Цитостатическая активность низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток

Повещенко, Ольга Владимировна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитостатическая активность низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Повещенко, Ольга Владимировна Новосибирск 2005 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Цитостатическая активность низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток

На правах рукописи

Повещенко Ольга Владимировна

ЦИТОСТАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОДУКТОВ ОПУХОЛЕВЫХ

КЛЕТОК.

14.00.36-«Аллергология и иммунология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: Козлов Владимир Александрович

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Ширинский Валерий Степанович

профессор

Доктор медицинских наук Шурлыгина Анна Вениаминовна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт фармакологии Томского Научного Центра.

Защита состоится "_" _2005 г. в_часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.001.01. «Аллергология и иммунология» при Государственном учреждении Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14).

Автореферат разослан "_" февраля 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Кудаева О.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проблема заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований - одна из наиболее актуальных в современной медицине. По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире умирает от рака более 4 миллионов человек. Рак входит в число трех основных причин смерти.

Существование противоопухолевого иммунного ответа не вызывает сомнения. Опухолеспецифический иммунный ответ демонстрируется в экспериментах in vitro и in vivo, а опухолеассоциированные антигены идентифицированы для многих опухолей (Lala P.K. et al., 1998). Однако, опухоль использует множественные пути для ускользания от надзора иммунной системы. Пассивные механизмы избегания иммунного ответа связаны со структурными изменениями опухолевой клетки - отсутствие или недостаточность презентации опухолеспецифичных антигенов на опухолевых клетках, снижение экспрессии молекул гистосовместимости, отсутствие костимулирующих молекул и молекул адгезии (Schauenstein К. et al., 1998; Strand S. et al., 1998).

Менее охарактеризованы и понятны изменения в опухолевых клетках, которые обусловливают более агрессивные способы резистентности, включающие активную деструкцию эффекторных клеток иммунной системы (Liyanage U.K. et al., 2002; Lötz M. et al., 1994). Опухолевые клетки используют комплекс защитных механизмов, позволяющих им активно вмешиваться в противоопухолевый иммунный ответ. Среди них особое место принадлежит способности опухолевых клеток продуцировать широкий спектр иммуносупрессорных медиаторов, результатом действия которых является угнетение функциональной активности опухолеспецифических клеток, в первую очередь Т-лимфоцитов. Рост опухоли сопровождается развитием системной иммуносупрессии, выраженность которой различна при разных видах опухоли. Участие в этих процессах отдельных иммуносупрессорных агентов, продуцируемых опухолевыми клетками, охарактеризовано (ТРФ-ß, ИЛ-10, ПГЕ2, NO) (Hidalgo G. et al., 2002; Wojtowicz-Praga S., 2003). В то же время, признается, что в развитии иммуносупрессии при опухолевом процессе задействованы не только эти известные медиаторы, но очевидно и другие неидентифицированные агенты (Klajman A. et al., 1992; Nakamura М. et al., 1980; Putman J.B. et al., 1985). Особый интерес вызывают низкомолекулярные молекулы, которые могут оказывать антипролиферативное действие. Но природа и механизмы их действия не определены.

С другой стороны, продуцируемые опухолью иммуносупрессорные агенты могут оказывать аутокринное негативное действие, подавляя рост опухоли (ТРФ-ß, NO), либо позитивное, являясь аутокринными ростовыми факторами (ИЛ-10, nrE2)(Chouaib S. et al., 1997; Gravisaco M.J. et al., 2002; Isoe S. et al., 1998; Shao J.et al., 2003). Направленность аутокринного действия определяется спектром медиаторов, продуцируемых опухолевой клеткой.

РОС. НА!Н"(Н\ЛЬНАЯ , ВИР. 1.«ОТЕКА ^СЛетсрбург

JMSPK

Остается открытым вопрос о влиянии низкомолекулярных медиаторов опухолевых клеток на собственный рост.

Особое место среди опухолевых клеток занимают лейкозные клетки, для которых микроокружением является костный мозг Полученные ранее данные свидетельствуют, что клетки костного мозга обладают выраженной способностью тормозить рост лейкемических клеток in vitro и in vivo за счет растворимых медиаторов, в том числе низкомолекулярных (Селедцова Г.В., 2003; Angulo I. et al., 1995; Sugiura К. et al., 1998). He до конца ясно, какую роль оказывают лейкозные клетки на функциональные способности клеток костного мозга. Роль низкомолекулярных медиаторов опухолевых клеток в паракринном действии на клетки костного мозга не исследована.

Таким образом, углубление и накопление знаний о механизмах взаимоотношения опухоли и иммунной системы позволит найти новые подходы к иммунотерапии онкозаболеваний.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель работы - исследовать механизмы действия низк'омолекулярных продуктов, продуцируемых лейкозными клетками, на иммунный ответ и рост опухолевых клеток in vitro.

Задачи исследования: 1.Выделить и охарактеризовать низкомолекулярные продукты лейкозных клеток L1210 и Р815 и нормальных клеток костного мозга и оценить их влияние на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов. 2.0ценить влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на пролиферацию опухолевых клеток. З.Исследовать влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на иммуносупрессорную и противоопухолевую активность костномозговых клеток. ^Охарактеризовать антипролиферативные механизмы действия низкомолекулярных продуктов клеток L1210 и Р815.

Научная новизна работы. Впервые получен низкомолекулярный опухолевый медиатор клеточных лейкозных линий Р815и L1210 (ОСФ), который по физико-химическим и функциональным характеристикам отличается от всех ранее описанных супрессорных факторов костномозгового происхождения. ОСФ не является белком, имеет молекулярный вес <0,5kDa, термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, действию липазы и фосфолипазы С, не чувствителен к обработке нейраминвдазой. Показано, что ОСФ обладает прямой иммуносупрессорной антипролиферативной активностью за счет блокады клеточного цикла и индукции апоптоза и отменяет иммуносупрессорное действие клеток костного мозга. ОСФ не обладает аутокринной цитостатической активностью и не влияет на цитостатическую активность клеток костного мозга.

Научная и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о роли растворимых медиаторов лейкозных клеток в регуляции иммунологических функций и опухолевого роста. Показано, что

низкомолекулярные медиаторы опухолевых клеток Р815 и L1210 оказывают иммуносупрессорное действие и не влияют на опухолевый рост. Физико-химические и функциональные характеристики ОСФ обусловливают целесообразность определения молекулярной структуры этого фактора и получения нового фармакологического препарата, обладающего иммуномодулирующим действием.

Основные положения, выносимые на защиту. 1.Опухолевые клетки секретируют низкомолекулярные <0,5kDa антипролиферативные медиаторы.

2.Опухолевый супрессорный фактор (ОСФ) по физико-химическим и функциональным свойствам отличается от низкомолекулярного костномозгового фактора (КСФ).

3.Низкомолекулярный ОСФ вовлечен в регуляцию как Т-, так и В-клеточных реакций.

4.Лейкозные клетки не способны к регуляции собственного роста in vitro посредством низкомолекулярных растворимых продуктов и контактного торможения.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации представлены на отчетных сессиях ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997г.,2000г), семинарах лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997-2004г), на российской научно-практической конференции „Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2004 г.). Апробация диссертации состоялась 13 января 2005 г. на расширенном семинаре ГУ НИИ Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на 115страницах машинописного текста, включающего 3 таблицы и 18 рисунков. Список литературы содержит 198 литературных источников, из них 183 зарубежных.

Работа выполнена в лаборатории клеточных технологий ГУ НИИКИ СО РАМН. Руководитель лаборатории - д.м.н. Селедцов В.И.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Животные. Мыши С57В1/6 (Н-2Ь), DBA (H-2d), (CBAxC57BL/6)Fl (H-2k/H-2b), (DBAxC57BL/6)F I (H-2d/H-2b) 4-6 месячного возраста. Линии опухолевых клеток. В работе использовались клетки мастоцитомы Р815 (Н-2") и лимфомы L1210 (H-2d).

Получение клеточных суспензий. Суспензии клеток мышиной селезенки получали посредством осторожного выдавливания клеток из тканевых кусочков в охлажденную среду с использованием специального пестика. Клетки костного мозга получали при помощи перфузии бедренных и больших берцовых костей. Кусочки костного мозга разбивали путем пипетирования. Затем осаждали недиссоциированные клеточные конгломераты при 4°С в течение 7 минут. Освобожденные от конгломератов клетки тщательно отмывали в среде RJPM1 1640 с 1% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) и после оценки жизнеспособности методом исключения трипановым синим использовали в экспериментах.

Условия культивирования. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 г/л NaHC03, 2 мМ L-глютамина, 5х10"5 M меркаптоэтанола, 30 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС (полная культуральная среда), при 37° С, во влажной атмосфере с 5% С02.

Получение культуральных супернатантов. Опухолевые клетки и клетки костного мозга культивировали в лунках 24-луночного планшета в бессывороточной среде RPM1 1640 в концентрации Зх106/мл в объёме 1,5 мл на лунку в течение 24 часов. Супернатанты, отделенные от клеток центрифугированием, фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и далее хранили до использования при -20°С

Выделение ОСФ и КСФ. Культуральный супернатант подвергали температурной обработке при 80°С в течение 20 минут. Для выделения низкомолекулярных продуктов <10kDa и <0,5kDa супернатант продавливали сквозь ультрафильтрационные мембраны YM 10 или YM 5 (Amicon) под давлением 30-40 psi. Полученные фракции стерилизовали посредством фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и хранили до использования при -20°С.

Ферментная обработка. Ультрафильтрационные образцы, содержащие ОСФ и КСФ (опыт) или не содержащие его (контроль), подвергались ферментаым обработкам в условиях, предписанных фирмой-производителем ферментов (Sigma). Затем образцы подвергались термической обработке при 80°С в течение 20 минут с целью инактивации ферментов, центрифугировались в ультрафильтрационной пробирке Microcon-10 (Amicon) при 2000 об/мин в течение 25 минут. Образцы хранили до тестирования при -20°. Пролиферативные тесты.

1 .Клетки селезенки мышей (CBAxC57BL/6)Fl или (DBAxC57BL/6)Fl в количестве 3x105 на лунку культивировали в течение 48 часов в присутствии ЛПС (12 мкг/мл) или КонА (5 мкг/мл).

2.Клетки селезенки мышей С57В1/6 и DBA по 1,5x10s на лунку культивировали совместно в течение 48 часов (двунаправленная CKJI).

