Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитокин-зависимая предстимуляция фагоцитов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР 2-й МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕЩИЦИНСКИИ ИНСТИТУТ им. Н.И.ПИРОГОВА

На правах рукописи

УДК 612.01715/576.357.04 616-092.19+612.1123

Апциаури Нато Эгоновна

ЦИТОКИН-ЗАВИСИМАЯ ПРЕ ДСТИМУЛЯЦИЯ ФАГОЦИТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА -1991

Работа выполнена на кафедре иммунологии 2-го Московскш ордена Ленина Государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова.

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессог

Л. В. КОВАЛЬЧУК

Научный консультант - кандидат химических наук, доцент

Г. И. КЛЕБАНОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И. М. ДОЗМОРОВ, доктор медицинских наук С. С. ВАСИЛЕЙСКШ Ведущее учреждение - Институт Иммунологии МЗ СССР

Защита диссертации состоится"__"_______

1991 года на заседании специализированного совета К. 084.14. 06 при 2-м Московском ордена Ленина Государственном медицинском институте им. Н. И. Пирогова (117869, г.Москва, ух Островитянова 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан" ________1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т. Е. КУЗНЕЦОВА

..тг: rii!y |

I ВВЕДЕНИЕ.

'"V""3! Актуальность проблемы.

ifaiW!, |

Исследования последних лет убедительно показывают, что фагоцитарные клетки играют важную роль в иммунном ответе (Allison,1984; Finkel,1987).В связи с этим, одной из главных задач иммунокоррекции является изыскание и испытание биологически активных веществ, избирательно действующих на фагоциты.

Изучение механизмов функционирования различных звеньев иммунной системы с использованием медиаторов иммунитета привлекает особое внимание в связи с их большой патогенетической ролью при многих заболеваниях. Прежде всего это касается изучения функционирования и активации различных клеток фагоцитарного звена иммунитета, которые определяют начальные ключевые механизмы развития адекватного иммунного ответа и их активность определяет взаимодействие с лимфоцитами как в кле-точноопосредованном, так и в гуморальном иммунном ответе.

К настоящему времени не подлежит сомнению ведущая роль фагоцитарных клеток в осуществлении противопаразитарной, бактерицидной, противоопухолевой защитах opraHH3Ma(Mutson, 1989). Лимфокины, влияющие на фагоцитарное звено иммунитета имеют большое значение в реализации вышеперечисленных эффекторных функций иммунной системы. Принципиально важно, что для выполнения эффекторных функций фагоциту необходимо перейти в активированное состояние. Поэтому исследование механизмов активации фагоцитов необходимо для выбора путей к управлению функционированием иммунокомпетенгных клеток.

В последние годы отводится большое внимание новому феномену предстимуляции (priming - effect) фагоцитов, активно обсуждаемому в литературе (Adams,Uhing,1989). Эффект предстимуляции заключается в том, что предварительная обработка фагоцитов низкими дозами стимулятора, не вызывающего прямой активации клеток (примирующий агент), приводит к усилению ответа на второй стимул (тригерный) (Limb,1988). Важно, что при-мирование фагоцитов различными активаторами (в том числе и эндогенного происхождения ), является одним важных этапов многоступенчатого процесса клеточной активации.

В последние годы на кафедре иммунологии 2-го МОЛГМИ им. Е И. Пирогова получен , охарактеризован и нашел применение как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях

комплекс естественных цитокинов (М- и Л-фракции), высоко ак тивный в отношении различных клеток иммунной системы, в то числе и фагоцитов (Ковальчук 1 В. , Ганковская Л. В. , др. ,1987).

Известно, что такие цитокины как интерфероны, колониести мулирующие факторы, некоторые интерлейкины действуют на мно гие процессы активации фагоцитов, но не прямо, а примирую клетки, переводя их в иное функциональное состояние.

Изучению регуляции процессов активации фагоцитов различ ными препаратами посвящены многочисленные исследования, те1 не менее многие аспекты цитокин-опосредованной регуляции таких функций фагоцитов, как продукция активных форм кислород; (АФК) и противопаразитарная активность остаются нераскрытым! (Ве11ау1Ье,1988; А1-МоПеЬ,1989).

Известны генетические дефекты функционирования фагоцитарного звена иммунитета (Мороз и др. ,1987). Поэтому необходимс проводить поиск возможностей регуляции фагоцитарной системы с учетом иммуногенетических особенностей.

Вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы, связанной с изучением цитокин-опосредованной регуляции функционирования и активации фагоцитов в норме и при ряде патологий.

Цель и задачи работы.

Целью данного исследования послужило изучение механизмов действия естественных иммуноцитокинов на процессы активации фагоцитарных клеток и их противопаразитарную активность.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние комплекса естественных эндогенных цитокинов и рекомбинантных иммунопептидов - интерферона^, и фактора некроза опухоли -Ф на "кислородный взрыв" макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.

2.Сравнить механизмы регулирующего действия комплекса цитокинов на уровень "кислородного взрыва" макрофагов и нейт-рофилов.

