Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Цитокиновый профиль иммунного ответа у детей, больных коклюшем, и его изменение в зависимости от особенностей течения заболевания

На правах рукописи

Котелева Светлана Игоревна

Цитокиновый профиль иммунного ответа у детей, больных коклюшем, и его изменение в зависимости от особенностей течения заболевания.

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 О СЕН 2010

Москва - 2010

004609742

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Федорова Ирина Михайловна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич доктор медицинских наук, профессор Суслов Анатолий Петрович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

на заседании диссертационного совета Д ius.u46.02 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, г. Москва.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

часов

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Коклюш остается серьезной проблемой в педиатрии: несмотря на успехи вакцинопрофилактики даже привитые дети могут заболевать коклюшем. Чаще всего это дети старше 6 лет, у которых напряженность иммунитета против коклюшной инфекции снизилась со временем или просто слабо ответившие на вакцину. Источником инфекции могут быть взрослые люди или дети младше года, не имеющие защитных титров от данного возбудителя (Тимченко В.Н. с соавт., 2005; Grimprel Е. et al., 1996; Esposito S. et al., 2001; Hallander H.O. et al., 2005).

Коклюш является инфекционным заболеванием, характеризующимся длительным течением, даже если на фоне «коклюшной анергии» у больного не присоединяются другие инфекции. Важно исследовать, какова в этом роль иммунной системы или же длительность коклюша более объясняется действием коклюшных токсинов на центральную нервную систему больного и нарушениями, связанными с гипоксемией (Тимченко В.Н. с соавт., 2005).

Кроме того, существенной проблемой является сочетание коклюшной инфекции с другими респираторными инфекциями (Тимченко В.Н. с соавт., 2000; То-ропова И.О., 2003; Бабаченко И.В., 2007; Попова О.П., Петрова М.С. с соавт., 2008; Wesley A.G. et al., 1983; Versteegh F.G. et al., 2006). В частности, распространение других инфекций, сопровождающихся длительным сухим кашлем, затрудняет своевременную диагностику коклюша у детей, подростков и взрослых и назначение им адекватной терапии.

Данных об иммунологических изменениях при коклюшной микст-инфекции относительно немного. Считается, что лимфоцигоз в начале заболевания происходит за счет выброса в кровоток незрелых клеток. Данный феномен на поздних стадиях заболевания сменяется снижением количества лимфоцитов и численности некоторых субпопуляций. Истощение адаптивных возможностей организма, т.н. «коклюшная анергия», часто приводит к присоединению других респираторных инфекций (Тимченко В.Н. с соавт., 2005).

В последние годы исследование иммунной системы у больных коклюшем стало дополняться исследованием цитокинового профиля иммунного ответа (Бабаченко И.В., 2007; Ярв Н.Э., 2007). Делаются предположения относительно того, ка-

кую роль играют цитокиновые взаимодействия различных видов регуляторных клеток (Thl, Th2) в клиническом течении данного заболевания. Однако попытки перенести выводы, полученные в эксперименте на животных, на клинические наблюдения не особенно успешны, т.к. у больных необходимо учитывать много факторов, влияющих на течение коклюша.

Появление в последнее время новых данных об активном участии в патогенезе коклюша других видов регуляторных клеток, таких как Tri и Thl7, оказывающих непосредственное воздействие на процессы, происходящие в легких, заставляет пересмотреть уже существующие представления об иммунопатогенезе коклюша (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2007; Leef М. et al., 2000; Stenger R.M. et al, 2009). Однако роль упомянутых регуляторных субпопуляций при коклюшной инфекции показана в респираторном тракте экспериментальных животных, а в клинике приходится судить о характере иммунорегуляторных процессов по активности лимфоцитов крови, т.к. получение бронхоальвеолярной лаважной жидкости у больных коклюшем, особенно в периоде судорожного кашля, затруднительно.

Для создания современных представлений об иммунопатологии коклюша необходимо охарактеризовать преобладающий тип цитокиновых взаимодействий на разных этапах заболевания и связать его с изменениями других параметров иммунной системы больного. При этом важно исследовать цитокиновую систему, во-первых, комплексно и, во-вторых, в динамике.