3.Клетки опухоли L1210 и Р815 культивировали в количестве 104 на лунку в течение 24 или 7 часов в круглодонных (BDSL, Великобритания), либо в

ряде экспериментов в плоскодонных (Nunc, Дания) и конусообразных (Linbro, США) планшетах.

4.Клетки опухоли L1210 и Р815 культивировали в количестве 104 на лунку с клетками костного мозга в соотношении 1:20 в течение 7 часов.

5.Клетки костного мозга в количестве ЗхЮ5 в лунку, предварительно инкубированные с ОСФ или КСФ в течение 20 часов, культивировались совместно со спленоцитами в количестве 3x10s на лунку в течение 48 часов в присутствии Л ПС (12 мкг/мл) или КонА (5 мкг/мл).

6.Клетки костного мозга в количестве ЗхЮ5 в лунку, предварительно инкубированные с ОСФ или КСФ в течение 20 часов, культивировались совместно с клетками опухоли L1210 и Р815 в количестве 104 на лунку в течение 24 часов.

Культивирование проводили, если не указано особо, в круглодонных 96-луночных планшетах (BDSL, Великобритания). В опытных пробах клетки культивировались в присутствии растворимых добавок в конечной концентрации 30%, "если не указано особо. В контроле клетки культивировались без добавок. Во всех экспериментах за 6 часов до окончания культивирования в культуры вносили [3Н]-тимидин (0.75 мкС1/лунку).

Уровень пролиферативной клеточной активности определяли, используя стандартную процедуру, включавшую перенос клеток на стекловолоконный фильтр и учет радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного Р-счетчика.

Процент супрессии клеточной пролиферации вычисляли по формуле: имп/мин в опыте

% супрессии -(1---------------------------)х100

имп/мин в контроле

Контрольное включение изотопа в митоген-стимулированные лимфоциты составляло не менее 110000 имп/мин, в CKJ1 не менее 60000 имп/мин, в опухолевые клетки не менее 100000 имп/мин. Определение уровня апоптоза и анализ клеточного цикла.

Анализируемые клетки однократно отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида Na (раствор 1) и фиксировали в течение 30 минут холодным 1% раствором параформальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 1 мл раствора 1, содержащего пропидиума иодида (Propidium iodide, Sigma, США) в конечной концентрации 50 мкг/мл и РНКазы (Sigma, США) в концентрации 20 мкг/мл, после чего образцы клеток инкубировали в темноте в течение 30 минут при 37°С.

Анализ клеточного цикла и уровня апоптоза проводили на основании измерения содержания ДНК методом проточной цитофлуорометрии с использованием лазерного клеточного сортера-анализатора FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Процентное содержание апоптотаческих клеток и клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, рассчитывалось по

одномерной гистограмме красной флуоресценции клеток, которые формировали пики в соответствии с плоидностью ДНК. Статистический анализ данных. Представленные данные (средние значения, дополненные соответствующими стандартными отклонениями) были воспроизведены не менее чем в 3 однотипных экспериментах. Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с помощью программы "БИОСТАТИСТИКА" непараметрическим критерием Манна-Уитни (р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ. Характеристика иммуносупрессорной активности низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток.

Ранее показано, что свежеизолированные клетки костного мозга мышей способны супрессировать бластогенез Т- и В- лимфоцитов и реакцию в СКЛ in vitro (Seledtsov V.I. et al., 1997). Супрессорное действие было воспроизведено при исследовании растворимых продуктов костномозговых клеток - надосадочная жидкость, полученная при культивировании, обладает сопоставимой с клетками антипролиферативной активностью.

Опухолевые клетки различного происхождения также опосредуют свой иммуносупрессорный потенциал через растворимые продукты, описано значительное число таких медиаторов (ТРФ-р, ИЛ-10, ПГЕ2, NO, ганглиозиды), определена их структура и молекулярный вес (Hidalgo G. et al, 2002; Wojtowicz-Praga S. 2003). Тем не менее, супрессорная активность опухолевых клеток подчас связана с неидентифицированными, в том числе низкомолекулярными факторами (Klajman A. et al., 1992; Nakamura М. et al., 1980; Putman J.B. et al., 1985).

Как было показано ранее в лаборатории регуляции иммунопоэза ГУ НИ ИКИ СО РАМН, низкомолекулярные <5kDa продукты, полученные при культивировании нормальных свежеизолированных клеток костного мозга мышей сохраняют присущий цельному нефракционированному культуральному супернатанту антипролиферативный потенциал. Низкомолекулярные медиаторы эритроидных клеток также обладают высокой супрессорной активностью. Для того чтобы ответить на вопрос, сохраняется ли у опухолевых клеток костномозгового происхождения лимфомы L1210 и мастоцитомы Р815 присущая для нормальных клеток костного мозга способность секретировать регуляторные факторы, мы выделили низкомолекулярные фракции из опухолевых супернатантов двух опухолевых линий и сравнили их действие с цельными нефракционированными растворимыми продуктами опухолевых клеток.

На рисунке 1 показано, что надосадочная жидкость культур клеток опухолевых линий лимфомы L1210 (рисунок 1А) и мастоцитомы Р815 (рисунок 1Б) способна на 38-45% супрессировать пролиферативный ответ как КонА- и ЛПС-стимулированных лимфоцитов, так и пролиферацию

лимфоцитов в двунаправленной СКЛ. Таким образом, исходные супернатанты обладают цитостатической активностью.

Рисунок 1. Супрессорный эффект цельных растворимых продуктов опухолевых клеток на КонА-, ЛПС-индуцированную пролиферацию спленоцитов и СКЛ.

А- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии цельных растворимых продуктов Ы210.

Б- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии цельных растворимых продуктов Р815.

*- достоверность различий (р<0,05) показателей в опытной и контрольной группах.

Но цельный нефракционированный супернатант может содержать большой ряд описанных в литературе антипролиферативных агентов, таких как ТРФ-р, ИЛ-10, N0, ПГЕ2.

Рисунок 2 демонстрирует, что после удаления продуктов с молекулярной массой >10Ша, таким образом исключая действие ТРФ-Р (м.в.-]2 кОа), ИЛ-10 (м.в.-17-21 Ша), сосудистого эндотелиального ростового фактора (м.в.-Зб-45 кОа), Раэ-лиганда (м.в.-40 кБа), части ганглиозидов в форме высокомолекулярных везикул, культуральный супернатант практически не изменил свою иммуносупрессорную активность в отношении КонА, ЛПС-стимулированных спленоцитов и в СКЛ (супрессия пролиферативного ответа 37-47%). Фракция опухолевого супернатанта <0,5Юа, добавленная в той же конечной концентрации (30%), обладала также достоверным сопоставимым антипролиферативным иммуносупрессорным действием (34-39%). Таким образом, низкомолекулярные медиаторы двух опухолевых линий Ы210 и Р815 являются ведущими в их антипролиферативном иммуносупрессорном действии.

Надо отметить, что растворимые продукты клеток различного гистогенетического происхождения (Ы210 из лимфоидного ростка Р815- из миелоидного), хотя одинакового гаплотипа (Н-2с1), проявляют сопоставимые действия. Очевидно, каждая опухоль продуцирует индивидуальный набор регуляторных агентов, а не гистологическая или анатомическая принадлежность определяет спектр секретируемых цитокинов.

А- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии растворимых продуктов Ь1210. Б- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии растворимых продуктов Р815 *- достоверность различий (р<0,05) показателей в опытной и контрольной группах.

Рисунок 2. Супрессорный эффект растворимых продуктов опухолевых клеток на КонА-, ЛПС- индуцированную пролиферацию спленоцитов и СКЛ.

Для исключения влияния процедуры фильтрования через мембраны, в качестве контроля использовался низкомолекулярный <0,5к0а ультрафильтрат среды ИРМЫ 640, который не оказывал супрессорного действия на митоген-стимулированный бластогенез.

Мы выделили такую же по молекулярному весу <0,5№а фракцию из супернатанта свежеизолированных клеток костного мозга и сравнили ее действие с такой же по молекулярному весу фракцией супернатанта лейкозных клеток. Как показано на рисунке 3, низкомолекулярный <0,5кБа опухолевый супрессорный фактор (ОСФ) клеток 1Л210 (рисунок ЗА) и Р815

(рисунок ЗБ) способен дозозависимо ингибировать пролиферацию стимулированных лимфоцитов, и при уменьшении концентрации фактора в лунке в 4 раза (с 30% до 7,5%) сохраняется супрессорная активность на достоверном уровне (супрессия пролиферации 25%). Костномозговой низкомолекулярный фактор (СКФ) (рисунок ЗВ) также действует дозозависимо и сохраняет значительный иммуносупрессорный потенциал при уменьшении его концентрации в лунке до 7,5%.

-/ГС —схл

2М 4» 73» -в» ЗОЛ

2* -ГУ. 75*, 18* згоь

А-супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии ОСФ 1,1210.

Б- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии ОСФ Р815.

В- супрессия пролиферативного ответа спленоцитов в присутствии СКФ.

Рисунок 3. Дозозависимое сунрессорное влияние фракции <0,5к0а опухолевых и костномозговых продуктов на лимфобластогенез.

Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что растворимые продукты опухолевых клеток костномозгового происхождения лимфомы Ы210 и мастоцитомы Р815 по своему супрессорному действию на пролиферацию митоген-стимулированных лимфоцитов сопоставимы с растворимыми продуктами свежеизолированных клеток костного мозга. Иммуносупрессорная активность и опухолевого супрессорного фактора и супрессорного костномозгового фактора концентрируется в низкомолекулярной фракции <5000а.

Оба фактора являются термостабильными, так как не изменяют свою антипролиферативную активность в отношении митоген-стимулированных лимфоцитов после прогревания при 1°=80С в течение 20 минут.

Закономерен вопрос об идентичности полученных нами медиаторах. Исследуя супрессорную активность в отношении митоген- стимулированных спленоцитов после ферментной обработки, мы обнаружили, что ОСФ резистентен к ферментному протеолизу (трипсину и хемотрипсину), действию липазы и фосфолипазы С, и надо отметить, не чувствителен к обработке нейраминидазой. В отличие от опухолевого фактора, СКФ значительно снижает свою иммуносупрессорную активность при обработке нейраминидазой, но так же, как ОСФ не чувствителен к действию других ферментов.

