо } е! а! , 2002] Уровень продукции [1.-8 повышался при увеличении инвазии и повышении стадии процесса, он был достоверно повышен уже в группе пациентов с РТМ 1а, где у преобладающего количества обследованных при оперативном вмешательстве инвазии не было выявлено

Изменения спонтанной продукции П--2 мононуклеарачи периферической крови пациентов с РТМ повторяли динамику изменений количественных показателей клеток-эффекторов Продукция II -2 была достоверно выше при высокодифференцированных новообразованиях и 1а стадии заболевания При прогрессе РТМ уровень продукции этого цитокина снижался, что отражалось на эффекторной активности ЫК-клеток Наши данные не противоречат проведенным ранее исследованиям, продемонстрировавшим особую значимость Л1-2 для реализации спонтанной цитотоксической активности А е1 а1, 2000] Кроме того, в ходе проведенной работы, была выявлена прямая

корреляционная связь между спонтанной цитотоксической активностью ТЖ-клеток и уровнем спонтанной продукции 11,-2

Таким образом, корреляционный анализ продемонстрировал прямую достоверную взаимосвя ¡ь уровня спонтанной продукции 1Ь-2 и ведущих прогностических признаков рассматриваемой патолшии, тогда как изучение корреляционных взаимосвязей между уровнем спонтанной продукции 1Ь-8 и ведущими прогностическими признаками продемонстрировало обратные корреляционные связи

Рисунок 3

Корреляционные взаимосвязи между спонтанной цитотоксической активностью МК. клеток и спонтанной продукцией 1Ь-2 и 1Ь-8 *

□ IL-2 BIL-8

*Непараметрическая мера связи - ранговая корреляция Снирмена, значимое огличие от О р<0,005

По данным литературы TNFa повышен у пациентов с адснокарциномами эндометрия и совместно с IL-8 проявляет ангиогенную активность [Chopra V et а!, 1997], способствуют) ю прогрессированию заболевания и мета- стазированию R пашем исследовании, достоверное

повышение TNFa, наблюдалось только у пациентов в 1а стадии РТМ. В стадиях 16 и Ь уровень спонтанной продукции соответствовал референтным значениям.

Тем не менее, между уровнями спонтанной продукции TNFa и глубиной инвазии (коэффициент корреляции по Спирмену 0,47, р<0,05) в группе пациентов со стадией 16 выявлена прямая корреляционная взаимосвязь.

В группах пациентов со стадиями 1а и 1в аналогичных корреляционных взаимосвязей не выявлено

Полученные результаты позволили высказать предположение, что нормализация спонтанной продукции TNFa может являться маркером инвазии аденокарциномы в эндометрий, но не ее дальнейшего прогрессирования. Это подтверждается отсутствием корреляционных связей при анализе спонтанной продукции TNFa в группе пациентов 1в стадии РТМ

Резкий прирост продукции TNFa наблюдался в 1а стадии, когда инфильтрация аденокарцином активированными лимфоцитами была максимальной. Снижение инфильтрации аденокарцином лимфоцитами, оцененное в исследовании по экспрессии панлимфоцитарного маркера в суспензии клеток неоплазм, совпадало со снижением уровня спонтанной продукции TNFa.

Следует отметить, что в исследовании не были получены корреляционные взаимосвязи между спонтанной цитотоксической активностью NK-клеток и одним из важнейших для этой функции цитокинов - IFNy. Уровень его спонтанной и индуцированной продукции у пациентов оставался сопоставимым с показателями группы сравнения, независимо от степени дифференцировки ткани аденокарцином и повышения стадии заболевания.

Проведенная в условиях m vitro индукция эффекторной активности NK-клеток, в группах пациентов и сравнения привела к приросту цитотоксической активности в обеих группах Достоверных отличий между уровнями индуцированной цитотоксической активности NK-клеток групп пациентов и сравнения (43,73±2,7% и 39,7±2,3%) получено не было, однако, индекс стимуляции в группе пациентов достоверно превысил таковой r группе сравнения Для группы сравнения он составил 1,16±0,1, а для группы пациентов 1,72±0,005, что достоверно (р<0,0003) выше

Таким образом, сравнительный анализ показателей индуцированной цитотоксической активности и индекса стимуляции в группах пациентов рандомизированных по стадии заболевания (и/или степени инвазии в эндометрий), а также по степени дифференцировки ткани аденокарциномы показал возможность индукции эффекторной активности NK-клеток при РТМ I.

