Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитокиновый статус у больных с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса

На правах рукописи

ЗУЙКОВ Игорь Александрович

ЦИТОКИНОВЫЙ СТАТУС У БОЛЬНЫХ С ВТОРИЧНЫМ ИММУНОДЕФИЦИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С ТЯЖЕЛЫМ ТЕЧЕНИЕМ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ПРОСТОГО

ГЕРПЕСА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007

003062342

Работа выполнена в ФГУ «НИИ физико-химической медицины» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Н.А. Дидковский Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор С.А. Гусев

доктор медицинских наук, профессор В.М. Земсков

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет.

Защита диссертации состоится мая 2007 года в часов на заседании диссертационного Совета Д № 208.057.02 при ФГУ «НИИ физико-химической медицины» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 119992, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ физико-

химической медицины» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Автореферат разослан еы^лЛ^ 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат биологических наук

Л. Л. Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

За последние годы в клинической практике значительно увеличилось число больных, страдающих хроническими часто рецидивирующими герпетическими инфекциями, которые сопровождаются определенными нарушениями иммунного статуса и трудно поддаются лечению. Согласно данным литературы, рецидивирующие герпесные инфекции наблюдаются у 20-25% жителей разных стран (Исаков В.А. и др, 2006г, Борисенко JI.K, 2003г). Проявления герпетической инфекции многолики - от "безобидной" губной лихорадки, афтозного стоматита до генерализованных форм с распространенным поражением кожи и слизистых оболочек с вовлечением в патологический процесс различных органов и систем. Кроме того, вирусы простого герпеса представляют серьезную угрозу для репродуктивного здоровья населения, вызывая неонатальный герпес, самопроизвольные выкидыши, мертворождение, формирование пороков развития плода, менингоэнцефалит (Сафонова М.М., 2003г, Corey L. et al, 2000г).

Главными биологическими и патогенетическими особенностями герпес-вирусов являются их пожизненное персистирование в организме хоть однажды инфицированного ими человека, сильнейшая зависимость течения хронического инфекционного процесса от состояния иммунитета вирусоносителя и склонность к рецидивированию при ослаблении иммунологического контроля. Ослабление иммунной защиты может индуцироваться самими вирусами, обладающими большим набором белков, подавляющих иммунную систему и снижающих роль факторов противовирусной защиты клеточного звена иммунитета, естественных киллеров и системы интерферона (Лебедева H.H. и др., 1997г, Сухих Г.Т. и др., 1997г., Халдин A.A., 2001г). Сама реактивация вирусов вследствие увеличения вирусных белков "супрессоров" усугубляет вторичный иммунодефицит со всеми вытекающими из этого последствиями. Патогенез развития тяжелого течения герпетической инфекции, вызванной вирусом простого герпеса у лиц не страдающих СПИД и не получающих постоянную иммуносупрессивную терапию, не страдающих онкологическими и другими заболеваниями, вызывающими тяжелый иммунодефицит, не вполне ясен. С учетом экспериментальных данных о взаимодействии разных лимфотропных вирусов герпес-группы и их пантропизма (возможность поражать клетки разных органов и систем) нам представлялось актуальным изучение распространенности вируса простого герпеса в организме больных с тяжелой формой болезни (системность поражения), а также наличие активации других вирусов герпес-группы, для оценки возможного вклада этих факторов в патогенез заболевания для разработки патогенетически обоснованных схем комплексного лечения этой категории «трудных» больных.

Одним из наиболее важных факторов системы противовирусной защиты и регуляции иммунного ответа в целом является система цитокинов. Цитокины являются низкомолекулярными медиаторами межклеточных взаимодействий, т.е. фигурально выражаясь, языком, на котором все клетки организма говорят друг с другом (Ковальчук Л.В. и др., 2001г, Симбирцев А.С. 2002г). Важность регуляции иммунного ответа определяется способностью цитокинов поддерживать пролиферацию и дифференцировку активированных иммунокомпетентных клеток различных субпопуляций и обеспечивать выполнение их функций. Следовательно, нарушения функционирования иммунной системы при иммунодефицитом состоянии может отражать дисфункцию цитокиновой системы. Вследствие этого является важным исследовать уровень продукции основных цитокинов, обеспечивающих противовирусную активность, и в том числе, обладающих провоспалительной и иммунорегулирующей активностью, таких как ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а, ИФН-а и ИФН-у у больных, страдающих вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с хронической герпесвирусной инфекцией.

Поскольку роль указанных цитокинов при хронических герпесвирусных инфекциях не достаточно изучена, несомненно, что эта задача является актуальной для понимания механизмов развития вторичных иммунодефицитов, связанных с хроническими герпесвирусными инфекциями, и для разработки патогенетически обоснованной комплексной терапии этой категории пациентов.

Цель работы: Изучить состояние системы цитокинов (ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а и ИФН-а, ИФН-у), а также наличие и распространенность активной репликации вируса простого герпеса и других вирусов герпес-группы у больных с вторичным иммунодефицитом и герпетической инфекцией тяжелого течения для разработки новых патогенетических подходов к терапии заболевания.

Задачи работы:

1. Исследовать у больных с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса, наличие активной репликации ВПГ и других вирусов герпес-группы методом ПЦР в различных материалах в фазу обострения и ремиссии.

2. Оценить уровень цитокинов ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а и интерферона а и у в сыворотке крови больных с вторичным иммунодефицитом в фазу обострения и ремиссии инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

3. Изучить продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови под влиянием индукторов синтеза цитокинов у пациентов с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

4. Изучить местную продукцию цитокинов (ИЛ-4, ФНО-а) в секрете ротовой полости у пациентов с вторичным иммунодефицитом в период обострения и ремиссии герпес-вирусной инфекции при выявлении вирусов в орофарингеальной области.

5. Провести сравнительный анализ между уровнем изучаемых цитокинов и показателями иммунного статуса у пациентов с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

Научная новизна. Впервые показано наличие микст-герпесвирусной инфекции у больных с вторичным иммунодефицитом (ВИД), ассоциированным с тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (ВПГ). Впервые обнаружено сохранение активной репликации лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) в период клинической ремиссии инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.

Обнаружено, что у всех больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, нарушено функционирование системы цитокинов как в период обострения, так и ремиссии заболевания. Определены основные различия в формировании цитокинового ответа и его нарушений у больных с различными вариантами вторичного иммунодефицита: Т-клеточной недостаточности, недостаточности цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров, гуморальной недостаточности. Впервые показано наличие выраженной гипореактивности иммунной системы у больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса в виде отсутствия ответа клеток-мишеней на вырабатываемые цитокины.

Впервые у пациентов с ВИД, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса, методом кластерного анализа выделено 3 варианта цитокинового ответа. Обнаружена взаимосвязь между вариантами продукции цитокинов и тяжестью клинического течения инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.

Впервые изучен местный цитокиновый ответ (ИЛ-4 и ФНО-а) у больных как в период активной репликации, так и в период ремиссии герпес-вирусной инфекции в орофарингеальной области. Показано, что уровень цитокинов в слюне является более информативньм показателем течения заболевания, значительно превышая сывороточные показатели в период обострения и более значимо снижаясь в период ремиссии герпес-вирусной инфекции.

Практическая значимость. Выявление других вирусов герпес-группы в различных клинических материалах, а также вирусов простого герпеса в лимфоцитах крови и орофарингеальной области (т.е. вне локализации высыпаний) у больных с ВИД и тяжелой инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, показывает необходимость более полного обследования этих

больных в период рецидива и ремиссии заболевания. Эти данные должны учитываться при проведении противовирусной терапии у таких пациентов.

Результаты проведенного анализа позволили установить варианты нарушений согласованной работы цитокиновой сети и выраженную гипореактивность иммунной системы при вторичном иммунодефиците, ассоциированном с тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса. Определение варианта цитокиновой и иммунной дисфункции у отдельного больного дает возможность осуществить подбор адекватной противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

Исследование цитокинового ответа позволило выделить ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а и ИФН-у как основные противовирусные и иммунорегуляторные цитокины, которые могут быть использованы для контроля за течением заболевания и эффективностью проводимого лечения.

