Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Цитологические и цитохимические критерии выявления этиологии и активности инфекционно-воспалительных заболеваний новорожденных и детей раннего возраста

Я Л П • • V

ШШЕТ2РСГГВ0 ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ НОЮСЩВДСШ ОРДЙНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗШШШ

ададажш институт

На правах рукописи УДК 616.981.25-053.31-078.333

ГАШШВА Лариса Олеговна

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ И ЦИГОХИЖЧЗСКШ КРИТЕРИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭТИШШШ И АКТИВНОСТИ ШШЦИОННО-ВОСПАЛИГЕЛЬНШ. ЗАБОЛЕВАНИЙ! НОВОРОЖДЕННЫХ. И ДЙМ1 РАННЕГО ВОЗРАСТА

14.00.10 - Инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1992

Работа выполнена в Институте клинической и экспериментальной медицины СО РАШ

Научный руководитель - доктор биологических наук А.И.Аутеншпоо

Научный консультант - кандидат медицинских наук, доцент

Н.Д.Ковальчук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор К. В. Лаврова

кандидат медицинских наук Г.М.Максакова

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт

детских инфекций, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится <М ОиЛ. 1992г. в /Л часов

на заседании Специализированного совета К 084.52.01 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук при Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте (630091, г.Новосибирск, Красный проспект, 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского ордена Трудового Красного Знамени медицинского института.

Автореферат разослан "/4*' Сьи^^ог^ 1992г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат медицинских наук

Н.С.Семьянова

^mrn'ä

:£ртаций ---у

ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ 11Р0БМ.Ш. Бактериальная инфекция играет значи-льную роль в структуре неонагальной заболеваемости и смерт -ности ¡Баранов A.A., 1990; Зматанская Г.В., 1991; Соколов B.U. и др., 1990 ; Яфаов ?.!., Зуева JE.il., I989;/^^s £.*Л<[989 ; HcuJ-^k tt/efut?., 1989 ] . Сложность клинической диагностики заболеваний, развившихся как в перинатальном, так к в цостнатаяьном периоде связана с тем, что начальные симптомы инфекционно-вос -палитёльного процесса у новорожденных и детей раннего возраста в большинстве случаев несшцпфичнн, проявления нешфекционной патологии (внутриматочная гипоксия, внутричерепная родовая травма, пневмопатип и др.) нередко имеют сходную клиническую симптоматику с бактериальными инфекциями, инфекционный процесс в неонатальном периоде монет в короткий срок закончиться летальным исходом [Буракова 5.Б., Никитина H.H., 1982 ; Дэвис U.A.,-Готефорс Л.А., 1987 ; L, аЛ-, 1983. Поэтому

ранняя диагностика бактериальных инфекций, способствующая проведении адекватной антибактериальной терапии, является актуальной проблемой клинической медицины.

В настоящее время диагностика бактериальной инфекции у детей проводится не специфично шли методами: количественное определение С-реактивного белка [Карапегян JI.B., 1990 ; he Р. а£., I989J , а также оценка лейкоцитарной формулы [ьежирова II. ¡Д., а др. 1989 ; Павлов ¿.В. 'я др'. 1990 ; CaJ? И. Р. ^Лг/, 1987 J . Этиология инфекционно-воспадительного процесса у новорожденных и детей раннего возраста обычно устанавливается бактериологическими методами [Бакулева JI.il. и др. 1984; Дэвис ¿i.A. Готефорс Л.А. 1987]. Повышение уровня специфических антител в сыворотке крот, включение в лимфоциты радиоактивных предшественников дКК я PIK или превращение их в бластные формы после взаимодействия с бактериальными антигенами такае выявляет возбудителя заболевашшр/^^ A-7J. ¿7^1986; А.ц, 1987 ; S. eJ- 19 Щ.

Изучение уровня внутриклеточной функциональной активности ишдунокошгетентных клеток позволяет получить сведения не только об активности, но и этиологии инфекционного процесса С Каримова Д.ы., IS8I; Никитин В.М., 1982; йавленшвили И, В., 1980; Jio^iwse^ ИН. ] . поэтому ишуноцитохимические

исследования лимфоцитов будут способствовать поиску критериев выявления этиологии и активности заболеваний у детей, а также разработке чувствительных микрометодов диагностики, что является актуальной задачей медицины.

ЦЕЛЬ ШОЩОВШЯ - выявить этиологию и активность инфекцион-но-во с палит е льного процесса бактериальной этиологии у новорожденных и детей раннегр возраста, а также установить диагностические критерии на основании цитохимических и морфологических показателей лимфоцитов периферической крови.

ОСНОНШЗ ЗАДАЧИ:

1. Изучить морфологи» нуклеолярного аппарата лимфоцитов у новорожденных и детей раннего возраста при развитии вакцинного процесса и при инфекционно-воспалительных заболеваниях с использованием антигенной стимуляции ¿п СПъ? . Разработать шкроыетод диагностики,

2. Изучить относительное содержание РНК в лимфоцитах у здоро-еых новорожденных и детей раннего возраста при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Выявить цитохимические показатели активности патологического процесса и разработать критерии диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний бактериальной этиоло -гии.

3. Провести сравнение разработанных методов диагностики этиологии и активности ИВЗ у новороаденных и детей раннего возраста с общепринятыми методами лабораторной диагностики.

.4. Разработать рекомендации для практического здравоохранения но применению ыикрометодов.определения этиологии и активности инфекционно-воспалительных заболеваний у новороаденных и де -тей раннего возраста.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Впервые проведено изучение морфологической структуры нуклеолярного аппарата лимфоцитов после стимуляции клеток

и> антигенами.

