Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль цитотоксических белков тромбоцитов в механизме гибели опухолевых клеток

РГБ ОЛ

Московский физико-технический институт Онкологический научный центр

На правах рукописи Голубева Татьяна Сергеевна

Роль цптотокспческих белков тромбоцитов в механизме гибели опухолевых клеток

(14.00.14 - Онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Московском Физико-Техппческом ипспп} ic и Онкологическом научном центре РАМН

Научные руководители: кандидат химических наук O.I< ).Черти доктор медицинских наук М.В.Кисслепскин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор U.E. Кушлинский, кандидат биологических паук Г.Г. Миллер

Ведущая организация: НИИ Иммунологии МЗРФ

Защита состоится ажлбкб 4$ЗЬ. на заседании

специализированного совета Д.001.17.01 (К.001.17.01) Онкологическою научного центра РАМН (115478, Москва. Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться нбиблпоюке Онкологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " Г- ______19% г.

Ученый Секретарь

специализированного совета В.С.Турусов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В связи с интенсивным развитием методов иммунодиагностики и иммунотерапии онкологических больных стала очевидной важность изучения клеточных механизмов противоопухолевого иммунитета и молекулярных механизмов клеточной гибели. В последние годы появляется все больше данных о функциях тромбоцитов, прямо не связанных с тромбообразованпем. Тромбоциты могут вызывать цитолиз эндотелиальных клеток и аутологичных красных клеток крови, а также обуславливать IgE-, IgG-, цитокин - зависимую цптотокспчность в отношении простейших. Аналогично Т-лимфоцитам, моноцитам, и другим клеткам иммунной системы, тромбоциты способны оказывать цптотоксическое действие на злокачественные клетки. Тромбоциты человека обладают высокой специфической цптотоксической активностью в отношении клеток линии ACL. На мембране этих опухолевых клеток были обнаружены рецепторы к адгезивному домену тромбоспондпна . Эндогенные иммуномо-дуляторы — интерлейкины, лимфокпны, рецепторы которых обнаружены на мембранах тромбоцитов, могут влиять не только на адгезию и агрегацию тромбоцитов, но и на их цитотокспческие свойства. Фактор активации тромбоцитов (PAF), стимулирующий высвобождение биологически активных веществ из секреторных гранул кровяных пластинок, вызывает увеличение цптотоксической активности тромбоцитов в концентрациях от 1(Г12М до 1(Г6М.

Тромбоциты способны в отсутствии антител оказывать цитотоксическое действие на клетки перевиваемых линий меланомы и аденокарциномы почки. При этом супернатант активированных тромбоцитов токсичен для опухолевых клеток.

Было показано, что активированные тромбином тромбоциты, также как и неактивированные проявляют цптотокспческий эффект по отношению к клеткам линии К-562. В отличие от цитолиза, обусловленного неактпвп-рованными тромбоцитами, для которого требуется прямой контакт между тромбоцитами и клетками - мишенями, цитолиз клеток К-562 активированными тромбином тромбоцитами происходит без прямого межклеточного контакта.

Данные, полученные при электронно - микроскопическом исследовании показали, что тромбоциты, адсорбированные на поверхности опухолевых клеток - мишеней, изменяют свою ультраструктуру, включая гипертрофию аппарата Гольджп, увеличение секреторных гранул и скопление их в области контактной зоны (подобно Т-лимфоцитам).

Ингибиторы протеаз способны окапывать влияние на цитотокеическнн эффект тромбоцитов.

Это позволяет предположить, что тромбоциты способны продуцировать и высвобождать медиаторы белковой природы, способные окапывать цито-токсическое действие на злокачественные клетки.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Выделение цитотоксических белков тромбоцитов человека и изучение механизма гибели клеток - мишеней под действием активированных тромбоцитов и полученных из них белковых фракций.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе впервые показано, что белковые фракции, выделенные из тромбоцитов, способны оказывать цптотокспческоо действие на клетки линии аденокарциномы легких. Определены молекулярные массы цитотоксических белков, содержащихся в этих фракциях, и их цитотоксическая активность. Для белка молекулярной массы 14 кДа определена N-концевая аминокислотная последовательность и показана уникальность его структуры. Впервые проведены исследования по изучению механизма гибели клеток линии ACL под действием тромбоцитов человека и цитотоксических белков тромбоцитов и показано, что при этом детектируемая фрагментация ДНК отсутствует.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты значительно расширяют имеющиеся представления об эффекторах противоопухолевого иммунитета и механизмах цптотокснческого действия тромбоцитов, роли цитотоксических белков в реализации цитотоксического эффекта тромбоцитов и механизмах цитолиза опухолевых клеток - мишеней под действием тромбоцитов и цитотоксических белков эффекторов иммунной системы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты настоящей работы были представлены на межлабораторных семинарах Института бпо-органической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и Московского фпзпко - технического института, а также на межлабораторной конференции НИИ Клинической онкологии РАМН. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 94 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Получение супернатанта активированных тромбоцитов

С.Н. Быковской и др. было показано, что цптотоксичность тромбоцитов значительно возрастает при их активации PAF. PAF вызывает изменение формы тромбоцитов, продукцию ТХЛ-2, секрецию гранул хранения аминов, гранул хранения белков, лппосом. При этом может происходить п секреция цитотокспческих белков, выделение которых являлось нашей задачей.