В процессе работы была показана возможность и информативность использования секрета ротовой полости в качестве материала для определения уровня местного цитокинового ответа и контроля за течением герпес-вирусной инфекции. Существенным для практического применения является неинвазивность метода забора этого клинического материала.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты работы внедрены в практику кабинета врача клинического иммунолога консультативного центра 7 городской клинической больницы, а также в практику МЛПУ «Правдинская поликлиника» Московской области.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006г), II международной научной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» (Ереван 2005г), 5-ом Национальном конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) (Москва, 2004г.), итоговой конференции 2004 и 2006 года в ФГУ «НИИ Физико-химической медицины» Росздрава.

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании лаборатории клинической иммунологии ФГУ «НИИ физико-химической медицины» и лаборатории клинической иммунологии ФППО ММА им. И.М.Сеченова 26.03,2007г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Вторичное иммунодефицитное состояние и тяжелое течение инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, у обследуемых пациентов, по-видимому, обусловлено наличием активной перманентной репликации других вирусов герпес-группы.

2. В период клинической ремиссии инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, сохраняется активная репликация других лимфотропных вирусов герпес-группы, а также у части больных репликация вирусов простого

герпеса в других биологических средах, что может иметь отношение к патогенезу тяжелого течения заболевания

3. У пациентов с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением ВПГ-инфекции выявлена дисфункция цитокиновой системы в виде нарушения согласованности и последовательности выработки цитокинов в процессе противовирусного ответа, а также отсутствие ответа на вырабатываемые цитокины со стороны клеток-мишеней.

4. Различные варианты нарушений цитокинового ответа обуславливают развитие нескольких типов иммунной недостаточности и взаимосвязаны с тяжестью течения инфекции, вызванной вирусом простого герпеса и, по-видимому, с влиянием активной репликации других лимфотропных вирусов герпес-группы.

5. Оценка уровня цитокинов (ИЛ-4 и ФНО-а) в секрете ротовой полости как в фазу активной репликации герпес-вирусов в эпителиальных клетках орофарингеальной области, так и в фазу ремиссии микст-вирусной инфекции является информативным методом контроля за течением заболевания.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 странице, иллюстрирована 22 таблицами и 10 рисунками. Диссертация состоит из введения и глав: обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы. Библиографический указатель включает 139 источника, из них 66 отечественные и 73 зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Характеристика пациентов. В исследование включались больные с признаками вторичного иммунодефицита (ВИД) и установленной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (ВПГИ) тяжелого течения. Клиническими маркерами ВИД являлись хронические часто рецидивирующие воспалительные заболевания респираторного, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. Диагноз ВПГИ устанавливался на основании анамнеза, жалоб больного, клинических признаков рецидивов заболевания, положительной реакции на ДНК ВПГ 1,2 типа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в материале из области поражения. Тяжесть течения ВПГИ характеризовалась частотой обострений от 8 до 18 раз в год, продолжительностью рецидива 6-12 дней, нарушением физического и психического самочувствия, качества жизни в период и вне рецидива.

В исследование не включались больные с тяжелыми сопутствующими заболеваниями, сопровождающимися декомпенсацией внутренних органов (дыхательная, сердечная, почечная недостаточность и так далее), которые в таких случаях могут являться причиной ВИД.

В соответствии с поставленными задачами нами было обследовано 94 больных с клиническими признаками ВИД и ВПГИ тяжелого течения.

Все больные обследованы клинически и лабораторно в период обострения и через 15 дней в период клинической ремиссии ВПГИ. С начала обострения все пациенты получали стандартную противовирусную терапию ацикловиром по 200 мг 5 раз в сутки в течение 7 дней. Группу контроля составили 32 практически здоровых лиц, не имеющих клинических признаков рецидивирующей ВПГ-инфекции (табл. №1).

Таблица №1

Характеристика пациентов основной (п=94) и контрольной (п=32) групп

ПРИЗНАКИ ГРУППЫ

Основная группа (п=94) Контрольная группа (п=32)

Возраст (min-max) 16 -60 лет 18-55 лет

Средний возраст (М±т) 37,9±3,2 32,0+3,2

Мужчины, абс число 26 14

Женщины, абс число 68 18

Длительность заболевания (М±т) от 2-х до 20 лет, в среднем 8,7±2,6 лет -

Хр. воспалительные заболевания - респираторного тракта 60,6% -

- желудочно-кишечного тракта 80,9% -

- мочеполового тракта 60,6% -

У наблюдаемых нами больных ВИД с ВПГИ, включенных в настоящее исследование, сопутствующие процессы хронического воспаления респираторного тракта (фарингит, трахеит, в ряде случаев рецидивирующий бронхит), желудочно-кишечного тракта, в том числе на фоне дисбиоза кишечной флоры в период исследования находились вне выраженного обострения.

Методы обследования.

Определение ДНК ВПГ-1.2 типа. ЦМВ. ВЭБ, ВГЧ-6 типа методом полимеразной цепной реакиии (ПНР)

С помощью метода ПЦР определяли наличие ДНК ВПГ1,2, ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ 6 типа. Выделение ДНК производили с помощью набора для выделения "ДНК-сорб-А" ("АмплиСенс", Москва), согласно протоколу производителя. Материалом для выделения ДНК служили эпителиальные клетки из области высыпаний, уретры, цервикального канала, осадка мочи, мазка из зева, слюны, лимфоциты/лейкоциты крови. В данной работе были использованы

диагностические наборы производства ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ "АмплиСенс и НПФ "Литех" для определения следующих патогенов: вирус простого герпеса 1,2 типа (HSV I+II), цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса человека 6 типа (HHV6), вирус Эппггейна-Барр (EBV). Реакцию амплификации проводили в термоциклере «Терцию> (НПФ «ДНК-Технология», Москва). Анализ продуктов амплификации проводили электрофоретическим разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле, содержащем краситель (бромид этидия).

Иммунологические методы исследования

Определение фенотипа лимфоцитов методом непрямой иммунофлуресценции с помощью моноклональных анти/яел._Определение субпопуляций лимфоцитов CD5+, CD4+, CD8+, CD72+, CD16+, CDllb+ и HLA-DR+ в периферической крови проводили методом проточной цитофотометрии с помощью моноклональных антител серии ЛТ-FITS (F(ab')2 фрагменты бараньих антител к Ig мыши, меченные FITS) (НИИ Иммунологии, ТОО «Сорбент Лтд»). Подсчет проводился на проточном цитометре «Ortum spectrum».

Количественное определение иммуноглобулинов классов IgA, IgM, IgG. Концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузиии в геле по Mancini et al., 1963. Определение содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови. Метод основан на преципитации иммунных комплексов в 4,16% растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 в полимеризующем буфере с последующим фотометрированием (по Гашкова В., 1978г).

Определение содержания цитокинов в биологических жидкостях (сыворотке, супернатанте мононуклеаров периферической крови, слюне)

Количественное содержание цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а) в сыворотке, супернатанте спонтанных и стимулированных проб цельной крови, слюне определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем («Протеиновый контур», г.С.-Петербург, «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Перед забором слюны проводилось трехкратное полоскание полости рта физиологическим раствором. Заббр слюны производился в одноразовые чашки Петри в количестве 2-3 мл.

Индукцию цитокинов проводили микрометодом в цельной крови, взятой из вены в день обследования. Способность мононуклеаров периферической крови изучали под воздействием индукторов: для продукции а-ИФН применяли вирус болезни Ньюкасла (ВБН) и для ИФН-у - ФГА (10 мкг/мл). Культивирование мононуклеаров периферической крови выполняли в течение 24 часов при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. Уровень ИФН-а и ИФН-у определяли в супернатанте вышеописанным методом ИФА.