2. Впервые обнаружены морфологические изменения нуклеоляр -ного аппарата лимфоцитов периферической крови детей и взрослых при стимуляции клеток ксйти? антигеном, к которому сгнси -билизирован организм. Разработан микрометод (нуклеолярный тест) диагностики этиологии инфекционно-воспалительных заболеваний, основанный на регистрации изменений нуклеолярного аппарата лзш-фицатов в ответ на антигенную стимуляцию (авторское свидетельство на изобретение Л 1534402. Способ выявления чувствительности организма к антигенам)..

о. ¿первые с помощью нуклеолярного теста проведена диаг-лотг.гкч врожденного токсоплазмоза, а также заболеваний, вызванных стафилококком .у новорожденных и детей раннего возраста.

4. Впервые установлен цитохимический критерий активности инфекциовно-воспалительных заболеваний бактериальной этио'ло -гии-у детей, заключающийся в увеличении количества лимфоцитов с высоким относительным содержанием РНК. Разработан цитохшк -ческий метод выявления активности инфекционно-воспалительных заболеваний; новорожденных и детей раннего возраста, основанный на цитофогометрическом анализе лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧШлООТЬ заключается в разработке и внедрении:

- цнтоморфологического микрометода ранней диагностики вроаденного токсоплазмоза, а такке заболеваний, вызванных стафилококком у новорожденных л детей раннего возраста;

- цитохимического микрометода диагностики активности инфекционно-воспалительных заболеваний бактериальной природы, развившихся как внутриутробно, так и постнатально.

Разработанные микрометоды обладают высокой специфичностью, чувствительностью и информативностью ; применение их в комплексе с клинико-лабораторными исследованиями уточняет и ускоряет определение этиологии и активности инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных и детей раннего возраста.

Разработанные методы диагностики вошли в методические рекомендации гл'З СССР "¡.-¡икрометод определения активности инфекционно-воспалительных заболеваний новорожденных" (Ы.,1987). шкрометоды внедрены в двух детских: больницах г.Новосибирска, имеются акты внедрения.

ОСНОВНЫЕ НСШбЕНИЯ ДИССПРГАЩ1, 2Ш0СЙШ НА ЗАЩИТУ:

1. Повышение количества лимфоцитов с зоной просветления вокруг ядрышка при инкубации клеток крови с антигенами являет-» ся достоверным критерием сенсибилизации организма к этому ан -тигену. Повышение количества лимфоцитов с ШЯ не зависит от трофики при рождении.

2. Возрастание количества лимфоцитов с высоки),I относительный содержанием РНК является достоверным критерием активности инфекционно-воспалительного процесса бактериальной этиологии.

У детей с внутриутробной гипотрофией указанное изменение отмечено в меньшей степени.

3. Разработанный микрометод выявления этиологии заболевания при диагностике врожденного токсоплазмоза у детей является более -чувствительным и специфичным, чем РСК. Разработанный микрометод выявления активности бактериальной инфекции при диагнос -гике заболеваний у новорожденных обладает большей специфичностью, чем общий анализ крови.

АНРОВДИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. У1 Международном симпозиуме по иммунологии репродукции, Варна, 30 мая - 2 июня 1985г.

2. 1У Всесовзной конференции "Актуальные вопросы адаптации человека к климато-географическиы условиям и первичная профилак -тика", Новосибирск, июль 1936г.

3. I съезде пульмонологов Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, Благовещенск, сентябрь 1986г.

4. Всесоюзной школе-семинаре "Шутриутробные инфекции плода и новорожденного", Новосибирск, апрель 1988г.

5. Всесоюзном симпозиуме "Патогенез хронического воспале -кия" с участием иностранных специалистов, Новосибирск, 11-13 сентября 1991 г.

6. Региональной научно-практической конференции "Актуальные проблемы охраны материнства и детства на Востоке страны" с участием японских ученых, Хабаровск, 8-10 октября 1991г.

В завершенном виде диссертационная работа апробирована на заседании кафедр инфекционных болезней лечебного и педиатри -ческого факультетов НОТКЗШ.

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ, Диссертация изложена на /УЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов^исследования, изложе -ния подученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 184 работы (122 отечественных и 62 зарубежных). Весь материал, представленный в диссертации, подучен, обработан и проанализирован лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Мдгешалн ? методы исследования

Материалом исследования служила периферическая кровь следующих групп новорожденных, детей раннего возраста и взрослых: 38 здоровых новорожденных ; 78 новорожденных и детей раннего возраста с неинфекционной патологией ; 9 детей с врожденный токсоплазмозом ; 150 новорожденных а детей раннего возраста с шфекцконно-воспалительнши заболеваниями бактериальной этиологии ; 16 женщин о токсоплазмозом, токсопдазмоносительством , (в том числе II матерей обследованных детей) ; 30 ыагерей обследованных детей.

Бее дети обследовались с согласия родителей.

Основную группу составили 159 детей с локализованной гнойной инфекцией, пневмонией, развившейся постнатально (90 человек) и внутриутробно (60 человек), а также с врожденным токсоплазмозом (9 человек). Возраст детей во время обследования от I до 7 дня жизни был у 26, от 8 до 28 дней - у 88, от 28 дней до 4 месяцев - у 45.

Для диагностики этиологии инфекционного процесса дети обследовались однократно, для диагностики активности инфекцеонно-вос-палительного процесса - дважды: в острый период заболевания (в среднем на 6 день) г в период реконвалесценции.