Цдтотокспческую активность тромбоцитов определяли по выходу радиоактивного Сг51 из клеток - мишеней линии ACL.

Тромбоциты одного здорового донора из 80 мл тромбоплазмы (10й клеток) инкубировали с PAF в течение 1 часа в 5% СО2 в среде RPMI-1640. Затем проводили тестирование супернатанта на цптотоксическую активность, которая, как оказалось, изменяется в зависимости от исходного препарата и не превышает 15% (Таблица 1).

Таблица 1

ЦАТ п цитотоксическая активность супернатанта активированных тромбоцитов

N эксперимента ЦАТ до активации *, % цитотоксическая активность супернатанта активированных тромбоцитов, %

1 21,0 ± 5,5 9,0 ± 3,2

2 20,1 ± 5,3 7,1 ± 2,8

3 25,3 ± 7,8 11,9 ± 4,3

4 22.1 ± 3,6 3,2 ± 2,9

5 10,3 ± 3,2 5.7 ± 2.1

6 45,2 ± 7,7 10,2 ± 3,4

7 40,1 ± 6,8 11,3 ± 1,2

не превышала 3%

Различия и низкий уровень исходной активности супернатаптов активированных тромбоцитов могут объясняться различиями в количестве секре-тируемых цитотокспческих факторов тромбоцитами различных доноров и присутствием веществ, пнгпбпруюншх цитолиз.

Для дальнейших исследовании использовали объединенный суперна-

тант после активации тромбоцитов от 7 разных доноров.

2 Получение фракций, обладающих цитотоксической противоопухолевой активностью из супернатанта активированных тромбоцитов с помощью HPLC

Цитотокспческая активность супернатанта активированных тромбоцитов — это результат суммарного действия различных присутствующих в нем биологически активных веществ, возможно, таких как цитотоксические белки, их активаторы п ингибиторы. Так, протеиназы серинового типа, содержащиеся в лпзосомах тромбоцитов и секретирующиеся при их активации PAF, относятся к активаторам цитолиза. Другие протеазы могут ингибировать цитотоксические белки за 18 часов инкубации супернатанта с клетками - мишенями в используемой системе тестирования.

Перед нами стояла задача выделить цитотоксические факторы в индивидуальном состоянии и определить их активность. Для этого свежеприготовленный супернатант, полученный путем 1 часовой инкубации тромбоцитов с PAF, замораживали и хранили при -40°С до дальнейшего использования.

Затем применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на обращенной фазе в градиенте ацетонитрила. Этот метод позволяет уже на первом этапе добиться высокой степени разделения веществ исходной смеси при минимальных потерях биологического материала. В результате получили 24 фракции, элюпрующихся при различных концентрациях ацетонитрила в элюирующем буфере (Рис.1). Фракции лиофилизовали, предварительно отобрав 1/3 от каждой фракции для последующего тестирования на цитотоксическую активность. Известно, что использование при хроматографии в качестве буферов летучих веществ (ТФУ и ацетонитрил) обеспечивает более пли менее полное восстановление биологической активности фракционируемых веществ после лпофили-зации. Отобранные и лпофилизованные части каждой фракции растворяли в среде RPMI-1640 п тестировали на цитотоксическую активность на клетках линии ACL, меченных радиоактивным хромом.

Фракции N11 и N15 обладали наибольшей цитотоксической активностью, равной, соответственно 44,9 ± 5,7% (р<0.05) и 33,4 ± 5.6% (р<0,05). Активность этих фракций намного выше активности исходного супернатанта, не превышающей 15%. следовательно, в ходе хроматографии

Рис.1. HPLC на обращенной фазе в градиенте ацстонитрила супернатанга активированных тромбоцитов и анализ цитотоксичесгай активности лио-филиэованных фрахций на клетках - мишенях ACL, меченных "Ст. Стрелками отмечены фракции 11 и 15, обладающие наибольшей цигоотжскчес-иэй активностью.

•set

I . К'--11 кДа

f ''

Рис.2. SDS-элекгрофорез в полнакриламидном геле с последующим элскт-ропереносом на мембрану Immobilon фракций 11 (слева и в центре) и 15 (справаХ выделенных из супернатанга активированных тромбоцитов, обладающих цитотоксичесюэй активностью по отношению к клеткам - мишеням ACL.

удалось отделить пптотоксические факторы от ингибиторов цитолиза. Фракции N11 и 15 были использованы для дальнейшего исследования, целью которого был попек цптотоксическпх белков.

3 Электрофорез в ПААГ с последующим электропереносом на мембрану Iinmobilon цитотоксических фракций супернатанта активированных тромбоцитов

При HPLC на обращенной фазе произошло разделение содержимого супернатанта активированных тромбоцитов на основании различного сродства веществ к гидрофобному носителю колонки. Электрофорез в полнакрн-ламидяом геле на следующем этапе позволяет произвести разделение по молекулярной массе (Рис.2). После электрофореза проводили электроперенос белков на мембрану Immobilon, которую затем окрашивали Кумассп R-250.