Таблица 1.Супрессорная активность ОСФ и СКФ после обработки ферментами.___

ФЕРМЕНТ ОСФ-СУПРЕССИЯ ОТВЕТА НА ЛГ1С(%) СКФ-СУПРЕССИЯ ОТВЕТА НА ЛПС (%)

Без ферментов 33±2 37±4

Нейраминидаза 3±53 0

Фосфолипаза С 38±5 зш

Липаза 33±5 40±4

Трипсин+ хемотрипсин 35±2 31±2

Учитывая вышесказанное, мы предполагаем, что ОСФ не является белком, а может являться ди- или олигопептидом, имея в составе одну или несколько аминокислот, молекулярным весом от 89 до 204 Da. На хроматограмме исследуемого образца отсутствовал единый пик, следовательно, в составе ОСФ есть аминокислоты не содержащие ароматического кольца. Литературные данные подтверждают наши предположения о том, что даже одна аминокислота может влиять на пролиферацию клеток. Boldizsar Н. et al., 1999, показали, что глицин ингибирует, а аспарагин и глютамат увеличивают пролиферацию лейкозных клеток К562 и клеток меланомы НТ168 в 48-часовой культуре in vitro.

Таким образом, нами идентифицирован новый иммуносупрессорный фактор, который отличается от ранее описанных медиаторов костномозгового происхождения.

Для того чтобы определить, с чем связано снижение пролиферативного ответа митоген-стимулированных спленоцитов под влиянием ОСФ, был

оценен уровень апоптоза у стимулированных КонА и ЛПС спленоцитов при культивировании их с ОСФ и без в контроле. Как следует из данных, представленных на рисунке 4, ОСФ <0,5к0а в конечной концентрации 30% достоверно увеличивает количество апоптотических клеток в КонА-стимулированных лимфоцитах в 18,5 раз, в ЛПС-стимулированных в 2,3 раза.

По оси ординат-процент апоптотических спленоцитов в присутствии ОСФ Ы210.

*- достоверность

различий (р<0,05) показателей в опытной и контрольной группах.

Рисунок 4. Уровень апоптоза в ЛПС- и КонА-стимулированных лимфоцитах под действием ОСФ.

И хотя мы получили достоверное увеличение содержания апоптотических клеток, все же абсолютный уровень апоптоза мал, что позволяет предполагать, что супрессия пролиферации лимфоцитов под влиянием ОСФ связана не столько с их апоптотической гибелью, сколько с состоянием функциональной неактивности - анергией.

В таблице 2 показан анализ клеточного цикла спленоцитов под влиянием ОСФ. При добавлении ОСФ в концентрации 30% как к КонА-, так и к ЛПС-стимулированным лимфоцитам, достоверно повышается доля клеток в во/О] фазах в 2 раза, что ведет к снижению числа лимфоцитов в 8-,С2/М- фазах. Таким образом, снижение пролиферации лимфоцитов при добавлении ОСФ обусловлено блоком клеточного цикла.

Таблица 2. Анализ клеточного цикла КонА - и ЛПС-стимулированных

фазы цикла КонА-стимулированные лимфоциты ЛПС-стим} лимс /лированные юциты

контроль ОСФ контроль ОСФ

ОоЮ, 14,54±0,5 28,37±1,2* 23,1±1,5 47,35±2,4*

БА/М 83,52±2,4 64,14±3,2 72,61±0,9 50,72±1,8

*- достоверность различий (р<0,05) показателей в опытной и контрольной группах.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о наличии иммунорегуляторной активности у клеток опухолевых линий L1210 и Р815, обусловленной действием низкомолекулярных растворимых продуктов. Но иммуносупрессорное действие опухолевых клеток, может бьггь не только прямым, но и опосредованным, через стимуляцию супрессорных клеток костного мозга. Ранее в лаборатории регуляции иммунопоэза ГУ НИ ИКИ СО РАМН была показана иммуносупрессорная активность клеток костного мозга. Мы предварительно прокультивировали клетки костного мозга в присутствии цельного супернатанта клеток опухолевых линий L1210 и Р815 и низкомолекулярной фракции (ОСФ) и оценили их влияние на лимфобластогенез.

На рисунке 5 показано, что способность клеток костного мозга супрессировать пролиферативный ответ КонА- и ЛПС-стимулированных спленоцитов практически полностью отменяется после предварительного 20-часового культивирования клеток костного мозга в присутствии как ОСФ, так и цельных опухолевых растворимых продуктов. Растворимые же продукты нормальных костномозговых клеток не изменяют супрессорную активность клеток костного мозга в отношении митоген-стимулированных лимфоцитов.

Рисунок 5. Влияние растворимых продуктов опухолевых и костномозговых клеток на иммуносупрессорную активность клеток костного мозга. В контроле-супрессия пролиферации митоген-стимулированных лимфоцитов клетками костного мозга

Таким образом, мишенью дистантной супрессорной активности низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток 1Л210 и Р815 являются

как Т-, так и В-лимфоциты. Оказывая прямое иммуносупрессорное действие, ОСФ не оказывает опосредованного, через супрессорные клетки костного мозга, антипролиферашвного действия на бластогенез Т- и В-спленоцитов. Более того, даже отменяет иммунносупрессорный эффект клеток костного мозга. Растворимые продукты костномозговых клеток, также прямо супрессируя лимфобластогенез, не изменяют супрессорное действие клеток костного мозга Следовательно, клетки костного мозга из-за своей иммуносупрессорной активности играют негативную роль при опухолевом росте. Но, с другой стороны, находясь в костном мозге, опухолевые клетки оказывают позитивное паракринное действие, отменяя обусловленную клетками костного мозга иммуносупрессию.

Известно, что многие цитокины могут обладать разнонаправленным действием в зависимости от типа отвечающих клеток и будучи супрессорными для иммунокомпетентных клеток выступать в роли позитивных или негативных аутокринных ростовых факторов для опухолевых клеток. Литературные данные преимущественно посвящены либо исследованиям иммуносупрессорного влияния опухолевых медиаторов, либо аутокринным воздействиям (Abolhassani М. et al., 1991; Buggins A. et al., 2001; Hirst W. et al., 2001; Korzelius J.M., 1983). Мы объединили исследования иммуносупрессорной и цитостатической противоопухолевой активности растворимых продуктов опухолевых клеток в рамках одной работы.

Опухолевые клетки в регуляции собственного роста.

Аутокринная регуляция опухолевого роста растворимыми продуктами опухолевых клеток может быть двунаправленной. Позитивная регуляция обусловлена секрецией ростовых факторов, способствующих росту опухоли, негативная - с выделением супрессорных агентов, которые вызывают ингибицию пролиферации (Chouaib S. et al., 1997). Влияние низкомолекулярных медиаторов опухолевых клеток в этом автономном процессе не определено. Представлялось важным оценить способность растворимых продуктов опухолевых клеток костномозгового происхождения лимфомы L1210 мастоцитомы Р815 влиять на свой рост. Мы определили, что надосадочная жидкость, полученная при культивировании опухолевых клеток, обладает слабовыраженным цитостатическим противоопухолевым действием. На рисунке 6 показано, что цельный культуральный супернатант лимфомы L1210 и мастоцитомы Р815 на 15% и 12% соответственно ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, но цитостатическое действие не является статистически достоверным (р >0,05).

А опухолевый низкомолекулярный фактор практически не влияет на пролиферацию лейкозных клеток (процент супрессии - 6-7%), то есть не проявляет аутокринного действия.

В отличие от опухолевого супернатанта, супернатант клеток костного мозга, как и низкомолекулярные медиаторы, на 40-60% ингибируют пролиферацию опухолевых клеток.

По оси абсцисс- супрессия пролиферации клеток 1Л210 в присутствии растворимых продуктов Ы210 (1) и клеток костного мозга (2). -супрессия пролиферации клеток Р815 в присутствии растворимых продуктов Ы210 (3) и клеток костного мозга (4).

Рисунок 6. Цитостатичсская активность опухолевых и костномозговых растворимых продуктов в отношении клеток Ы210 и Р815.

Как следует из данных, представленных на рисунке 7, ОСФ не изменяет количество апоггготических клеток 1Л210 и Р815, что логично объясняет отсутствие аутокринной цитостатической активности.

По оси ординат-процент апоптотичес-ких опухолевых клеток в присутствии ОСФ в конечной концентрации 30%.

Рисунок 7. Уровень апоптоза клеток Ы210 и Р815 под действием ОСФ.

Таблица 3 демонстрирует отсутствие блокирования клеточного цикла, показывая, что процент клеток в 0о/0| фазе не изменяется при культивировании опухолевых клеток с ОСФ.

Таблица 3.

Анализ клеточного цикла клеток 1Л210 иР815 под действием ОСФ.

фазы цикла Ы210 Р815

контроль ОСФ контроль ОСФ

Со/С, 47,01±2,5 47,02±2,2 44,93±2,9 44,47±3,5

ЗА/М 52,23±3,4 53,15±2,6 42,3±1,6 44,1±1,9

Ранее показано (Селедцова Г.В., 2003) что костномозговые растворимые продукты могут усиливать цитостатическуго активность клеток костного мозга в отношении опухолевых клеток. Как свидетельствуют результаты наших исследований, предварительная 20-часовая инкубация свежеизолированных клеток костного мозга в присутствии культурального супернатанта, кондиционированного опухолевыми клетками, не оказывает влияния на обусловленную клетками костного мозга супрессию пролиферации клеток опухолей. На рисунке 8 показано, что клетки костного мозга на 50% супрессируют пролиферативный ответ опухолевых клеток, а растворимые продукты опухолевых клеток Ы210 и Р815 практически не изменяют эту супрессию. Растворимые же продукты клеток костного мозга, как показано на рисунке 14, достоверно усиливают супрессию пролиферации клеток 1Л210 на 28-30%, а Р815 на 26-28%.

Рисунок 8. Влияние растворимых продуктов опухолевых и костномозговых клеток на цитостатическуго активность клеток костного мозга в отношении клеток Ы210 и Р815.

В контроле- супрессия пролиферации клеток 1Л210 и клеток Р815 клетками костного мозга мышей (СВАхС57В1/6)Р1

Таким образом, в костном мозге лейкозные клетки испытывают цитостатическое действие со стороны растворимых продуктов клеток костного мозга, а сами активно не припятствуют этому влиянию. Но с другой стороны, нормальные клетки костного мозга способны сдерживать опухолевый рост не только продукцией растворимого цитостатического фактора, но и путем межклеточного контактного взаимодействия.