Диагноз локализованной гнойной инфекции, был-выставлен на основании клинических данных и результатов микробиологического исследования гнойных очагов ; диагноз пневмонии - также на осно -вании клиничееккх данных и результатов рентгенологического ис -следования органов грудной полости ; диагноз врожденного токсо -плазмоза£вт)на основании положительных результатов серологического исследования матери и ребенка.

При анализе анамнестических данных обращали внимание на ' состояние здоровья матери,, характер течения беременности и ро -дов, При клиническом осмотре детей отмечалось общее состояние ребенка, наличие или отсутствие гнойных очагов на коже и ели -зисгнх, изменения со стороны внутренних органов и центральной нервной системы.

Основное количество детей (155) родились при сроке геста-цшг 37-41 неделя. Из фоновых состояний у 78 детей отмечалась внутриутробная гипотрофия, определенная центильным методом (Ильин Б.И., 1975).

Выявление нукдеолярного аппарата лимфоцитов проводилось с помощью окраски толуидиновыы синим по Sme^h^a. К-. (1969). Изучение сенсибилизации организма к антигенам (АГ) провода -лось'по разработанной методике (нуклеолярный тест, ИТ), за -ключающейся в том, что микрообъем периферической крови (40-80 мкл) инкубировали в течение 4-6 часов при 37°С с АГ (опыт) и такой же объем крови этого ребенка инкубировали без добавления AI1 (контроль) ; затем готовили мазки крови и окра -швали толуидиновыы синим.

Изучение морфологии ядрышкового аппарата лимфоцитов проводилось под световым микроскопом БИ0ЛАМ-Р-16 (06.90х, ок.7х, масляная иммерсия). Б каждом мазке изучалось 50-100 лимфоцитов - подсчигывалось количество безъядрышковых, одноядрыи -ковых и многоядрышковых клеток ; подсчитывалось относительное содержание компактных, кольцевидных и шшроядрьшек; определи -лось количество лимфоцитов с зоной просветления (311Я) вокруг хотя бы одного ядрышка.

Проводился подсчет процента превышения количества лимфоцитов с ЗПЯ в опыте по сравнению с контролем д) По следующей формуле:

д А = --2S----3S----- х I0OÎ ;

кзп

где а А - превышение (в %) количества лимфоцитов с ЕьШ в опыте пс сравнению с контролем, 0ЗП - % лимфоцитов с &1Я в опытной пробирке, Кзп - % лимфоцитов с ¿¿Ш в контроле Были использованы следующие антигены: сухой очищенный туберкулин, сухой токсоплазменный антиген для реакции связывания комплемента, вакцина стафилококковая, вакцина ЕЦд противотуберкулезная сухая, взвесь микробных тел генетически выведенного штамма Sa>. t*H^iesotn- & 595j любезно предоставленная' сотруд -никами лаборатории этиологии диарей (рук.- к.м.н. й.О.Бпргер) Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского.

При проведении модельных исследований (иммунизация новорожденных против туберкулеза) были определены оптимальные условия проведения НТ (длительность инкубации с АГ 6 часов, концентра -ция растворимого АГ-2 мкг/мл; корпускулярного - 2 млрд.микр. тел/мл); а также числовой параметр наличия сенсибилизации к АГ — кригерия л А, равный 1&% и более при использовании растворимого АГ, и 11% более при использовании корпускулярного АГ.

Определение относительного содержания РНК в лимфоцитах проводилось на одаолучевом цитофотометре, прилагаемом к микроскопу ЛШАЫ И-3 при длине волны /У = 575 мм после окраски мазков крови галлоцианином - хромовыми квасцами по Эйнарсону (1962). Контрольные препараты обрабатывались ДНК - азой и РНК - азой по Пирсу Э. (1962). В каждом препарате в 50 лимфоцитах определялось относительное' содержание РНК; строилась гистограмма распределения лимфоцитов по содержанию РНК ; определялся средний уро -вень РНК у каждого ребенка; подсчигывалось относительное о ли -чесгво с содержанием РНК 9 усл.ед.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась как методами параметрической, гак и непараметрической статистики. Из параметрических критериев для сравнительной оценки средних величин применялся ^ - критерий Стьюдента; для измерения корреляционной зависимости между признаками использовался непараметрический показатель - коэффициент ассоциации, или тетрахорический показатель связи (Лакин Г.Ф., 1990). Статистически обработанные данные представлены в таблицах и в графическом изображении.

Результаты исследований.

Изучение морфологии нуклеолярного аппарата лимфоцитов

детей после стимуляции туберкулином и вакциной ЕЦК

С целью выявления изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов после стимуляции АГ было проведено модельное исследова -нив. Моделью гиперчувствительности замедленного типа являлась иммунизация новорожденных против туберкулеза. При изучении семи морфологических показателей нуклеолярного аппарата после

стимуляции лимфоцитов туберкулином отмечалось достоверное ф <0,001, Р < 0,05) возрастание но сравнению с контролем количества лимфоцитов с ЗПЯ после 4-6 часов инкубации. Контролем служила периферическая кровь тех же детей, но вместо АГ к ней добавлялся изотонический раствор натрия хлорида. В группе неиш4увизированных детей изменений показателя в опыте (после стимуляции туберкулином) по сравнении с контролем получено не было (габл.1).

Аналогичные изменения лимфоцитов у иммунизированных детей получены и после использования корпускулярного АГ микобактерий туберкулеза - вакцины ЕЦЕ (табл.1).