3. Оценить влияние комплекса эндогенных цитокинов на противопаразитарную активность и уровень продукции активных форм кислорода макрофагами при их заражении внутриклеточным облигатным паразитом - Ье1зЬ1пата <1опоуаги .

4. Изучить генетические аспекты отвечаемости макрофагов

на стимуляцию цитокинами при заражении Leishmariia donovani и Mlcobacterla tuberculosis, используя оппозитно-реагирующие линии мышей.

Научная новизна работы.

Впервые проведена оценка влияния Фракции естественных цитокинов с молекулярной массой 15-30 kD (М-фракция) из культур стимулированных монинукдеарных клеток периферической крови свиньи на уровень "кислородного взрыва" макрофагов и нейт-рофилов и на основе этого разработан быстрый и доступный метод оценки биологической активности иммуномодулирующих препаратов на модели хеми.пюминесценции фагоцитов.

Обнаружено, что одним из проявлений влияния комплекса цитокинов на продукцию фагоцитами кислородных радикалов является способность примировать клетки; при этом комплекс цитокинов сам по себе не оказывает прямого стимулирующего действия на хемилюминесценции фагоцитов.

Выявлены принципиальные различия в механизме предстиму-ляции цитокинами двух типов фагоцитов - МФ и ПМЛ и охарактеризованы два типа эффекта предстимуляции - кратковременный (для ПМЛ) и длительный (для МФ).

Сравнительный анализ предстимуляции макрофагов комплексом цитокинов и рекомбинантными иммунопептидами показал, что примирующая активность иммуноцитокинов изменяется в ряду: ЖШ-Jy комплекс цитокинов > ФНО-с^.

Выявлены изменения в продукции АФК макрофагами при внутриклеточных инфекциях - L. donovani и М. tuberculosis. Обнаружено постепенное угнетение продукции АФК клетками в динамике заражения по сравнению с контролем, что свидетельствует об ингибиции кислородзависимых механизмов защиты МФ от инфекционного агента. При этом отмечено, что исходные межлинейные различия в способности клеток генерировать АФК в ответ на стимуляцию во многом предопределяют изменения уровня "кислородного взрыва", вызванные возбудителем.

Показаны различия в генетически-опосредованном иммуномо-дулирующем влиянии комплекса цитокинов на функциональную активность инфицированных МФ на модели оппозитно реагирующих линий мышей. Проведен сравнительный анализ иммуномодулирующе-го влияния цитокинов при инфицировании L. donovani и М. tuberculosis. Установлено нарушение способности инфициро-

- 4 -

ванных МФ к предстимуляции комплексом цитокинов.

Впервые охарактеризовано влияние изучаемого комплекса цитокинов на фагоцитоз и его завершенность внутриклеточного облигатного паразита - L. donovani. Предобработка МФ комплексом цитокинов или ИНФ^- усиливает эффект внутриклеточного киллинга и генерацию АФК у мышей, чувствительных к паразиту.

Практическая значимость.

Разработанный подход к оценке биологической активности иммуномодуляторов в комплексе естественных цитокинов (М- и JI-фракции) отличается экономичностью и относительной простотой, что делает возможным его широкое применение в экспериментальной работе.

Данные о способности цитокинов предстимулировать "кислородный взрыв" фагоцитов, а такде анализ биологического значения двух типов примирования уточняют представления о путях регуляции функций фагоцитарного звена иммунитета, что в свою очередь создаёт предпосылки для разработки новых методов им-мунокоррекции.

Выявленная генетически-детерминированная разница в отве-чаемости инфицированных фагоцитов на стимуляцию иммуноцитоки-нами дает возможность пересмотреть имеющиеся ныне схемы лечебного применения иммуномодуляторов, учитывая исходный функциональный уровень фагоцитарного звена иммунитета.

Сравнительный анализ активности комплекса цитокинов и ряда рекомбинантных иммунопептидов позволяет оценить преимущества и недостатки того или иного иммуномодулятора в моделях in vitro и in vivo.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ.

Разработанный подход к оценке способности макрофагов, инфицированных L. donovani, продуцировать активные формы кислорода внедрен для совершенствования научных исследований в лаборатории клинической иммунологии Института тропической медицины и медицинской паразитологии им. Е И. Марциновского.

Метод оценки биологической активности иммуноцитокинов на модели хемшгоминесценции фагоцитов внедрен на кафедре биофизики МВФ 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

- 5 -

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ.,

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях кафедры иммунологии },{БФ и отдела иммунологии МЖ 2-го МОЛГМИ им. Е И. Пирогова (Москва, 1988-1991), на коференции молодых ученых "Иммунный гомеостаз в норме и патологии" (Фрунзе,1989), на конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологически активных веществ" (Рига.1989), на Всесоюзной конференции с международным участием "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологических состояниях" (Новосибирск,1990), на Мэждународ-ном симпозиуме "Проблемы иммунофармакологии" (Тбилиси,1991), на I Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (Москва, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописи и состоит из введения, четырех глав: "Обзор литературы", "Объекты и методы исследования", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов" и воводов. Список использованной литературы содержит 195 ссылок, из них £5 - отечественных и 170 - иностранных авторов. Диссертация содержит б таблиц и 22 рисунка.

ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследования проводили с полиморфноядерными лейкоцитами (ПМЛ) периферической крови человека и свиньи, а также с клетками (макрофагами) перитонеального эксудата мышей.

В работе использовали чистолинейных мышей равных линий -СВА, С57ВЬ/6, ВАЬВ/с, 1/31.

Гранулоциты периферической крови человека и свиньи получали по общепринятой методике (Воушл, 1968) из гепаринизиро-ванной крови после седиментации на градиенте плотности фи-колл-верографина. После гипертонического лизиса эритроцитов клетки культивировали в среде 199, содержащей 100 ед/мл пени-

циллина и 100 мкг/мл стрептомицина, или в растворе Хенкса без фенолового красного (pH 7.4), содержащего 20 мМ Hepes буфера (Serva, ФРГ).

Клетки перитонеального эксудата (макрофаги) получали по общепринятой методике (Stuart, 1978) двумя путями. После внут-рибрюшинного введения 2Z р-ра пептона за трое суток до эксперимента получали пептон-етимулированные макрофаги. Резидентные марофаги получали без предварительной стимуляции мышей пептоном. В брюшную полость вводили 8-10 мл среды 199 или бесцветного р-ра Хенкса с гепарином (5 ед/мл ). Перитонеаль-ный эксудат собирали в охлавденные силиконизированные пробирки. После отмывки клеток суспензию делили на две части в зависимости от целей эксперимента - часть клеток помешали в пробирки с покровными стеклами и оставляли при ЗТ^С на 1 час для прилипания макрофагов. Неприлипшие клетки удаляли сменой среды, а затем инфицировали облигатным внутриклеточным паразитом L. donovaiii. Другую часть клеток помещали в силиконизи-рованную посуду и использовали для оценки люминолзависимой хемилюминесценции .

Фагоциты обрабатывали комплексом цитокинов и другими стимуляторами в течение разных промежутков времени.

Комплекс цитокинов получали из культур ФГА-стимулирован-ных мононуклеаров периферической крови свиньи, которые в течение 3-х часов обрабатывали ФГА в дозе 8-10 мкг/мл. Затем митоген удаляли и клетки культивировали в безсывороточной среде 199 в течение 20-24 часов. Надоеадочную жидкость концентрировали на мембранных фильтрах "Amicon", РМ-10, после чего проводили гель-хроматографию сконцентрированной надоса-дочной жидкости на сефадексе G-100 в колонке типа "Whatman" (1,00x100 см). Фракционирование и биохимическую очистку комплекса цитокинов проводила аспирантка кафедры иммунологии Ка-расева М. В. В экспериментах использовали фракцию с молекулярным весом 15-30 кД.

Для сравнения использовали рекомбинантные иммунопептиды - mil-J* (Gamaferoa, Pharmach i m, Bul gar i а) и ФНО-oO (интитут Биоорганической химии им. И. Е Шемякина).

Способность фагоцитов продуцировать активные формы кислорода, исследовали в методе люминолзависимой хемилюминесценции.

Регистрацию ЛХЛ фагоцитов проводили на хемилюминометре LKB-1251 (Швеция) при 37°С. При измерении ЛХЛ кювета хемилю-

минометра содержала люминол (Serva, ФРГ) - 5x10"^М в бездетном растворе Хенкса и клетки - 10е/мл. В качестве стимуляторов ХЛ-ответа использовали частицы полистиролового латекса (Serva,ФРГ) - 20 мкл (80 частиц на клетку) или опсонизирован-ный зимозан (Signa) - 50 мкл (0,2 мг/мл). Стимулятор добавляли к клеткам через 3 мин после начала регистрации спонтанной ЛХЛ.

Для изучения влияния цитокинов на "кислородный взрыв" фагоцитов, цитокины добавляли в дозе 20 мкг/мл либо непосредственно в кювету хемилюминометра, либо клетки прединку-бировали с цитокинами (примирующий агент) в течение различных промежутков времени, а затем оценивали ЛХЛ-ответ клеток на стимуляцию латексом или опсонизированным зимозаном.

В ряде эксперименотв по изучению влияния комплекса цитокинов на "кислородный взрыв" фагоцитов использовали ингибитор синтеза белка - циклогексимид который добавляли к культивируемым в присутствии цитокинов клеткам в количестве 30 мкМ на 3 часа, затем его удаляли из культуры путем смены среды, а клетки продолжали культивировать только в присутствии комплекса цитокинов.

Регистрацию ЛХЛ проводили как на интактных МФ, так и на марофагах, инфицированных L. donovani или М. tuberculosis.

