Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Цитокитновый профиль иммунного ответа у детей, больных коклюшем, и его изменение в зависимости от особенностей лечения заболевания

Актуальность проблемы

Коклюш остается серьезной проблемой в педиатрии, несмотря на успехи вакцинопрофилактики: даже привитые дети могут заболевать коклюшем. Чаще всего это дети старше 6 лет, у которых напряженность иммунитета против коклюшной инфекции снизилась со временем или просто слабо ответившие на вакцину. Источником инфекции могут быть взрослые люди или дети младше года, не имеющие защитных титров от данного возбудителя [30, 68, 76, 78, 79].

Коклюш является инфекционным заболеванием, характеризующимся длительным течением, даже если на фоне «коклюшной анергии» у больного не присоединяются другие инфекции. Важно исследовать, какова в этом роль иммунной системы или же длительность коклюша более объясняется действием коклюшных токсинов на центральную нервную систему больного и нарушениями, связанными с гипоксемией [30].

Кроме того, существенной проблемой является сочетание коклюшной инфекции с другими респираторными инфекциями [24, 33, 34, 127, 135]. В частности, распространение других инфекций, сопровождающихся длительным сухим кашлем, затрудняет своевременную диагностику коклюша у детей, подростков и взрослых и назначение им адекватной терапии.

Данных об иммунологических изменениях при коклюшной микст-инфекции относительно немного. Считается, что лимфоцитоз в начале заболевания происходит за счет выброса в кровоток незрелых клеток. Данный феномен на поздних стадиях заболевания сменяется снижением количества лимфоцитов и численности некоторых субпопуляций. Истощение адаптивных возможностей организма, т.н. «коклюшная анергия», часто приводит к присоединению других респираторных инфекций [30].

В последние годы исследование иммунной системы у больных коклюшем стало дополняться исследованием цитокинового профиля иммунного ответа [2, 4, 23, 41]. Делаются предположения относительно того, какую роль играют цитоки-новые взаимодействия различных видов регуляторных клеток (Thl, Th2) в клиническом течении данного заболевания. Однако попытки перенести выводы, полученные в эксперименте на животных, на клинические наблюдения не особенно успешны, т.к. у больных необходимо учитывать много факторов, влияющих на течение коклюша.

Появление в последнее время новых данных об активном участии в патогенезе коклюша других видов регуляторных клеток, таких как Trl и Thl7, оказывающих непосредственное воздействие на процессы, происходящие в легких, заставляет пересмотреть уже существующие представления об иммунопатогенезе коклюша [12, 95, 119]. Однако, роль упомянутых регуляторных субпопуляций при коклюшной инфекции показана в респираторном тракте экспериментальных животных, а в клинике приходится судить о характере иммунорегуляторных процессов по активности лимфоцитов крови, т.к. получение бронхоальвеолярной лаваж-ной жидкости у больных коклюшем, особенно в периоде судорожного кашля, затруднительно.

Для создания современных представлений об иммунопатологии коклюша необходимо охарактеризовать преобладающий тип цитокиновых взаимодействий на разных этапах заболевания и связать его с изменениями других параметров иммунной системы больного. При этом важно исследовать цитокиновую систему, во-первых, комплексно и, во-вторых, в динамике.

Необходимо также исследовать роль цитокиновой сети при разных формах коклюша, поскольку тип цитокинового ответа, наблюдаемый у больного, зависит от многих факторов: от самой коклюшной инфекции, от исходного типа реагирования, присущего данному организму, от присоединения других респираторных инфекций, от прививочного анамнеза и возраста больного.

Прогресс в решении этой задачи позволит оценивать, насколько успешно иммунная система больного справляется с коклюшной инфекцией, и велик ли риск развития осложнений, т.е. обеспечивать индивидуальный подход к лечению пациента. Поскольку выздоровление больных коклюшем является длительным процессом, исследование цитокиновой сети в динамике заболевания может дать информацию о дальнейшем функционировании иммунной системы, что особенно важно, если больной - ребенок.

Цель работы - изучение влияния коклюшной инфекции и ее сочетаний с другими респираторными инфекциями на иммунную систему и продукцию цито-кинов у детей в динамике заболевания. Задачи исследования:

1. Исследование изменений в иммунной системе и характере продукции цито-кинов при коклюше.

2. Исследование особенностей функционирования цитокиновой сети у больных, переносящих коклюш в сочетании с другими респираторными инфекциями.

3. Сравнение динамики и интенсивности продукции антител к В.pertussis у детей, ранее привитых против коклюша, и у непривитых. Сопоставление этих данных с продукцией цитокинов, сопровождающих реализацию иммунного ответа на коклюшную инфекцию.