Таким образом, контакт АГ с лимфоцитами ребенка, сенсиби -газированного к этому АГ, приводил к изменению морфологии нуклеолярного аппарата вследствие возрастания его функциональной активности.

Диагностическая ценность лабораторных методов определяется их чувствительностью и специфичностью, причем при высокой чувствительности отмечается минимальное количество лоянополо -аительных результатов, а при высокой специфичности - шнималь -ное количество ложноотрицателышх результатов. При использовании растворимого АГ (туберкулина) максимальные величины чувствительности и специфичности (82,3%е 90,0$ соответственно) были получены при следующих условиях: концентрация туберкулина 2 мкг/мл, длительность инкубации с АГ 6 часов, числовой пара -метр критерия наличия сенсибилизацииа А-16% и более. При ис -пользовании корпускулярного АГ (вакцина БЦЕ) максимальные величины чувствительности и специфичности (78,9$ и 90,9$ соответственно} отмечались при следующих условиях: концентрация вакцины' БЦК 2 млрд. микр. тел в I мл., длительность инкубации 6 часов, числовой параметр критерия наличия сеноибилизации д к-11% и бо -лее. При проведении дальнейших исследований (диагностика врок -денного токсоплазмоза и стафилококковых инфекций) использова -лрсь именно эти условия постановки НГ и числовые параметры критерия л А.

Известно, что у новорожденных с пренатальной гипотрофией наблюдается снижение функциональной активности клеточного звена иммунитета. Однако, при постановке НТ с'АГ микобактерий туберкулеза не было выявлено особенностей реагирования лимфоцитов

Таблица I

Количество лимфоцитов о ЗЛЯ после стимуляции антигеном пси различных условиях постановки реакции

Группы детей Антиген Концентра- Длитель - Контроль Опыт

ция АГ ность (/Ч ±ы ) (/*7±/и)

инкубации

I

ы

7., Дети, иммунизи- туберкулин ; 2 мкг/мл 1 4 чао

ровашыз против ; 6 час

т.у<$вркук®за 1.10 мкг/мл . 4 час

I , 6 час

вакцина 2 млрд.микр.

тел/мл

4 час 6 час

65,67 ± 3,81 64,29 + 2,55 35,5 ±23,05 37,2 + 6,40

64,60 £ 5,33 65,95 + 2,97

77,0 ± 5,93 83,94± 2,4$"*^ 54,5 +19,5 60,7 ± 7,48*

70,70+ 4,11

79,89± 3,24

I

Продолжение табл.1

1йуппы детей Антиген Концентра- Длитель - Контроль Опыт

ция АГ ность

инкубации

2, Дети, не имму- туберкулин 2 мкг/мл 4 час 67,08 £ 3,43 66,31±3,77

низированные 6 час 65,15 + 3,83 65,75^3,71

против тубер- 10 мкг/мл 6 час 36,87 + 5,26 51,37+4,31

кулеза вакцина ЕЦК 2 млрд.

1 микр.тел/мл 4 час 55,42 + 5,96 59,33+3,75

Й 1 6 час 67,73 ± 2,67 66,36^2,95

Примечание: достоверность различий между контролем и опытом * - Р <0,05 - Р С 0,001

I

периферической крови иммунизированных против туберкулеза детей с внутриутробной гипотрофией по сравнению с иммунизиро -ванными детьми-нормотрофикаш. Следовательно, морфологичео -кая перестройка нуклеолярного аппарата лимфоцитов сенсибилизированных детей не зависит от трофики при рождении; Величины чувствительности и специфичности метода у детей с внутриутробной гипотрофией также не отличались'' от группы детей' -- нормотрофиков.

Таким образом, у иммунизированных против туберкулеза-новорожденных о внутриутробной гипотрофией отмечается возрастание количества лимфоцитов с ЗЛЯ после стимуляции антигенами микобактерий туберкулеза также,как у детей-нормотрсфзков. Установленные числовые параметры критерия выявления сенсибнлзг -зацнилА можно применять у детей независимо от трофики при рождении.

С помощью НТ мргдео определять эффективность нмму&Езацга новорожденных против туберкулеза в возрасте 1-3■месяцев.

Диагностика врожденного токсоплазмоза с поиощьо НТ с токсоплазмвкным АГ (ТАГ)

С целью изучения возможностей применения разработанного' нами НТ в диагностике этиологии заболеваний у новорожденных было взято заболевание, вызываемое возбудителем из рода про -стекикх - токсоплазмоз. Врожденный токсоплазмоз у-детей встречается довольно широко, диагностика его по клинически проявлением крайне затруднена.

При постановке НТ с ТАГ у больных токсоплазмозом детей и взрослых было выявлено достоверное ( рсЭ,05; р <; 0,01 соответственно) возрастание количества лимфоцитов о ЗЛЯ после стимуляции ТАГ по сравнению с контролем. Среда детей с различной патологией перинатального периода (врожденные порока развития, локализованная гнойная инфекция, перинатальная патология ДНС и др.) подобная закономерность не обнаружена.

Среди .9 детей с врожденным токсоплазмозом у 8 (88,9?) выявлялась сенсибилизация к ТАГ по результатам НГ. У всех детей с выявленной сенсибилизацией к ТАГ определялись патогкоыоннч-ные симптомы врожденного токсбплазмоза.. Триада патогномокнчннх симптомов (гидроцефалия, поражение глаз, кальци$икаты в голоз-

вон мозге) была у 1 ребенка, два симптома из триада (гидроцефалия х хориоретинит) - у I, по одному симптому - у 6. У I ребенка о врожденным тоясодлазмозом не отмечалось латогвомонич -ных симптомов этого заболевания (у него выявлялась Ш НДС, синдром задержки моторного развития). Именно у этого ребенка не было выявлено сенсибилизации к ГАГ по результатам НТ. Сле -довательыо, у всех детей о КГ отмечались симптомы поражения цдс, у большей чаоти органического характера.