Рисунок 9. Влияние плотности клеточных культур на пролиферацию клеток 1Л210 (2) и при совместном культивировании лейкозных клеток с клетками костного мозга (1) в течение 7 часов в планшетах с разной формой дна. *- достоверность различий (р<0,05) показателей в опытной и контрольной группах.

При добавлении к опухолевым клеткам свежевыделенных клеток костного мозга (рисунок 9) в 7-часовом пролиферативном тесте, когда минимизируется влияние растворимых факторов, определяется супрессия пролиферации клеток Ы210 и Р815, которая зависит от формы дна лунки, следовательно от клеточной плотности. Так, в лунках с коническим дном наблюдается наибольшая супрессия опухолевого роста в сравнении с аналогичным культивированием в лунках с плоским дном. Промежуточный уровень супрессии имеет место в лунках с круглым дном. Культивирование опухолевых клеток в планшетах с разным дном, т.е. различной плотности, не выявило различий в пролиферации клеток Ы210 и Р815, т.е. опухолевые клетки не обладают контактным торможением по отношению друг к другу.

Таким образом, опухолевые клетки путем продукции низкомолекулярных медиаторов могут быть вовлечены не только в прямую регуляцию иммунологических процессов, но и в систему противоопухолевого надзора в гемопоэтической ткани.

ВЫВОДЫ:

1. Низкомолекулярные 0,5Ша продукты опухолевых клеток Ы210 и Р815 обладают иммуносупрессорным действием, так как ингибируют пролиферацию КоиА- и ЛПС- стимулированных спленоцитов и генерацию цитотоксических лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

2.Опухолевые клетки 1Л210 и Р815 являются продуцентами супрессорного фактора (ОСФ), имеющего молекулярную массу меньшую или близкую 0,5к0а. Для него характерна термостабильность, резистентность к ферментному протеолизу, к действию липазы и фосфолипазы С и не чувствительность к обработке нейраминидазой, из чего следует, что ОСФ не является белком.

3. Механизмом антипролиферативного действия ОСФ является индукция апоптоза и блокада клеточного цикла митогенстимулированных Ти В-лимфоцитов, поскольку увеличивается количество апоптотических КонА- и ЛПС-стимулированных лимфоцитов и количество лимфоцитов в воЛ^-фазе.

4. Лейкозные клетки не чувствительны к аутокринному воздействию низкомолекулярных продуктов, так как ОСФ не изменяет пролиферацию, не блокирует клеточный цикл опухолевых клеток Ы210 и Р815 и не вызывает их апоптоз. Лейкозные клетки не способны к собственному контактному торможению, так как изменение плотности клеток в культуре не влияет на их рост, но сохраняют определенную чувствительность к контактному торможению со стороны клеток костного мозга, поскольку выраженность супрессорного действия костномозговых клеток в отношении пролиферации опухолевых клеток уменьшается по мере снижения плотности распределения клеток в совместных культурах.

5. ОСФ отменяет опосредованную клетками костного мозга иммуносупрессорную активность, поскольку нивелирует антипролиферативное действие клеток костного мозга на КонА- и ЛПС-стимулированный бластогенез. ОСФ не влияет на цитостатическое противоопухолевое действие клеток костного мозга, так как не изменяет пролиферативный ответ клеток Ы210 и Р815 на действие клеток костного мозга.

6. Наличие иммунорегуляторных функций у ОСФ свидетельствует об участии низкомолекулярных медиаторов, продуцируемых опухолевыми клетками, в ускользании опухоли из под системы противоопухолевого иммунного надзора.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Селедцов В.И., Тарабан В .Я., Селедцова Г.В., Самарин Д.М., Авдеев И.В., Сенюков В.В., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Противоопухолевая и естественная супрессорная активность костномозговых клеток. Сравнительное исследование // Научный отчет ИКИ СО РАМН 1996, Новосибирск 1997. - С.22-23.

2. Селедцов В.И., Селедцова Г.В., Тарабан В.Я., Сенюков В.В., Самарин Д.М., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Сравнительное исследование противоопухолевой цитостатической и естественной супрессорной активности костномозговых клеток // Бюлл.эксп.биол.и мед. -1998.-Т.125, № 4.-С.437-439.

3. Селедцов В.И., Сенюков В.В., Повещенко О.В., Тарабан В.Я., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Кащенко Э.К. Механизмы цитостатического действия костномозговых клеток. // Russian J.Immunology.- Тезисы докладов 2-го съезда иммунологов России (6-9 сентября 1999 года)-1999.- С.55.

4. Сенюков В.В., Селедцов В.И. Повещенко О.В., Тарабан В.Я., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Кащенко Э.А. Растворимый фактор и контактное межклеточное взаимодействие в вызываемой клетками костного мозга супрессии роста лейкозных клеток // Материалы 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН-2000 - С.121-122.

5. Сенюков В.В., Селедцов В.И., Повещенко О.В., ВЛ.Тарабан,, В А.Козлов. Растворимый фактор и межклеточное контактное взаимодействие в осуществляемом клетками костного мозга цитостазисе // Бюлл.эксп.биол.и мед.-2000- Т. 129(6)- С.657-660.

6. Seledtsov V.l., Senyukov V.V., Seledtsova G.V., Avdeev I.V., Samarín D.M., Taraban V.Ya., Poveschenko O.V., Morenkov A.V., Kozlov V.A. Bone marrow cells in suppressing leukemic cell growth // Russian Immimology.-2001.-V.6.-P.203-206.

7. Повещенко O.B., Селедцов В.Й., Тарабан В.Я., Самарин Д.М., Сенюков В.В., Селедцова Г.В., Козлов В.А. Спонтанная секреция опухолевыми линиями низкомолекулярного супрессорного фактора. //Евразийский Медицинский Журнал.- 2004.-Т.З.-С.58-67.

8. Повещенко О.В., Селедцов В.И., Сенюков В.В., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Козлов В.А. Роль низкомолекулярных опухолевых продуктов в регуляции иммунных реакций и роста опухоли Н Современное состояние и перспективы развитая экспериментальной и клинической онкологии -Материалы Российской научно-практической конференции (г.Томск, ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, 24-25 июня 2004 г.)- С .64.

)

(

Подписано в печать 31 01 2005 Формат 60x84 1/16 Уел печ л 1 Тираж 100 экземпляров Отпечатано в типографии ООО «Компания ЮзерС», г Новосибирск, Красный проспект 1ЭТУ1

РНБ Русский фонд

2005-4 46422

! 6 ФЕ5»

1199

Оглавление диссертации Повещенко, Ольга Владимировна :: 2005 :: Новосибирск

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1 .Противоопухолевый иммунитет.

1.1. Механизмы преодоления опухолью иммунологического надзора.

Глава 2.Иммуносупрессорная активность опухолевых клеток.

Глава 3.Опухолевые клетки в регуляции собственного роста.

3.1.Роль растворимых продуктов в регуляции опухолевого роста.

3.2.Роль контактного взаимодействия в опухолевом росте.

Глава 4.Цитостатическая и иммунносупрессорная активность клеток костного мозга.

4.1.Клетки костного мозга в торможении опухолевого роста.

4.2.Влияние опухолевых клеток на цитостатическую активность клеток костного мозга.

4.3.Естественная супрессорная активность клеток костного мозга.

ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 5.Характеристика иммуносупрессорной активности низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток.

Глава 6.Опухолевые клетки в регуляции собственного роста.

6.1.Роль растворимых продуктов в регуляции опухолевого роста.

6.2.Роль контактного взаимодействия в регуляции опухолевого роста.

ЧАСТЬ IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Повещенко, Ольга Владимировна, автореферат

Проблема заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований - одна из наиболее актуальных в современной медицине. По данным Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире умирает от рака более 4 миллионов человек. Рак входит в число трех основных причин смерти.

Существование противоопухолевого иммунного ответа не вызывает сомнения. Опухолеспецифический иммунный ответ демонстрируется в экспериментах in vitro и in vivo, а опухолеассоциированные антигены я идентифицированы для многих опухолей [10,95]. Однако опухоль использует множественные пути для ускользания от надзора иммунной системы. Пассивные механизмы избегания иммунного ответа связаны со структурными изменениями опухолевой клетки - отсутствие или недостаточность презентации опухолеспецифичных антигенов на опухолевых клетках, снижение экспрессии молекул гистосовместимости, отсутствие костимулирующих молекул и молекул адгезии [151,165].

Менее охарактеризованы и понятны изменения в опухолевых клетках, которые обусловливают более агрессивные способы резистентности, включающие активную деструкцию эффекторных клеток иммунной системы [102,104]. Опухолевые клетки используют комплекс защитных механизмов, позволяющих им активно вмешиваться в противоопухолевый иммунный ответ. Среди них особое место принадлежит способности опухолевых клеток продуцировать широкий спектр иммуносупрессорных медиаторов, результатом действия которых является угнетение функциональной активности опухолеспецифических клеток, в первую очередь Т-лимфоцитов. Рост опухоли сопровождается развитием системной иммуносупрессии, выраженность которой различна при разных видах опухоли. Участие в этих процессах отдельных иммуносупрессорных агентов, продуцируемых опухолевыми клетками, охарактеризовано (ТРФ-|3, ИЛ-10, ПГЕ2,>Ю) [68,183,190]. В то же время, признается, что в развитии иммуносупрессии при опухолевом процессе задействованы не только эти известные медиаторы, но очевидно и другие неидентифицированные агенты [82,130,143,180]. Особый интерес вызывают низкомолекулярные молекулы, которые могут оказывать антипролиферативное действие. Но природа и механизмы их действия не определены.

С другой стороны, продуцируемые опухолью антипролиферативные агенты могут оказывать аутокринное негативное действие, подавляя рост опухоли (ТРФ-|3, NO), либо позитивное, являясь аутокринными ростовыми факторами (ИЛ-10, ПГЕ2) [41,65,74,157,172]. Направленность аутокринного действия определяется спектром медиаторов, продуцируемых опухолевой клеткой. Остается открытым вопрос о влиянии низкомолекулярных медиаторов опухолевых клеток на собственный рост.