Для характеристики баланса активности Т-хелперов 1 и 2 типа в динамике заболевания нами выбраны были продукция ими ИФНу и ИЛ-4 соответственно. Кроме того, определялись ИЛ-10 и ИЛ-17, - продукты регуляторных субпопуляций лимфоцитов.

Для анализа провоспалительного профиля цитокинов при коклюше были выбраны ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8. Продукция данных цитокинов отражает активность воспалительной реакции в организме и миграции клеток в очаг воспаления.

Для характеристики хемокинового фона иммунного ответа в динамике заболевания были выбраны ИЛ-8 и ИЛ-17. ИЛ-8 сам является хемокином, стимулирующим миграцию клеток в очаг воспаления, а ИЛ-17 регулирует процесс миграции клеток-эффекторов, индуцируя продукцию хемокинов.

Специфический иммунный ответ рассматривали в сопоставлении с продукцией ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 лейкоцитами крови больных. ИЛ-4 активирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток в плазматические клетки. ИЛ-10 регулирует переход с ответа по Thl на ответ Th2 за счет ингибирования активности Thl, играет важную роль в переключении продукции антител с IgM изотипа на IgG и IgA. ИЛ-6 является ростовым фактором для активированных В-клеток, стимулирует дифференцировку и пролиферацию плазматических клеток

Положения, выносимые на защиту:

1. Параметры функционирования цитокиновой сети у больных коклюшем резко отличаются от показателей здоровых детей и варьируют в зависимости от стадии заболевания.

2. Снижение способности лимфоцитов к продукции ИФНу является наиболее характерной особенностью функционирования цитокиновой сети при данном заболевании.

3. Цитокиновый профиль иммунного ответа больных коклюшем зависит от прививочного анамнеза, присоединения микоплазменной или вирусной инфекции и возраста больного ребенка.

4. В спектре цитокинов, регулирующих специфический иммунный ответ у больных коклюшем, выявляются различия между детьми, ранее привитыми от этой инфекции, и не привитыми. Наибольшие различия касаются продукции ИЛ-4 и ИЛ-10.

Научная новизна

В ходе работы проведено комплексное обследование детей, переносящих коклюш, с учетом таких особенностей как степень тяжести заболевания, присоединение сопутствующих респираторных инфекций, прививочный анамнез больного. Состояние цитокиновой сети впервые было оценено по 13 параметрам в динамике заболевания с учетом возраста ребенка. Дана оценка функциональной активности лимфоцитов крови в зависимости от наличия или отсутствия у больного лимфоци-тоза.

Выявлено, что при сочетании коклюша с микоплазменной или вирусной инфекцией способность лейкоцитов больного продуцировать цитокины изменяется по сравнению с тем, как это происходит при «чистом» коклюше. Эти различия заключаются, прежде всего, в характере продукции ИФНу снижающейся при «чистом» коклюше и его сочетании с вирусными инфекциями и сохраняющей высокий уровень в случае присоединении к коклюшу микоплазменной инфекции. При сочетании коклюша с микоплазменной инфекцией способность лейкоцитов больного продуцировать ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-17 существенно выше, чем при других формах заболевания.

Впервые показано, что различие в прививочном анамнезе наиболее ярко отражается на индуцированной продукции ИЛ-4 и ИЛ-10. Так, у привитых детей наблюдаются высокие уровни продукции ИЛ-4, в то время как у непривитых детей наблюдается более высокая продукция ИЛ-10.

Впервые проанализирована динамика продукции ИЛ-17 при коклюше и его сочетании с другими инфекциями.

Практическая значимость работы

Полученные данные используются врачами-педиатрами клинического отдела ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для оценки течения респираторных инфекций и коррекции состояния иммунной системы детей, больных коклюшем.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертационной работы вошли в курс практических занятий по иммунологии на кафедре микробиологии Российского университета дружбы народов.

Апробация материалов диссертации

Апробация материалов диссертации проведена на заседании Секции Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Общая и прикладная иммунология», протокол № 4 от 27 мая 2010 года.

Результаты работы доложены и обсуждены на X Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006), на XI Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007), на Объединенном иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008) на научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008), на XIII Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 101 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты собственных исследований», обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 12 таблицами. Список литературы состоит из 139 работ, в том числе 41 отечественных и 98 зарубежных авторов.

Выводы.

1. Цитокиновый профиль больных коклюшем отличается от такового у здоровых детей. При коклюше индуцированная продукция ряда цитокинов (в основном, провоспалительных) снижена, спонтанная повышена.

2. Снижение продукции ИФНу лимфоцитами больных является характерной, длительно сохраняющейся особенностью функционирования цитокиновой сети при коклюше. Вероятно, это является проявлением интенсивной реализации гуморального ответа на возбудитель коклюша по Th2 типу.