Необходимо также исследовать роль цитокиновой сети при разных формах коклюша, поскольку тип цитокинового ответа, наблюдаемый у больного, зависит от многих факторов: от самой коклюшной инфекции, от исходного типа реагирования, присущего данному организму, от присоединения других респираторных инфекций, от прививочного анамнеза и возраста больного.

Прогресс в решении этой задачи позволит оценить, насколько успешно иммунная система больного справляется с коклюшной инфекцией, и велик ли риск развития осложнений, т.е. обеспечить индивидуальный подход к лечению пациента. Поскольку выздоровление больных коклюшем является длительным процессом, исследование цитокиновой сети в динамике заболевания может дать информацию о

дальнейшем функционировании иммунной системы, что особенно важно, если больной - ребенок. Цель работы

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния коклюшной инфекции и ее сочетаний с другими респираторными инфекциями на иммунную систему и продукцию цитокинов у детей в динамике заболевания.

Задачи исследования

1. Исследование изменений в иммунной системе и характере продукции цитокинов при коклюше.

2. Исследование особенностей функционирования цитокиновой сети у больных, переносящих коклюш в сочетании с другими респираторными инфекциями.

3. Сравнение динамики и интенсивности продукции антител к В.регШ551з у детей, ранее привитых против коклюша, и у непривитых. Сопоставление этих данных с продукцией цитокинов, сопровождающих реализацию иммунного ответа на коклюшную инфекцию.

Научная новизна

В ходе работы проведено комплексное обследование детей, переносящих коклюш, с учетом таких особенностей как степень тяжести заболевания, присоединение сопутствующих респираторных инфекций, прививочный анамнез больного. Состояние цитокиновой сети впервые было оценено по 13 параметрам в динамике заболевания с учетом возраста ребенка. Дана оценка функциональной активности лимфоцитов крови в зависимости от наличия или отсутствия у больного лимфоци-тоза.

Выявлено, что при сочетании коклюша с микоплазменной или вирусной инфекцией способность лейкоцитов больного продуцировать цитокины изменяется по сравнению с тем, как это происходит при «чистом» коклюше. Эти различия заключаются прежде всего в характере продукции ИФНу, снижающейся при «чистом» коклюше и его сочетании с вирусными инфекциями и сохраняющей высокий уровень в случае присоединения к коклюшу микоплазменной инфекции. При соче-

тании коклюша с микоплазменной инфекцией способность лейкоцитов больного продуцировать ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-17 существенно выше, чем при других формах заболевания.

Впервые показано, что различие в прививочном анамнезе наиболее ярко отражается на индуцированной продукции ИЛ-4 и ИЛ-10. Так, у привитых детей наблюдаются высокие уровни продукции ИЛ-4, в то время как у непривитых детей наблюдается более высокая продукция ИЛ-10.

Впервые проанализирована динамика продукции ИЛ-17 при коклюше и его сочетании с другими инфекциями.

Практическая значимость работы

Полученные данные используются врачами-педиатрами клинического отдела ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для оценки течения респираторных инфекций и коррекции состояния иммунной системы детей, больных коклюшем.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертационной работы вошли в курс практических занятий по иммунологии на кафедре микробиологии Российского университета дружбы народов.

Положения, выносимые на защиту

1. Параметры функционирования цитокиновой сети у больных коклюшем резко отличаются от показателей здоровых детей и варьируют в зависимости от стадии заболевания.

2. Снижение способности лимфоцитов к продукции ИФНу является наиболее характерной особенностью функционирования цитокиновой сети при данном заболевании.

3. Цитокиновый профиль иммунного ответа больных коклюшем зависит от прививочного анамнеза, присоединения микоплазменной или вирусной инфекции и возраста больного ребенка.

4. В спектре цитокинов, регулирующих специфический иммунный ответ у больных коклюшем, выявляются различия между детьми, ранее привитыми от этой инфекции, и не привитыми. Наибольшие различия касаются продукции ИЛ-4 и ИЛ-10.

Апробация материалов диссертации

Апробация материалов диссертации проведена на заседании Секции Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Общая и прикладная иммунология», протокол №4 от 27 мая 2010 года.

Результаты работы доложены и обсуждены на X Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006), на XI Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007), на Объединенном иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008) на научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2008), на XIII Всероссийском научном Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 101 странице и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты собственных исследований», обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 12 таблицами. Список литературы состоит из 139 работ, в том числе 41 отечественных и 98 зарубежных авторов.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Иммунологическое обследование больных было проведено на базе ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского в лаборатории по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета

Материалы исследования.