Используемые культуры паразита выращивали в пробирках на 20% кровяном агаре 2-3 недели. К культуре макрофагов, прилипших кпокровным стеклам добавляли L. donovani из расчета 1-2 парзита на клетку. Комплекс цитокинов вносили за 20-24 часа до заражения в дозе 20 мкг/мл. Степень зараженности МФ и наличие лейшманий в клектах оценивали на 1-е, -3-й, 5-е сутки культивирования. Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа (увеличение х90) под масляной иммерсией.

При изучении иммунорегуляторной активности комплекса цитокинов в системе in vivo, мышам оппозитно реагирующих к инфицированию линий внутрибрюшинно вводили комплекс цитокинов (50 мкг/мышь),и через 20-24 часа заражали внутрибрюшинно L. donovani (3x10 /мышь) или М. tuberculosis -H37RV (0,25 мкг/мышь). На 1, 3 и 5 сутки оценивали зимозан-стимулированную ЛХЛ клеток перитонеального экссудата инфицированных мышей по сравнению с мышами, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл р-р Хенкса. (1мл).

Полученные результаты обрабатывали с использованием общепринятых статистических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕД0БАШ1Я И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСА ЕСТЕСТВЕННЫХ ЦИТОКИНОВ НА СПОСОБНОСТЬ ФАГОЦИТОВ ПРОДУЦИРОВАТЬ АКТИВНЫЕ ФОРШ КИСЛОРОДА.

1.1. Оценка влияния комплекса цитокинов на хемилюми-несценцию НМЛ.

Цитокины, не оказывая непосредственного действия на ХЛ ПМЛ, тем не менее предстимулируют клетки, что проявляется в усилении продукции АФК в ответ на стимуляцию латексом или опсонизированным зимозаном. Добавление КЦ в дозе 20 мкг/мл/млн клеток в кювету хемилюминометра не влияет на уровень и кинетику ХЛ Однако, предварительная инкубация ПМЛ в присутствии КЦ в течение 3-х часов (оптимальное время для проявления эффекта) приводит к увеличению ХЛ-ответа клеток на последующую стимуляцию частицами латекса (в 1,4 раза) или опсонизированным зимозаном (в 1,8 раз) (р<0,05) (Рис.1).

300

250

Л 200 )

о

т 150 н

д ЮО

50

О

О 2 4 6 8 10 12 14 16

ВРЕМЯ, мин

Рис. 1 Предстимуляция полиморфноядерных лейкоцитов комплексом цитокинов.

Люминол-завиоимая хемшгоминесценция 1!МЛ, предобработаи-пых комплексом цитокинов (20 мкг/мл) в течение 3-х часов в ответ на последующую стимуляцию латексом или опсонизировашшм зимозаном.

контроль 1 (латекс) , -Ж"" контроль 2 (зимозан) , -Ч— НМЛ I КЦ (латекс), --о-- ГШ + КЦ (зимозан) По оси X - время регистрации ХЛ-ответа ПМЛ (в мин). По оси У - хемилюминесценния ПМЛ (в отн. ед. )

1.2. Оценка действия комплекса цитокинов на хемилюми-несценцию клеток перитоиеального эксудата мышей.

Использование в экспериментах клеток перитоиеального эксудата, а не выделение чистой популяции прилипающих к стеклу макрофагов объясняется тем, что прилипание само по себе является мощным стимулятором "кислородного взрыва" и истощает систему генерации активных форм кислорода клетки, что может исказить результаты по изучению действия КЦ на эту функцию фагоцитов. Поскольку в экссудате присутствуют помимо МФ другие клетки, на дыхание клеток смешанной популяции могло бы оказывать влияние дыхание лимфоцитов. Однако известно, что при фагоцитозе опсонизированного зимозана практически не происходит стимуляции дыхания лимфоцитов и их В1эдад в хемилюми-нееценцию отсутствует (Baron,Proctor,1982). Поэтому "дыхательная вспышка" при стимуляции в клеточной популяции эксудата, содержащей преобладающее количество зрелых МФ, главным образом, обеспечивается цианидустойчивым немитохондриальным дыханием макрофагов.

Уровень зимозан-стимулированной ХЛ резидентных МФ перитоиеального эксудата от мышей разных линий изменяется в ряду BALB/c > FKCBA х C57BL/6) > СВА > C57BL/6. Эти результаты могут представлять специальный интерес, так как демонстрируют межлинейные различия в индукции "кислородного взрыва" макрофагов.

ХЛ клеток перитоиеального эксудата мышей, стимулированных внутрибрюшиннмм введением 2Z пептона в среднем по разным линиям мышей в 2-3 раза больше, чем ХЛ резидентных клеток нестимулированных мышей.

Хотя стимуляция мышей внутрибрюшинным введением пептона резко увеличивает количество макрофагов в перитонеальном

эксудате, однако эти клетки по целому ряду признаков можно считать уш активированными, поэтому основную часть экспериментов проводили на резидентных клетках перитонеального эксудата и использовали мышей линии СВА.