3. Повышение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8) у больных коклюшем свидетельствует об активной реакции иммунной системы на коклюшную инфекцию и другие респираторные инфекции, сочетающиеся с ней. Для ИЛ-6 и ИЛ-8 такая реакция усиливается с углублением тяжести заболевания.

4. Цитокиновая регуляция специфического гуморального ответа на коклюшную инфекцию имеет особенности, связанные с прививочным анамнезом больных. У ранее привитых детей активность Th2 высока с первых недель заболевания, а у непривитых начинает преобладать на поздних сроках заболевания.

5. Присоединение микоплазменной инфекции к коклюшу наиболее сильно изменяет цитокиновый профиль, наблюдаемый у больных. При этом варианте заболевания наблюдается самая высокая продукция ИЛ-8, ИЛ-17 на ранних сроках и наиболее быстрая нормализация продукции ИФНу на поздних сроках. Повышенная концентрация IgE в крови больных также характерна для сочетания коклюша с микоплазменной инфекцией.

Заключение

Исходя из вышесказанного, можно сделать следующие выводы. Биологическая активность ИФНу снижается как у детей с коклюшной моноинфекцией, так и при сочетании ее с другими респираторными инфекциями. Снижение резервных I возможностей лимфоцитов больного к продукции ИФНу в той или иной степени является наиболее общей характеристикой коклюша. Особенно выражено снижение данного параметра интерферонового статуса у детей младше 6 лет.

Прием Виферона больными младшего возраста не вызывает повышения способности лимфоцитов их крови продуцировать ИФНу.

Терапия Циклофероном у детей 6 лет и старше может приближать биологическую активность данного показателя к нормальным значениям, однако детали этого механизма и быстрота достижения эффекта не исследованы. Значимых изменений альфа-интерфероногенеза у детей, переносящих коклюш, не выявлено.

Обсуждение результатов

Наше исследование выполнено в ходе мониторинга терапии больных коклюшем 1,5-12 лет, проходивших в 2007-2009 г.г. лечение в специализированном отделении Инфекционная клиническая больница №1 г. Москвы.

Следует отметить, что 2/3 из них переносили коклюш в сочетании с другими респираторными инфекциями. Таким образом, выявить изменения в состоянии иммунной системы, связанные с самим коклюшем, а не с присоединением других инфекций, было непросто. Поэтому, анализируя динамику изменений в иммунной системе этих больных по неделям заболевания, при всех видах анализа мы подразделяли детей на 3 группы: 1) коклюш, протекающий как моноинфекция, 2) коклюш с микоплазменной инфекцией, 3) коклюш с вирусной инфекцией. Кроме того, обязательным было разделение группы на детей 6 лет и старше и младших детей (1,5 -6 лет). Последнее представляется особенно важным, так как лимфоцитоз встречался в основном в группе детей младше 6 лет.

По данным литературы, патогномоничным симптомом коклюша является лейко- и лимфоцитоз [30]. Признается, тем не менее, что он более характерен для больных коклюшем 1 года жизни [3, 30, 93].

Многими авторами [84, 86] показано, что лимфоцитоз у детей, больных коклюшем, связан, прежде всего, с выходом незрелых клеток из тимуса и снижением продукции на них L-селектина (CD62L). Экспрессия L-селектина информативна и при других респираторных заболеваниях (например, при гриппе [111, 125]) для мониторинга активности Т-клеток памяти и Т-эффекторов.

То, что лимфоцитоз является непременным атрибутом коклюша, не подтверждается нашими данными. В группе больных до 6 дет лимфоцитоз наблюдался у 37% детей, в более старшей возрастной группе (6-12 лет) - у 3%. На фоне лимфоцитоза у 71% детей наблюдалось повышение численности всех субпопуляций, в особенности В- и NK-клеток. При лимфопении у 87% детей наблюдалось снижение абсолютной численности всех субпопуляций.

Нами отмечено, что при коклюше повышается процент Т-хелперов и В-лимфоцитов, и эти данные согласуются с литературными. Более чем у половины детей, переносящих коклюш как моноинфекцию, процент В-лимфоцитов в крови заметно превышает нормальные значения.

Повышение процента Т- хелперов и отношения CD4+/CD8+ и длительное его сохранение обращает на себя внимание. У контрольной группы детей с коклюше-подобным кашлем, которую мы обследовали, стремясь оценить вклад микоплазменной инфекции в изменения, наблюдаемые при сочетании коклюша с микоплазменной инфекцией, средняя величина CD4+/CD8+ была 1,42 ± 0,19 (у здоровых детей - 1,62 ± 0,13, у больных с «чистым» коклюшем - 1,91 ± 0,24; с сочетанным -1,85 ± 0,11). Однако при «чистом» коклюше повышение процента Т-хелперов характерно только до 4 недели заболевания, а при сочетании коклюша с другими респираторными инфекциями - до 6 недели.