Оказалось, что во фракциях N11 и 15 содержится значительное количество белка молекулярной массы 65 кДа. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности этого белка показал его идентичность сывороточному альбумину человека. Известно, что сывороточный альбумин не обладает цитотокспческой активностью. Его присутствие объясняется тем, что тромбоциты способны сорбировать на себе альбумин плазмы крови, который не удается удалить даже путем многократного отмывания тромбоцитов и отмыванием с последующей обработкой проп'олптпчеекп-ми ферментами. На мембранах отмытых тромбоцитов

помимо альбумина обнаруживаются фибриноген, фактор XIII,~ -глобулин Эти белки не только покрывают мембрану тромбоцитов, но и являются внутриклеточными тромбоцитарными белками. В процессе активации альбумин десорбпруется с мембраны тромбоцитов, что обуславливает его присутствие в супернатанте активированных тромбоцитов в значительном, по сравнению с другими белками, количестве.

Денситометрнческпн анализ полосы, соответствующей альбумину, показал, что его содержание во фракциях N11 а 15 составляло не менее 10-,.

Кроме альбумина, во фракции N11 содержался белок молекулярной массы 30 кДа. С помощью автоматического газофазного срквенагора удалось установить 4 N-концевых аминокислотных остатка этого белка: Asp-Val-Gly-Leu-

Во фракции N15, кроме альбумина, содержались белки молекулярной массы 95 кДа, 45 кДа. 35 кДа, 28кДа и ряд белков в минорных количествах.

4 Элюция белков с мембраны 1ттоЫ1оп и определение их цитотоксической противоопухолевой активности

Чертовым и др. в группе общих методов исследования структуры белков ИБХ РАН был разработан метод элюцпн белков с мембраны 1ттоЫ1оп, позволяющий использовать элюаты для тестирования цитотоксической активности без их дополнительной обработки. Для этого белковый препарат наносили параллельно в 2 кармана полиакрплампдного геля, проводили электрофорез с последующим электропереносом на мембрану 1ттоЫ1оп, после чего одну из дорожек окрашивали Кумасси 11-250, а другую разрезали на полоски шириной 5 мм, с которых элюировалп белкп для анализа биологической активности. Элюцию белков с мембраны проводили буфером, содержащим 0,05М ГШ^НСОз, 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 50% ацетонитрила, в течение 2,5 часов при их интенсивном перемешивании. Сочетание элюирующего раствора, содержащего органический растворитель (ацетонитрил), и бычий сывороточный альбумин в качестве слабого детергента позволяет добиться сравнительно высокого выхода элюируемого белка (до 90%) с сохранением 30 - 40% биологической активности. Элюаты лиофилизовали и использовали для тестирования цитотоксической активности.

Белок молекулярной массы 30 кДа (рЗО) из фракции N 11 был элюпро-ван с мембраны и тестирован на цитотоксическую активность на клетках линии АСЬ, меченных Сг51. Его активность составила 9,3±3.8% из расчета % погибших клеток мишеней. Отмечено значительное повышение удельной активности белка, рассчитанной на единицу массы вещества, т.е. прп хроматографии произошла очистка цитогоксического фактора от балластных белков (Таблица 2).

Белки из фракции N15 также элюировалп с мембраны 1ттоЫ1оп. Дорожку с препаратом предварительно разрезали на полоскп шириной 5 мм, элюаты лиофилизовали и тестировали на цитотоксическую активность.

Цитотоксическая активность выявлена для белков молекулярной массы от 80 до 95 к Да. Она составила 6 - 9 %. Белки молекулярной массы от 10 до 15 кДа проявляли активность от 6,6 до 13%. Для остальных белков

активность достоверно не выявлена. Удельная активность шпогоксиче-ских белков фракции 15 не определялась, так как их не удались выделить в гомогенном состоянии.

Таблица 2

Анализ цитотокспческоп активности белков из суиернатанти лкгпппрп-

Стадии Анализируемые Цитотоксическая Удельная

очистки вещества ПКП1ИНООТ1., 1\Д" ¡1К шшюгть. К. 1 'мг

Исходный 8.л

суиерпатапт "

НРЬС, фракция 11 •II .У ¡4-

иНгароге ЯРБС фракция 15 :!.'!. 1 1.1 х И)-

Электрофорез, р.'Ю из фракции 11 9,2 1:\ '(и'

блоттинг,

элюция

— препарату приписывается единица активности, если он вызывает минимально наблюдаемый цитотоксическнй эффект (\%) по отношению к клеткам - мишеням в данной системе тестирования, будучи растворенным в 1 мл среды.

** — указана усредненная цитотоксическая активность суцерпатанга активированных тромбоцитов, выделенных от 7 разных доноров.