Оценивая влияние КЦ на ХЛ клеток перитонеального эксудата (или же со ссылкой на вышесказанное - на ХЛ МФ перитонеального эксудата), как и в случае ПМЛ, обнаружили способность цитокинов предстимулировать генерацию АФК макрофагами. Однако, в данном случае наблюдали иную зависимость степени прими-рования от времени инкубации клеток. Непосредственное добавление, так. же как и 40 мин прединкубации МФ с КЦ не влияет на отвечаемость МФ на зимозан, тогда как прединкубация в течение 20 и 40 часов приводит к увеличению зимозан-стимулированной

Рис. 2 Предстимуляция макрофагов перитонеального экссудата мышей комплексом цитокинов.

Люминол-зависимая хемилюминесценция МФ, редетимулирован-ных комплексом цитокинов (20 мкг/мл) в течение 40 мин, 20 часов и 40 часов в ответ на последующую стимуляцию опсонизи-рованным зимозаном.

- и -

-----контроль, —40 мин инкубации,

-~Х ~ "О час инкубации ,а40 час инкубации По оси X - время регистрации ХЛ (в мин). По оси У - хемилюминесценция МФ (в отн. ед.). Результаты исследования позволяют выделить два типа ци-токин-зависимой предстимуляции фагоцитов - длительная (для макрофагов) и кратковременная (для ПМЛ) (Табл.1).

Табл. 1 Два вида цитокин-зависимой предстимуляции для двух типов Фагоцитов.

параметр макрофаги нейтрофилы

1. Время инкубации клеток с комплексом цитоки-нов, необходимое для проявления максимального эффекта предстимуляции. 3 - 4.3 часов 0,5 - 3 часа

2. Максимальная степень проявления предстимуляции. 4 - 8 раз 0,5 - 2 раз

3. Зависимость эффекта от ингибиторов синтеза белка. есть нет

1. 3. Сравнение примирующей активности комплекса цитокиное и рекомбинантных ИФН^- и ФИО- ск>.

Использование в наших экспериментах комплекса естественных иммуноцитокинов предполагает возможность предстимулирую-щего эффекта в результате кооперации двух или более типов молекул, представленных во фракции. В связи с этим проводили сравнительный анализ предсгимулирующей активности КЦ и реком-бинантных иммунопептидов ИФН^ и ФН0-с£.

Были выбраны оптимальные рабочие дозы - для ИНФ^ 100 и/мл , для ФНО^ЮО и/мл .

Обнаружили, что примирующая активность иммуноцитокинов

- 12 -

возрастает в ряду: ИНФ4" > КЦ > ФИО -<Jj (р<0,05) (Рис.3).

600

500

Л ^о

I

о

т 300

д

. 200

100

О

Рис.3 Предстимуляция макрофагов перитонеального эксудата мышей различными иммуноцитокинами: комплексом естественных цитокинов, интерфероном и фактором некроза опухоли-об-

Люминол-зависимая хемилюминесценция МФ, предобработанных одним из вышеперечисленных иммуноцитокинов в течение 20 или 40 часов, в ответ на последующую стимуляцию опсонизированным зимозаном. По оси Y - хемилюминесценция (отн. ед.).

3.2. 4. Изучение влияния циклогексимида на цитокин-зависимую предстимуляцию МФ и НМЛ.

Механизм активации "кислородного взрыва" в результате стимуляции фагоцитов включает в себя полную сборку белков НАДФН-системы, что, по-видимому, должно быть связано с усилением синтезом белка de novo. Для проверки этого предположения

ингибировали синтез белка в клетках путем добавления в культуру МФ или ПМЛ ингибитора синтеза белка - циклогексимида в дозе 30 мкМ, при которой не снижается зкизнеспособность клеток в процессе культивирования,но угнетаются синтетические процессы внутри клетки (Уоос1тап ,1988).

Добавление ЦГМ в культуру МФ отменяет эффект цитокин-за- * висимой предстимуляции этой популяции фагоцитов (Рис.4).

ВРЕМЯ, мим

Рис. 4 Влияние циклогексимида на предстимуляцию макрофагов комплексом цитокинов.

Кинетика зимозан-стимулированной хемилюминесценции макрофагов, предобработанных "комплексом цитокинов" в отсутствие или в присутствии ингибитора синтеза белка - циклогексимида (30 мкМ).

--—-макрофагии, Н— макрофаги + КЦ, —Ж— макрофаги + ЦГМ + КЦ

По оси X -Но оси Y -

- 14 -

время регистрации ХЛ МФ (в мин). ХЛ-ответ МФ (в отн. ед.).

Циклогексимид не действует на изменение предстимуляции другого типа Фагоцитов - ПМЛ. Эффект отмены примирования в данном случае отсутствовал.

Таким образом, при сопоставлении влияния ЦГМ на КЦ-опосредованное примирование ПМЛ и МФ можно предположить, что механизмы "прайминга" МФ и ПМЛ иммунопептидами различны. Предстимуляция макрофагов цитокинами связана с интенсификацией синтеза белка de novo и это длительный эффекте часы,дни), включающий этап регуляции генома для синтеза необходимых для функционирования клетки поверхностных и секретируемых белков. Что касается второго типа фагоцитов - ПМЛ -,то в этом случае активация синтетических процессов в клетке не играет решающей роли для проявления эффекта предстимуляции и эффект кратковременный (минуты, часы) (Табл.1).

2. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ НА ПР0ТИВ0ПАРАЗИТАРНУЮ И ПРОТИВОИНФЕКЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТО-НЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ В МОДЕЛЯХ in vitro и in vivo.

2.1. Влияние КЦ на продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами, инфицированными Leishmania donovani, а также на внутриклеточный киллинг паразита в системе in vitro .

Изучали способность КЦ примировать МФ для киллинга об-лигатного внутриклеточного паразита L.donovani и повышения респираторного взрыва инфицированными клетками. Культура лейшманий была любезно предоставлена д. м. н. Шуйкиной 3. Е. -в.н.с. Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Марциновского МЗ СССР. Работа велась совместно и под руководством Э. Е. Шуйкиной.

МФ, обработанные комплексом цитокинов (5-20 мкг/мл) или (100 и 1000 U/мл) проявляют повышенную противопарази-тарную активность, что выражается в уменьшении числа внутриклеточных паразитов и улучшении морфологических показателей культуры инфицированных клеток.

Для оценки роли кислород-зависимых механизмов осуществления внутриклеточного киллинга паразитов под влиянием цито-

кинов проводили исследование уровня кислородного взрыва ин-тактных МФ в сравнении с инфицированными L. donovani.

В первые часы внесения паразита в клеточную культуру МФ (находящихся с суспензии, для исключения дыхательной вспышки за счет прилипания) ХЛ-ответ на стимуляцию зимозаном увеличивался в два раза, что можно объяснить началом фагоцитоза паразитов, который, как правило, всегда сопровождается резким увеличением кислородного метаболизма. Однако но мере культивирования - через 20 и 40 часов заражения способность клеток отвечать ХЛ-вспышкой на стимуляцию зимозаном значительно снижалась по сравнению с неинфицированныш клетками .

Таким образом, становится очевидным, что заражение клеток лейшманией сопровождается нарушением кислород-зависимого механизма клеточной защиты.

Принимая во внимание способность КЦ примировать МФ для усиления кислородного метаболизма, проводили оценку влияния КЦ на зимозан-стимулированную ХЛ интактных и инфицированных лейшманией МФ. Комплекс цитокинов способен повышать генерацию активных форм кислорода, которая ингибироьана инфекционным агентом, хотя и не в такой степени, как у интактных МФ.

2. 2. Изучение действия комплекса цитокинов на продукцию активных форм кислорода макрофагами разных линий мышей, инфицированных L. donovani в системе in vivo.

С целью анализа механизмов генетического контроля иммунного ответа и кислородного метаболизма МФ при лейшманиозе и возможностей его регуляции с учетом иммуногенетических особенностей проводили исследования влияния КЦ на МФ разных линий мышей, онпозитно-реагирующих на заражение L. donovani.

Среди трех используемых в наших экспериментах линий мышей • линия BALB/c является высокочувствительной к заражению лейшманиозом, а линии СВА и C57BL/6 - резистентными.

Измеряли зимозан-стимулиролванную ХЛ МФ перитонеального эксудата мышей трех линий - СВА, BAL.B/с, C57BL/6 - .инфицированных внутрибрюшинным введением суспензии живых L. donovani. В первые часы после заражения ХЛ МФ всех трех линий мышей возрастает, что, по-видимому, связано с фагоцитозом лейшманий макрофагами. Однако, как и в экспериментах т vitro, ХЛ инфицированных МФ в динамике зараженности значительно снижалась, что подтверждает полученные ранее результаты, свидетельствую-

шме о способности лейшманий нарушать кислород-зависимые процессы клеток.

Для исследования генотип-зависимой чувствительности МФ к примирующему действию цитокинов, КЦ в дозе 50 мкг/мышь вводили внугрибрюшинно мышам трех вышеперечисленных линий за сутки до заражения лейшманией и после этого измеряли зимозан стимулированную ХЛ МФ на 1-е, 3-й и 5-е сутки заражения.

КЦ снижает зимозан-стимулированную ХЛ инфицированных МФ резистентных линий - СБА и С57ВЬ/6 и наоборот, увеличивает генерацию активных форм кислорода МФ чувствительной линии -ВАЬВ/с (Рис.5) (р'0,05).

350

300-

250

200 -

150-

100-

50 -

КЦ КЦ Ж 1 сут

КЦ КЦ ки Э сут

М1 ки 5 сут

ВА1В/с ЕШ) С57В1./6 ЕЗ СВА

Рис. 5 Иммуномодулирующре влияние комплекса цитокинов на зимозан-стимулированпую хемшшминесценцию макрофагов оппо-зитно реагирующих линий мышей, инфицированных I. г1опоуаш на 1-е, 3-й и 5-е сутки заражения.

По оси У - ХЛ макрофагов (в отн. ед.).