Очевидно, что коклюш течет на фоне повышенной по сравнению с другими инфекциями активности иммунной системы, причем эта активация не ограничивается 2-3 неделями, а сохраняется длительно.

Возможно, среди Т-хелперов, численность которых при коклюше повышена, увеличено количество активированных клеток. По данным Бабаченко И.В. с соавторами [4] экспрессия такого маркера активации лимфоцитов как CD25 повышена, особенно на поздних сроках периода судорожного кашля. По их мнению, это происходило за счет увеличения регуляторных Т-клеток CD4+CD25+, но напрямую с использованием двойной метки это не было показано. Напротив, по другим данным [84, 86] экспрессия активационных маркеров CD25, CD69, HLA-DR на Т-клетках периферической крови не изменялась.

Здесь хотелось бы подчеркнуть, что экспрессия различных маркеров на лимфоцитах периферической крови отличается от таковой в легких или лимфоузлах [8]. Так, например, снижение экспресии костимуляторной молекулы CD28 на лимфоцитах в легких при коклюше (по данным McGuirk Р. с соавторами [103]) не сопровождалось снижением экспрессии данной молекулы на Т-клетках периферической крови [84, 86]. Если при экспериментах на мышах в легких выявляли «наивные» (CD45RA+) или активированные клетки (HLA-DR+), то в крови это происходило не всегда [102].

Безусловно, незрелость клеток, о которой часто упоминается и которая нередко вызывает присоединение других респираторных инфекций и осложнений, будет проявляться и в недостаточности функциональной активности лимфоцитов. В частности, функциональная недостаточность клеток иммунной системы может выражаеться в неадекватной продукции цитокинов: снижении их продукции или в изменении спектра продуцируемых цитокинов.

При изучении состояния иммунной системы у больных инфекционными респираторными заболеваниями, в частности, коклюшем, и влияния на него имму-нотропной терапии некоторые авторы ограничиваются оценкой сывороточной концентрации цитокинов [7, 10, 19, 23, 39, 124]. Однако более информативно помимо изучения этого параметра дополнять характеристику функционирования цитокиновой сети изучением спонтанной и индуцированной продукции исследуемых цитокинов. Поскольку взаимосвязь компонентов цитокиновой сети очень сложна, а возможности исследователя полностью охватить ее ограниченны, необходимо тщательно формировать набор параметров для изучения, так чтобы они были максимально адекватны задачам исследования.

Для характеристики баланса активности Т-хелперов 1 и 2 типа в динамике заболевания нами были выбраны ИЛ-4 и ИФНу. Кроме того, для характеристики регуляторных взаимодействий в цитокиновой сети больных определялись ИЛ-10 и ИЛ-17: ИЛ-10 может вызывать изменение направленности иммунитета, выводя его из Thl в ТЬ2-зависимый иммунный ответ, а ИЛ-17 представляет активность хел-перной субпопуляции Thl7, по последним данным, играющей важную роль в регуляции ответа на коклюшную инфекцию.

Среди провоспалительных цитокинов, помимо ИФНу и ИФНа при коклюшной инфекции, мы исследовали еще ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8. Продукция данных цитокинов отражает активность воспалительной реакции и миграции клеток в очаг воспаления [28].

ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-17 также важны для активации клеточной миграции: ИЛ-8 сам является хемокином, стимулирующем миграцию клеток в очаг воспаления, тогда как ИЛ-17 регулирует процесс миграции клеток-эффекторов, в частности, ней-трофильных гранулоцитов, индуцируя продукцию СС- и СХС- хемокинов, а ИЛ-6 способен переключать развитие защитных реакций врожденного ответа на реакции приобретенного иммунитета за счет снижения синтеза хемокинов (CXCL1, CXCL8 (ИЛ-8), CX3CL1), привлекающих в ткани главным образом нейтрофилы, и усиления синтеза хемокинов (CXCL5, CXCL6, CCL2, CCL8), усиливающих миграцию моноцитов и различных типов лимфоцитов. ИЛ-6 может стимулировать проникновение Т-лимфоцитов в ткани путем усиления экспресии L-селектина.

Регуляция специфического иммунного ответа была охарактеризована с учетом продукции ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10. ИЛ-4 активирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток в плазматические клетки. ИЛ-10 может вызывать изменение направленности иммунитета, выводя его из Thl в ТЬ2-зависимый иммунный ответ. ИЛ-10 костимулирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток в плазматические клетки, играет роль во включении синтеза иммуноглобулинов. ИЛ-6 является ростовым фактором для активированных В-клеток.