В ходе работы было обследовано 175 детей, больных коклюшем (в том числе 41 чел. с коклюшной моноинфекцией, 34 - коклюш в сочетании с микоплазменной инфекцией, 18 - в сочетании с хламидийной, 63 - в сочетании с вирусными ин-

фекциями) в возрасте от 1,5 до 12 лет. Повторно (через 2-4 месяца) обследовано 28 человек.

Табл.1 Объем выполненных исследований

Вид исследования Показатель Количество исследований

Иммунофенотипирование лимфоцитов 1 -хелперы CD3' CD4' 191

Т-цитотокс. клетки CD3 CD8T

B-клетки CD3CD19'

ЫК-клетки CWCD16CD56'

Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови IgU, IgM, IgA -J со OJ i

igH 172

Диагностика респираторных инфекций (определение специфических антител ^М, ^А классов) к Bordetella pertussis 111

к Mycoplasma pneumoniae 169

к Chlamydia pneumoniae 172

Определение концентрации цитокинов в сыворотке и супернатантах культуры клеток цельной крови: спонтанной и индуцированной разными митогенами ИЛ-2 индуц. Ф1 А/ индуц. ФМА 69/46

ИЛ-4 индуц. ФМА 66

ИЛ-6 спонт./ индуц. ЛПС 84/84

ИЛ-8 спонт./ индуц. ЛПС 91/91

ИЛ-10 спонт./ индуц. ФГА 93/93

ИЛ-17 спонт./ индуц. ФГА 19/74

ФНОа спонт./ индуц. ЛПС 98/98

ИФНу спонт./ индуц. ФГА 27/171

сыворотка 40

Интерфероновый статус спонтанная продукция ИФН 191

индуц. продукция ИФНу

индуц. продукция ИФНа

ИФН в сыворотке

Дети были госпитализированы с диагнозом «коклюш» в специализированное отделение Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы. Диагностика коклюша, клиническое наблюдение и терапия больных проведена к.м.н. О.П. Поповой. Диагноз «коклюш», поставленный на основании клинико-

эпидемиологических данных, верифицирован бактериологическим и/или серологическими лабораторными методами.

Для оценки вклада присоединившихся инфекций в изменения иммунологических параметров при коклюше параллельно (в табл.1 не включено) было обследовано несколько групп детей: здоровые дети (58чел.), не больные коклюшем дети с длительным сухим приступообразным кашлем микоплазменной (40чел.) или не-уточненной этиологии (38чел.).

Параметры функционирования цитокиновой сети больных коклюшем сравнивались с показателями детей 3-9 лет, которые по заключению педиатра были здоровы. С интервалом 5 недель дети дважды прошли иммунологическое обследование и показатели их иммунного и интерферонового статуса находились в пределах нормы.

Материалом для иммунологических исследований служили сыворотки крови, лимфоциты периферической крови больных, супернатанты стимулированных культур лейкоцитов периферической крови.

Методы исследования Иммунофенотипирование лимфоцитов методом проточной цитометрии.

Определение основных субпопуляций лимфоцитов крови, таких как Т-хелперы (CDS^DA^), Т-цитотоксические клетки (CD3+CD8+), В-клетки (CD3" CD19*) и НК-клетки (CD3'CD 16+С056*) было проведено с помощью моноклональ-ных антител фирмы «Beckman Coulter» на проточном цитофлюориметре «Cytomics FC500» («Beckman Coulter», США). Помимо данных об относительной численности указанных субпопуляций анализировалось изменение абсолютного количества клеток, относящихся к этим субпопуляциям.

Определение сывороточной концентрации иммуноглобулинов G, М, А и Е.

Иммуноглобулины классов G, М, А были определены в сыворотке крови турбидиметрическим методом на биохимическом анализаторе «Humalyzer 2000» («Human», Германия).

Концентрация IgE в сыворотке крови была определена иммуноферментным методом на тест-системе «Хема-Медика» (Россия). Данная работа была выполнена совместно с к.б.н. Наумовой М.А.

Исследование интерферонового статуса.