5 Определение цитотоксическон активности тромбоцитов здоровых доноров в тесте с использованием витального красителя МТТ1

В связи с высоким уровнем спонтанного лпзнса КМ в тесте с использованием радиоактивного Сг51 отечественного производства на определенной стадии исследования возникла необходимость в разработке новой методики тестирования цитотоксическон активности. Было решено использовать тест с витальным красителем МТТ. основанный на свойстве красителя восстанавливаться в митохондриях живых клеток, образуя кристаллы формазана. Этот метод тестирования довольно прост в исполнении и позволяет автоматически регистрировать результаты с помощью сканирующего спектрофотометра в отличии от метода с. использованием трипано-вой синьки, требующего ручного подсчета числа погибших клеток. Тест с МТТ позволяет также регистрировать Не только уровень цитолиза КМ.

1Эта масть работы выполнен! сопместно с аспирантом лпГлфлгприп клеточного иммунитета ОНИ РАМН А.Р.Тугуз

30 40 во ЯО

цитотоксичность (%)

Рис.3. Вариационный рад цнтотоксичесюой противоопухолевой активности тромбоцитов здоровых доноров. Тест с МТТ на клетках - мишенях АСЬ.

но и цптостатичсскнн эффект.

На первом этапе представлялось целесообразным провести исследования этим методом уровня питотокспческон активности самих тромбоцитов для сравнения с данными, полученньшн ранее С.Н.Быковской в тесте с Сг51, а также для последующего сравнения с уровнем активности выделенных цитотокепчеекпх факторов, измеренным в аналогичных условиях.

Была изучена цитотоксическая активность тромбоцитов (ЦАТ), выделенных из периферической крови 32 здоровых доноров.

Были выявлены значительные колебания активности тромбоцитов отдельных доноров от 1 % до 72 %, но у большинства обследованных лиц находилась в диапазоне от 15-50 %. Среднее значение ЦАТ 32 здоровых доноров составило 33.0±6.4%. Высокая ЦАТ (выше 35 %) наблюдалась у 17 из 32 обследованных здоровых доноров, тогда как более низкие значения ( менее 25 %) у 15 из 32 доноров (Рнс.З).

Полученные данные согласуются с данными С.Н. Быковской, хотя несколько отличаются по абсолютному значению ЦАТ. Это связано, вероятно, с тем, что тест с МТТ позволяет, наряду с цитолптпческим эффектом тромбоцитов, выявить и их цитостатпческие свойства. При этом термин "цитотоксичность" следует понимать в более широком смысле, а именно, как всякое угнетение клеточного метаболизма, ведущее к угнетению пролиферации, а, возможно, и к гибели клетки.

Было проведено также исследование модулирующего влияния PAF на ЦАТ 19 здоровых доноров.

Достоверное повышение ЦАТ отмечено у 12 из 19 обследованных доноров. В среднем ЦАТ увеличивалась с 24,6±6,1% до 42,2±5.1% (р<0,05). Причем, PAF преимущественно активировал тромбоциты с исходно низким уровнем цитотокспческои активности. Установлено, что наибольшую активность PAF проявлял в концентрации 10~СМ. Эти данные также согласуются с данными С.Н. Быковской и нашими данными, полученными в тесте с Сг51 о том, что PAF вызывает увеличение ЦАТ.

Таким образом, было решено, что тест с: МТТ можно использовать для выделения цитотокспческих белков тромбоцитов человека.

6 Лизирование тромбоцитов и получение суперна-танта с содержимым гранул тромбоцитов

Присутствие больших количеств альбумина, который не удавалось отделить методами ионообменной хроматографии и гельфильтрацни, в супер-натанте активированных тромбоцитов затрудняло выделение цптотокси-ческих белков из супернатанта и требовало разработки иного метода выделения цитотокспческих белков из тромбоцитов.

В 1990 г. J.M. Schroder et.al. описали методику выделения нового полипептида из тромбоцитов — фактора хемотаксиса для нейтрофилов, гомологичного по структуре фактору 4 из тромбоцитов. Они растворяли осажденные и отмытые тромбоциты в 2М NaC'l при рН 3.0 и подвергали их трех - кратному замораживанию и оттаиванию, после чего нерастворимые белки осаждали центрифугированием (4000»;. ЗОмин) и супернатант использовали для исследования.

Мы использовали аналогичную методику для выделения цитотокспческих белков из тромбоцитов человека. Выделенные из периферической крови 23 здоровых доноров и отмытые тромбоциты растворяли в 2М NaCL

0,1% ТФУ. Это позволяло сразу после трехкратного замораживания и оттаивания и осаждения остатков мембран и нерастворимых белков (4000g, 30 мин) наносить супернатант на колонку для HPLC. так как для HPLC в качестве стартового буфера используется 0,1% ТФУ. Кроме того, использование денатурирующих условий (2М NaCI, рН 2,0) позволяет добиться инактивации протеаз из лизосом тромбоцитов на время от начала разрушения тромбоцитов до последующих фаз разделения белков, когда происходит пространственное разобщение субстратов и ферментов.

Последующая HPLC позволяет полностью отделиться от соли, приводит уже на первой стадии к высокой степени разделения исходной смеси, и после лиофилизацип полученных фракций, более пли менее полностью восстанавливается биологическая активность белков.