Во многих экспериментальных работах было выявлено преобладание ответа по Thl типу на ранних стадиях заболевания коклюшем [54, 100, 113]. Вакцинация как цельноклеточной, так и бесклеточной вакциной приводит к генерации клеточного ответа по Thl типу [138]. Продукция таких Thl цитокинов, как ИФНу и ИЛ-12 в ответ на антигены В.pertussis может, по мнению некоторых авторов, может служить для оценки эффективности противококлюшных вакцин [47]. Нами была определена концентрация ИФНу в сыворотке крови, а также способность лимфоцитов больных продуцировать его спонтанно и при индукции фитогемагглютинином.

Преобладание иммунного ответа по Thl-типу должно было бы выражаться в повышенной способности лимфоцитов крови продуцировать ИФНу. Тем не менее, на ранних стадиях коклюша нами было отмечено снижение индуцированной продукции этого провоспалительного цитокина вплоть до 4 недели от начала заболевания. Исключением из данной картины была группа детей, больных коклюшем, с присоединившейся микоплазменной инфекцией. В этой группе продукция интерферона наблюдалась на уровне 2000 пг/мл, начиная с 3 недели заболевания. Интересно отметить, что, по данным Nakayama Т. с соавторами [106], лимфоциты большинства больных микоплазменной инфекцией в острой фазе инфекции продуцируют меньше ИФНу в ответ на стимуляцию микоплазменными антигенами, чем на стадии реконвалесценции.

Мы предположили, что если индуцированная продукция ИФНу, характеризующая резервную активность Т-клеток, снижена, то это связано с интенсивным текущим Thl ответом на коклюшную инфекцию и в этом случае спонтанная продукция ИФНу должна быть высокой. Однако спонтанная продукция данного цитокина у большинства больных, обследованных нами, была близка к нулю. Т.е. наши данные относительно спонтанной продукции ИФНу и его уровня в сыворотке крови не согласуются с фактами, приведенными Бабаченко И.В. с соавторами. Они отмечают высокую спонтанную продукцию ИФНу (на уровне 100 пг/мл) и высокий уровень ИФНу в сыворотке (200 пг/мл) [4]. Мы регистрировали ИФНу в сыворотке в среднем на уровне 0-10 пг/мл, и только при сочетании коклюшной инфекции с вирусной средняя сывороточная концентрация ИФНу была около 30 пг/мл за счет того, что у нескольких больных концентрация ИФНу составляла около 100 пг/мл.

Возможно, такое противоречие связано с тем, что в наше исследование не были включены дети до года и, следовательно, мы не исследовали самые ранние сроки коклюша. Дети старше 1-2 лет госпитализируются обычно после некоторого периода лечения дома. Ausiello С.М. с соавторами [49] отмечали наличие спонтанной продукции ИФНу на уровне 100 - 150 пг/мл как у привитых против коклюша детей до года, так и у привитых вакциной не содержащей коклюшной компоненты.

В значительной части отечественной литературы интенсивность воспаления при респираторных заболеваниях (грипп, ОРВИ, коклюш) оценивается по сывороточной концентрации цитокинов. К сожалению, чаще всего в этих статьях не приводится полная информация о количественных различиях между начальным и конечным состояниями исследуемых параметров. В иностранных работах, где такая информация приводится, можно видеть, что, хотя сывороточная концентрация цитокинов иногда повышается в 2-3 раза, разница между начальной и конечной точкой составляет 2-10 пг/мл. Не ясно, имеет ли какой-либо биологический смысл изменение сывороточной концентрации цитокинов в таких пределах.

Уровень продукции ИФНа не был оценен нами количественно, но по данным интерферонового статуса, исследованного нами у детей, переносящих коклюш, биологическая активность данного интерферона находилась в пределах возрастной нормы. Другие авторы также отмечают, что уровень продукции данного цитокина и его количество в сыворотке находилось в пределах нормальных значений у большинства больных коклюшем детей в разные периоды судорожного кашля [3]. Вопрос о том, почему высокая активность альфа-интерфероногенеза не защищает больного коклюшем от присоединения, например, вирусной инфекции остается актуальным.

На ранних сроках заболевания (2-3 неделя) нами отмечена высокая спонтанная и индуцированная продукция такого провоспалительного цитокина как ФНОа. Значение этого феномена можно оценить на основе литературных данных. Wolfe D.N. [136] с соавторами было показано на мышах, что продукция данного цитокина способствует снижению воздействия коклюшного токсина путем модуляции миграции нейтрофилов в респираторный тракт и снижения их фагоцитарной активности в ответ на инфекцию В. pertussis. При отсутствии ФНОа наблюдалось накопление нейтрофилов в легких, активация Т-хелперов 1 типа, сопровождаемая неэффективным фагоцитозом нейтрофилов, что вызывало дыхательные расстройства у мышей.