Интерфероновый статус исследовали микрометодом в цельной гепаринизи-рованной крови (Ершов Ф.И., 1996). Способность лейкоцитов продуцировать ин-терфероны оценивали по отмене культуральными супернатантами этих лейкоцитов цитопатогенного действия тест-вируса (вирус энцефаломиокардита мышей; рабочая доза - 100 цитопатогенных доз) на культуру фибробластов. Уровень биологической активности интерферонов выражали величиной, обратной максимальному разведению тестируемого супернатанта, задерживающему цитопатогенное действие вируса на 50%, и выражали ее в ед/мл. Определяли уровень интерферона в сыворотке крови, способность лейкоцитов периферической крови к спонтанной продукции интерферонов и под действием индукторов ИФНа и ИФНу (вируса болезни Ньюкасла штамм Канзас, любезно предоставленный сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи РАМН, Москва) и ФГА-Р («Sigma», США).

Стимуляция лимфоцитов к продукции цитокинов.

Культивирование клеток цельной крови с индукторами проводили при температуре 37°С в атмосфере с 5%-ным содержанием С02 в стерильном круглодон-ном 96-луночном планшете для культуральной работы. Для каждого пациента использовали по 3 лунки на каждый вид стимуляции. Разведение крови в лунке культуральной средой RPMI 1640 (содержащей р-р гентамицинаи L-глютамин) - 1:10. Стимуляторы:

• фитогемагглютинин (РНА-Р, «Sigma», США) - рабочая концентрация в лунке 12,5 мкг/мл;

• липополисахарид S.typhi (Пирогенал, «МедГамал», Россия) - рабочая концентрация в лунке 100 нг/мл;

• форболмиристатацетат (ФМА, «Sigma», США) - рабочая концентрация в лунке 0,5 нг/мл, использовался в сочетании с иономицином («Sigma», США) - рабочая концентрация в лунке 100 мкг/мл.

Для стимуляции продукции ИФНу, ИЛ-10, ИЛ-17 использовался ФГА (72 часа инкубации), для ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа - ЛПС S.typhi (24 часа инкубации), а для ИЛ-2 и ИЛ-4 - ФМА с иономицином (48 часов инкубации).

Определение цнтокинов методом ИФА в культурах клеток крови больного.

Концентрацию ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФНу, ФНОа в су-пернатантах культур клеток цельной крови определяли методом ИФА с использованием тест-систем фирм «Цитокин» (Россия) и «Вектор-Бест» (Россия). Концентрацию цитокина, продуцируемую под действием стимулятора, сопоставляли с его спонтанной продукцией.

Серологическая диагностика коклюшной, микоилазменной, хламидийнон и вирусных инфекций.

Серологическая диагностика коклюша проводилась методом ИФА на тест-системах «Ridascreen Коклюш /Bordetella pertussis/» («R-biofarm AG», Германия).

Видоспецифические антитела к Chlamydia pneumoniae и Mycoplasma pnemoniae определяли методом ИФА в периферической крови с использованием наборов «Medac» (Германия) и «Savyon» (Израиль). Данная работа была выполнена совместно с сотрудниками ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского к.м.н. Т.А. Скирдой и к.м.н. И.В. Капустиным.

Диагностика вирусных инфекций (респираторно-синтициальный вирус, вирус парагриппа, вирус гриппа, аденовирус) проводилась в Институте вирусологии им. Д.Н. Ивановского с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) в мазках из носоглотки. Данная информация предоставлялась к.м.н. О.ГТ. Поповой.

Методы статистической обработки полученных результатов.

Для определения статистической достоверности полученных результатов использовался критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия между параметрами считались статистически достоверными при р<0,05. Все данные представлены в виде среднего значения и его 95% доверительного интервала. Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Наиболее характерным для коклюша изменением в количественном составе лимфоцитов является то, что это заболевание протекает на фоне длительного сохранения повышенной численности Т-хелперов (CD3+CD4+) и В-лимфоцитов (CD19 ): относительная численность Т-хелперов повышена на всех сроках заболевания у 40% детей; относительная численность B-лимфоцитов повышена на всех сроках заболевания у 60% детей.

Такое повышение абсолютной численности B-лимфоцитов связанно с активным гуморальным ответом на антигены В. pertussis. Однако на 4 неделе от начала заболевания можно было видеть не только повышение уровня специфических антител, но и концентрации общего IgM и общего IgE.