Таким образом, нами был получен супернатант, содержащий растворимые белки тромбоцитов, использованный в дальнейшем для поиска цпто-токсических белков.

7 Идентификация цитотоксических белков из супер-натанта разрушенных тромбоцитов

В результате разделения содержимого гранул тромбоцитов, находящегося в супернатанте, полученном после лизнровапия тромбоцитов, с помощью HPLC на обращенной фазе на колонке Ultrapore RPSC получили 17 фракций, элюирующпхея при различных концентрациях апетонитрпла в подвижной фазе. Профиль элюции схематически представлен на рис.4. Отобранные фракции тестировали на цптотоксическую активность с использованием красителя МТТ на клетках - мишенях ACL.

Тестирование алпквот фракций после их лпофплпзаипп показало, что фракции 1,2 и 3, указанные стрелками на рис.4, элюпруюпгаеся при концентрации ацетонитрпла в подвижной фазе 40,8%, 44,4% и 54.0% соответственно, содержат вещества, проявляющие наибольшую по сравнению с другими фракциями цптотоксическую активность, равную соответственно 15,4 ± 3,1%, 20,3 ± 3. 2% и 21,5 ± 3,7% в тесте с МТТ на KM ACL.

Анализ активных фракций с помощью SDS-электрофореза в полиакрп-ламидном геле с последующим электропереносом на мембрану Immobilon и соответствующей окраской показал присутствие в них белков (рис.5). По данным электрофореза во фракции 1 содержится белок с молекулярной массой, близкой к 14 кДа, и белок с молекулярной массой 22 кДа.

и

A« 4CH,CN

Рис.4. Профиль элюции экстракта из тромбоцитов человека на колонке Ulirapore RPSC ( Весшап USA) (схема). Отмечены активные фракции, проявляющие цитотоксическую активность в отношении клеточной линии ACL.

Рис.5. SDS-элекгрофорез в поли акр иламидном геле с последующим электропереносом на мембрану Immobilon фракций, обладающих циготокеической активностью, вьщеленных из тромбоцитов человека. (Окраска Coomassie R-250). Слева - набор стандартных белков для электрофореза (Bio-Rad, USA), сверху вниз - молекулярная масса (кД); далее слева направо - фракции 1,2,3, соответственно.

Во фракции 2 содержатся белки с молекулярными массами 28 кДа. 35 кДа, 44 кДа и 65 кДа. Во фракции 3 содержится целый ряд белков и требуется их дальнейшее фракционирование. Нами была проанализирована цптотоксическая активность белков фракций 1 и 2 после их элюцнп с мембраны Iminobiloii. Оказалось, что основной вклад в цптотоксическую активность фракции 1 вносит белок молекулярной массы 14 кДа, активность которого п тесте с МТТ на IvM ACL составила 14,1±4.3%. в то время как белок молекулярной массы 22 кДа не проявлял активности. Из бел-коп, содержащихся по фракции 2. цптотоксическую активность, рапную 11,2±3,4%, проявлял белок молекулярной массы 35 кДа. остальные белки этой фракции былп не активными. Была определена удельная активность белков молекулярной массы 35 кДа (р35) (Таблица 3). Белок молекулярной массы 14 кДа не удалось выделить в гомогенном состоянии, поэтому его удельная активность не определялась.

Таблица 3

Анализ цптотокспческой активности белков при фракционировании су-перпатанта лпзпроваиных тромбоцитов на колонке Ultrapore RPSC.

Стадии Анализируемые Цптотоксическая Сдельная

очистки вещества активность, КД активность. ЕД/мг

Исходный

супернатант "

HPLC, Ultrapore iirSC фракция 1 фракция 2 фракция 3 15,1 20,:! 21.5 5.2х 102 5.1 хЮ2 7.2 х102

Электрофорез, рЗЗ in фракции 2 11.2 1,1x10'

блоттииг,

элюция

* — цптотоксическая активность исходного супернатанта не определялась, так как он содержал 2М NaCl и 0.1% ТФУ п сразу наносился на колонку для HPLC'.

Для более тонкого разделения белков и по возможности выделения в гомогенном состоянии белков из фракции 3 (Рис.5) была использована обращеннофазная колонка для HPLC с более длинным углеводородным носителем (Сц) Hi Роге RP-304 (Bio - Rad). На эту колонку наносили супер-натант, полученный тем лее способом после трехкратного заморлжнпанпя н оттаивания тромбоцитов. и проводили HPLC в градиенте

ацетонитрила (Рис.6;. В результате хроматографпческого разделения содержимого супернатанта получили 19 (фракций.

1(

V, CH.CN

SO 60 шл

Рис.6. Профиль элюции экстрахта из тромбоцитов человека на колонке Hi Роге RP-304 (Bio-Rad, USA) (схема). Отмечены активные фракции, проявляющие цитотоксическую активность в отношении клеточной линии ACL.