- 17 -

Эта закономерность прослеживается в течение всего периода зараженности, за исключением 3-х суток, когда наблюдали инверсию ХЛ МФ обработанных КЦ чувствительной линии.

Полученные данные свидетельствуют, что иммуноцимтокины неоднозначно влияют на кислород-зависимый механизм активации макрофагов, во многом это определяется исходным генетически-опосредованным уровнем метаболизма кислорода и зависит от чувствительности мышей к данному патогену.

2. 3. Сравнение генотип-опосредованного иммунорегулиру-кяцего влияния комплекса цитокинов на кислородный взрыв МФ оп-позитно-реагирующих линий мышей по отношению к L. donovani и М. tuberculosis £ системе in vivo.

С целью более детального изучения иммуномодулирумцего влияния КЦ на МФ в зависимости от генетически обусловленной исходной функциональной активности фагоцитов, проводили изучение влияния КЦ на ХЛ МФ мышей оппозитно-реагирующих по от-ноению к вирулентному штамму М. tuberculosis H37RV.

В работе использовали несколько линий мышей: линия I/St - чувствительная к заражению туберкулезом и линии СВА, AKR,F1(AKRxI) и Fl(CBAxB6) - резистентные к туберкулезу. Линии мышей, инфицированных туберкулезом, получали из Института туберкулеза АМН СССР. Работу проводили совместно с научным сотрудником данного института Б. Я Никоненко.

Выбор именно М. tuberculosis для сравнения с лейшманиозом обусловлен тем, что, во-первых, данный патоген как и лейшма-ния имеет направленное поражающее действие на фагоцитарное звено иммунитета, и во-вторых, согласно данным литературы имеется тесное сцепление генов BCG и Lsh, регулирующих чувствительность мышей к инфицированию туберкулезом и лейшманиозом, соответственно (Plant,1982).

В отличие от инфицирования мышей лейшманией, в первые сутки после заражения микобактериями наблюдается снижение ХЛ

МФ по сравнению с клетками интактных животных, однако в большей степени это проявляется в случае МФ резистентной линии СВА.

Внутрибрюшинное введение КЦ в дозе 50 мкг/мышь за сутки до заражения вело к увеличению ХЛ МФ резистентной линии с

45,7+14,75 до 205+86,5 и снижению ХЛ МФ чувствительной линии с 271,8+11,4 до 155,1+10,5 (р< 0,05). Таким образом наблюдается картина прямо противоположная характеру регулирующего действия КЦ при инфицировании лейшманиозом, где КЦ увеличивал генерацию АФК МФ чувствительной линии и снижал в случае резистентной линии ( Рис. б).

ВРЕМЯ, мин

- -Ж-- 1/51. --о-- + КЦ, -----СВА, —+---СВА + КЦ

Рис. 5 Иммуномодулирующее влияние комплекса цитокинов на зимозан-стимулированную хемилюминесценцию макрофагов оппо-зитно реагирующих линий мышей, инфицированных М. 1иЬегси10313. По оси X - время регистрации ХЛ МФ (в мин). По оси У - ХЛ макрофагов (в отн. ед.).

- 19 -

Таким образом, применение комплекса цитокинов в качестве примирущего иммуномодулятора при одной и той же инфекции в ряде случаев приносит совершенно противоположные результаты, что может быть обусловлено генетически детерминированными различиями восприимчивости, в частности, как это имеет место у оппозитных по своей чувствительности к инфекционному агенту линий мышей.Иммунотерапия мышей с противоположной чувствительностью к инфекции, обусловленной генетически, оказывает неодинаковый эффект в зависимости от степени сопротивляемости каждой линии к определенному типу инфекции и выбранного для коррекции иммуномодулятора.

Полученные данные подтверждают возможность фенотипи-ческой коррекции генетических дефектов сопротивляемости к туберкулезу и лейшманиозу с помощью комплекса цитокинов и дают экспериментальное обоснование дифференцированного подхода к их применению с учетом иммуногенетического статуса и типа инфекционного агента.

ВЫВОДЫ.

1. Комплекс естественных цитокинов (фракция с молекулярной массой 15-30 кД) иммеет способность примировать фагоциты к усилению генерации активных форм кислорода в процессе "кислородного взрыва", не влияя непосредственно на данную фукнцию фагоцитарных клеток.

2. Обнаружены два вида цитокин-зависимой предстимуляции для различных типов фагоцитов: а/ длительная - характеризуется необходимостью длительного контакта клеток с цитокинами -3-48 часов, и сопровождается выраженной степенью примирова-ния - увеличение продукции активных форм кислорода в 4-8 раз (для макрофагов); б/ кратковременная - необходимое время инкубации для проявления максимального эффекта - 0,5-3 часа,и сопровождается относительно невысокой степенью проявления эффекта - увеличение продукции активных форм кислорода в 0,5-2 раза (для полиморфноядерных лейкоцитов).