Корреляционный анализ выявил прямые корреляционные связи между индексом стимуляции цитотоксической активности NK-клеток и обратные корреляционные взаимосвязи менаду показателями индуцированной цитотоксической активности и классическими прогностическими критериями

Рисунок 4

Корреляционные связи между индуцированной цитотоксической активностью, индексом ее стимуляции с ведущими прогностическими признаками заболевания

индекс стимуляции

0,6

0,830,520.5* ШШШ-»•

■степень

дифференцировки ткани эндометрия □ стадия заболевания

El глубина инвазии

■ степень

дифференцировки ткани эндометрия □ стадия заболевания

индуцированная цитотоксичечкая активность

И глубина инвазии

Приведены значения непараметрического коэффициента связи гамма, значимо отличающиеся от 0 на уровне р<0,001

Экспрессия CD95 на клетках различных неоплазм рассматривается, как возможный путь запуска в них процессов апоптоза через взаимодействие лиганда и рецептора. Высокая экспрессия этого рецептора является прогностически благоприятным признаком при аденокарциномах эндометрия [Atasoy Р et al., 2003, Ben-Hur Н. et al, 2002; Reimer Т. et al., 2002]. По нашим данным количество клеток аденокарцином, экспрессирующих CD95, снижалось параллельно клеткам, экспрессирующим CD45, по мере нарастания стадии заболевания и снижении дифференцировки гкани аденокарцином. Таким образом, адекватная экспрессия CD95, но и CD45 может считаться прогностически благоприятным признаком.

Внутриклеточный белок bcl-2 предотвращает развитие апоптоза клеток. При гиперэкспрессии bcl-2 С095/СВ95Ь-опосредованный путь апоптоза предотвращался на стадии продукции цитохрома-С митохондриями [RaisovaM., 2001].

Рисунок 5

Уровень экспрессии на лимфоцитах, инфильтрирующих ткань неоплазмы и клетках

аденокарцином маркеров СЕИ5, СТ>95 и Ьс1-2 при I стадии рака тела матки -различия, полученные методом Вилкоксона-Манна-Уитни достоверны при

сравнении параметров групп пациентов при 1а и 1с стадиях (р<0,005)

Полученные данные подтверждают увеличение экспрессии этого противоапоптического белка по мере прогрессирования заболевания Можно предположить, что в основе невосприимчивости клеток изученных нами аденокарцином к эффекторному воздействию NK-кпeтoк лежит гиперэкспрессия Ьс1-2 на мембранах митохондрий. В группе пациентов с РТМ между числом лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль и экспрессирующих ПЭ95 и СП45, выявлены прямые, а между числом клеток аденокарцином, экспрессирующих Ъс1-2, - обратные корреляционные связи с эффекторной активностью МК-клеток.

Рисунокб

Корреляционные связи спонтанной цитотоксической активности с ларамерами экспресиии С095, СР45 и Ьс1-2, в суспензиях клеток аденокарцином

Приведены значения непараметрического коэффициента связи гамма, значимо отличающиеся от 0 на уровне р<0,001

При рандомизации пациентов по признаку наличия или отсутствия анеуплоидии было выявлено, что сравниваемые группы достоверно отличались степенью дифференциронки ткани, но при этом степень инвазии и стадия РТМ не различались. В группах с анеуплоидией и без нее не выявлено достоверного различия в количестве клеток-эффекторов. Спонтанная цитотоксическая активность №С-клеток в группе пациентов с анеуплоидными новообразованиями оказалась достоверно ниже, чем в группе сравнения и у пациентов с диплоидными аденокарциномами (таблица 8).

При этом отмечен достоверно более высокий уровень спонтанной продукции П--8 в группе пациентов с анеуплоидными аденокарциномами. Среди пациентов с анеуплоидными новообразованиями преобладали низкодифференцированные аденокарциномы, отмечалось достоверное снижение инфильтрации лимфоцитами аденокарцином и прирост клеток, гиперэкспрессируюших Ьс!-2

Таблица 8

Сопоставление спонтанной цитотоксической активности №С-клеток в группах пациентов с диплоидными и анеуплоидными аденокарциномами и в группе сравнения

(М±т)*

Сравниваемые группы Спонтанная цитотоксическая активность (%)

Группа сравнения 38,1±5,2

Пациенты с диплоидными аденокарциномами 28,55±9,53 (р<0,006)

Пациенты с анеуплоидными аденокарциномами 19,10*10,32 (р<0,004)