Характеристика методов статистического анализа

Данные, полученные в результате исследования, обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики на ПК с использованием стандартных программ: «Statistica 5.5A», «MatLab 6», «Microsoft Excel, Professional Office 2000» (пакеты статистического анализа данных). В ряде случаев с целью нормализации данных использовали метод исключения «выскакивающих» вариант. Для распределения пациентов исходной выборки на подгруппы по данным иммунологического обследования применяли кластерный анализ (с использованием метода K-средних, стандартизованного Евклидова расстояния, расстояния Чебышева, расстояния Джаккарда, метода Варда). При небольших размерах групп количественные переменные анализировались с помощью непараметрических методов даже при условии нормального характера распределения, включая критерий Вилкинсона-Манна-Уитни. При оценке взаимосвязей признаков между независимыми выборками применялся коэффициент ранговой корреляции Спирмана. Для оценки достоверности различий и корреляционных взаимосвязей применяли критерий Стьюдента. Статистически значимым для всех показателей считался критерий достоверности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты клинического обследования и ДНК-диагностики больных

В обследуемую группу вошло 94 больных с тяжелым течением ВПГ-инфекции с частотой рецидивов в среднем 11,0 раз в год, у части пациентов до 18 раз в год, с ухудшением физического и психического самочувствия. Среди пациентов большую часть в группе - 72,4% составили женщины, 27,6% -мужчины. У обследуемых больных отмечалась различная локализация герпетических высыпаний - у 23,4% назо-лабиальная форма, у 25,4% - ано-генитальная форма, 51,2% пациентов - с сочетанным поражением (назо-лабиальная и ано-генитальная форма).

Все больные жаловались на эпизодически появляющиеся пузырьковые/эрозивные высыпания различного диаметра, расположенные группами или одиночно, в привычной локализации (крылья носа, красная кайма губ, кожа подбородка, половые губы, лобковая, паховая область, область полового члена, ягодичная область). Обострения заболевания сопровождались жалобами на общее недомогание, головную боль, слабость, выраженное увеличение лимфатических узлов, пониженную работоспособность. Кроме того, при ано-генитальной локализации выраженный зуд, болезненность и жжение в области наружных половых органов, не поддающиеся какому-либо лечению, являлись причиной неврастенических и депрессивных расстройств.

По результатам ДНК обследования было обнаружено, что у 96,0% больных с ВИД и тяжелым течением Bill И в различных средах присутствует репликация других вирусов этой группы (Рис №1).

Рисунок №1

Частота выявления других вирусов герпес-группы у обследуемых пациентов с ВИД и рецидивирующей ВПГ-инфекцией

ВПГ1,2+ЦМВ

ВПГ 1,2 + ВЭБ

ВПГ1,2+ ВГЧ6

18%

ВЛГ1,2+ВЭБ+ ВГЧ6

45%

моноинфекция ВПГ1.2 4%

Наиболее часто у пациентов с тяжелым течением ВПГИ выявлялась микст-инфекция - в 45,0% случаев, с присутствием одновременно 3-х вирусов (ВПГ1,2, ВЭБ и ВГЧ 6 типа). Также достаточно часто присутствовала микст-инфекции по 2-м вирусам - ВПГ 1,2 + ВЭБ и ВПГ1,2 +ВГЧ6 в 21,0% и 18,0% случаев, соответственно. Отмечено, что чаще всего обнаруживались вирус Эшцтейна-Барр (суммарно в 66,0% случаев, в основном в слюне, эпителиальных клетках зева, реже — в лимфоцитах периферической крови) и вирус герпеса 6-го типа (суммарно в 63,0% случаев в этих же материалах).

Цитомегаловирусная инфекция выявлялась только в 12,0% случаев в эпителиальных клетках из уретры, цервикального канала, осадка мочи. Следует отметить, что у 29,8% (28 больных) ДНК ВПГ1,2 типа было обнаружено в нескольких средах, в частности, при аво-ге н итал ьных высыпаниях выявляли вирус в слюне, эпителиальных клетках зева, лимфоцитах периферической крови.

Для сравнительного анализа наличия активной репликации других вирусов герпес-группы при легком течении ВПГИ, привлечены данные обследования 36 больных (26 женщин, 10 мужчин). Средний возраст больных в данной группе сравнения - 33,4±2Д лет, частота обострений ВПГИ - в среднем 3,9±0,8 раз в год.

Выявлена достоверно меньшая доля пациентов - 27,8% с микст-вирусной инфекцией (ВЭБ, ВГЧ6) при легком течении ВПГИ по сравнению с данными группы с тяжелым течением (р<0,05). При этом одновременно ВПГ1,2 типа и ВЭБ определялись в 8,3±2,8% случаев, ВПГ1,2 типа и ВГЧ6 - в 16,6±3,2% случаев, ВПГ 1,2 и ЦМВ - 0% случаев. Одновременная репликация ВПГ1,2 типа, ВЭБ и ВГЧ6 типа обнаружена только у 2,8±1,7% пациентов, что достоверно реже, чем в группе с тяжелым течением ВПГ-инфекции (р<0,05).

Обследование больных основной группы в период клинической ремиссии ВПГИ после приема ацикловира показало сохранение активной репликации герпес-вирусов (ВЭБ, ВГЧ 6, ЦМВ) у 96,6% пациентов. Кроме того, в период клинической ремиссии присутствие ЗПГ 1,2 в активной форме выявлено у 20,2% (19 больных) в слюне, эпителиальных клетках зева, осадка мочи (рис. №2).

Рисунок №2

Частота выявления вирусов герпес-группы у пациентов с ВИД в период обострения и клинической ремиссии рецидивирующей ВГТГ-инфекции

100,0% 80,0%

п

0

1 60.0%'

| 40.0%

S!

20,0% 0,0%

ВПГ1,3 ВЭБ ВГЧ6 ЦМВ

Таким образом, ВИД и тяжелое течение ВПГИ у обследуемых больных по-видимому в значительной мере связано с наличием у них микст-вирусной инфекции (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) Следует также отметить, что в период отсутствия клинических симптомов обострения ВПГИ у 20,2% больных сохраняется активная репликация ВПГ (при исследовании слюны, эпителиальных клеток зева, осадка мочи), что отражает необходимость проведения у них соответствующей противовирусной терапии.

Результаты обследования иммунного и цитокиновиго статуса у пациентов с ВИД, ассоциированным с ВПГ-инфекцией тяжелого течения

При обследовании у всех больных ВПГИ были выявлены признаки иммунной дисфункции и вторичной иммунной недостаточности. В зависимости от нарушений в различных звеньях противовирусной защиты в период обострения В IT И было выделено три подгруппы пациентов. В первую подгруппу вошли больные с преимущественной недостаточностью по Т-клеточному звену со снижением содержания общих CD5+ и CD4+■ л и м ф оцитс в. Во второй подгруппе у больных отмечалась недостаточность цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и естественных киллеров (CD16+). У пациентов третьей подгруппы была выражена недостаточность гуморального звена со снижением уровня иммуноглобулина IgG. В выделенных подгруппах проводилось изучение продукции основных цигокинов.

Как показали исследования, у больных с Т-клеточной недостаточностью в период обострения ВПГИ было достоверно снижено содержание общих Т-лимфоцитов CD5+ до 62,6+1,3% и Т-хелперов CD4+ до 30,5±1,3% по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05). Содержание цитотоксических CD8+, ЕК CD 16+, CDllb+ и DR.+-лимфоцитов у данных пациентов было сопоставимо с показателями здоровых лиц, что

отражает отсутствие адекватного ответа этих клеток на активацию вирусной инфекции. В период ремиссии ВПГИ содержание СБ5+-лимфоцитов (Лф) недостоверно увеличилось до 65,5±1,5%, а содержание СБ4+-Лф повысилось до 35,б±1,9%, оставаясь ниже показателей здоровых лиц (р<0,05). На фоне увеличения содержания Т-хелперов соотношение CD4+/CD8+ (ИРИ) также увеличилось, но не достигая значений группы здоровых лиц. Изменений в составе остальных субпопуляций лимфоцитов не отмечено (таб. №2).

Таблица №2

Содержание основных субпопуляций лимфоцитов у больных ВИД с Т-клеточной недостаточностью в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции (п=27)

Показатель Группа CD 5+ % CD 4+ % CD 8+ % ИРИ 1,2-2,1 CD 16+ % HLA- DR+ % CD llb+ %

Подгруппа больных ВИД с Т-кл. Н, в период обострения (п=27) 62,6±1,3* 30,5±1,3* 32,6+1,6 1,01±0,08* 11,3±1,0 10,7±1,1 15,2±1.3

Подгруппа больных ВИД с Т-кл. Н, в период ремиссии (п=27) 65,5±1,5* 35,6±1,9* 31,8±1,5 1,20±0,11 12,4±1,1 11,5±0,9 16,4±1,2

Группа здоровых лиц (п=32 ) 75,6±1,1 42,3±1,5 30,5±1,3 1,40±0,02 14,2±1,3 12,5+1,3 16,3±2,1

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

Как видно из таб. 3, показатели цитокинового ответа у пациентов данной подгруппы в период обострения характеризовались достоверным повышением в сыворотке уровня ИЛ-1р до 267,8±12,8 пкг/мл (р<0,05). При этом содержание ИЛ-2 и ИЛ-4 не было повышено и составило 43,0±4,3 и 42,0±3,8 Пкг/мл, соответственно.