'-ШтШ^- ал

— 67 43

Я- 30 - 20,1 ■ — 14,4

-V; 1

Рис.7. SDS - электрофорез в полиакриламидном геле с последующим электропереносом на мембрану Immobilen (окраска Coomassie R 250) фракций 1 -(1) и2-(2), выделенных из тромбоцитов человека с помощью HPLC на колонке Hi Роге и обладающих цитотоксической активностью по отношению к клеточной линии ACL. В центре - набор стандартных белков для электрофореза ( Bio-Rad, USA). Сверху вниз - молекулярная масса (кДа).

1

которые лпофнлпзовалп и тестировали на цнтотоксическуто активность. Для дальнейшего исследования использовали пять фракций, отмеченных на рис.б стрелками.

Эти фракции (за исключением фракции 3) проявляли более высокий уровень цнтотокспческой активности по сравнению с другими фракциями.

Наибольшую активность проявляла фракция 1, элюпруюшаяся при 30% ацетонитрила. Ее активность составляла 24,1 ±4,7% (р<0.05) (рис.6). С помощью БОБ-электрофореза в полнакрнламидном геле с последующим электропереносом па мембрану 1шишЫ1оп Р (МПНроге) мы обнаружили, что в данной фракции содержится белок с молекулярным весом 14кДа (р14) (рис.7). Дснсптометрический анализ полосы, соответствующей данному белку, показал, что из 200мл тромбоплазмы можно выделить не менее 30 пкмоль р14. Белок элюнровалн с мембраны и тестировали на цнтоток-сическую активность в концентрациях 10~8М, Ю~10М, 10-12М.

Наибольшую иптотокспческую активность, равную 21,8±7.4%, р14 проявлял в концентрацпи Ю~10М. Цнтотокснческая активность данного белка определялась в трех концентрационных разведениях (через 2 порядка) в 18 часовом тесте, так как скорость развития индуцируемых различными цитолитиками долговременных цитолитическнх процессов зависит от их концентрации и такая схема дает возможность детектировать цптотоксп-чески активные вещества с наибольшей вероятностью.

Была установлена Х-концевая аминокислотная последовательность р14: Туг-А1а-С1у-С1п-С1и-С1п-РЬе-С1у-Рго-

Поиск в банке первичных структур РШ. показал, что данная последовательность уникальна и пмеет ограниченную степень гомологии с участком полипептидной цепи СЬ компонента комплемента (242 - 251 а.к.о.): р14 Туг-А1а-С1у-С1п-С1и-С1п-РЬе-С1у-РгоЛ'а1-

С1я -\al-Ala-Giy-Asp-Arg-Gln-Phe-Gly-Pro-Tyr- (242 - 251 а.к.о.)

По-видимому этот белок может пополнить ряд известных пптотокспче-ских белков, продуцируемых клетками иммунной системы.

Было проведено также Электрофоретичсское разделение фракций 2, 3, 4, и 5 с последующим электропереносом на мембрану ЬшпоЬПоп. Во фракции 2 содержится белок с молекулярной массой 14кДа. во фракции 3 -белки с молекулярными массами 2()кДа и 25кДа, во фракциях 4 и 5 содержится около 10 белков белков в каждой фракции (Рис.7.8). Проводили анализ цнтотокспческой активности белков: белки наносили параллельно в два кармана полнакрнламндпого геля, после электрофореза

i 3;

Рис.8. SDS - электрофорез в полшкриламцдном геле с последующим электропереносом на мембрану Immobilem (окраска Coomassie R 250) фракций 3 - (Ц 4 - (2Х 5 - (ЗХ выделенных из тромбоцитов человека с помощью HPLC на колонке Hi Роге и обладающих цитотоксическвй активностью по отношению к клеточной линии ACL. Справа - набор стандартных белков для электрофореза (Bio- Rad, USA). Сверху вниз -молекулярная масса (кДа).

п электропереноса на мембрану Iinmobilon одну из дорожек окрашивали Кумасси R-250, другую разрезали на полоски шириной 5 мм. с которых элюировали белки. Оказалось, что белок молекулярной массой 14кДа из фракции 2 проявлял пптотоксическую активность 11.0±3.G'X ! р< 0.05) при концентрации белка 1О-10М

(Денсптометрическпй анализ полосы, соответствующей этому белку показал, что он содержится в выделенной фракции в количестве не менее 10 пкмоль). Цитотокспческая активность белков из фракции 3 достоверно не выявлена.

Максимумы активности для фракции 4 приходятся на область 67-95 кДа, а также на 25кДа. а для фракции 5 — 80 - 95 кДа. 35 кДа и 20кДа.

Была определена удельная активность цптотоксических белков фракций 1-5 (Таблица 4>.