При сравнении результатов определения специфических факторов гуморального иммунитета ) в реакции связывания комплемента и наличия сенсибилизации к ТАГ по результатам НТ было обнаружено, что отрицательные результаты РСК у больных новорож -денных отмечались у 3 детей, в го время как отрицательные ре -зудьтагы НТ - у I. Чувствительность РСК при диагностике врож -денного токсоплазыоза составила 66,7$, чувствительность НТ-88,9^.

Из 9 детей с ВТ только I родился доношенным без проявлений внутриутробной гипотрофии, у остальных 6 доношенных новорожденных отмечалась внутриутробная гипотрофия 1-Ш степени, 2 ребенка родшшоь недоношенными. Следовательно, внутриутробное инфициро -езнеэ токсоплазмой способствует внутриутробной гипотрофии или преждевременным родам.

Из 58 детей с различной патологией пренатакьного периода сенсибилизация к ТАГ была выявлена у 10 (17,2/0.

При' изучении НТ с ТАГ у взрослых с хроническим токсоплазмо-зом, токсоплазменным носигельствош отмечалась высокая чувсгви -тельнооть как НТ (81,25$) так и РСК (100$). Специфичность НТ соотавила 73,3$, а РСК только 58,3^.

Изучение сенсибилизации к ТАГ в ларах мать-ребенок пока - • вело, что не было ни одного случая рождения сенсибилизированного к ТАГ по результатам НГ ребенка от неоенсибилизированной матери, хотя результаты определения ^ б в РСК нередко свидетель -отвует ей обратном (рис.1).

Из ii матерей с токсоплазмозом или токсоплазменным инфицированием у 4 по положительный результатам РСК в I триместре бере -мешости было установлено инфицирование до наступления настоя -щей беременности. При постановке НТ в послеродовом периоде у воех 4 женщин выявлена сенсибилизация к ТАГ, у их детей сенсн -бюпюации к таг не было и не определялось патогномошчных

Рис.4. Сопоставление результатов определения гуморальных факторов антитоксоплазыенного иммунитета л РСК Ж шйЭХёнкя чувствительности организма к ТАГ в НТ в парат магь-ре^ейок.

- мать, - ребенок, - результат РСК поло-

жительный, - результат РСК огснцагэльный,

С) - результат РСК положительный, сиенжвпжйся ртргагим^» ным,,.йшг наоборот , - результат -РСК неизвестен»

* '- больные токаоплазиозом» На заштрихованной часта рисунка - лица о выявленной -овно*<}й*> лизацией к ТАГ по результата^ НГ, на не завтрнхованноа -о отсутствием сенсибилизации.

симптомов врожденного токсоплазмоза.

У матерей 7 детей (I разнояйцевая двойня) по результатам РСК инфицирование произошло во время беременности, в послеродовом периоде у всех женщин определялась сенсибилизация к ТАГ. Все дети родились с проявлениями внутриутробной гипотрофии, у всех выявлялись симптомы ПП ЦНС, у 5 из них был хотя бы один из патогномоничных симптомов ВТ. Сенсибилизация к ТАГ была обнаружена также у 5 детей, причем у всех>них отмечался хотя бы один из патогномоничных симптомов» Вровденный токсоплазмоз диагностирован у 6 детей.

У матери I ребенка установить время инфицирования токсо-плазмой не представлялось возможным, ребенок ее не был сенсибилизирован к ТАГ.

Следовательно, подученные результаты подтверждают ранее установленный факт, что инфицирование женщин гоксоплазмой до наступления, беременности не опасно для плода ; инфицирование и развитие ВТ возможно только в случае первичного заражения во время беременности.

Результаты проведенного исследования позволили сделать сводующее заключение:

- положительные результаты НТ с ТАГ у детей и взрослых отражают инфицирование токсоплазмой ;

- положительные результаты НТ с ТАГ у новорожденных позволяют диагностировать врожденный токсоплазмоз и назначать специфическую терапию ;

- внутриутробное инфицирование плода токсоплазмой приводит в большинстве случаев к развитию внутриутробной гипотро - . фии и во всех случаях к ПП ЦДС, как правило, органического характера ;

- обследование новорожденных и детей раннего возраста на токсоплазмоз с помощью НТ дает более точные результаты, чем с помощью РСК, так как НТ, обладает более высокой спеда -фияностью, в, следовательно, дает меньшее количество ложно -положительных результатов.

Диагностика заболеваний стафилококковой этиологии у новорожденных и детей раннего возраста с помощью НГ

Выявив диагностическую значимость ИТ при врожденном токсо-плазмозе, с целью расширения области его применения, в даль -нейших исследованиях проводилось выявление сенсибилизации к АГ стафилококка и энтеробактерий у новорожденных с локализованной гнойной инфекцией и пневмонией, возникших как постнаталъно, так и внутриутробно.

При постановке ИТ с АГ стафилококка (стафилококковая вак -цпна) отмечалось достоверное возрастание количества лимфоцитов с ШЯ в опыте по сравнению с контролем как у детей с постнаталь-ным заражением, так и с внутриутробным (р <Г 0,001 и р< 0,01 соответственно).