Таблица №3

Содержание основных цитокинов у больных ВИД с Т-клеточной недостаточностью в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции (п=27)

~~ Группа Показатель Подгруппа больных ВИД о Т-кл. Н, в период обострения (п-27) Подгруппа больных ВИД с Т-кл. Н, в период ремиссии (п=27) Группа здоровых лиц (п=32)

ИЛ-1р, пкг/мл 267,8±12,8* 540,6±15,7* 66,7±7,2

ИЛ-2, пкг/мл 43,0±4,3 42,3±3,5 45,5±3,1

ИЛ-4, пкг/мл 42,0±3,8 43,0±4,1 32,2±5,7

ФНО-а, пкг/мл 2,9±0,1 2,3±0,2 2,5±0,2

ИФНа сыв, пкг/мл 12,8±2,5 13,0±2,2 15,5±3,5

ИФНа индуц, пкг/мл 38,8±4,3* 45,5±3,8* 65,5±4,5

ИФНу сыв, пкг/мл 40,0i2,4 46,0±3,1 45,5±3,3

ИФНу индуц, пкг/мл 93,2±7,3* 110,5±б,9* 145,5±6,8

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

Выявлено, что у всех пациентов этой подгруппы не происходит повышения в сыворотке ИФН-а и ИФН-у в ответ на активную вирусную

инфекцию. Индуцированная продукция лейкоцитами крови ИФН-а и ИФН-у также оказалась сниженой и не достигала уровня группы здоровых лиц, составляя 38,8±4,3 и 93,2±7,3 пкг/мл, соответственно (р<0,05).

В период ремиссии Bill И, несмотря на отсутствие герпетических высыпаний и подавление репликации вируса в местах привычной локализации, обнаружено дальнейшее повышение среднего содержания ИЛ-1(3 у данных пациентов и тенденции к увеличению продукции ИФН-у по сравнению с периодом обострения. Уровень остальных цитокинов у них не изменялся.

Таким образом, у больных ВШ И тяжелого течения данной подгруппы Т-клеточная недостаточность CD5+ и СБ4+-Лф сочеталась с повышенной продукцией провоспалительного цитокина ИЛ-1(3 и нарушением синтеза основных противовирусных и иммунорегуляторных цитокинов - ИЛ-2, ИФН-а, ИФН-у как в период обострения, так и ремиссии заболевания.

В подгруппе больных ВИД с недостаточностью цитотоксических лимфоцитов (НЦТЛ) и естественных киллеров (ЕК) в среднем содержание общих Т-Лф и Т-хелперов не отличалось от показателей группы здоровых лиц (таб. №4). Уровень ЦТЛ CD8+-Лф в период обострения ВПГ-инфекции был существенно снижен до 22,6±0,7%, как и содержание ЕК до 9,3±0,8% по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05). Кроме того, было снижено содержание клеток, экспрессирующих рецепторы CDllb+ в среднем до 10,8±0,9%, (при показателе здоровых 16,3±2,1%, р<0,05), которые отражают способность ЕК к адгезии к клеткам-мишеням. В период ремиссии ВШ И выявленные нарушения в содержании ЦГЛ СБ8+-лимфоцитов, ЕК и CD11Ь+-клеток сохранялись.

Таблица №4

Содержание основных субпопуляций лимфоцитов у больных ВИД с НЦТЛ и ЕК в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции (п=34)__

^--Показатель Группа CD 5+ % CD 4+ % CD 8+ % ИРИ 1,2-2,1 CD 16+ % HLA-DR+ % CD 1 lb+ %

Подгруппа 5ольных ВИД с НЦТЛ и ЕК, в период обострения [п=34) 72,3±1,2 46,5±1,4 22,6±0,7* 2,11±0,10* 9,3±0,8* 16,2+1,5 10,8±0,9*

Подгруппа зольных ВИД с НЦТЛ и ЕК, в период ремиссии :п=34) 72,4±1,1 47,9±1,1 23,7±0,6* 2,02±0,08* 9,6±0,9* 14,3±1,2 10,3±1,1*

Группа здоровых лиц(п=32 ) 75,6±1,1 42,3±1,5 30,5+1,3 1,40±0,02 14,2±1,3 12,5±1,3 16,3 ±2,1

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

Анализ содержания цитокинов у данной под1руппы больных с НЦТЛ и недостаточностью ЕК показал наличие существенного повышения уровня ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-4 в период обострения по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05). Содержание ИФН-а и ИФН-у в сыворотке

соответствовало показателям группы здоровых лиц, указывая на нарушение активации интерфероногенеза в ответ на инфекцию (гипореактивность). Кроме того, стимулированная продукция ИФН-а и ИФН-у была снижена до 46,4+4,3 пкг/мл и 93,9±6,8 пкг/мл, соответственно (при показателе здоровых лиц -65,5±4,5 пкг/мл и 145,5±6,8 пкг/мл соответственно). Следовательно, несмотря на наличие повышенной выработки ИЛ-2 системы специфической и естественной цитотоксичности (СБ8+Лф и СБ16+Лф), зависимые от этого цитокина, находится в состоянии глубокой супрессии (таб. №5).

Таблица №5

Содержание основных цитокинов у больных ВИД с НЦГЛ и ЕК в период

обострения и ремиссии ВПГ-инфекции i п=34)

Группа Показатель4---^ Подгруппа больных ВИД с НЦТЛ и ЕК, в период обострения (п=34) Подгруппа больных ВИД с НЦТЛ и ЕК, в период ремиссии (п=34) Группа здоровых лиц (п=32)

ИЛ-1(3, пкг/мл 191,9±7,8* 220,7±6,2* 66,7±7,2

ИЛ-2, пкг/мл 110,3±4,3* 97,3±5,8* 45,5±3,1

ИЛ-4, пкг/мл 65,7±8,3* 57,2+6,8* 32,2+5,7

ФНО-ot, пкг/мл 2,9±0,1 2,3±0,2 2,5±0,2

ИФНа сыв, пкг/мл 11,5±2,8 13,0±2,5 15,5±3,5

ИФНа индуц, пкг/мл 46,4±4,3* 39,6+4,6* 65,5±4,5

ИФНу сыв, пкг/мл 32,9±4,2 38,8±3,7 45,5±3,3

ИФНу индуц, пкг/мл 93,9±6,8* 100,0±7,3* 145,5±6,8

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

В период ремиссии Bill И у больных данной подгруппы, несмотря на подавление репликации ВПГ, также как и в подгруппе с Т-кл.Н отмечается повышение содержания ИЛ-ip (в среднем до 220,7±6,2 пкг/мл), сохранение повышенного уровня ИЛ-2 (97,3±5,8 пкг/мл), и тенденция к снижению уровня ИЛ-4 до 57,2±6,8 пкг/мл. Содержание ИФН-а и у в сыворотке, как и их стимулированная продукция лейкоцитами крови оставались сниженными и не изменялись даже в период ремиссии ВПГИ (таб. №5), что свидетельствует о подавлении работы этого звена.

Таким образом, у больных подгруппы с недостаточностью содержания ЦТЛ CD8+, ЕК CD 16+ и CD11Ь+-Лф повышена продукция ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-4 и отсутствует выработка ИФН-а и ИФН-у, т.е. наблюдается нарушение работы цитокиновой сети. Кроме того, нарушен ответ клеток-мишеней на ИЛ-2, что возможно связано с дефицитом последующей выработки ИФН-у или с врожденным дефектом этих систем.

В подгруппе пациентов ВИД с гуморальной недостаточностью выявлено снижение уровня IgG до 919,5±17,0мг% по сравнению с показателями здоровых лиц (р<0,05) и отсутствие повышения уровня IgM (125,6±8,1мг%) и циркулирующих иммунных комплексов - ЦИК (58,2±4,8 усл.ед.), характерных для активной вирусной инфекции. В период ремиссии отмечается недостоверное повышение содержания IgG до 1025,9±40,5мг%

(оставаясь достоверно ниже показателя группы здоровых), ЦИК до 60,4±6,2 усл.ед. и 1§А до 182,4±15,5мг% (таб. №6).