По нашим собственным данным, на 2 - 4 неделе от начала заболевания повышенная спонтанная продукция ФНОа наблюдалась при всех клинических формах коклюша: от легкой до осложненной бронхитом или пневмонией, а после 4 недели она снижалась также при всех формах. Сочетание повышенной спонтанной со сниженной индуцированной продукцией ФНОа показывает большое значение процессов, в которых участвует ФНОа при коклюше, а также то, что данное звено ци-токиновой сети у больных близко к истощению.

По литературным данным, уровень продукции ИЛ-8 снижен на начальных стадиях заболевания в результате действия коклюшного токсина [59, 90]. В результате этого снижается миграция лейкоцитов в респираторный тракт и на фоне этого снижения количества клеточных эффекторов снижается клиренс бактерий, в т.ч. антителозависимый.

Нами действительно были отмечены невысокие уровни спонтанной и индуцированной продукции данного цитокина на ранних сроках заболевания у детей с коклюшем, протекающим как моноинфекция. Присоединение микоплазменной или вирусной инфекции меняло эту картину - особенно наличие вирусной инфекции сопровождалось высокой продукцией ИЛ-8 на протяжении нескольких недель течения заболевания.

У 25 % детей, обследованных нами, течение коклюша осложнялось бронхитом или пневмонией. По литературным данным, подьем продукции таких провос-палительных цитокинов как ФНОа, ИЛ-8 отражает выраженность воспалительных изменений при пневмонии [7]. Наши данные показывают, что интенсивная спонтайная продукция ФНОа в культуре клеток крови больных не отличается при легком течении коклюша, коклюше средней тяжести без осложнений и с осложнениями: 94+60, 93+36 и 90±63 пг/мл - соответственно. Спонтанная продукция ИЛ-8 (130±103, 344±168, 530±570 пг/мл) наиболее выражена при осложнении течения коклюша пневмонией или бронхитом. Наиболее интенсивно спонтанная продукция ФНОа происходит на ранних сроках заболевания (вплоть до 3 недели), что же касается ИЛ-8, то выраженная спонтанная продукция данного цитокина на ранних сроках заболевания отмечается у детей, переносящих коклюш в сочетании с микоплазменной инфекцией.

По данным Torre D. с соавторами [124], определявшим уровни ФНОа, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8 и белков острой фазы воспаления в сыворотке больных коклюшем детей, наблюдался повышенный уровень ИЛ-6 и ФНОа. Повышение уровня острофазовых белков в сыворотке крови детей, больных коклюшем, не выявлялось. Концентрация всех перечисленных цитокинов в сыворотке крови повышалась у детей с острой лихорадочной инфекцией.

Таким образом, даже при неосложненном коклюше в организме на ранних стадиях заболевания может отмечаться значительная продукция провоспалитель-ных цитокинов.

Считается, что в динамике коклюша ответ по Thl типу сменяется на ответ по Th2 типу, что связано с активацией антителогенеза на 3-4 неделе коклюша. Мы исследовали продукцию ИЛ-4 и ИЛ-10 в культурах клеток крови больных для изучения активности Th2 и ее связи с интенсивностью гуморального ответа.

ИЛ-4 продуцируется Т-хелперами 2 типа, а также активированными Thl, ба-зофилами, эозинофилами и является фактором роста для В-лимфоцитов. Он стимулирует как пролиферацию, так и дифференцировку активированных В-лимфоцитов в плазматические клетки. ИЛ-6 также оказывает влияние на дифференцировку В-клеток в плазматические после их преактивации ИЛ-4. Активное участие в диффе-ренцировке В-клеток, синтезе IgG, IgM, IgA принимает ИЛ-10. Его основной функцией в регуляции гуморального ответа является ингибирование клеточного иммунитета и переключение ответа по Thl в ответ по Th2 типу.

Все больные были поделены нами на 2 группы с учетом прививочного анамнеза. У привитых от коклюша детей наблюдались высокие уровни индуцированной продукции ИЛ-4 в начале заболевания, в то время как у непривитых детей его повышение наблюдалось на поздних сроках заболевания.

Напротив, продукция ИЛ-10 в культуре клеток крови была выше у непривитых детей. Максимум продукции ИЛ-10 наблюдался на 4 неделе, что связано с активацией гуморального ответа на инфекцию у обследованных нами непривитых детей. У привитых детей продукция данного цитокина была невысока и носила монотонный характер на протяжении всего заболевания.

Таким образом, картина продукции двух противовоспалительных цитокинов у непривитых детей подтверждает литературные данные об общей активации гуморального звена иммунитета на поздних стадиях коклюша и ответа по 2 типу в частности. Привитые дети, по нашим данным, демонстрируют преобладание Th2 типа иммунного ответа с самого начала заболевания, что говорит о быстрой активации антителогенеза, вызванного проведенной ранее вакцинацией.