3. Выраженность предстимулирующего воздействия иммуноци-токинов на способность макрофагов к продукции кислородных радик

алов возрастает в ряду ИФН-^ > комплекс цитокинов > ФНО-сС,.

4. Ингибитор синтеза белка - циклогексимид - отменяет цитокин-опосредованное примирование макрофагов, не влияя на

- 20 -

этот феномен при предобработке цитокинами нейтрофилов.

5. Комплекс цитокинов и WR-f усиливают противопарази-тарную активность макрофагов in vitro с вовлечением кислород-зависимых механизмов киллинга.

6. Иммуномодулирующее влияние комплекса цитокинов in vivo на продукцию кислородных метаболитов макрофагами, инфицированными L. donovani или М. tuberculosis, а также чувствительность клеток к примирующему действию цитокинов зависит от генетически обусловленной предрасположенности макрофагов к инфекционному агенту, а также от типа возбудителя.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Комплекс естественных цитокинов (М-фракция) может быть использован для оценки примирующего действия иммуномоду-ляторов на фагоцитарные клетки экспериментальных животных и человека, а также для оценки индивидуальной чувствительности здоровых и больных людей к примирующему действию иммунопепти-дов.

2. Система с двумя типами примирующего эффекта может быть применена для отбора лекарственных средств, регулирующих фагоцитарные клерки.

3. Межлинейные различия в генерации макрофагами активных форм кислорода под влиянием цитокинов и опсонизированного зи-мозана могут иметь значение в экспериментальной иммунологии.

4. Модель регуляции функций инфицированных макрофагов оппозитно реагирующих линий мышей может быть использована в области патофизиологии.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ.

1. Апциаури ЕЭ. , Крейнина М. В. .Вривиба К. К. Лимфокины в эффекте предстимуляции макрофагов // Иммунный гомеостаз в норме и патологии: Тез. докл. конференции молодых ученых.-Фрунзе, 1989.-С. 6-7.

2. Апциаури Е Э. , Карасева М. В. Влияние лимфокинов на функциональную активность макрофагов // Синтез и исследование биологически активных соединений: Тез. докл. конференции молодых ученых. -Рига, 1989. -С. 97.

3. Ковальчук JL В. , Каримова Е. В. , Ганковская Л. В. , Карасева. М. В. , Апциаури Н. Э. .Соколова Е. В. , Титовец Р. Е. Цитокинзависи-мая регуляция продукции TNF-«C и активных форм кислорода макрофагами интактных мышей и мышей с меланомой В16 // Доклады Академии Наук СССР, 1991, Том 318,6. -С.

4. Kovalchuk L. V. .Gankowskaja L. V. .Aptsiauri N. E. .Karase-va M. V. .Shuikina E. E. Superlimph regulates functional properties of macrophages // Molecular aspects of immune response and infectious diseases,Abstracts,International conference. -Rome, Italy,1989. - Poster ,

5. Kovalchuk L. V. .Gankowskaja L. V. .Aptsiauri N. E.,Shuikina E. E. Genetical aspects of macrophages function regulation by lymphokines // Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states, Abstracts, All Union symposium with the participation of foreign scientists.-Novosibirsk, 1990. -p. 71-72.

6. Klebanov G. I. .Kreynina M. V. .Naumov 0. G. .Aptsiauri N. E. Kovalchuk L. V. , Vladimirov Yu. A. Phagocyte priming mechanisms // Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states, Abstracts,All Union symposium with the participation of foreign scientists.-Novosibirsk, 1990.-p. 64-65.

7. Kovalchuk L. V. .Aptsiauri N. E. .Gankowskaja L. V. .Shuikina E. E. .Nikonenko B.N. Priming effect of macrophages - as estimation index of irrniunopharmacological agents activity // Problems of immunopharmacology,Abstracts,International congress. -Tbilisi, 1990. - p. 27.

8. Kovalchuk L. V. .Klebanov G. I. .Gankowskaja L. W. .Aptsiauri N. E. .Shuikina E. E. Complex of endogenous cytokines regulates functional properties of phagocytes // Abstracts,Constituent Congress of International society for pathophysiology. -Moscow, 1991. -p. 176.

9. Kovalchuk L. V. .Klebanov G. I. .Ribarov S. R. .Krejruna M. V. Aptsiauri N. E. .Gankowskaja L. V. .Karaseva M. V. .Shuikina E. E. , Vladimirov Yu. A. Priming of phagocytes by cytokines and water-soluble products of lipid peroxidation // Biomedical Science, 1991,Vol. 2(3). - p. 11-21.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АФК - активные формы кислорода

ИФН - интерферон

КЦ комплекс цитокинов

ЛХП - люминол-зависимая хемшгоминесценция

МНК. -■ мононуклеарные клетки

ЫФ - макрофаг

ПМЛ - полиморфноядерный лейкоцит

ФГА - фитогемагглютинин

ФИО -- фактор некроза опухоли

ХЛ - хемилюминесценция

ЦГМ - циклогексимид

L. donovani - Le intiman i a donovani

M. tubérculos i s - Micobacteria tuberculosis