*Достоверные отличия от группы сравнения получены методом Вилкоксона-Манна-Уитни

Таким образом, в ходе исследования, выявлены высоко достоверные умеренные корреляционные взаимосвязи изученных параметров с классическими критериями прогноза РТМ Из исследованных параметров обратно коррелировали с классическими прогностическими критериями РТМ спонтанная цитотоксическая активность ЫК клеток, количество лимфоцитов, инфильтрирующих аденокарциному, нормальное содержание ДНК в клетках аденокарциномы, уровень спонтанной продукции ТЬ-2. Прямые корреляционные взаимосвязи были выявлены между классическими прогностическими признаками и уровнем экспрессии Ьс1-2, 1Ь-8, анеуплоидным содержанием ДНК в клетках аденокарцином Данные исследования спонтанной цитотоксической активности 1ЧК - клеток, уровней продукции ЕЬ-2 , ТЬ-8 и ТОР-а могут быть использованы в качестве критериев прогноза и течения РТМ еще в дооперационном обследовании. Индукция цитотоксической активности Ж-клеток препаратом 11,-2 позволяет оценить максимальную эффекторную способность Ж клеток в момент исследования. Мониторинг этих показателей в послеоперационном периоде позволит оптимизировать комплексную терапию

Выводы:

1. Спонтанная цнтотоксическая активность ЫК -клеток достоверно ниже при I стадии РТМ в сопоставлении с группой сравнения, что связано с перераспределением субпопуляций КК-кпеток и преобладанием субпопуляций с регуляторными функциями

2 Спонтанная цитотоксическая активность ЫК-клеток пациентов с РТМ прогрессивно достоверно снижалась по мере снижения дифференцировки ткани аденокарцином эндометрия, повышения стадии заболевания и глубины инвазии

3 Установлен прирост клеток эффекторов с фенотипом СО^Зб" в группах пациентов с 1а стадией РТМ и/или высокой степенью дифференцировки ткани аденокарцином, что обеспечивает поддержание референтных значений спонтанной цитсгтоксической активности ЮС-клеток в этих группах

4 Спонтанная продукции П.-8 повышается в 1а стадии РТМ, увеличивается по мере прогрессирования заболевания, находится в обратной корреляционной взаимосвязи со спонтанной цитотоксической активностью клеток-эффекторов

5 Спонтанная продукции 11,-2 повышается в 1а стадии РТМ, снижается по мере прогрессирования заболевания, находится в прямой корреляционной взаимосвязи со спонтанной цитотоксической активностью клеток-эффекторов.

6 Цитотоксическая активность индуцированная И.-2 (фармакопейный препарат Ронколейкин) НК-клеток была сопоставима между группой пациентов с РТМ и группой сравнения Индекс стимуляции цитотоксической активности клеток-эффекторов в группе пациентов достоверно превышал параметры группы сравнения.

7. По мере возрастания стадии заболевания происходит снижение инфильтрации тканей аденокарцином лимфоцитами, повышение экспрессии белка Ьс1-2 в клетках опухоли, увеличение относительного количества аденокарцином с аномальным содержанием ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Дмитриева И.Б., Бычкова Н.В, Давыдова Н.И. Оценка функциональной активности иммунокомпетентных клеток методом ДНК-цитометрии. //Russian journal of immunology. 2003.- Vol-9, Spp, p.87.

2. Дмитриева И.Б., Бычкова H.B., Чиненова Л.В., Калинина Н.М., Новикова E.H. Спонтанная цитотоксическая активность естественных киллерных клеток у пациенток с первой стадией рака тела матки и ее взаимосвязь с основными прогностическими критериями заболевания. // Клинико-лабораторная диагностика,- 2004,- N5.-C. 17-28.

3. Дмитриева И.Б., Мурзакматов М.А., Абашин В.Г., Ильин А.Б., Эллиниди В.Н., Чиненова JI.B. Показатели местного иммунитета эндометрия у женщин с бесплодием.// Медицинская иммунология.-2004.-Т. 6, N3-5,- С.383.

4. Дмитриева И.Б., Бычкова Н.В., Давыдова Н.И., Калинина Н.М Спонтанная цитотоксическая активность естественных киллерных клеток у пациенток с аденокарциномой эндометрия // Медицинская иммунология. -2004 -Т. б, N3-5 - С.383

5 Дмитриева И Б, Бычкова Н В, Давыдова Н.И., Калинина Н.М. Метод проточной ДНК-цитометрии в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток.// Медицинская иммунология.-2004.-Т. 6, N3-5,- С.397.

РНБ Русский фонд

2005-4 48487