При постановке 1ГГ сс стафилококковой вакциной у детей о постнатальнш развинти локализованной гнойной инфекции в 93,3$ случаев были получены положительные результаты. В 82,8$ случаев у детей, сенсибилизированных к стафилококку, при бактериологи -ческой исследовании выделялись стафилококки, т.е. отмечалось совпадение результатов НТ и бактериологического исследования. ' Следовательно, положительные результаты НГ со стафилококковой вакциной подтвердили этиологию заболевания. У 6 из 29 детей с локализованной гнойной инфекцией до результатам НТ со взвесью кик робких тол £ 595, обладающей

общим для грамогрицагельной микрофлоры АГ

( Не - гликолипидом) была выявлена сенсибилизация к энтеро-бактерияы. Выявление корреляционной связи мезду наличием у ре -бенка дисфункции кишечника и положительным-результатом НТ с ^ичттаегг. ( Z^ = + 500; р < 0,01) и отсутствие совладения между НТ и бактериологическим исследованием позволило заключить, что у детей с локализованной гнойной инфекцией наличие сенсибилизации к АГ энтеробакгерий свидетельствует не об этиологии заболевания, а о развитии дасбиоценоза кишечника.

Аналогичные результаты НГ со стафилококком и 5*. ^'^езл^к. были получены при внутриутробном развитии шфекционно-воспали -тельного процесса. Хотя у новорожденных с внутриутробной инфекцией в меньшем проценте случаев из гнойных очагов выделялся золотистый стафилококк, у них чаще, чем у детей с локализован-

- 17 -

У

йой гнойной инфекцией, выявлялась контаминация сапрофитным или эпидермальным стафилококком 2-4 локусов.

у новорожденных с внутриутробной инфекцией чаще, чем у детей с постнатальным заражением, отмечалась дисфункция кишечника^ также дасбактериоз кишечника, установленный бактериологически, что могло быть связано с проведением у всех детей антибактериальной терапии в раннем неонатальном периоде. У них чаде выявлялась сенсибилизация к АГ энтеробакгерии (у 7 из 20 детей). Выявлена положительная корреляционная зависимость между диагностически значимыми результатами НТ с Su. ^j^iesaúi £ 595 и наличием у ребенка дисфункции кишечника ( ^/j = + 0,538; р «с. 0,001), а также между положительными результатами НТ с M^hne^ci^. /Z 595 и наличием дисбактериоза кишечника, установленного бактериологическим методом ( tA =+0,525; р с 0,001).

Таким образом, положительные результаты НТ с S*». ñ

595 у детей с внутриутробной инфекцией свидетельствует о наличии дасбиоцевоза, развившегося вследствие.совокупности неблагоприятных факторов ; вскармливания донорским молоком, отсутствия контакта о матерью, назначения в раннем неонатальном периоде антибактериальной терапии.

Результаты проведенных исследований позволили сделать следующее заключение:

- положительные результаты НТ со стафилококковой вакциной

у детей с локализованной гнойной инфекцией, развившейся постна -тально и с внутриутробной инфекцией, свидетельствуют о наличии иммунного ответа на антиген этиологически значимого возбудителя и позволяют выявить стафилококковую этиологию заболевания;

- положительные результаты НТ с S/>?, w/m^o^a <6 595 у детей с локализованной гнойной инфекцией ж с внутриутробной инфекцией отмечаются при развииии дисбиоценоза, в частности, лисбактериоза кишечника ;

- стафилококк не утратил значения в этиологии внутриутроб -них инфекционных воспалительных заболеваний.

Показатели относительного содержания РНК лимфоцитов у здоровых и больных детей.

Кроме специфической диагностики ИВЗ у детей с помощью изу -чения показателей функциональной внутриклеточной активности им-мунокомпетенгных клеток можно определять и активность процесса.

У новорожденных и детей раннего возраста в острый период

воспалительного процесса бактериальной этиологии происходило, достоверное (р <0,001) возрастание среднего содержания РНК в лимфоцитах по сравнению со здоровыми и детьми с неинфекционной патологией. Установлено, что подобная закономерность отмечалась независимо от того, возник процесс внутриутробно или постнатально, а также независимо от нозологической формы заболевания (табл.2). Кроме возрастания среднего содержания ГО*, у детей в острый период процесса увеличивалась гетерогенность популяции лимфоцитов по содержанию РНК, а именно появлялись клетки с высоким (9 и более усл. ед.) уровнем 1НК, которые практически не встречались у здоровых новорожденных и при заболеваниях небактериальной природы.

В период клинического улучшения среднее содержание РНК в лимфоцитах снижалось, но не достигало показателей здоровых новорожденных, гетерогенность популяции лимфоцитов несколько уменьшалась за счет'сншения количества лимфоцитов с высоким' показателем РНК.

При изучении гетерогенности популяции лимфоцитов 'здоровых новорожденных было установлено, что у детей, матери которых перенесли во П половине беременнооти ИВЗ, возрастало ореднее содержание РНК на 1-2 день жизни по сравнению с новорождайпош, матери которых ничем на болели во время беременности.

В связи с тем, что у здоровых новорожденных абсолютное большинство лимфоцитов содержали НЕС в количестве от 5 до 8 усл. ед., то за критерий активации иммунной системы нами было принято количество лимфоцитов с содержанием РНК Ь 9 усл.ед. При числовом значении параметра активации равного 12$ и более, актива -ция иммунной системы у здоровых новорожденных отмечалась в 12,5$ случаев.