Особое место среди опухолевых клеток занимают лейкозные клетки, для которых микроокружением является костный мозг. Полученные ранее данные свидетельствуют, что клетки костного мозга обладают выраженной способностью тормозить рост лейкемических клеток in vitro и in vivo за счет растворимых медиаторов, в том числе низкомолекулярных [11,12,20169]. Не до конца ясно, какую роль оказывают опухолевые клетки на функциональные способности клеток костного мозга. Роль низкомолекулярных медиаторов в этом процессе не исследована.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель работы - исследовать механизмы действия низкомолекулярных продуктов, продуцируемых лейкозными клетками, на иммунный ответ и рост опухолевых клеток in vitro.

Задачи исследования:

1.Выделить и охарактеризовать низкомолекулярные продукты лейкозных клеток L1210 иР815 и нормальных клеток костного мозга и оценить их влияние на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов.

2.0ценить влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на пролиферацию опухолевых клеток.

3.Исследовать влияние низкомолекулярных продуктов лейкозных клеток и нормальных клеток костного мозга на иммуносупрессорную и противоопухолевую активность костномозговых клеток. 4.Охарактеризовать антипролиферативные механизмы действия низкомолекулярных продуктов клеток Ы210иР815.

Научная новизна работы.

Впервые получен низкомолекулярный опухолевый медиатор клеточных лейкозных линий Р815и L1210 (ОСФ), который по физико-химическим и функциональным характеристикам отличается от всех ранее описанных супрессорных факторов костномозгового происхождения. ОСФ не является белком, имеет молекулярный вес <0,5kDa, термостабилен, резистентен к ферментному протеолизу, действию липазы и фосфолипазы С, не чувствителен к обработке нейраминидазой. Показано, что ОСФ обладает прямой иммуносупрессорной антипролиферативной активностью за счет блокады клеточного цикла и индукции апоптоза и отменяет иммуносупрессорное действие клеток костного мозга. ОСФ не обладает аутокринной цитостатической активностью и не влияет на цитостатическую активность клеток костного мозга.

Научная и практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют представления о роли растворимых медиаторов лейкозных клеток в регуляции иммунологических функций и опухолевого роста. Показано, что низкомолекулярные медиаторы опухолевых клеток Р815 и L1210 оказывают иммуносупрессорное действие и не влияют на опухолевый рост. Физико-химические и функциональные характеристики ОСФ обусловливают целесообразность определения молекулярной структуры этого фактора и получения нового фармакологического препарата, обладающего иммуномодулирующим действием.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Опухолевые клетки секретируют низкомолекулярные <0,5kDa антипролиферативные медиаторы.

2. Опухолевый супрессорный фактор (ОСФ) по физико-химическим и функциональным свойствам отличается от низкомолекулярного костномозгового фактора (КСФ).

3. Низкомолекулярный ОСФ вовлечен в регуляцию как Т-, так и В-клеточных реакций.

4. лейкозные клетки не способны к ауторегуляции in vitro посредством . низкомолекулярных растворимых продуктов и контактного торможения.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации представлены на отчетных сессиях ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997г.,2000г), семинарах лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997-2004г), на российской научно-практической конференции „Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2004 г.). Апробация диссертации состоялась 13 января 2005 г. на расширенном семинаре ГУ НИИ Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включающего 3 таблицы и 18 рисунков. Список литературы содержит 198 литературных источников, из них 183 зарубежных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Цитостатическая активность низкомолекулярных продуктов опухолевых клеток"

ВЫВОДЫ:

1. Низкомолекулярные 0,5к0а продукты опухолевых клеток Ы210 и Р815 обладают иммуносупрессорным действием, так как ингибируют пролиферацию КонА- и ЛПС- стимулированных спленоцитов и генерацию цитотоксических лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.

2.0пухолевые клетки Ы210 и Р815 являются продуцентами супрессорного фактора (ОСФ), имеющего молекулярную массу меньшую или близкую 0,5к0а. Для него характерна термостабильность, резистентность к ферментному протеолизу, к действию липазы и фосфолипазы С и не чувствительность к обработке нейраминидазой, из чего следует, что ОСФ не является белком.

3. Механизмом антипролиферативного действия ОСФ является индукция апоптоза и блокада клеточного цикла митогенстимулированных Т- и В-лимфоцитов, поскольку увеличивается количество апоптотических КонА- и ЛПС-стимулированных лимфоцитов и количество лимфоцитов в Со/Орфазе.

4. Лейкозные клетки не чувствительны к аутокринному воздействию низкомолекулярных продуктов, так как ОСФ не изменяет пролиферацию, не блокирует клеточный цикл опухолевых клеток 1Л210 и Р815 и не вызывает их апоптоз. Лейкозные клетки не способны к собственному контактному торможению, так как изменение плотности клеток в культуре не влияет на их рост, но сохраняют определенную чувствительность к контактному торможению со стороны клеток костного мозга, поскольку выраженность супрессорного действия костномозговых клеток в отношении пролиферации опухолевых клеток уменьшается по мере снижения плотности распределения клеток в совместных культурах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

При опухолеобразовании значительно расширяется количественный и качественный состав цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной активностью. Не только хорошо охарактеризованные полипептиды, но и низкомолекулярные молекулы могут предохранять опухолевые клетки от иммунного надзора.

Полученные данные свидетельствуют, что низкомолекулярные медиаторы лейкозных клеток мышинной лимфомы 1Л210 и мастоцитомы Р815 обладают ингибирующим действием на иммунную систему и не эффективны в подавлении опухолевого роста. Доминирующей составляющей иммуносупрессорной активности растворимых продуктов лейкозных клеток является идентифицированный впервые опухолевый супрессорный фактор с молекулярным весом <0,5к£)а. ОСФ оказывает прямое цитостатическое действие на пролиферативную активность Т- и В- лимфоцитов, вызывая их анергию, и не проявляет опосредованного иммуносупрессорного действия. Но, с другой стороны, сами опухолевые клетки не чувствительны к аутокринной регуляции низкомолекулярными продуктами и к контактному торможению. Находясь в костном мозге, лейкозные клетки подвергаются цитостатическому действию со стороны нормальных клеток костного мозга и могут отменять их иммуносупрессорное действие, что способствует сдерживанию опухолевого роста. Выход лейкозных клеток в периферическое кровеносное русло приводит к системной иммуносупрессии, что при отсутствии аутокринного цитостатического влияния ведет к прогрессированию опухолевого процесса.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Повещенко, Ольга Владимировна

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки.- М.: Изд-во Мир, 1994.-тЗ.- 501 стр.

2. Вельский Ю.П. Естественные супрессорные клетки, их свойства и функции в норме и при злокачественном росте в эксперименте: Автореф. дис. i-.канд. мед. наук. // Томск: Ин-т онкологии ТНЦ СО РАМН. 1996. - 20 с.

3. Вельский Ю.П., Землянская Н.В., Кусмарцев С.А., Агранович И.М. Дифференциальная индукция супрессорной активности клеток костного мозга in vitro различными типами опухолей // Бюл. эксп. биол. 1995.-N.8.- С.184-187.

4. Галактионов В.Г. Иммунология. -М.: Изд-во МГУ, 1998. -480 с.

5. Козлов В.А., Журавкин И.Н., Цырлова И.Г. Стволовая кроветворная клетка и иммунный ответ.-Новосибирск:Наука, 1982.-221стр.

6. Кусмарцев С.А. Функциональное состояние B-лимфоцитов и активность супрессоров костного мозга на этапах злокачественного роста: Автореф. дис. .канд. мед. наук // Томск: Ин-т онкологии. -1990. 21 с.

7. Кусмарцев С.А., Вельский Ю.П., Агранович И.М., Землянская Н.В. Естественные супрессорные клетки // Успехи соврем, биологии. -1994. Т. 114, Вып.6. - С.705-714.

8. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека.- М.: Изд-во Мир, 1993.-Т2.- 480стр.

9. Пальцев М.А., Иванов A.A., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия.-М.Медицина, 2003.-287 стр.

10. Ю.Ройт А. Основы иммунологии.-М.: Изд-во Мир, 2000.- 670 стр.

11. П.Селедцов В.И. Цитостатическая активность клеток костного мозга и клеточные механизмы ее регуляции: Дис. .докт. мед. наук //

12. Новосибирск: Ии-т клинической иммунологии СО РАМН. 1998. -с.175

13. Селедцова Г.В. Иммунорегуляторные и противоопухолевые свойства ядерных эритроидных клеток. Дис. .докт. мед. наук // Новосибирск: Ин-т клинической иммунологии СО РАМН. 2003. -с.49-113.

14. Сидорович И.Г., Ляхов В.В., Власов А.А., Новиков В.И. Характеристика и клетки-мишени супрессорного фактора, секретируемого клетками костного мозга // Иммунология.- 1987.- № 4. С.67-69.

15. Тарабан В.Я. Роль лимфоидных и эритроидных клеток в регуляции противоопухолевой активности костномозговых цитостатических клеток-эффекторов: Дис. .канд. мед. наук // Новосибирск: Ин-т клинической иммунологии СО РАМН. 1997. - с. 108.

16. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А.Клетки иммунной системы.-Санкт-Петербург.: Изд-во Наука, 2001.-TIII-V.- 390 стр.

17. Abolhassani М., Chiao J.W. Purification and characterization of a human leukemia cell-derived immunosuppressive factor// 1991.-V.21.-P.25-33.

18. Akhust R. TGF-(3 antagonists: why suppress a tumor suppressor? // J Clin Invest.-2002.-V.109.-P. 1533-1536.

19. Almand В., Clark J., Nikitina E., Beynen J., English N., Knight S., Carbone D., Gabrilovich D. Increased production of immature myeloid cells in cancer patients: a mechanism of immunosuppression in cancer // J of Immunology.-2001 .-V. 166.-P.678-689.

20. Angulo I., Rodrigez R., Garcia B., Medina M., Navarro J., Subiza J. Involvement of nitric oxide in bone marrow-derived natural suppressor activity: its dependence on IFN-gamma // J. Immunol.-1995.-V.155.-P. 15-26.

21. Bailet J.W., Lichtenstein A., Chen G., Mickel R.A. Inhibition of lymphocyte function by head and neck carcinoma cell line soluble factors // Arch Otolaryngol Head Neck Surg.-1997.-V.123.-P.855-862.

22. Bitton R.J., Guthmann M.D., Gabri M.R., Carnero A.J., Alonso D.F., Fainboim L., Gomez D.E. Cancer vaccines: an update with special focus on ganglioside antigens // Oncology Reports.-2002.-V.9.-P.267-276.