Индуцированная продукция ИЛ-6, по нашим данным, не различалась у привитых и непривитых детей. Спонтанный уровень продукции данного цитокина повышался на 4 - 5 неделе от начала заболевания у непривитых детей. На 5-6 неделе уровень IgG и IgA антител к В.pertussis у непривитых практически выравнивался с их уровнем у привитых. Вероятно, характер динамики данного цитокина у непривитых детей связан с его воздействием на дифференцировку В-клеток, способствующим их превращению в плазматические клетки [16].

Тем не менее, следует иметь в виду как широкий спектр видов активности ИЛ-6, так и то, что в культуре клеток цельной крови, которую мы применяли при обследовании своих больных, ИЛ-6 могли продуцировать не только лимфоциты, но и моноциты, и нейтрофильные гранулоциты.

Одна из биологических функций ИЛ-6 связана с переходом от защитной реакции организма, основанной на врожденном иммунитете, к реакциям приобретенного иммунитета. Под действием ИЛ-6, регулирующего хемокиновый фон, инфильтрат в легких, представленный нейтрофилами, дополняется моноцитами и различными типами лимфоцитов. ИЛ-6 также способен стимулировать адгезию Т-лимфоцитов и их проникновение в ткань за счет усиления экспрессии L-селектина (CD62L) [12].

Москаленко Е.П. с соавторами [19] также исследовали изменение уровня цитокинов в сыворотке крови, характеризующих активность Thl (ИФНа, ИЛ-1 р) и Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6) в динамике заболевания. Повышение уровня ИЛ-4 было отмечено на 2 неделе и у 33% детей на 3-4 неделе заболевания. Уровни ИФНа и ИЛ-6 были ниже контрольного уровня на протяжении всего срока заболевания. Существенных различий в показателях уровня цитокинов у привитых и непривитых детей отмечено не было. Поскольку мы сами регистрировали невысокие уровни цитокинов в сыворотке крови, вероятно недостаточно одних только данных о продукции цитокинов в сыворотке для выявления различий между группами привитых и непривитых детей.

По данным Andreasen С. с соавторами [45], активная продукция ИЛ-6 предшествует генерации ТЫ7-клеток, активность которых нарастает на поздних сроках коклюша. По нашим данным, во весь период наблюдения активность клеток-продуцентов ИЛ-17 при коклюше была несколько повышена по сравнению с нормой, а при сочетанном течении коклюша - достоверно повышена на 2-3 неделях заболевания.

С другой стороны, Thl7 активно участвуют в миграции нейтрофилов в очаг воспаления и, соответственно, регулируют неспецифический клеточный ответ в легких. Т.е. ИЛ-17, продуцируемый данной популяцией Т-хелперов, помимо ФНОа и ИЛ-8 отражает выраженность воспалительного ответа в легких. Нами отмечено повышение индуцированной продукции ИЛ-17 при осложнении коклюша бронхитом или пневмонией, особенно на ранних сроках заболевания.

У детей при сочетанном течении коклюша наиболее интенсивная индуцированная продукция ИЛ-17 была отмечена при присоединении микоплазменной инфекции на ранних сроках коклюша. В то же время при протекании коклюша как моноинфекции выраженного повышения индуцированной продукции ИЛ-17 не отмечалось.

По данным Wu Q. [137] с соавторами, в бронхоальвеолярном лаваже мышей, зараженных микоплазменной инфекцией, наблюдалось повышение количества ИЛ-17 и повышалась его экспрессия в легких. Т.е. микоплазменная инфекция приводит к активации данной популяции Т-клеток.

Можно предположить, что воздействие, оказываемое на иммунную систему микоплазменной инфекцией, преобладает над процессом регуляции иммунного ответа на B.pertussis с участием ИЛ-17.

При сочетании коклюша с вирусной инфекцией также наблюдался подъем продукции ИЛ-17 в ранние сроки заболевания. Вирусная инфекция, диагностируемая у обследованных нами детей, у 16% представлена респираторно-синцитиальным вирусом, у 14% - парагриппом, у 39% - недиагносцированный вирусный возбудитель, а в 18% случаев - вирусные ассоциации.

По данным Larranaga C.L. с соавторами [94], ИЛ-17 в плазме крови выявлялся у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией, причем наибольшая его концентрация определялась при умеренно текущем заболевании, регистрировалась на более низком уровне у детей с осложненным течением и не определялась у здоровых детей.

Продукция ИЛ-2 происходила у больных, обследованных нами, на очень низком уровне, что не дает возможности говорить о динамике его продукции. Нами отмечено существенное отличие уровня продукции данного цитокина, наблюдаемого у детей с коклюшем, от уровня, наблюдаемого у здоровых детей. Возможно, такая низкая продукция ИЛ-2 является одним из звеньев «коклюшной анергии».