При более подробном исследовании связи между повышенным синтезом IgE и различными клиническими формами коклюша было обнаружено, что это изменение более характерно не для самого коклюша, а для его сочетания с микоплазмен-ной инфекцией (рис. 1.).

Рис. 1. Концентрация IgE в сыворотках крови больных коклюшем (М ± tm).

700

600

500

с;

400

400

200

100

0

ш

'чистый" кокл+оир КОКЛ+вир+ кокл+мико коклюш мино

Сывороточная концентрация IgE повышена не только при коклюше, соче-танном с инфекцией М. pneumoniae, но и у детей с коклюшеподобным кашлем, вызванным М. pneumoniae.

Этот пример показывает, что при коклюше, который часто (у 77% больных, обследованных в ходе данной работы) протекает в сочетании с другими респираторными инфекциями, важно выделять изменения, связанные с собственно коклюшем. Поэтому в дальнейшем все показатели, в том числе динамику продукции раз-

личных цитокинов при коклюше, анализировали с учетом влияния присоединившейся инфекции.

Наиболее характерные изменения в цитокиновом статусе всех детей, больных коклюшем, по сравнению со здоровыми детьми того же возраста приведены в таблице 2.

Табл. 2 Продукция цитокинов клетками крови в культуре (пг/мл; М ± 1т).

Цитокины Здоровые дети 3-9 лет Больные коклюшем 2-12лет

индуц спонт индуц спонт

НЛ-2 902 ± 372 - 161 ± 159* -

ИФНу 2312+1314 42 ±46 1115 ± 338 * -

ФНОа 1799 ±284 7± 5 1197 + 320* 92 ± 28*

ИЛ-6 6401±1098 48 ±58 7004 ±1433 206±165

ИЛ-8 3328 ±712 190 ±133 3132 ±791 376 ± 234

ИЛ-4 89 + 31 - 90 ±40 -

ИЛ-10 206 ± 57 2 ± 5 416±105 * 15 ± 13*

ИЛ-17 243 ± 76 - 469 ±166* -

* - статистически значимое отличие от одноименного показателя здоровых детей

Проведенное нами сравнение показателей здоровых детей и больных коклюшем выявило значительное снижение способности лейкоцитов больных к индуцированной продукции провоспалигельных цитокинов ИЛ-2, ИФНу и ФНОа. Повышение индуцированной продукции у больных коклюшем по сравнению со здоровыми детьми отмечено для ИЛ-10 и ИЛ-17.

Спонтанная продукция у некоторых цитокинов (ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-17) регистрировалась на уроне ниже чувствительности тест-системы, поэтому эти данные не приведены в таблице.

Наиболее устойчивым изменением в цитокиновой сети больных коклюшем является резкое снижение индуцированной продукции ИФНу. У детей, переносящих коклюш как моноинфекцию, этот показатель снижен в течение 1- 2 месяцев от начала заболевания. При сочетанном коклюше ситуация сходная: к 5-6 неделе про-

дукция ИФНу только приближается к среднему уровню показателя у здоровых детей.

Важно отметить, что на первых неделях коклюша индуцированная продукция ИФНу значимо ниже аналогичного показателя у здоровых детей, и только спустя 2-4 месяца от начала заболевания достигает уровня продукции, наблюдаемого у здоровых детей (рис.2).

Рис. 2. Различие в динамике продукции ИФНу при «чистом» коклюше и его сочетаниях с другими респираторными инфекциями. Горизонтальной прерывистой линией показано среднее значение данного показателя у здоровых детей.

2нед Знед

.........У........У

коклюш с вирусной инфекцией

2 «А Зкед 4 не д $нед 2-4мес

коклюш и ми ко плазменная инфекция

4000 3000

|

| 2000

6 г

1000

2 нед 3 н«я 4 нед 5 нед ¿-4 мсс

*- достоверное отличие от аналогичного показателя у здоровых детей

При сочетании коклюша с вирусной инфекцией также наблюдается снижение продукции ИФНу вплоть до 5 недели заболевания. Однако при сочетании коклюша с микоплазменной инфекцией индуцированная продукция ИФНу находилась примерно на уровне здоровых детей.

Таким образом, несмотря на то, что присоединение других респираторных инфекций к коклюшу влияет на динамику продукции ИФНу, резкое снижение индуцированной продукции ИФНу действительно является наиболее устойчивым изменением в цитокиновой сети больных коклюшем.