23. Blobe G., Shiemann W., Lodish H. Role of transforming growth factor p in human disease // The New England J of Medicine.-2000.-V.342,-P.1350-1358.

24. Blumenthal R.D., Reising A., Leon E., Goldenberg D.M. Modulation of maiTow proliferation and chemosensitivity by tumor-produced cytokines from syngenic pancreatic tumor lines // Clinical Cancer Research.-2002.-V.8.-P.1301-1309.

25. Boldizsar H., Szende B., Timar F. Effect of glutamic acid, aspartic acid, glycine and gamma amino butyric acid on the growth of human leukemia and melanoma cells in vitro // Med Sci Monit.-1999.-V.5.-P.1059-1064.

26. Bomstein Y., Ophir R., Harshemes H., Ben-Eraim S. Release of immunosuppressive factor(s) by MOPC-315 murine plasmacytoma cells: a possible mechanism of defence // Anticancer Res.-1993.-V.13.-P.2125-2129.

27. Botti C., Seregni E., Ferrari L., Martinetti A., Bombardieri E. Immunosuppressive factors: role in cancer development and progression // Int J Biol Markers.-1998.-V.13.-P.51-69.

28. Brizzi M.F., Avanzi G.C., Veglia F., Clark S.C., Pegoraro L. Expression and modulation of IL-3 and GM-CSF receptors in human growth factor dependent leukaemic cells // Br. J. Haemotol.- 1990.-V.76.-P.203-209.

29. Bronte V., Apolloni E., Cabrelle A., Ronca R., Seraflni P., Zamboni P., Restifo N., Zanovello P. Identification of a CDllb+/Gr-l+/CD31+ myeloid progenitor capable of activating or suppressing CD8+Tcells // Blood.-2000.-V.96.-P.3838-3846.

30. Caldwell S., Heitger A., Shen W., Liu Y., Taylor B., Ladisch S. Mechanisms of ganglioside inhibition of APC function // J Immunol/-2003/-V. 171.-P. 1676-1683.

31. Cappello P., Novelli F., Forni G., Giovarelli M. Death receptor ligands in tumors // J Immunother.-2002.-V.25.-P.l-15.

32. Carey B.M., Dooley M., Weedle R., Clynes M. Production of autostimulatory growth factors by the human carcinoma line, RPMI 2650 // In Vitro Cell Dev Biol.-1993.-V.29A.-P.153-160.

33. Chang S.H., Liu C.H., Conway R., Han D.K., Nithipaticom K., Trifan O.C., Lane T.F., Hla T. Role of prostaglandin E2 -dependent angiogenic switch in cyclooxygenase 2-induced breast cancer progression// PNAS.-2004.-V. 101.-P.591-596.

34. Chouaib S., Asselin-Paturel C., Mami-Chouaib F., Caignard A., Blay J.Y. The host-tumor immune conflict: from immunosuppression to resistance and destruction // Immunology Today.- 1997.-V.10.-P.493-497.

35. Cleveland M.G., Lane R.G., Klimpel G.R. Spontaneouse INF-beta production. A common feature of natural suppressor systems // J.Immunol.-1988.-V.141.-P.2043-2049.

36. Cornelius J.G., Normann S.J. Isolation of a low molecular weight inhibitor of lymphocyte prolifration from tumorous ascites //J Immunol.-1988.-V. 141.-P.2175-2189.

37. Cortes J., Kurzrock R. Inrerleukin-10 in non-Hodgkin's lymphoma // LeukLymphoma.-1997.-V.26.-P.251-259.

38. Costa R.S., Assreuy J. Nitric oxide inhibits irreversibly P815 cell proliferation: involvement of potassium channels // Cell Prolif.-2002.-V.35.-P.321-332.

39. Decker T., Lohmann-Matthes M.L., Baccarini M. Liver associated macrophage precursor cells proliferate under impairment of regular hemopoesis // Eur J Immunol.- 1988.-V.18.-P.697-703.

40. Deffie A., Hao M., Oca Luna R.M., Hulboy D., Lozano G. Cyclin E restores p53 activity in contact-inhibited cells // Molecular and Cellular Biology.-1995.-V.15.-P.3926-3933.

41. Ding L., Isobe K., Yoshida T., Nacashima I. Suppression of lymphocyte signal transduction by murine mastocytoma ascites // Microbiol Immunol.-1991.-V.35.-P.757-774.

42. Ding Y., Qin L., Kotenko S.V., Pestka S., Bromberg J.S. A single amino acid determines the immunostimulatory activity of interleukin 10 // J Exp Med.-2000.-V. 191 .-P.213-224.

43. Divino C.M., Angel L.P., Brower S.T., Chen S.H. Characterization of a novel immunocytolytic factor secreted by pancreatic adenocarcinoma // 1999.-V.11.-P.489-495.

44. Dumont N., Arteaga C. Transforming growth factor-P and breast cancer. Tumor promoting effect of transforming growth factor-P // Breast Cancer Rec.-2000.-V.2.-P. 125-132.

45. Enk A.H., Jonuleit H., Saloga J., Knop J. Dendritic cells as mediators of tumor-induced tolerance in metastatic melanoma // Int J Cancer.-1997.-V.73.-P.309-316.

46. Fang B.3 Roth J.A. Tumor-suppressing gene therapy // Cancer Biol Ther.-2003.-V.2.-P.115-121.

47. Farrar D., Katz K., Windsor J., Thrush G., Scheuermann R., Uhr J., Street N. Cancer dormancy. VII. A regulatory role for CD8+ T cells and IFN-y in establishing and maintaining the tumor-dormant state // J.of Immunology.-1999.-V. 162.-P.2842-2849.

48. Finke J., Ferrone S., Frey A., Mufson A., Ochoa A. Where have all the T cells gone? Mechanisms of immune evasion by tumors // Immunology Today.-1999.-V.20.-P. 158-160.

49. Fishman P., Bar-Yehuda S., Vagman L. Adenosine and other low molecular weight factors released by muscle cells inhibit tumor cell growth // Cancer Rec.-l998.- V.58.-P.3181-3187.

50. Gabrilove J.L. Angiogenic growth factors: autocrine and paracrine regulation of survival in hematologic malignancies// The Oncologist.-2001.-V.6.-P.4-7.

51. Gabrilovich D., Velders M., Sotomayor E., Kast M. Mechanism of immune dysfunction in cancer mediated by immature Gr-1+ myeloid cells //J.of Immunology.-2001 .-V. 166.-P.5398-5406.

52. Garcia-Hernandez M.L., Hernandez-Pando R., Gariglio P., Berumen J. Interleukin-10 promotes B16-melanoma growth by inhibition of macrophage functions and induction of tumour and vascular cell proliferation // Immunology.-2002.-V.105.-P.231-243.

53. Gerber H.P., Ferrara N. The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis // J.Mol.Med.-2003.-V.81.-P.20-31.

54. Gravisaco M.J., Mongini C., Alvarez E., Ruybal P., Escalada A., Sanchez-Lockhart M., Hajos S., Waldner C. IL-2, IL-10, IL-15 and TNF are key regulators of murine T-cell lymphoma growth // Int J Mol Med.-2002.-V.12.-P.627-623.

55. Gustincich S., Schneider C. Serum deprivation response gene is induced by serum starvation but not by contact inhibition // Cell Growth Differ.-1993.-V.4.-P.753-760.

56. Hao W., Messbarger L., Joshi S.S. Immunosuppression by metastatic lymphoma derived altered retroviral gp 70 molecule // Leukemia.-1997.-V.l 1.-P.202-205.

57. Hidalgo G., Zhong L., Doherty D., Hirschowitz E. Plasma PGE-2 levels and altered cytokine profiles in adherent peripheral blood mononuclear cells in non-small cell lung cancer//Molecular Cancer.-2002.-V.5.-P.l-7.

58. Hirst W., Buggins A., Mufti G. Central role of leukemia-derived factors in the development of leukemia-associated immune dysfunction // Hematol J.-2001.-V.2.-P.2-17.

59. Holda J.H. LPS Activation of Bone-Marrow Natural Suppressor Cells // Cell. Immunol.-1992.-V. 141 .-P.518-527.

60. Hooper W.C. The role of transforming growth factor-beta in hematopoiesis. A review//Leukem. Res. -1991.-V.15.-P.179-184.

61. Isoe S., Naganuma H., Nakano S., Sasaki A., Satoh E., Nagasaka M., Maeda S., Nukui H. Resistance to growth inhibition by transforming growth factor-beta in malignant glioma cells with functional receptors // J Neurosurg .-1998.-V.88.-P.529-534.

62. Jadeski L.C., Chakraborty C., Lala P.K. Role of nitric oxide in tumour progression with special reference to a murine breast cancer model // Can J Physiol Pharmacol.-2002.-V.80.-P. 125-135.

63. Jayadev S., Liu B., Bielawska A.E., Lee J.Y., Nazaire F., Pushkareva M.Y., Obeid L.M., Hannum Y.A. Role for ceramide in cell cycle arrest // J Biol Chem.-1995.-V.270.-P.2047-2052.

64. Kamradt T., Mitchison A. Tolerance and autoimmunity // N Engl J Med.-2001.-V.344.-P.655-663.

65. Kaneto H., Fujii J., Seo H.G., Suzuki K., Matsuoka T., Nakamura M., Tatsumi H., Yamasaki Y., Kamada T., Taniguchi N. Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic beta-cells // Diabetes.-V.44.-P.733-738.

66. Kato A., Takahashi H., Takahashi Y., Matsushime H. Inactivation of the cyclin D-dependent kinase in the rat fibroblast cell line, 3Y1, induced by contact inhibition // J Biological Chemestry.-1997.-V.272.-P.8065-8070.

67. Klajman A., Drucker I., Zan-Bar I., Mekori Y., Ben-Efraim S. Immunosuppression in vitro and in vivo by supernatants from murine lymphoma cell lines // Anticancer Res.-1992.-V.12.-P.741-747.

68. Kong Y., Ladisch S. Natural forms of shed tumor gangliosides // Biochim Biophys Acta.-1998.-V.1394.-P.43-56.

69. Koo G.C., Manyak C.L. Generation of cytotoxic cells from murine bone marrow by human recombinant IL-2 // J.Immunol.-1986.-V.137.-P.1751-1756.