7 детей в острый период бактериальной инфекции в соответствии с установленным критерием активация иммунной системы определялась в 86,5$ случаев при постнатальном заражении и в 81, при ввдгриутробной, т.е. существенно не различались между-собой. Однако, при'анализе индивидуальных показателей было выявлено,, что при выраженных клинических проявлениях бактериальной инфекции у детей с пренатальной гипотрофией реже, чем у нормотрофв -ков отмечалась активация иммунной системы, выявляемая по пито -

Таблица 2

Среднее содержание РНК в лимфоцитах: и относительное их количество с уровнем РНК ^ 9 усл.ед.

Группы обследованных

1. Контрольная группа

2. Дети с неда-фекционной патологией

3. Дети с посг-нагальной бактериаль -ной инфекцией

а) Острый период

б) период клинического улучшения

4. Дети с внутриутробной инфекцией

а) Острый период период клинического улучшения Р

б)

Содержание РНК в Относительное со-лнмфоцитах (усл.ед.) держание лиыфош-(Шл) ) тов с уровнем РНК

9 усл.ед. (SO

24 6,61 £ 0,15

28 6,41 t 0Д5

37 8,42+0,25 12 7,80 £ 0,56

37 7,96 £ 0,20

13

7,57 + 0,35

2-1> 0,05 За-1< 0,001 36-1 < 0,05 4а-1 < 0,001 46-1 < 0,001 За-2 < 0,001 3а-3б>0,05 4а-2 < 0,001 4а-4б>0,05

(ц+ rf) )

4,42 + 1,48

3,78 £ 1,00

40,42 £ 4,77. 28,83 £10,87

36,92 £ 4,15

30,92 £10,65

0,05 0,001 0,05 0,001 0,05 0,001 0,05 0,001 0,05

2-1 За-1 36-1 4а-1 46-1 За-2 За-Зб 4а-2 < 4а-4б >

>

< < < < <

химическим показателям РНК в лимфоцитах. Шла выявлена отрицательная корреляционная зависимость между внутриутробной . гипотрофией и наличием активации иммунной системы у новорожденных в острый период ИВЗ бактериальной этиологии 0,348; р < 0,01).

Было проведено сопоставление результатов выявления бактериальной инфекции по изменению показателей периферической крови и предлагаемому способу выявления активации иммунной системы. Оба метода выявления бактериальной инфекции дали примерно одинаковые результаты (78,4$ и 83,8$ соответственно) у больных детей без учета трофики при роадении. Однако, при изучении чувствительности этих методов отдельно среда детеЙ--нормотрофиков и новорожденных с внутриутробной гипотрофией было выявлено, что при диагностике бактериальной инфекции у детей-нормотрофиков чувствительность цитохимического метода выше, чем анализа периферической крови (91,3$ и 73,9$ соот -ветственно), у детей с лренатальной гипотрофией - наоборот, чувствительность цитохимического метода была ниже, чем обще -го анализа крови (71,4$ и 85,7$ соответственно). Полученные результаты можно объяснить тем, что у детей с пренагальной гипотрофией н связи с нарушениями функциональной активности лимфоцитов, которые проявлялись в недостаточной активации синтеза РНК при бактериальной инфекции, происходила компенса -торная активация нейтрофшлшого звена антибактериальной за -щиты. Специфичность выявления бактериальной инфекции состава -ла для цитохимического метода - 89,3$, для общего анализа крови - только 64,3$.

Таким образом, показатели цигофогомегряческогоопределенна содержания РНК в лимфоцитах периферической крови не только позволили диагностировать инфекционно-воспалительное заболевание, но и выявили недостаточное возрастание внутриклеточной функциональной активности у новорожденных, у которых бактериальная инфекция развилась на фоне-внутриутробной гипотрофии. Установлен числовой параметр критерия активации иммунной системы бактериальным агентом, при котором отмечается высокая чувства -тельность и специфичность метода.

Изучение цитохимических и морфологических показателей внутриклеточной функциональной активности лимфоцитов здоровых

и больных новорожденных позволило не только предложить два микрометода, но и установить числовые значения критерия сенсибилизации организма к антигенам и активации иммунной системы. Проведение этих методов осуществляется на серийно производимой аппаратуре (микроскопы, цитофотометры и т.д.), не требует дорогостоящего дополнительного оборудования, импортных реактивов. Метода достаточно просты в исполнении, обладают хорошей воспроизводимостью. Установленные числовые значения критериев обеспечивают их высокую чувствительность и специфичность при диагностике. Все это позволяет рекомендовать их к внедрению в клини -чешшх лабораториях детских больниц.

Б Ц Б О Д Ы

1. При взаимодействии ¿п лимфоцитов с антигеном, к которому они чувствительны, происходят морфологические изменения нуклеолярного аппарата, выявляемые с помощью окраски толуидиновым синим в виде зоны просветления вокруг одного или нескольких ядрышек.

2. Разработанный, микрометод выявления сенсибилизации де -тей к антигенам возбудителей заболеваний (нуклеолярный тест)

и установленные числовые параметры критерия наличия сексиби-' лизации как при использовании в НТ растворимых антигенов, так и корпускулярных, обеспечивают высокую чувствительность и специфичность диагностики.

3. С помощью НТ можно проводить определение эффективности вакцинации новорожденных против туберкулеза; диагностику врож -денного токсоплазмоза у новорожденных ; заболеваний стафилококковой этиологии, возникших как внутриутробно, так и посгнаталь-но, а также дисбиоценоза у новорожденных и детей раннего воз -раста.