Таблица №6

Содержание основных иммуноглобулинов А, М, в, ЦИК и В-лимфоцитов у больных ВИД с гуморальной недостаточностью в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции (п=33)___

—Показатель Группа ~~--____ IgA (мг%) IgM (мг%) IgG (мг%) В-лимф (CD72+) ЦИК (усл.ед)

Подгруппа больных ВИД с гуморальной недостаточностью, в период обострения (п=33) 16б,4±11,5 125,6±8,1 919,5417,0* б,8±0,6 58,2±4,8

Подгруппа больных ВИД с гуморальной недостаточностью, в период ремиссии (п=33) 182,4±15,5 123,9±9,7 1025,9±40,5* 6,3±0,6 60,4±6,2

Группа здоровых лиц (п=32 ) 150,6±5Д 120,5+4,1 1455,2±20,1 б,5±0,5 46,9±1,2

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

У больных ВПГИ данной подгруппы отмечено повышение содержания провоспалительного цитокина ИЛ-ip до 216,8±5,2 пкг/мл, ИЛ-4 до 71,6±5,4 пкг/мл и отсутствие повышения уровня ИЛ-2 (таб. №7). Как и в предыдущих подгруппах отмечается нарушение продукции ИФН-а и ИФН-у в ответ на стимул, отсутствие повышения их уровня в сыворотке. В период ремиссии сохранялся повышенный уровень ИЛ-ip - 214,4±6,5 пкг/мл, содержание ИЛ-4 достоверно снижалось до 47,4±5,2 пкг/мл (р<0,05 по сравнению с периодом обострения).

Таблица №7

Содержание основных цитокинов у больных с гуморальной недостаточностью

в период обострения и ремиссии ВПГ-шк >екции (п=33)

Группа Показатель^. Подгруппа больных ВИД с гуморальной недостаточностью, в период обострения (п=33) Подгруппа больных ВИД с гуморальной недостаточностью, в период ремиссии (п=33) Группа здоровых лиц (п=32)

ИЛ-ip, пкг/мл 216,8±5,2* 214,416,5* 66,7±7,2

ИЛ-2, пкг/мл 50,0±3,8 46,9±4,1 45,5+3,1

ИЛ-4, пкг/мл 71,6+5,4* 47,4±5,2# 32,2±5,7

ФНО-а, пкг/мл 0,29±0,01 0,20±0,01 2,5±0,2

ИФНа сыв, пкг/мл 11,7±1,1 12,0±1,0 15,5±3,5

ИФНа индуц, пкг/мл 49,2±3,1* 44,5±3,9* 65,5±4,5

ИФНу сыв, пкг/мл 40,5±3,8 41,014,4 45,5±3,3

ИФНу индуц, пкг/мл 99,5±9,9* 100,718,9* 145,5±6,8

* - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05) " - различия достоверны по сравнению с периодом обострения (р<0,05)

У больных с гуморальной недостаточностью отмечается снижение уровня отсутствие повышения 1цМ, ЦИК и цитокиновый ответ с

повышением только ИЛ-1(3 и ИЛ-4. С учетом невысоких значений иммуноглобулинов можно говорить о нечувствительности клеток-мишеней к вырабатываемым цитокинам (Т-хелперы 1 и 2-го типов, В-лимфоциты и др.).

Таким образом, у больных с ВИД и тяжелым течением Bill И выявлены выраженные нарушения в продукции цитокинов (ИЛ-2, ИФН-а и ИФН-у), ассоциированные с недостаточностью в различных звеньях иммунного ответа, как в период рецидива, так и в период ремиссии заболевания (гиперпродукция отдельных цитокинов), а также гипореактивность клеток-мишеней к продуцируемым цитокинам.

Эти данные отражают участие в формировании ВИД и тяжелого течения Bill И других вирусов герпес-группы, репликация которых выявляется как в период обострения, так и ремиссии заболевания. Кроме того, результаты исследования свидетельствуют о необходимости проведения иммунокоррипирующей терапии у данных больных с учетом выявленных нарушений иммунного статуса и системы цитокиновой сети. Оценка нарушений продукции цитокинов и их связи с клиническими особенностями заболевания у больных с ВИД и рецидивирующей ВПГ-инфекцией тяжелого течения методом кластерного анализа

Развитие противовирусного иммунного ответа зависит от большого числа параметров, что обуславливает трудности, связанные с выявлением структуры их взаимосвязей. Наличие множества исходных показателей, характеризующих процесс функционирования иммунной системы, заставляет отбирать из них наиболее существенные, ключевые, и изучать меньший набор показателей. Это можно осуществить путем разбиения множества исследуемых показателей на однородные группы (кластерный анализ) и дальнейшего изучения этих групп по отдельности.

Проведенный нами кластерный анализ содержания цитокинов в период обострения ВШ И позволил выделить три типа развития цитокинового ответа у данных больных. В результате были сформированы следующие три группы:

1 группа - 16 человек (17,0%), цитокиновый ответ с повышенной продукцией ИЛ-ip, ИЛ-2 и ИНФ-а;

2 группа - 22 человека (23,4%), цитокиновый ответ с повышенной продукцией ИЛ-ip и ИЛ-4;

3 группа - 56 человек (59,6%), цитокиновый ответ с повышенной продукцией только ИЛ-ip.

У пациентов 1-й группы выявлено достоверное повышение содержания в сыворотке ИЛ-1р в среднем до 312,0±6,8 пкг/мл, ИЛ-2 в среднем до 312,0±7,4 пкг/мл и стимулированной продукции лейкоцитами крови ИФН-а в среднем до 98,6±3,2 пкг/мл (р<0,05 по сравнению с показателями здоровых лиц) в период обострения ВПГИ. Отмечено снижение только стимулированной продукции ИФН-а до 35,2±3,8 пкг/мл в период ремиссии ВПГИ. Содержание ИЛ-4 и стимулированной продукции ИФН-у не претерпевало значительных изменений в период ремиссии. Уровень ИЛ-4 был сопоставим с показателем группы здоровых лиц - в среднем 48,1±3,4 и 56,0±4,5 пкг/мл в обострение и

ремиссию, соответственно. Содержание ИФН-у в сыворотке снижено по сравнению с данными для здоровых лиц и составило в среднем 103,8+6,4 и 98,2+5,2 пкг/мл, соответственно (рис. №3).

Рисунок №3

Цитокиновый ответ с повышенной продукцией ИЛ-1 [3, ИЛ-2 и ИНФ-а у больных с ВИД в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции

ИЛ-1 бета ИЛ-г ИФН-альфа

индуц

+ - различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

Во 2-й группе у пациентов достоверно было увеличено содержание в сыворотке ИЛ-1в среднем до 227,7+3,3 пкг/мл и ИЛ-4 в среднем до 132,1±6,8 пкг/мл по сравнению с данными группы здоровых лиц (р<0,05). В период ремиссии у данных больных отмечено увеличение сывороточного уровня ИЛ-1 р в среднем до 227,7+8,3 пкг/мл и тенденция к снижению ИЛ-4 до 72,7±5,6 пкг/мл (р<0,05 по сравнению с показателями здоровых лиц). Содержание в сыворотке ИЛ-2 у них не было повышено, как и продукция лейкоцитами крови ИФН-и и ИФН-у (рис. №4).

Рисунок Ла4

Цитокиновый ответ с повышенной продукцией ИЛ-113 и ИЛ-4 у больных с ВИД в период обострения и ремиссии ВИГ-инфекции

ИЛ-1 бета ИЛ-2 ИЛ-4

*- различия достоверны по сравнению с показателями группы здоровых лиц (р<0,05)

У пациентов 3-й группы не отмечено повышения содержания изучаемых цитокинов - ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а и ИФН-у как в обос1рение, так и ремиссию ВПГИ. При этом только содержание ИЛ-1 р было повышено до 130,9+8,6 пкг/мл в период обострения и увеличивалось до 211,4±10,2 пкг/мл в период ремиссии (р<0,05 по сравнению с данными для здоровых лиц, рис. №5).