70. Korzelius J.M., Bealmear P.M., Holtermann O.A. Suppressor substance produced by the K562 cell line in vitro // Syrg Oncol.-1983.-V.23.-P.16-20.

71. Kovacs E. How does interleukin-6 affect the membrane expressions of interleukin-6 receptor and gpl30 and the proliferation of the human myeloma cell line OPM-2 // Biomed Pharmacother.-2003.-V.57.-P.489-494.

72. Krishnan L., Sad S., Raghupathy R. Characterization of an immunosuppressive factor secreted by a human trophoblast-derived choriocarcinoma cell line // Cell Immunol.-1995.-V.162.-P.295-308.

73. Kumar S., Witzing T.E., Timm M., Haug J., Wellik L., Fonseca R., Greipp P.R., Rajkumar S.V. Expression of VEGF and its receptors by myeloma cells //Leukemia.-2003.-V.17.-P.2025-2031.

74. Kusmartsev S., Cheng F., Yu B., Nefedova Y., Sotomayor E., Lush R., Gabrilovich D. All-trans-retinoic acid eliminates immature myeloid cells from tumor-bearing mice and improves the effect of vaccination // Cancer Research.-2003 .-V.63 .-P.4441-4449.

75. Kusmartsev S., Gabrilovich D. Inhibition of myeloid cell differentiation in cancer: the role of reactive oxygen species // J of Leukocyte Biology.-2003 .-V.74.-P. 186-196.

76. Kusmartsev S., Nefedova Y., Yoder D., Gabrilovich D.J. Antigen-specific inhibition of CD8+ T cell response by immature myeloid cells in cancer is mediated by reactive oxygen species //J Immunology.-2004.-V.172.-P.989-999.

77. Kusmartsev S.A., Li Y., Chen S.H. Gr-1+ myeloid cells derived from tumor-bearing mice inhibit primary T cell activation induced through CD3/CD28 costimulation // J Immunol.-2000.-V.165.-P.779-785.

78. Lala P.K., Orucevic A. Role of nitric oxide in tumor progression: lessons from experimental tumors // Cancer Metastasis Rev.-1998.-V.17.-P.91-106.

79. Larmonier N., Ghiringhelli F., Larmonier C.B., Moutet M., Fromentin A., Baulot E., Solary E., Bonnote B., Martin F. Freshly isolated bone marrow cells induce death of various carcinoma cell lines. // Int J Cancer.-2003.-V.107.-P.747-756.

80. Lee J.W., Chung H.Y, Ehrlich L.A., Jelinek D.F., Callander N.S., Roodman G.D., Choi S.J. IL-3 expression by myeloma cells increases both osteoclast formation and growth of myeloma cells //Blood.-2004.-V.103.-P.2308-2315.

81. Lejeune P., Lagadec P., Onier N., Pinard D., Ohshima H., Jeannin J. Nitric oxide involvement in tumor-induced immunosuppression // J Immunol.-V. 152.-P.5077-5983.

82. Leu R.W., Leu N.R., Shannon B J., Fast D.J. IFN-gamma differentially modulates the sucseptibility of L1210 and P815 tumor targets for macrophage-mediated cytotoxicity // J Immunol.-199 l.-V.l 47.-P.1816-1822.

83. Levey D., Udono H., Heike M., Srivastava P. Identification of a tumor-associated contact-dependent activity which reversibly downregulates cytolytic function of CD8+ T cells // Cancer Immunity.-2001.-V.1.-P.5-18.

84. Li R., Villacreses N., Ladisch S. Human tumor gangliosides inhibit murine immune responses in vivo //Cancer Research.-1995.-V.5 5.-P.211-214.

85. London C.A., Galli S.J., Yuuki T., Hu Z.Q., Helfand S.C., Geissler E.N. Spontaneous canine mast cell tumors express tandem duplications in the proto-oncogene c-kit // Exp Hematol.-1999.-V.27.-P.689-697.

86. Lotz M., Ranheim E., Kipps T.J. Transforming growth factor beta as endogenous growth inhibitor of chronic lymphocytic leukemia B cells // J Exp Med.-1994.-V. 179.-P.99-1004.

87. Lu P., Sharom F.J. Immunosuppression by YAC-1 lymphoma: role of shed gangliosides // Cell Immunology.-1996.-V.173.-P.22-32.

88. Luo J.S., Kammerer R., von Kleist S. Comparison of the effects of immunosuppressive factors from newly established colon carcinoma cell cultures on human lymphocyte proliferation and cytokine secretion // Tumour Biol.-2000.-V.-21.-P.l 1-20.

89. Maier T., Holda J.H. Natural suppressor (NS) activity from murine neonatal spleen is responsive to INF-gamma // J. Immunol.-1987.-V. 138.-P.4075-4084.

90. Maier T., Holda J.H., Claman H.N. Murine natural suppressor cells in the newborn, in bone marrow, and after cyclophosphamide. Genetic variations and dependence on INF-gamma // J Immunol.-1989.-V.143.-P.491-498.

91. Maier T., Holda J.H., Choi K.L., Claman H.N. Characterization and functions of the natural suppressor cell systems // In Functions of the natural immune system ( Reynolds C.W., Wiltrout R.H., Eds.) New York: Plenum.-1989.-P.267-298.

92. Markert U.R., Chaouat G. Preliminary characterization of an immunosuppressive inducer factor secreted by the JEG-3 choriocarcinoma cell line: in vitro and in vivo studies // Am J Reprod Immunol.-1997.-V.38.-P.327-338.

93. Mazzoni A., Bronte V., Visintin A., Spitzer J.H., Apolloni E., Serafini P., Zanovello P., Segal D.M. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism // J Imrnunol.-2002.-V. 168.-P.689-695.

94. McGarry R.C., Anderson R., Singhal S.K. Regulation of humoral immune responses by a bone marrow-derived glycolipid-like molecule // Cell.Immunol.- 1982.-V.71 .-P.293-3 00.

95. McKallip R., Li R., Ladisch S. Tumor gangliosides inhibit the tumor-specific immune response // J of immunology.-1999.-V.163.-P.3718-3726.

96. Modiano J.F, Ritt M.G, Wojeiszyn J, Smith R 3rd. Growth arrest of melanoma cells is differentially regulated by contact inhibition and serum deprivation/DNA Cell Biol.-1999.-V.18.-P.357-367.

97. Moore S.C., Shaw M.A., Soderberg L.S.F. Transforming growth factor-beta is the major mediator of natural suppressor cells derived from normal bone-marrow // J Leuk Biol.-1992.-V.52.-P.596-601.

98. Moore S.C., Theus S.A., Barnett J.B., Soderberg L.S.F. Bone-marrow natural suppressor cells inhibit the growth of myeloid progenitor cells and the synthesis of colony stimulating factors // Exp. Hematology.-1992.-V.20.-P.1178-1183.

99. Moore S.C., Theus S.A., Barnett J.B., Soderberg L.S.F. Cytokine regulation of bone-marrow natural suppressor-cell activity in thesuppression of lymphocyte function // Cell. ImmunoL-1992.-V.141.-P.398-408.

100. Moqattash S., Abraham N.G., Lutton J.D. Modulation of growth supportive and oncogenic properties of murine leukemia cells // Leuk Res.-1994.-V.18.-P.531-539.

101. Mori N., Prager D. Interleukin-10 gene expression and adult T-cell leukemia // Leuk Lymphoma.-1998.-V.29.-P.239-248.

102. Mortari F., Singhal S.K. Production of human bone marrow-derived suppressor factor: effect on antibody synthesis and lectin-activated cell proliferation // J Immunol.-1988.-V. 141.-P.3037-3042.

103. Mortellaro A, Songia S, Gnocchi P, Ferrari M, Fornasiero C, Alleso R, Isetta A, Colotta F, Golay J. New immunosuppressive drug PNY156804 blocks IL-2-dependent proliferation and NF-kB and AP-1 activation // J Immunol.-1999.-V. 162.-P.7102-7109.

104. Morvillo V., Bover L., Mordoh J. Identification and characterization of a 14 kDa immunosuppressive protein derived from IIB-MEL-J, a human melanoma cell line // Cell Mol Biol.-1996.-V.42.-P.779-795.

105. Mullins D.R., Martins R.S., Burger C.J., Elgert K.D. Tumor cell-derived TGF-beta and IL-10 dysregulate paclitaxel-induced macrophage activation // J Leukoc Biol.-2001.-V.69.-P.129-137.

106. Nakamura M., Ishida N., Kamo I. Immunosuppressive factors from mastocytoma cells cultured in serum-free medium //J Natl Cancer Inst.-1980.-V.65.-P.759-768.

107. Pani G., Colavitti R., Bedogni B., Anzevino R., Borrello S., Galeotti T. A redox signaling mechanism for density-dependent inhibition of cell growth // The Journal of Biological Chemestry.-2000.-V.275.-P.38891-38899.

108. Pardoll D.M., Topalian S.L. The role of CD+T cell responses in antitumor immunity // Current Opinion in Immunology.-1998.-V.10.-P.588-594.

109. Parker G., Fernandes H., Chong S.Y., Czarneski J., Ra H., Lin Y.C., Raveche E. Antisense IL-10 abrogates the inhibitory effects of IL-10 production by transfected tumor cells // Cytokines Cell Mol Ther.-2000.-V.6.-P.113-119.

110. Peled A., Lee B.C., Sternberg D., Toledo J., Aracil M., Zipori D. Interaction between leukemia cells and bone marrow stromal cells: stroma-supported growth vs. serum dependence and the roles of TGF-beta and M-CSF // Exp Hematol.-1996.-V.24.-P.728-737.

111. Pignolo R.J., Francis M.K., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. Putative role for EPC-1/PEDF in the GO growth arrest of human diploid fibroblasts // J Cell Physiol.-2003.-V.195.-P.12-20.

112. Putnam J.B. Jr, Roth J.A. Identification and characterization of a tumor-derived immunosuppressive glycoprotein from murine melanoma K-1735 // 1985.-V.19.-P.90-100.

113. Quesada S., Leo R., Deicher H., Peest D. Functional and biochemical characteristics of a soluble B lymphocyte proliferation-inhibiting activity produced by bone marrow cell from multiple myeloma patients //Cell Immunol.-1995.-V. 162.-P.275-281.

114. Sadzuka Y., Sugiyama T., Sonobe T. Improvement of idarubicin induced antitumor activity and bone marrow suppression by theanine, a component of tea // Cancer Lett.-2000.-V.158.-P.l 19-124.