Другим провоспалительным цитокином, индуцированная продукция которого снижена, является ФНОа (табл.3). Спонтанная продукция данного цитокина повышена при всех клинических формах заболевания. Согласно современным представлениям, данное изменение указывает на высокую текущую активность процессов, регулируемых данным цитокином. Сочетание повышенной спонтанной со сниженной индуцированной продукцией ФНОа показывает большое значение процессов, в которых участвует ФНОа при коклюше, а также что данное звено цитокиновой сети у больных близко к истощению.

Спонтанная продукция таких провоспалительных цитокинов как ИЛ-6 и ИЛ-8 (табл.3) повышается с ухудшением состояния больного.

Табл. 3 Спонтанная и индуцированная продукция ряда провоспалительных цитокинов при коклюше разной степени тяжести (пг/мл; М ± 1т)

Клинические формы коклюша продукция ФНОа продукция ИЛ-6 продукция ИЛ-8

индуц спонт индуц спонт индуц спонт

Легкая п = 31 849** ±181 94 ** ±60 5664 ±2441 45 ±46 3121 ±2447 130 ±103

средней тяжести без осложнений п = 29 957** +192 93** ±36 7927 ±2676 260* ±241 3284 ±1146 344* ±168

средней тяжести с осложнением бронхитом или пневмонией п = 20 1553 ±796 90** ±63 7324 ±2379 182 ±254 3451 ±1598 530 ±570

норма п = 34 1799 ±284 7 ±5 6401 ± 1135 68 ±99 3298 ±206 206 ±57

* - значимое отличие от показателя при легкой форме коклюша ** - значимое отличие от нормы

Однако детальное изучение спонтанной продукции ИЛ-8 в динамике заболевания коклюшем показало, что при «чистом» коклюше и при сочетании его с дру-

гими респираторными инфекциями изменение продукции данного цитокина происходит неодинаково (рис.3).

Рис. 3. Спонтанная продукция ИЛ-8 в культуре клеток цельной крови при «чистом» коклюше и коклюше, сочетанном с другими инфекциями (средние значения; пг/мл). Горизонтальной прерывистой линией дана средняя величина показателя у здоровых детей.

Известно, что коклюшный токсин подавляет миграцию лейкоцитов к очагу инфекции, и действительно, нам удалось показать, что только при сочетанном течении коклюша спонтанная продукция ИЛ-8 повышена по 4 неделю заболевания. При «чистом» коклюше активное выделение хемокина ИЛ-8 на ранних сроках заболевания подавлено и только с 4 недели от начала заболевания регуляция миграции восстанавливается.

ИЛ-17 также играет большую роль в регуляции миграции нейтрофильных гранулоцитов в очаг воспаления, индуцируя продукцию СС- и СХС- хемокинов, поэтому можно ожидать, что присоединение других респираторных инфекций к коклюшу или осложнение пневмонией или бронхитом течения коклюша будет приводить к подъему продукции данного цитокина.

При сочетанном течении коклюша отмечается ранний подъем продукции ИЛ-17, в то время как динамика продукции ИЛ-17 при коклюше, протекающем без присоединения каких-либо респираторных инфекций, носит довольно монотонный характер.

Продукция ИЛ-17 повышена на всех сроках заболевания по сравнению со здоровыми детьми. Наиболее высокая продукция данного цитокина была отмечена у детей, переносящих коклюш в сочетании с микоплазменной инфекцией (табл.4).

Табл.4. Изменение активности ТЫ 7 при сочетании коклюша с другими респираторными инфекциями (М ± 1т).

Группы детей Количество детей Индуцированная продукция ИЛ-17 (пг/мл)

Коклюш п=19 476±323

Коклюш и микоплазменная инфекция п=19 574±287*

Коклюш и вирусная инфекция п=13 298±145

Здоровые дети п=20 243 ± 78

*- достоверное отличие от аналогичного показателя у здоровых детей

У детей, переносящих коклюш легкой или средней степени тяжести, уровень индуцированной продукции ИЛ-17 достоверно не отличался от такового у здоровых детей. Повышение данного показателя отмечалось только при осложненном течении данного заболевания (табл. 5).

Табл. 5. Изменение активности ТЬ17 при разных формах коклюша (М ± 1т).