Рисунок №5

Цитокиновый ответ с повышенной продукцией ИЛ-1р у больных с ВИД в период обострения и ремиссии ВПГ-инфекции

250,0 -I

ИЛ-1 бета ИЛ-2 ИЛ-4

* - различия достоверны по сравнению с показателями 1руппы здоровых лиц (р<0,05)

Таким образом, у всех обследованных больных рецидивирующая ВПГИ тяжелого течения сопровождается повышенной продукцией провоспалигельного цитокина ИЛ-1]3 в период обострения и ремиссии, что может быть обусловлено репликацией других вирусов герпес-группы. У пациентов 1 -й группы отмечено повышение продукции ИЛ-2 и ИФН-а, одной из функций которых является активация ЕК и цитотоксических лимфоцитов. Усиление выработки этих цитокинов может способствовать более эффективному процессу подавления репродукции вирусов герпеса. Во 2 группе наблюдался цитокиновый ответ с преимущественной активацией ТЬ-2-лимфоцитов (ИЛ-4), т.е. менее эффективный противовирусный ответ. Для пациентов 3 группы характерно отсутствие ответа в отношении всех изучаемых цитокинов (кроме ИЛ-1р).

Нами был проведен сравнительный анализ клинической характеристики течения В ПГ-инфекции и цитокинов о го ответа у данных пациентов. Обнаружено, что отсутствие повышения в сыворотке всех изучаемых цитокинов (кроме ИЛ-1(3) в период обострения характерно для пациентов с более продолжительным периодом тяжелого течения ВПГ-инфекции (в среднем 4,5 года), более высокой частотой рецидивов (в среднем 12,6 раз в год) и большей продолжительностью периода обострения (в среднем 8,6 дней). Ответ с преобладанием продукции ИЛ-4 характерен для пациентов с меньшей продолжительностью периода тяжелого течения ВПГ-инфекции (в среднем 3,9

лет), но с такой же высокой частотой обострений и клинической продолжительностью рецидивов (таб. №8).

Таблица №8

Сравнительная характеристика течения ВПГ-инфекции у пациентов с различным типом цитокинового ответа __

Группы пациентов Продолжительность тяжелого течения ВПГИ (лет) Частота обострений (в год) Средняя продолжительность обострений (дни)

Группа 1 (п=16) 3,26±0,18* 9,35±0,25* 6,53±0,31*

Группа 2 (п=22) 3,89±0,21 12,07±0,21 8,50±0,32

Группа 3 (п=56) 4,47±0,31 12,58±0,39 8,61±0,29

* - различия достоверны между группами (р<0,05)

Преимущественная продукция ИЛ-2 и ИНФ-а (группа 1) отмечалась у пациентов с достоверно меньшим периодом тяжелого течения ВПГИ (в среднем 3,3 года), меньшей частотой рецидивов (в среднем 9,4 раза в год) и меньшей продолжительностью обострений (в среднем 6,5 дней). Тем не менее, у пациентов этой группы имелись признаки ВИД и тяжелое течение ВПГИ, что возможно связано с недостаточностью выработки одного из основных иммунорегуляторных цитокинов - ИФН-у, а также с вышеописанной гипореактивностью клеток-мишеней и наличием микст-вирусной инфекции.

Проведенный нами анализ показал, что особенности цитокинового ответа у данных больных характеризуются изменением продукции ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а, ИФН-у, на основании которых можно оценить направленность иммунного ответа и провести выбор иммунокорригирующей терапии.

Исследование местной продукции цитокинов (ИЛ-4 и ФНО-а) у пациентов с ВИД и микст-герпесвирусной инфекцией

В настоящее время показано, что секрет ротовой полости может являться альтернативным субстратом для определения маркеров системного иммунного ответа (М.А. Абаджиди и др., 2002). Для изучения местной продукции цитокинов было выбрано 29 пациентов (7 мужчин, 22 женщины) с ВПГ-инфекцией и наличием активной герпесвирусной инфекции при ПЦР-исследовании материала из ротоглотки (слюна, соскоб из зева). У всех, пациентов обнаружена активная репликация одновременно 3-х вирусов -простого герпеса (ВПГ1,2), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ6). Уровень цитокинов изучался в период активной репликации вирусов и в период ремиссии, соответствующий отсутствию репликации выявленных вирусов или значительному снижению вирусной нагрузки, оцениваемой методом ПЦР.

Не было выявлено корреляции между содержанием ИЛ-4 и ФНО-а в секрете ротовой полости и сыворотке. Установлено значительное превышение уровня ФНО-а в слюне в фазе обострения по сравнению с сывороточным у 19 пациентов (65,5%), в период ремиссии у 12 пациентов (41,3%). Соотношение

уровня в секрете ротовой полости к сывороточному для ФИО-а в период обострения герпесвирусной инфекции составило 11,3, в период ремиссии - 6,2.

Период ремиссии сопровождался снижением уровня ФНО-а во всех материалах. Динамика в снижении продукции была более выражена при оценке цитокинов в слюне по сравнению с сывороткой крови. Соотношение содержания ФНО-а в секрете ротовой полости в период обострения и ремиссии составило 2,6, изменение в сывороточном уровне - 1,5 раза (рис. №6).

Рисунок №6

Содержание ФНО-а в секрете ротовой полости и сыворотке у пациентов с ВИД в фазу обострения и ремиссии герпес-вирус ной инфекции

4,0 и

3,5 -

з,о -

с 2.5 -| 2,0 -* 1,6 ■ 1,0

0,5 0,0

сыворотка

секрет ротовой полости

■ обострение □ ремиссия

* - различия достоверны по сравнению с периодом обострения (р<0,05) Для ИЛ-4 также отмечено более высокое содержание в секрете ротовой полости в течение всего периода наблюдения больных (соотношение с ал и вар но го к сывороточному уровню — 3,4 в фазу обострения. 1,6 - в фазу ремиссии). Доминирование содержания в слюне в фазу обострения для ИЛ-4 отмечено у 23 пациентов (79,3%), в фазу ремиссии - у 15 пациентов (51,7%). Снижение саливарного уровня ИЛ-4 в период ремиссии составило 1,7 раза, а сывороточный уровень практически не менялся и был ниже показателей группы здоровых лиц.

Рисунок №7

Содержание ИЛ-4 в секрете ротовой полости и сыворотке у пациентов с ВИД в фазу обострения и ремиссии герпес-вирус ной инфекции

140,0 120,0 -100,0 ■ 80,0 ■ 60,0 ■ 46,0 -20,0 ■ 0.0

■ обострение □ ремиссия

сыворотка

секрет ротовой погости

* .

различия достоверны по сравнению с периодом обострения (р<0,05)

Таким образом, уровень изучаемых цитокинов (ФНО-а и ИЛ-4) в секрете ротовой полости превышает сывороточный как в период обострения, так и ремиссии хронической микст-герпесвирусной инфекцией, что может являться информативным показателем контроля за течением заболевания.

ВЫВОДЫ

1. У 96,0% больных с вторичным иммунодефицитом на фоне тяжелого течения ВПГ-инфекции обнаружена активная репликация лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) как в период рецидива, так и в период ремиссии герпетической инфекции.

2. У больных с вторичным иммунодефицитом на фоне тяжелого течения ВПГ-инфекции выявлены три варианта цитокинового ответа: повышенная продукция ИЛ-1Р в 59,6% случаев; повышенная продукция ИЛ-1р и ИЛ-4 в 23,4%; повышенная продукция ИЛ-1Р, ИЛ-2 и ИНФ-а в 17,0%, что отражает дисфункцию системы цитокинов. Указанные изменения отмечены не только в период рецидива, но и в период ремиссии ВПГ-инфекции и связаны с репликацией лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ).

3. Отсутствие повышения в сыворотке основных изучаемых цитокинов (ИЛ-2, ИФН-а, ИФН-у) в период обострения характерно для пациентов с более тяжелым клиническим течением ВПГ-инфекции.

4. Обнаружено, что у всех больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением ВПГ-инфекции нарушена продукция ИФН-а и ИФН-у в ответ на стимулы как в период обострения, так и ремиссии заболевания.

5. Выявлена гипореактивность или неотвечаемость клеток-мишеней на продукцию тех или иных цитокинов у больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением ВПГ-инфекции. Так, при недостаточности цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров отмечено отсутствие ожидаемого ответа этих клеток на продукцию ИЛ-2, при гуморальной недостаточности у обследуемых пациентов отсутствует ответ В- и ТЬ2-лимфоцитов на выработку ИЛ-4.