1(1

Таблица 4

Анализ цитотоксической активности белков при фракционировании су-

Стадии Анализируемые Цнтотоксическая Удельная

очистки вещества активность, ЕД активность. ЕД/мг

Исходный

супернатант

HPLC, фракция 1 21,1 1.2х103

Hi-Pore Rl>-:i(M фракция 2 I7,:i 1,1 х Ю3

фракция 3 10.!) 6.lxll)J

фракция 4 17,0 4.9х10г

фракция 5 1-1.0 ЗДхЮ2

Электрофорез, pit из фракции 1 21,8 5,2 х106

блоттинг, pi4 из фракции 2 11,0 7,8 x10е

элюцня р25 из фракции 4 18,8 3,0x10s

р20 из фракции 5 20,6 5,2 x10s

рЗо чэ фракции 5 Ы,6 2,8 x10s

С помощью колонки Ш Роге удалось достичь лучшего разделения белков и идентифицировать больше цитотокспческпх белков. Цитотоксиче-ские белки с молекулярными массами 14 кДа и 35 кДа выделены как с помощью НРЬС на колонке иНгароге ИРБС. так и на колонке Ш Роге. Цитотоксические белки молекулярной массы 14 кДа и 80 - 95 кДа присутствовали и в супернатанте актипиропанных тромбоцитов (см. пыше). Можно сделать предположение об идентичности белков соответствующих молекулярных масс, выделенных разными способами.

Таким образом, из тромбоцитов человека нам удалось выделить цитотоксические белки, определить их противоопухолевую активность по отношению к КМ АСЬ п установить пх молекулярные массы: 14 кДа, 20 кДа. 25 кДа, 35 кДа. 67 - 95 кДа. Для белка молекулярной массы 14 кДа установлена N - концевая аминокислотная последовательность и показана ее уникальность и ограниченная степень гомологии с участком полипептидной цепи СИя компонента комплемента. Некоторые из этих белков, вероятно, могут сек ретироваться тромбоцитами при активацпп в неизменном виде пли после специфического протеолпза, так как. нами установлено, что в супернатанте активированных РА Г тромбоцитов находятся цитотоксические белки с молекулярными массами И) - 15 кДа. 30 кДа и 80 - 95 кДа.

Можно заключить, что иитотоксическая противоопухолевая активность тромбоцитов опосредуется целым спектром цитотокспческпх белков, кото-

рый, вероятно изменяется в зависимости от способа активации и используемых клеток - мишеней, что обуславливает специфичность пптотокснче-ского эффекта тромбоцитов.

8 Определение нуклеосомальной фрагментации ДНК клеток линии ACL при их инкубации с тромбоцитами человека

В связи с возрастанием интереса к проблеме изучения механизмов цитолиза в связи с развитием методов иммунотерапии злокачественных опухолей, нами предпринята попытка определения механизма цитолиза клеток - мишеней линии ACL под действием неактпвпрованных тромбоцитов здоровых доноров, тромбоцитов, активированных PAF в различных концентрациях, а также под действием цнтотоксическнх белковых фракций из тромбоцитов человека. Выявление нуклеосомальной фрагментации ДНК КМ позволило бы заключить, что гибель КМ происходит по механизму апоптоза.

Сначала в данном эксперименте в качестве эффекторов мы использовали тромбоциты человека от 4 здоровых доноров с высоким уровнем цнто-токсической активности: от 50 до 65%.

После 18-ти часовой инкубации с тромбоцитами из КМ выделяли ДНК и анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

На рис.9, представлены результаты детекции нуклеосомальной фрагментации ДНК в клетках линии ACL при их инкубации с тромбоцитами. Критерием положительных результатов детекции является присутствие фрагментов ДНК в опытных треках и их отсутствие в контрольном треке. При электрофоретпческом анализе ДНК. выделенной из клеток - мишеней линии ACL, не было выявлено признаков нуклеосомальной фрагментации, индуцированной неактпвнрованными тромбоцитами человека.

Далее нами были проведены аналогичные исследования при использовании в качестве эффекторов тромбоцитов 1 здорового донора, активированных PAF в концентрациях 10_()М. 10"'М, К)""ЧМ. Из 19 обследованных доноров тромбоциты этого донора активировались в наибольшей степени.

На рис.10 представлены результаты детекции нуклеосомальной фрагментации ДНК в клетках линии ACL. при их инкубации с тромбоцитами, активированными PAF в различных концентрациях. Анализ полученного изображения не позволяет выявить присутствия нуклеосомальных

5 I : I

Рис. 9 Анализ фрагментации ДНК клеток - мишеней ACL при их инкубации с тромбоцитами здоровых доноров - (I). (2). (3 >. i4): контроль клеток 15 маркер ДНК фага X - Hind III - (6).

: :■ -i

> *

i' ■ ' 4 1 .

к- и ' * Л. >»'Д

*

iVr-' * ц 1 f ' " , , ( :■ ••Л

Рис. 10. Аналю фрагментации ДНК клеток - мишеней ACL при их инкубации с тромбоцитами человека, активированными PAF в концентрациях 10^1 (2), Ю 'М (5), Ю*М(7); контроль клеток (3). контроль PAF, Ю^М (1 к юмггроль PAF, Ю'М (4); ко1ггроль PAF. 10'М(6).

* - s

Рис. 11. Анализ фрагментации ДНК клеток - мишеней ACL при их инкубации с цитотонеическими белковыми фракциями 1,2,4, 5 (слева направо соответственно, далее - контроль клеток - мишеней).

фрагментов ДНК в опытных треках.