Клиническая форма коклюша Количество детей Индуцированная продукция ИЛ-17, пг/мл

Легкая п=9 438±317

Средняя п=31 348±148

С осложнениями п=20 610±339*

Здоровые дети п=20 243 ± 78

*- достоверное отличие от аналогичного показателя у здоровых детей

Таким образом, изменения в продукции ИЛ-17 при коклюше связаны скорее с сочетанием коклюша с другими респираторными инфекциями или осложнением данного заболевания бронхитом или пневмонией.

Помимо общих изменений в цитокиновой сети больных коклюшем наблюдаются некоторые различия между ранее привитыми от коклюша и непривитыми. Различия касаются цитокинов, регулирующих гуморальный ответ.

Для изучения баланса активности Т-хелперов 1 и 2 типа мы проанализировали динамику продукции ИЛ-4 и ИФНу в зависимости от прививочного анамнеза детей.

Рис.4. Продукция ИЛ-4 и ИФНу у больных коклюшем детей с разным прививочным анамнезом. Горизонтальной прерывистой линией показано среднее значение параметров у контрольной группы.

* достоверное отличие от аналогичного показателя у непривитых детей У привитых детей на 2-4 неделе от начала заболевания отмечена высокая продукция ИЛ-4, что связано, по нашему мнению, с активным вторичным иммунным ответом на коклюшную инфекцию. У непривитых детей индуцированная продукция ИЛ-4 постепенно нарастает. Характер динамики продукции ИФНу у обеих групп больных сходен, продукция этого цитокина снижена у всех больных на всех сроках заболевания (рис.4).

Таким образом, у больных, ранее привитых против коклюша, иммунный ответ с первых дней заболевания развивается как ТЫ регулируемый. У непривитых детей переход к ТЬ2 регулируемому ответу происходит не ранее 4 недели заболевания.

Еще одним цитокином, регулирующим гуморальный ответ, является ИЛ-10. На 4 неделе заболевания у непривитых детей регистрируется всплеск продукции ИЛ-10, причем как спонтанной, так и индуцированной. В то же время у привитых детей продукция этого цитокина носит монотонный характер (рис.5).

Рис.5. Индуцированная продукция ИЛ-10 у детей, переносящих коклюш, в зависимости от прививочного анамнеза. Горизонтальной прерывистой линией показано среднее значение данного параметра у здоровых детей

1200

2нед Знед 4нсд 5нед 2-4мес

' достоверное отличие от аналогичного показателя у непривитых детей

Исходя из способности ИЛ-10 переключать иммунную систему с преимущественно клеточного ответа (Thl регулируемого) на преимущественно гуморальный (Th2 регулируемый), можно предположить, что отличия, наблюдаемые у непривитых детей, связаны именно с этим. Вероятно, резкое увеличение активности Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-10, предваряет важное изменение в реализации гуморального иммунного ответа - переход к синтезу IgG-антител.

При сравнении динамики специфических антител к B.pertussis и продукции цитокинов, регулирующих гуморальный иммунный ответ, нами было отмечено,

что ИЛ-4 и ИЛ-10 принимают активное участие в регуляции специфического иммунного ответа на коклюшную инфекцию.

Рис. 6. Изменение сывороточной концентрации специфических 1§0-антител

600

На рис.6 показано, что продукция специфических ^О антител на 2-4 неделе от начала заболевания у привитых детей сопровождается высоким уровнем продукции ИЛ-4. В то же время активная продукция антител данного класса у непри- I витых детей начинается с 4 недели и сопровождается высоким уровнем продукции ИЛ-10. I

Таким образом, на течение коклюша и, соответственно, на изменения показателей активности иммунной системы оказывают влияние приви- г вочный анамнез и сочетания коклюша с другими респираторными инфекциями.

У привитых детей с ранних сроков заболевания повышенная активность ТЬ2 выявлялась по повышенной продукции ИЛ-4, тогда как у непривитых активность

ТЬ2 возрастала позже. Напротив, у непривитых выявлялся всплеск продукции ИЛ-10 на 4 неделе от начала заболевания, в то время как у привитых динамика продукции ИЛ-10 в течение заболевания монотонна.

Устойчивое снижение способности лимфоцитов больного коклюшем к продукции ИФНу способствует присоединению других респираторных инфекций, которое существенно влияет на цитокиновый профиль иммунного ответа.