6. У больных с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции уровень цитокинов ФНО-а и ИЛ-4 в секрете ротовой полости превышал сывороточный (в 11,3 и 6,2 раз для ФНО-а, и в 3,4 и 1,6 раз для ИЛ-4) как в период обострения, так ремиссии хронической микст-герпесвирусной инфекцией.

Практические рекомендации

1. Всем пациентам с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции рекомендовано обследование на наличие репликации других вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) в различных материалах как в период обострения, так и ремиссии ВПГ-инфекции для адекватного подбора противовирусной терапии.

2. Определение уровней ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а и ИФН-у в период обострения и ремиссии инфекции может быть рекомендовано для оценки направленности цитокинового ответа и контроля эффективности проводимой терапии у пациентов с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции.

3. При выборе иммунокорригирующей терапии необходимо ориентироваться на вариант цитокинового ответа и иммунной недостаточности у пациента с ВИД и тяжелой ВПГ-инфекцией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Герпес-вирусная инфекция: клиническое значение и принципы терапии// Дидковский Н.А., Зуйков И.А., Малашенкова И.К., Танасова А.Н., Щепеткова И.Н./РМЖ. -2004. -вып. 7. с. 459-465.

2. Состояние интерферонового статуса у пациентов с хронической герпесвирусной инфекцией разной степени тяжести. Зуйков И.А., Танасова А.Н., Малашенкова И.К., Дидковский Н.А.// Материалы II международной научной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» Ереван 2005г., с. 215

3. Особенности этиопатогенеза хронической герпесвирусной инфекции тяжелого течения. Зуйков И.А., Танасова А.Н., Малашенкова И.К. // Материалы II международной научной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине» Ереван 2005г, с. 186

4. Уровень провоспалительных цитокинов у больных с тяжелым течением герпетической инфекции// И.А. Зуйков, А.Н.Танасова, М.А.Жарова, Н.М. Хитрик, Н.А.Дидковский/У1 съезд аллергологов и иммунологов СНГ, Аллергология и иммунология. 2006.- том 7. -№3. - с.39б.

5. Актуальные вопросы тяжелой герпетической инфекции у взрослых // Н. А. Дидковский, И. К. Малашенкова, Ж. Ш. Сарсания, А. Н. Танасова, И. Н. Зуйкова, И. А. Зуйков, Н. М. Хитрик/ Лечащий Врач. - 2006, №2, с.4-11.

6. Влияние интерферона-альфа и его индуктора на функциональную активность нейтрофилов при тяжелой герпетической инфекции//Н.М. Хитрик, И.К. Малашенкова, А.Н.Танасова, И.А. Зуйков, Н.А.Дидковский, В.А. Малиновская/ VI съезд аллергологов и иммунологов СНГ, Аллергология и иммунология. 2006,- том 7. -№3. -с.397.

7. Интерферонотерапия хронической герпетической инфекции тяжелого течения// А.Н.Танасова, НА.Дидковский, И.К. Малашенкова, И.А. Зуйков, Н.М. Хитрик, В.А. Малиновская/ VI съезд аллергологов и иммунологов СНГ, Аллергология и иммунология. 2006,- том 7. -№3. -с.396.

8. Некоторые аспекты местного цитокинового ответа у больных с рецидивирующей микст-герпесвирусной инфекцией// И.К. Малашенкова, А.Н. Танасова, И.А. Зуйков, Н.А. Дидковский/ Материалы VIII конгресса РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - Москва. - 2007.

9. Патогенетические аспекты герпетической инфекции тяжелого течения// Н. А. Дидковский, И. К. Малашенкова, А. Н. Танасова, И. А. Зуйков, И. Н. Зуйкова, Н. М. Хитрик, Ж. Ш. Сарсания/ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины/ 2007, П.№2, с. 76-81.

Список сокращений

ВБН - вирус болезни Ньюкасла

ВИД - вторичный иммунодефицит

ВПГ1,2 - вирус простого герпеса 1,2 типа

ВШ И - инфекция, вызванная вирусом простого герпеса

ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр

ИЛ - интерлейкин

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

НЦТЛ - недостаточность цитотоксических лимфоцитов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Т-к Н - Т -клеточная недостаточность

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЦМВ - цитомегаловирус

ФГА - фитогемагглютинин

СБ4+ - Т-хелперы

СБ5+ - Т-лимфоциты

С08+ - (ЦТЛ) - цитотоксические лимфоциты СБ 16+ - (ЕК) - натуральные киллерные клетки СБ 19+ - В-лимфоцнты

НЬА-ВЯ+ - антиген главного комплекса гистосовместимости класса II 1§А, IgM - иммуноглобулины А, М, О

Подписано в печатьi2 ■ 0 4■ 0 ? ' г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 2i ? Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Являясь одной из наиболее распространенных в мире, герпетическая инфекция обусловлена высокой восприимчивостью человека к вирусам герпеса. Контакт с инфекцией происходит у большинства людей, что подтверждается обнаружением антител к ВПГ у 90% взрослого населения. Повышенное внимание со стороны врачей к этому заболеванию связано с увеличением числа больных герпетической инфекцией с часто рецидивирующими формами - с поражением кожи лица, слизистых оболочек полости рта, глаз, гениталий. Кроме того, вирусы герпеса представляют серьезную угрозу для репродуктивного здоровья населения, вызывая неонатальный герпес, самопроизвольные выкидыши, мертворождение, формирование пороков развития плода, менингоэнцефалит.(Брязжикова Т.С. 1996)

Вирусы герпеса могут активировать геном вируса иммунодефицита человека, находящийся в стадии провируса, и являются кофактором распространения и прогрессирования ВИЧ-инфекции и СПИДа. Вирус простого герпеса 2-го типа (ВПГ-2) также способен увеличивать восприимчивость к заражению гепатитом С половым путем. Участие ВПГ в развитии иммунодефицитных состояний и ассоциированных с ними нередко тяжелых заболеваний позволяет считать герпесвирусные инфекции важной медико-социальной проблемой практического здравоохранения как в развивающихся, так и в развитых странах.(Бажан С.И., БеловаО.Е. 1998)

Основными факторами распространения ВПГ-инфекции являются бессимптомное выделение вируса и неадекватная диагностика заболевания. В настоящее время генитальная форма ВПГ-инфекции считается наиболее распространенным заболеванием, передаваемым половым путем. Частые обострения генитального герпеса, низкая эффективность многих методов лечения, приводят к значительному ухудшению физического и психического состояний пациентов, выраженному снижению качества их жизни. .(Брязжикова Т.С. 1996)

В последние годы по данным экспериментальных исследований, при вторичных иммунодефицитных состояниях (ВИД) нередко находят герпес-вирусные инфекции. Исследования показали, что герпес-вирусы обладают мощным набором иммуносупрессивных белков, что усугубляет и поддерживает это патологическое состояние иммунной системы. (Прокопенко В.Д. 1997)

Рецидивирующие герпесвирусные инфекции наблюдаются у 20-25% жителей разных стран. Проявления этой патологии различны: от так называемой "лихорадки" на губах и афтозного стоматита до генерализованных форм с поражением внутренних органов. Надо отметить, что герпес-вирусы обладают высокой онкогенностью. Кроме того, они способствуют развитию аутоиммунной патологии (Скрипкин Ю.К.и др. 2001) Предупреждение заболеваний, вызванных герпес-вирусами, а также достижение длительной ремиссии невозможно без восстановления нарушенного противовирусного иммунитета. Лечебные воздействия на иммунный статус при ВИД с хронической герпетической инфекцией находятся в стадии изучения и разработки. (Прокопенко В.Д. 1997)

Клетки иммунной системы осуществляют все свои функции с помощью цитокинов, которые являются медиаторами межклеточных взаимодействий, образно говоря, языком клеток организма человека. С помощью системы цитокинов происходит активация определенных популяций клеток иммунной системы, их пролиферация и дифференцировка, выполнение необходимых функций, осуществляется как включение, так и выключение иммунного ответа.(Ковальчук Л.В.и др. 2001)

Способность к продукции ИЛ является важной характеристикой функционального состояния клеток иммунной системы. Состояние системы цитокинов и роль нарушений в их продукции при ВИД с хронической герпетической инфекцией практически не изучены. Исследование уровня продукции основных цитокинов, обладающих провоспалительной активностью и участвующих в противовирусной защите является необходимым для понимания механизмов ВИД при хронических ГВИ. (Ковальчук Л.В.и др. 2001; Прокопенко В.Д. 1997)

Патогенез развития тяжелого течения герпетической инфекции, вызванной вирусом простого герпеса у лиц не страдающих СПИД и не получающих постоянную иммуносупрессивную терапию, не страдающих онкологическими и другими заболеваниями, вызывающими тяжелый иммунодефицит, не вполне ясен. С учетом экспериментальных данных о взаимодействии разных лимфотропных вирусов герпес-группы и их пантропизма (возможность поражать клетки разных органов и систем) нам представлялось актуальным изучение распространенности вируса простого герпеса в организме больных с тяжелой формой болезни (системность поражения), а также наличие активации других вирусов герпес-группы, для оценки возможного вклада этих факторов в патогенез заболевания для разработки патогенетически обоснованных схем комплексного лечения этой категории «трудных» больных.