4. Нуклеолярный тест с токсоплазменным антигеном обладает большей чувствительностью и специфичностью при диагностике врожденного токсоплазмоза, чем определение антитоксоплазменных антител в РАК. Врожденный токсопиазмоз приводит к развитию пренагальной гипотрофии в 77,8% случаев и к перинатальному поражению ЦНС, выявляемому в неонатальном периоде у 100/5 детей.

5. Инфекционно-воспалительные заболевания бактериальной этиологии (независимо от нозологической формы), развившиеся

как внутриутробно, гак и постнатально, приводят к возрастание количества лимфоцитов с высоким содержанием РНК; в период клинического улучшения количество таких лимфоцитов снижается. Определен числовое параметр количества лимфоцитов с высоким относительным содержанием ЕЖ, отражающий развившийся воспали -тельный процесс. Цитохимический метод выявления активности ивз обладает болыпей специфичностью, чем общий анализ крови, чувствительность же этих цетодов не различалась.

6. 7 детей с ивфекционно-воспалительнши заболеваниями, развившимися на фоне внутриутробной гипотрофии,реакция лимфоцитов на этиологически значимый антиген не отличалась от детей--норыотрофиков, хотя у них в острый период заболевания в мень -шеи проценте случаев отмечалась активация иммунной системы.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаврилова Л.-0.', Аутенштс А.И., Петерсон В.Д. Содерка-ние РНК в лимфоцитах - критерий состояния иммунной системы организма и ее реакции на инфекционный агент / Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний в вторичных шшуянодефицитов. - Новосибирск, 1985. - Т.2. - С.63-65.

2. Гаврилова 1.0., Дутеншгос А.И., Петерсон В.Д. Содедаа-ние РНК в лимфоцитах - показатель нормы и патологии у детей в неонатальноы периоде ¿'Адаптация человека к климато-географи -ческим условшш и первичная профилактика. - Новосибирск, 1986, - T.I.-C.5I.

3. Аутешшос А.И., Гаврилова 1.О., Петерсон В.Д. Содержание РНК в лимфоцитах периферической крови как критерий актив -ности неспецифических и специфических заболеваний легких // Диагностика, особенности течения и профилактики болезней органов дыхания в Дальневосточном регионе. - Благовещенск, 1986,- С.61-72.

4. Аутеншляс А.И., Петерсон В.Д., Гаврилова Л.О., Столярова В.М. Микрометода определения активности инфекционно-вос-палительных заболеваний новорожденных. Методические рекомендации. - М., 1987, - С.12.

5. Гаврилова 1.0., Аутеншлюс ¿.И., Петерсон В.Д. Опреде -ление сенсибилизации лимфоцитов иоворсжденнык и грудных детей к токсоплазменному антигену /J Иммунологая репродукции.

В воесовзвнК смпеаиум с международным участием. - Киев, 1987. - С.172-173.

6. Яав£яя0ва Д.О..Аутеншлюс &.И., Свцонош Т.Н., Петер-ош В. Д. Содержанке РНК в лимфоцитах как показатель актив -воогх шфекционно-восяалигелъного процесса у новорожденных в дате! раннего возрасга^Иодиагсня. - 1988.-i 2.-С.40-45.

7. Еавржяова 1.0., Аутеншлюс А. И. Иорфолывческие измене-вхя нукдаоляЕИого аппарата лимфоцитов как показатель чувствительности к туберкулину и токоошшзиеншад антигену U Педа -атржя. - 1989. - В 7. - С. 43-47.

8. Г&вдалова Л.О., Столярова B.U., Петерсон В.Д. Иммуно-циохшшчэокие показатели активности ив|)екционн©-воспалительного процзсса и сенсжбилизацди новорожденных к бактериальным я парезитадаым антигенам/I Всесоюзный иммунологический Съезд. - И. 1999. - T.I. - С. 207.

9. Аутеншлюс А.И., Гаврилова 1.0., Петерсон В.Д. Способ выявления чувствительности организма к антигенам. А.С.№1534402 Нгагл. открытий и изобретений. - £990. - К I.

10. Аутеншлюс А.И., Гаврилова I.O., Тенетова Б.Д. Диагностика токсонлазмова о использованием стандартного токсошюзиек-еого антигена для РСК/?£урн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1990. - J61. - С. 105-107.

П. Гаврилова 1.0., Аутеншлюс А.И. О сенсибилизации лимфо-цигов новорожденных и детей раннего возраста к патогенной и условно-патогенной микрофлоре/ Педиатрия. - 1990. - й 10.--С.33-38.

12. Гаврилова Д.О. Цитологические и цитохимические показатели лимфоцитов периферической крова у новорожденных при ин -фекционно-воспалигельных заболеваниях/'Патогенез хронического воспаления. - Новосибирск, 1991. - C.I50-I5I.

13. Гаврилова Д.О., Столярова В.М., Аутеншлюс А.И., Иванова О.В. Иммунные реакции с бактериальными и тканевыми антиге -нами у новорожденных, с патологическими процессами // Актуальные проблемы охраны материнства и детства на Востоке страны,- Новосибирск, 1991. - Ч.Х. - С.158-160.

14. L-А\ ЙгХея<>ои ¿ГЗ, TfcJkbsh&s A J, Sh^uk Л P.t ТУ., Gafu'&fo. I. Ov The ¿s/i^u.^ &/ гЪе

5>/s.te*yi SAtuM&iiCto /я а**/

«Ъ ¿<2.-P. 6• ^

Тип.CO AMU. Зак. Тис. 1992 ^