При действии цитотоксическнх белковых фракций 1, 2, 4. о. выделенных с помощью HPLC на колонке Hi Роге, на клетки лпнпп ACL в 18-ти часовом тесте также не было зарегистрировано детектируемой фрагментации ДНК (Рис. 11), хотя степень деградации ДНК КМ под действием фракции 4 намного превышает контрольный уровень.

Не наблюдается корреляционной зависимости между ппютоксической активностью тромбоцитов, определяемой в тесте с МТТ и появлением ну-клеосомальных фрагментов при электрофоретнческом анализе ДНК, выделенной из клеток-мшденей. Активация тромбоцитов PAF не приводит к появлению нуклеосомальных фрагментов ДНК. Цптотоксические белковые фракции из тромбоцитов человека также но вызывают появления нуклеосомальной фрагментации ДНК KM ACL.

Далее нами были также проведены эксперименты по выявлению нуклео-

сомальной фрагментации ДНК KM ACL под действием неактпвированных тромбоцитов здоровых доноров, тромбоцитов, активированных PAF в различных концентрациях, а также; под действием цитотокепчеекпх белковых фракций из тромбоцитов человека в 2-х. 4-х и 6 - часовых тестах. Детектируемой фрагментации ДНК КМ зарегистрировано не было.

Вероятно, что гибель клеток - мишеней при их пзаимодействни с тромбоцитами происходит без нуклеосомальной фрагментации ДНК. По - видимому, при этом цитолиз происходит по механизму, отличному от апоптоза.

Необходимы еще дополнительные исследования морфологических изменении KM ACL в процессе цитолиза, чтобы решить окончательно вопрос о его механизме.

Полученные нами данные по определению механизма гибели опухолевых клеток - мишеней можно расценивать как свидетельство того, что цитотокснческин противоопухолевый эффект тромбоцитов реализуется посредством цитотокепчеекпх белков, так как прп инкубации КМ и с тромбоцитами, и с активированными тромбоцитами, и с цптотокепчеекпмп белковыми фракциями из тромбоцитов наблюдалась аналогичная картина деградации ДНК без ее нуклеосомальной фрагментации. Прп этом механизм гибели КМ, по - видимому, отличен от апоптоза.

ВЫВОДЫ

1.Установлено, что пптотоксическая противоопухолевая активность тромбоцитов обусловлена спектром цитотоксическнх белков, которые содержатся в суперпатапте активированных тромбоцитов, а также могут быть выделены из натпвных тромбоцитов.

2.Установлено, что цптотокенчеекпе белки тромбоцитов способны оказывать противоопухолевое действие на клетки линии аденокарпнпомы легких.

3.Установлено, что ннтотоксическпе белки, выделенные из суперна ганта активированных тромбоцитов после пх стимуляции ([»актором актппаппн тромбоцитов, имеют молекулярные массы 10 - 1j кДа. 31) кДа. 80 - П") кДа. а цптотоксические белки, выделенные из натнвных тромбоцитов имеют молекулярные массы 1 ! кДа. 21) к Да. 2"» к Да. 3") к Да. 67 - 9 о кДа.

1.Для ннтотоксичеекчго белка молекулярной массы •'!() кДа. выделенного из супернатанта активированных тромбоцитов установлена N - концевая аминокислотная последовательность из четырех аминокислотных остатков:

.

Asp-Val-Gly-Leu-.

5.Для цитотоксического белка молекулярной массы 14 кДа. выделенного из нативных тромбоцитов установлена N - концевая аминокислотная последовательность из десяти аминокислотных остатков:

Tyr-Ala-Gly-Gln-Glu-Gln-Plie-Gly-Pro-Val-.

показана ее уникальность и ограниченная степень гомологии с участком полипептидной цепи Cls компонента комплемента (242 -251 а.к.о.).

6. Установлено, что при инкубации тромбоцитов человека, а также цитотоксических белков из тромбоцитов человека, с клетками - мишенями линии аденокарциномы легкого человека детектируемая фрагментация ДНК отсутствует.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1.Т.С.Голубева, А.Р.Тугуз. О.Ю.Чертов. М.В.Киселевский. Выделение цитотоксических белков тромбоцитов человека. Бюл.экспер.бпол. - 1996. - N8. - С.183.

2.Т.С.Гол.убева. Выделение цитотоксических белков тромбоцитов человека. Деп. в ВИНИТИ N 1346 - В96. РЖ "Биохимия".

3.Т.С.Голубева. Определение нуклеосомальной фрагментации ДНК клеток линии ACL при их инкубации с тромбоцитами человека. Деп. в ВИНИТИ N 1347 - В96. РЖ "Биохимия".

4.А.Р.Тугуз, М.В.Кпселевский. А.М.Бунцевнч. Д.В.Комов. Б.Е.Полоцкий. В.А.Нормантович. И.Г.Комаров. Т.С.Голубева. Е.М.Рощнн. С.Н.Быковская. Цитотокснческая активность тромбоцитов и мононуклеаров периферической крови онкологических больных и здоровых доноров. Нюл. экспер. биол. - 1996. - N2. - С.192.

Автор выражает благодарность А.Р.Тугуз. В.М.Паромову. Д.Ю.Малкону за помощь в методической части работы над диссертацией.