Повышение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) является типичным изменением при коклюше. Однако, если коклюш сочетается с другими инфекциями, спонтанная продукция ИЛ-8 повышена начиная с ранних стадий заболевания, а при «чистом» коклюше воздействие коклюшного токсина приводит к тому, что продукция ИЛ-8 повышается на поздних стадиях заболевания. Кроме того нам удалось показать, что повышение уровня спонтанной продукции ИЛ-6, ИЛ-8 тем сильнее, чем выше тяжесть заболевания.

Выводы

1. Цитокиновый профиль больных коклюшем отличается от такового у здоровых детей. При коклюше индуцированная продукция ряда цитокинов (в основном, провоспалительных) снижена, спонтанная повышена.

2. Снижение продукции ИФНу лимфоцитами больных является характерной, длительно сохраняющейся особенностью функционирования цитокиновой сети при коклюше. Вероятно, это является проявлением интенсивной реализации гуморального ответа на возбудитель коклюша по ТЪ2 типу.

3. Повышение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8) у больных коклюшем свидетельствует об активной реакции иммунной системы на коклюшную инфекцию и другие респираторные инфекции, сочетающиеся с ней. Для ИЛ-6 и ИЛ-8 такая реакция усиливается с углублением тяжести заболевания.

4. Цитокиновая регуляция специфического гуморального ответа на коклюшную инфекцию имеет особенности, связанные с прививочным анамнезом больных. У ранее привитых детей активность ТЬ2 высока с первых недель заболевания, а у непривитых начинает преобладать на поздних сроках заболевания.

5. Присоединение микоплазменной инфекции к коклюшу наиболее сильно изменяет цитокиновый профиль, наблюдаемый у больных. При этом варианте заболевания наблюдается самая высокая продукция ИЛ-8, ИЛ-17 на ранних сроках и наиболее быстрая нормализация продукции ИФНу на поздних сроках. Повышенная концентрация 1§Е в крови больных также характерна для сочетания коклюша с микоплазменной инфекцией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Характер изменений в цитокиновой сети при коклюше. // Медицинская иммунология, 2006, том 8, № 2-3. с. 298 (Федорова И.М., Котелева С.И., Капустин И.В., Попова О.П)

2. Изменения в цитокиновой сети при коклюше и его сочетаниях с другими инфекциями. // Медицинская иммунология, 2007, том 9, № 2-3, с. 231-232 (Котелева С.И., Федорова И.М., Капустин И.В., Попова О.П.)

3. Влияние сопутствующей микоплазменной инфекции на цитокиновый статус больных коклюшем. // Российский иммунологический журнал, 2008, т.2, №2-3, с. 251 (Котелева С.И., Федорова И.М., Капустин И.В., Рамазанова З.К)

4. Цитокиновый статус больных коклюшем, соответствующий различным стадиям и формам заболевания. // Российский иммунологический журнал, 2008, т.2, №2-3, с. 262 (Федорова И.М., Котелева С.И., Капустин И.В., Попова О.П., Бляхер М.С.)

5. Динамика антител к В. pertussis и продукция цитокинов у детей, больных коклюшем. // Медицинская иммунология, 2009, том 11, № 4-5, с. 388 (Котелева С.И., Федорова И.М., Капустин И.В., Попова О.П., Скирда Т.А.)

Список сокращений ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-23 - интерлейкины ИФНа, ИФНу - интерфероны - альфа и - гамма

KT - коклюшный токсин

ЛПС - липополисахарид

PCB - респираторно-синцитиальный вирус

ФГА - фитогемагглютинин

ФМА - форболмиристатацетат

ФНОа - фактор некроза опухоли альфа

CD4, CD8, CD 19, CD 16 56 - маркеры основных субпопуляций лимфоцитов крови IgG, IgM, IgA, IgE - иммуноглобулины классов G, М, А, Е

Th 1, Th2, Th 17 - Т-хелперы 1, 2 типа и продуцирующие ИЛ-17

Tri, Tieg - субпопуляции Т-регуляторных клеток

Подписано в печать 10.09.2010г. Формат 60x84/16 Печать цифровая. Усл.п.л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 216. Отпечатано в ООО «Реглет» 125315 г. Москва, Ленинградский проспект, д.74 к.1 Тел: 790-47-77; 661-60-89