115. Saffran D.C., Singhal S.K. Suppression of mixed lymphocyte reactivity by murine bone-marrow-derived suppressor factor inhibition of proliferation due to a deficit in IL-2 production // Transplantation.-1991.-V.52.-P.685-690.

116. Saffran D.C., Parsons M.F., Singhal S.K. Separation of allostimulatory and natural suppressor/stem cell functions of murine bone marrow-implications for bone marrow transplantation // Transplantation.-1991.-V.52.-P.680-684.

117. Saffran D.C., Singhal S.K. Further characterization of murine bone marrow-derived natural suppressor cells: potential relationships between NS and NK/LAK activities // Cell. Immunol.-1990.-V.128.-P.301-308.

118. Salvadori S., Martinelli G., Zier K. Resection of tumors reverses T cell defects and restores protective immunity // J Immunology.-2000.-V.164.-P.2214-2220.

119. Schauenstein K., Schauenstein E. Diagnostic relevance of non-specific tumor associated immune dysfunctions // The Cancer Journal.-1998.-V.11.-P.-5-8.

120. Schmid M., Porzsolt F. Autocrine and paracrine regulation of neoplastic cell growth in hairy cell leukemia // Leuk Lymphoma.-1995.-V.17.-P.401-410.

121. Schreiber K.L., Forman J. Effects of bone marrow-derived natural suppressor activity on B-cell responses to lipopolysaccharide // Transplantation.-1993 .-V.56.-P.700-708.

122. Segerson E.C., Beetham P.K. Suppressor activity of bone marrow cells and localization of fluorescent-labeled bone marrow cells within ovine endometrial tissue. // J Anim Sci.-2000.-V.78.-P.709-717.

123. Seledtsov V.I., Taraban V.Y., Seledtsova G.V., Samarin D.M., Avdeev I.V.,Senyukov V.V., Kozlov V.A. Tumor growth inhibitory and natural suppressor activities of murine bone marrow cells: comparative study // Cell Immunol.-1997.-V. 182.-P. 12-19.

124. Shao J., Lee S.B., Guo H., Evers B.M., Sheng H. Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin // Cancer Research.-2003.-V.63.-P.5218-5223.

125. Sheu B.-C., Lin R.-H, Lien H.-C., Ho H.-N., Hsu S.-M., Huang S.-C. Predominant Th2/Th2 polarity of tumor-infiltrating lymphocytes in human cervical cancer // The Journal of Immunology.-200 l.-V.-167.-P.2972-2978.

126. Sica A., Saccani A., Bottazzi B., Polentarutti N., Vecchi A., Damme J.V., Mantovani A. Autocrine production of IL-10 mediates defective IL-12 production and NF-kB activation in tumor-associated macrophages // J of Immunology .-2000.-V. 164.-P.762-767.

127. Singhal S.K., King S., Drury T. Antibody-inhibiting activity of bone marrow cells in vitro // Int. Arch. Apll. Allergy.-1972.-V.43.-P.934-940.

128. Sriram V., Cho S., Li P., 0,Donnel., Dunn C., Hayakawa K., Blum J.S., Brutkiewicz R.R. Inhibition of glycolipid shedding rescues recognition of a CD1+ T cell lymphoma by natural killer T (NKT) cells// PNAS.-2002.-V.99.-P.8197-8202.

129. St.Croix B.,Sheehan C., Rak J.W., Florenes V.A., Slingerland J.M., Kerbel R.S. E-cadherin-dependent growth suppression is mediated by the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIPl // J Cell Biology.-1998.-V. 142.-P.557-571.

130. Stoika R., Yakymovych M., Souchelnytskyi S., Yakymovych I. Potential role of transforming growth factor betal in drug resistance of tumor cells // Acta Biochim Pol.-2003.-V.-50.-P.497-508.

131. Strand S., Galle P.R. Immune evasion by tumours: involvement of the CD95 (APO-l/Fas) system and its clinical implications // Molecular medicine today.-1998.-V.2.-P.63-68.

132. Sugiura K., Inaba M„ Ogata H., Yasumizu R., Sardina E.E., Inaba K., Kuma S., Good R.A., Ikehara S. Inhibition of tumor cell proliferation bynatural suppressor cells present in murine bone marrow // Cancer Res. -1990.-V.50.-P.2582-2586.

133. Sugiura K., Pahwa S., Yamamoto Y., Borisov K., Pahwa R., Nelson R., Ishikawa J., Iguchi T., Oyaizu N., Good R., Ikehara S. Characterization of natural suppressor cells in human bone marrow // Stem cells.-1998.-V. 16.-P.99-106.

134. Timoshenko A.V., Xu G., Chakrabarti S., Lala P.K., Chakraborty C. Role of prostaglandin E2 receptors in migration of murine and human breast cancer cells // Exp Cell Res.-2003.-V.289.-P.265-274.

135. Trina J.Stewart, Mark J.Smyth, Germain J.P. Fernando, Ian H.Frazer, and Graham R.Leggatt. Inhibition of early tumor growth requires Jal8-positive (Natural killer T) cells // Cancer Research.-2003.-V.63.-P.3058-3060.

136. Van Vlasselaer P., Niki T., Strober S. Identification of factor(s) fromcloned natural suppressor sells that inhibits 11-2 secretion during antigen-«driven T cell activation // Cell. Immunol. -1991.-V.138.-P.326-333.

137. Vitetta E., Tucker T., Racila E., Huang Y., Marches R., Lane N., Scheuermann R., Street N., Watanabe T., Uhr J. Tumor dormancy and cell signaling.V. Regrowth of the BCL tumor after dormancy is established. // Blood.-V.89.-P.4425-4436.

138. Vizirianakis I.S., Chen Y.Q., Kantak S.S., Tsiftsoglou A.S., Kramer R.H. Dominant-negative E-cadherin alters adhesion and reverses contact inhibition of growth in breast carcinoma cells // Int J Oncol.-2002.-V.21.-P.135-144.

139. Vodovotz Y., Bogdan C., Paik J., Xie Q-W., Nathan C. Mechanisms of suppression of macrophage nitric oxide release by transforming growth factor-beta//J. Exp. Med. -1993.-V.178.-P.605-613.

140. Warabi H., Venkat K., Geetha V., Liotta L.A., Brownstein M., Schiffmann E. Identification and partial characterization of low-weight inhibitor of leukotaxis from fibrosarcoma cells // Cancer Res.-1984.-V.44.-P.915-922.

141. Weirzbowska A., Robak T., Wrzesien-Kus A., Krawczynska A., Lech-Maranda E., Urbanska-Rys H. Circulating VEGF and its soluble receptorssVEGFR-land sVEGFR-2 in patients with acute leukemia // Eur Cytokine Netw.-2003 .-V. 14.-P. 149-153.

142. William T. Bellamy, Lynne Richter, Yvette Frutiger and Thomas M. Grogan. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and its receptors in hematopoietic malignancies // Cancer Research.-1999.-V.59.-P.728-733.

143. Wojtowicz-Praga S. Reversal of tumor-induced immunosuppression by TGF-beta inhibitors // Invest New Drugs.-2003.-V.21.-P.21-32.

144. Wright M.A., Wiers K., Vellody K., Djordjevic D., Young M.R. // Stimulation of immune suppressive CD34+ cells from normal bone marrow by Lewis lung carcinoma tumors // Cancer Immunol Immunother.-1998.-V.46.-P.253-260.

145. Yanagie H., Chen Z., Takeda Y., Sugiyama H., Sekiguchi M., Eriguchi M. Regulation of mouse immuno-responses by a natural suppressor cell clone from bone marrow // Res Exp Med.-1997.-V.197.-P.165-175.

146. Yanagie H., Sugiyama H., Sekiguchi M. Establishment of a natural suppressor cell line producing soluble suppressor factor other than transforming growth factor-beta. // Immunol Cell Biol.-1995.-V.73.-P.333-339.

147. Yasumura S, Amoscato A, Hirabayashi H, Lin WS, Whiteside TL. Proliferation of hematopoietic cell lines induced by a soluble factor derived from human sguamous cell carcinomas of the head and neck /Cancer Immynology Immunother.-1994.-V.39.-P.407-415.

148. Yin-Cheng He., Yuan-Hong Wang., Jun Cao., Ji-Wei Chen., Ding-Yu Pan., Ya-Kui Zhou . Effect of complex amino acid imbalance on growth of tumor in tumor-bearing rats // World J of Gastroenterology.-2003 .-V.9.-P.2772-2775.

149. Young M.R., Wright M. A., Coogan M., Young M.E., Bagash J. Tumor-derived cytokines induce bone marrow suppressor cells that mediate immunosuppression through transforming growth factor beta // Cancer Immunol Immunother.-1992.-V.35.-P.14-18.

150. Young M.R., Petruzzelli G.J., Kolesiak K., Achille N., Lathers D.M., Gabrilovich D.I. Human squamous cell carcinomas of the head and neck chemoattract immune suppressive CD34+ progenitor cells // Hum Immunol.-2001.-V.62.-P.332-341.

151. Young M.R., Wright M.A., Lozano Y., Matthews J.P., Benefield J., Prechel M.M. Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer: influence on the immune infiltrate of the cancer // Int J Cancer.-1996.-V.67.-P.333-338.

152. Young M.R.I., Young M.E., Wright M.A. Stimulation of immune suppressive bone marrow cells by colony stimulating factors // Exp Hematol.-1990.-V.18.-P.806-812.

153. Yu Zhiya and Restifo Nicholas. Cancer vaccines:progress reveals new complexities // J Clinical Investigation.-2002.-V.l 10.-P.289-294.

154. Zaninoni A., Imperiali F.G., Pasquini C., Zanella A., Barcellini W. Cytokine modulation of nuclear factor-kappaB activity in B-chronic lymphocytic leukemia // Exp Hematol.-2003.-V.31.-P. 185-190.

155. Zeng G., Gao L., Birkle S., Yu R.K. Suppression of ganglioside GD3 expression in a rat F-ll tumor cell line reduced tumor growth, angiogenesis, and vascular endothelial growth factor production // Cancer Research.-2000.-V.60.-P.6670-6676.

156. Zhang B., Ma X.T., Zheng G.G., Li G., Rao Q.,Wu K.F. Expression of IL-18 and its receptor in human leukemia cells // Leuk Res.-2003.-V.27.-P.813-822.