Главной функцией ИЛ-2 является, помимо стимуляции пролиферации лимфоцитов, стимуляция дифференцировки Treg in vivo. Данный вид регуляторных Т-клеток необходим для регуляции численности наивных СГ)4+Т-лимфоцитов в циркуляции и лимфоидных органах. Соответственно, снижение продукции ИЛ-2 опосредованно может приводить к описанной многими авторами картине, патогномо-ничной для коклюша, - повышению количества наивных CD4+T-icieTOK [12].

Для более полного понимания процессов, происходящих в системе интерфе-роногенеза у больных коклюшем, нами, помимо количественной оценки продукции ИФНу лимфоцитами периферической крови, была исследована биологическая активность интерферонов ИФНа и ИФНу по Ф.И. Ершову.

Этот подход особенно полезен при решении вопроса, необходима ли больному терапия, направленная на коррекцию функционирования интерфероновой системы для профилактики присоединения вторичных вирусных или бактериальных инфекций.

При исследовании интерферонового статуса больных коклюшем было обнаружено, что титр биологической активности ИФНу у них был снижен по сравнению со здоровыми детьми. Наиболее выражено снижение данного параметра наблюдалось у детей младше 6 лет. У детей, переносящих коклюш как моноинфекцию, данный факт встречался в 40% случаев, в то время как при сочетании коклюша с другими респираторными инфекциями снижение титра биологической активности наблюдалось у 56% детей. В отличие от этого продукция ИФНа, индуцированная в культуре клеток крови вирусом ВБН, была не ниже, чем у здоровых детей и регистрировалась на высоком уровне на всех сроках заболевания.

Для повышения эффективности терапии детям, переносящим коклюш в сочетании с вирусными, хламидийной или микоплазменной респираторными инфекциями, назначали средства, усиливающие интерфероновую защиту организма: Ви-ферон или Циклоферон, в зависимости от возраста. При этом, помимо клинического состояния ребенка, лечащий врач ориентировался на показатели интерферонового статуса.

Виферон назначался детям младше 6 лет в основном с сочетанным коклюшем, сопровождающимся у 68% детей выраженным снижением биологической активности ИФНу, продуцируемого в культуре клеток их крови. Для детей старшего возраста был выбран Циклоферон. У больных данной группы коклюш протекал также в сочетании с вирусной или микоплазменной инфекцией; при этом в 42% случаев наблюдалось снижение биологической активности ИФНу.

Мы имели возможность обследовать 28 детей повторно через 1-3 месяца после выписки из стационара. Немногочисленность выборки не позволила нам оценить достоверность различий между группами, получавшими и не получавшими Виферон или Циклоферон. Однако наблюдалось снижение титра биологической активности ИФНу у детей, принимавших Виферон, и контрольной группы того же возраста (младше 6 лет). У детей, получавших терапию Циклофероном, титр ИФНу недостоверно повышался.

У 57% больных коклюшем после лечения Циклофероном регистрировалась нормальная индуцированная продукция ИФНу, тогда как в подгруппах 1, 2 и 5 - у 25 - 30%. Возможно, у больных детей старшей возрастной группы интерфероновая система лучше готова к восприятию стимулирующей терапии (табл. 3.12).

По данным Тимченко В.Н. с соавторами [32], применение Виферона способствовало сохранению более высокой по сравнению с контрольной группой индуцированной продукции ИФНа на поздних сроках заболевания, в то время как клеточная продукция и сывороточный уровень ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФНу не изменялся под действием терапии.

Завершая обсуждение, хотелось бы отметить, что отсутствие стандартных подходов к исследованию цитокиновой сети человека ограничивает наши возможности сравнить свои данные с результатами многих исследовательских групп. В своей работе, столкнувшись с тем, что сывороточная концентрация интересующих нас цитокинов у большинства больных колеблется в диапазоне 0-10 пг/мл (при чувствительности тест-систем 5-20 пг/мл), мы отказались от анализа этого материала.

Мы полагаем, что текущее состояние цитокиновой сети более объективно характеризуется спонтанной продукцией цитокинов, а резервные возможности организма - индуцированной продукцией. В отечественной литературе по коклюшу только в работах Бабаченко И.В. с соавторами и Тимченко В.Н. с соавторами приводятся данные об этих показателях у больных, тогда как сведений о продукции цитокинов лимфоцитами животных при экспериментальной коклюшной инфекции довольно много в иностранной литературе.

Некоторые полученные нами результаты подтверждаются литературными данными, например, снижение продукции ИЛ-8 на ранних стадиях коклюша и устойчивое снижение продукции ИФНу в течение всего заболевания. Однако по наиболее важному вопросу о причинах длительного сохранения сниженного гамма-интерфероногенеза и о возможности коррекции данного отклонения в цитокиновой сети больных коклюшем пока не накоплено достаточно информации. По-видимому, он будет решен в ходе дальнейших исследований.