Цель работы: Изучить состояние системы цитокинов (ИЛ-1|3, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а и ИФН-а, ИФН-у), а также наличие и распространенность активной репликации вируса простого герпеса и других вирусов герпес-группы у больных с вторичным иммунодефицитом и герпетической инфекцией тяжелого течения для разработки новых патогенетических подходов к терапии заболевания. Задачи работы:

1. Исследовать у больных с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса, наличие активной репликации ВПГ и других вирусов герпес-группы методом ПЦР в различных материалах в фазу обострения и ремиссии.

2. Оценить уровень цитокинов ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-4, ФНО-а и интерферона а и у в сыворотке крови больных с вторичным иммунодефицитом в фазу обострения и ремиссии инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

3. Изучить продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови под влиянием индукторов синтеза цитокинов у пациентов с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

4. Изучить местную продукцию цитокинов (ИЛ-4, ФНО-а) в секрете ротовой полости у пациентов с вторичным иммунодефицитом в период обострения и ремиссии герпес-вирусной инфекции при выявлении вирусов в орофарингеальной области.

5. Провести сравнительный анализ между уровнем изучаемых цитокинов и показателями иммунного статуса у пациентов с вторичным иммунодефицитом, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса.

Научная новизна. Впервые показано наличие микст-герпесвирусной инфекции у больных с вторичным иммунодефицитом (ВИД), ассоциированным с тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (ВПГ). Впервые обнаружено сохранение активной репликации лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) в период клинической ремиссии инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.

Обнаружено, что у всех больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, нарушено функционирование системы цитокинов как в период обострения, так и ремиссии заболевания. Определены основные различия в формировании цитокинового ответа и его нарушений у больных с различными вариантами вторичного иммунодефицита: Т-клеточной недостаточности, недостаточности цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров, гуморальной недостаточности. Впервые показано наличие выраженной гипореактивности иммунной системы у больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса в виде отсутствия ответа клеток-мишеней на вырабатываемые цитокины.

Впервые у пациентов с ВИД, ассоциированным с инфекцией тяжелого течения, вызванной вирусом простого герпеса, методом кластерного анализа выделено 3 варианта цитокинового ответа. Обнаружена взаимосвязь между вариантами продукции цитокинов и тяжестью клинического течения инфекции, вызванной вирусом простого герпеса.

Впервые изучен местный цитокиновый ответ (ИЛ-4 и ФНО-а) у больных как в период активной репликации, так и в период ремиссии герпес-вирусной инфекции в орофарингеальной области. Показано, что уровень цитокинов в слюне является более информативным показателем течения заболевания, значительно превышая сывороточные показатели в период обострения и более значимо снижаясь в период ремиссии герпес-вирусной инфекции.

Практическая значимость. Выявление других вирусов герпес-группы в различных клинических материалах, а также вирусов простого герпеса в лимфоцитах крови и орофарингеальной области (т.е. вне локализации высыпаний) у больных с ВИД и тяжелой инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, показывает необходимость более полного обследования этих больных в период рецидива и ремиссии заболевания. Эти данные должны учитываться при проведении противовирусной терапии у таких пациентов.

Результаты проведенного анализа позволили установить варианты нарушений согласованной работы цитокиновой сети и выраженную гипореактивность иммунной системы при вторичном иммунодефиците, ассоциированном с тяжелым течением инфекции, вызванной вирусом простого герпеса. Определение варианта цитокиновой и иммунной дисфункции у отдельного больного дает возможность осуществить подбор адекватной противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

Исследование цитокинового ответа позволило выделить ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а и ИФН-у как основные противовирусные и иммунорегуляторные цитокины, которые могут быть использованы для контроля за течением заболевания и эффективностью проводимого лечения.

В процессе работы была показана возможность и информативность использования секрета ротовой полости в качестве материала для определения уровня местного цитокинового ответа и контроля за течением герпес-вирусной инфекции. Существенным для практического применения является неинвазивность метода забора этого клинического материала.

выводы

1. У 96,0% больных с вторичным иммунодефицитом на фоне тяжелого течения ВПГ-инфекции обнаружена активная репликация лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) как в период рецидива, так и в период ремиссии герпетической инфекции.

2. У больных с вторичным иммунодефицитом на фоне тяжелого течения ВПГ-инфекции выявлены три варианта цитокинового ответа: повышенная продукция ИЛ-1|3 в 59,6% случаев; повышенная продукция ИЛ-10 и ИЛ-4 в 23,4%; повышенная продукция ИЛ-10, ИЛ-2 и ИНФ-а в 17,0%, что отражает дисфункцию системы цитокинов. Указанные изменения отмечены не только в период рецидива, но и в период ремиссии ВПГ-инфекции и связаны с репликацией лимфотропных вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ).

3. Отсутствие повышения в сыворотке основных изучаемых цитокинов (ИЛ-2, ИФН-а, ИФН-у) в период обострения характерно для пациентов с более тяжелым клиническим течением ВПГ-инфекции.

4. Обнаружено, что у всех больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением ВПГ-инфекции нарушена продукция ИФН-а и ИФН-у в ответ на стимулы как в период обострения, так и ремиссии заболевания.

5. Выявлена гипореактивность или неотвечаемость клеток-мишеней на продукцию тех или иных цитокинов у больных с вторичным иммунодефицитом и тяжелым течением ВПГ-инфекции. Так, при недостаточности цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров отмечено отсутствие ожидаемого ответа этих клеток на продукцию ИЛ-2, при гуморальной недостаточности у обследуемых пациентов отсутствует ответ В- и ТЬ2-лимфоцитов на выработку ИЛ-4.

6. У больных с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции уровень цитокинов ФНО-а и ИЛ-4 в секрете ротовой полости превышал сывороточный (в 11,3 и 6,2 раз для ФНО-а, и в 3,4 и 1,6 раз для ИЛ-4) как в период обострения, так ремиссии хронической микст-герпесвирусной инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем пациентам с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции рекомендовано обследование на наличие репликации других вирусов герпес-группы (ВЭБ, ВГЧ6, ЦМВ) в различных материалах как в период обострения, так и ремиссии ВПГ-инфекции для адекватного подбора противовирусной терапии.

2. Определение уровней ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-а и ИФН-у в период обострения и ремиссии инфекции может быть рекомендовано для оценки направленности цитокинового ответа и контроля эффективности проводимой терапии у пациентов с ВИД и тяжелым течением ВПГ-инфекции.

3. При выборе иммунокорригирующей терапии необходимо ориентироваться на вариант цитокинового ответа и иммунной недостаточности у пациента с ВИД и тяжелой ВПГ-инфекцией.

Выражаю глубокую признательность за предоставленную возможность для написания работы и помощь при оформлении диссертации доктору медицинских наук, профессору Дидковскому Николаю Антоновичу.

Искренняя благодарность и признательность за постоянные ценные консультации и помощь в анализе полученных результатов ведущему научному сотруднику лаборатории клинической иммунологии, кандидату медицинских наук Малашенковой Ирине Константиновне.

Благодарю за активную помощь и содействие в проведении исследования сотрудников лаборатории Сарсанию Ж.Ш., Жарову М.А., Федоткину О.В., Никишину О.П., Платонову Н.С., Горячеву Н.С.