Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Клинико-иммунологическая эффективность локальной иммунокоррекции в комплексном лечении угревой болезни

На правах рукописи

Лялюхина Елена Ивановна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛОКАЛЬНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ УГРЕВОЙ БОЛЕЗНИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

¡1 3 МАЙ 2010

Курск - 2010

004601171

Работа выполнена в медицинском институте Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Орловский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Снимщикова Ирина Анатольевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хмелевская Ирина Георгиевна кандидат медицинских наук Зоря Игорь Васильевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава», г. Москва

Защита диссертации состоится «20 мая» 2010 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «КГМУ Росздрава».

Автореферат разослан ¿г » 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор - Калуцкий П.В.

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной медицины остается профилактика и лечение воспалительных заболеваний кожи, распространённость которых не имеет тенденции к снижению. Угревая болезнь поражает до 85% людей, преимущественно молодого возраста, что приводит к их психосоциальной дезадаптации и нарушению качества жизни (Адаскевич

B.П., 2003; Иванов В.П., 2007; Потекаев H.H., 2008; Аравийская Е.Р., 2008; Cun-liffe W.J., 2004; Ross J.I., 2004; Lehmann H.P., 2006; Webster G. F., 2008).

Результаты лечения различных форм угревой болезни, несмотря на использование широкого арсенала лекарственных средств и способов воздействия на поражённую кожу, не удовлетворяют полностью дерматологов. Длительное лечение, значительные материальные затраты, частые осложнения, косметические изъяны - это все требует изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов терапии данной группы больных (Самгин М. А., Монахов

C.А., 2008; Carmina Е. А., 2002; Cordain L., 2002,2006; Eichenfield L.F., 2005). Многочисленные исследования показывают сложный мультифакторный

характер патогенеза угревой болезни, важную роль в котором играют иммунные нарушения. Изучению роли дисфункций иммунитета у больных с acne vulgaris посвящены работы отечественных и зарубежных авторов (Масюкова С.А., 2005; Nagy I., Zouboulis С.С., 2006; Harder J., 2007; Jones D., 2008; Yamasaki K., 2008). Вместе с тем, несмотря на то, что в литературе накапливается все больше данных о роли врождённых иммунных механизмов в регуляции гомеостаза кожи и слизистых, их значение в патогенезе угревой болезни изучено недостаточно и является дискутабельным.

В последние годы показано, что одним из перспективных способов лечения акне и коррекции поствоспалительных изменений кожи является мезотера-пия - интрадермальное введение малых доз лекарственных препаратов (антибиотиков, витаминов и др.) в зону патологического очага (Озёрская О.С., 20032006; Сажина Е.В., 2007; Le Coz., 2001).

Учитывая регулирующее влияние иммунотропных препаратов эндогенных пептидов на течение и исход локальных воспалительных процессов, патогенетически обоснованным представляется их топическое использование при угревой болезни.

В связи с этим приобретает актуальность разработка комплексного подхода к лечению acne vulgaris с включением в программы терапии локальной им-мунокоррекции.

Цель работы. Повышение эффективности лечения больных с акне путём применения локальной иммунокоррекции. Задачи исследования.

1. Уточнить некоторые механизмы развития иммунной дисфункции у больных угревой болезнью.

2. Изучить in vitro антимикробную активность препарата миелопид.

3. Исследовать in vitro влияние препаратов миелопид и суперлимф на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопе-

роксидазы) и оксида азота мононуклеарными фагоцитами здоровых доноров и больных акне.

4. Разработать способ локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и оценить его клиническую эффективность в комплексной терапии пациентов с угревой болезнью в сравнении с традиционным лечением и мезотерапией препаратом гентамицин.

5. Исследовать влияние локальной иммунотерапии препаратом миелопид на динамику показателей иммунного статуса больных с acne vulgaris.

Научная новизна. Получены данные об изменении продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы и гепсидина) и оксида азота при угревой болезни, которые расширяют представления о роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе акне.

Впервые установлена прямая антибактериальная активность препарата миелопид в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae.

Впервые показано иммуномодулирующее влияние препаратов миелопид и суперлимф на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопероксидазы) и оксида азота мононуклеарными фагоцитами крови больных акне.

Впервые разработан и внедрен в клиническую практику способ лечения угревой болезни с локальным использованием препарата миелопид путём мезо-терапии; проведена оценка его эффективности в сравнении с традиционным лечением и мезотерапевтическим введением препарата гентамицин.

Выявлено положительное влияние локальной иммунокоррекции препаратом миелопид на динамику показателей врождённого и адаптивного иммунитета больных с угревой болезнью.

Практическая значимость работы. В результате проведённых исследований патогенетически обосновано локальное применение препаратов иммуно-регуляторных пептидов (миелопида, суперлимфа) в комплексном лечении угревой болезни.

Разработаны критерии балльной оценки тяжести течения различных форм acne vulgaris и определена их значимость при проведении локальной иммунотерапии.

Предложенный способ локальной иммунокоррекции путём мезотерапии позволяет улучшить результаты лечения угревой болезни и постакне: сократить сроки лечения и частоту рецидивов заболевания, ускорить санацию очагов акне, снизить риск развития поствоспалительных косметических дефектов и повысить качество жизни пациентов.

Положения, выносимые на защиту. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных с угревой болезнью является нарушение продукции эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы и гепсидина) и оксида азота.

Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Препараты миелопид и суперлимф in vitro оказывают иммуномодули-рующее влияние на продукцию антимикробных пептидов и оксида азота моно-нуклеарными фагоцитами периферической крови пациентов с угревой болезнью.

Использование в комплексном лечении папулопустулёзной формы угревой болезни локальной иммунокоррекции препаратом миелопид ускоряет санацию очагов акне и купирование перифолликулярного инфильтративного процесса, снижает частоту поствоспалительных косметических дефектов, сокращает сроки лечения, частоту рецидивов и способствует повышению качества жизни у 63,3% больных.

Локальное применение препарата миелопид путём мезотерапии при папулопустулёзной форме acne vulgaris приводит к восстановлению исходно нарушенных показателей врождённого и адаптивного иммунитета.

Внедрения. Способ локальной иммунокоррекции препаратом миелопид путём мезотерапии внедрён в практику работы ОГУЗ «Орловская областная поликлиника №2», ОГУЗ «Областной кожно-венерологический диспансер». Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Связь с планом НИР.

Работа проведена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (номер госрегистрации комплексной темы 14.00.03).

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии и педиатрии» (Орел, 2005); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы педиатрии и иммунологии» (Санкт-Петербург, 2005), «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006); межкафедральной конференции медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (Орёл, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ (6 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками, 9 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 93 отечественных и 129 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Клинические исследования. Под нашим наблюдением находились 176 пациентов с различными формами акне (134 женщины и 42 мужчины) в возрасте от 18 до 36 лет, обращавшихся в ОГУЗ «Орловская областная поликлиника № 2» в период с 2004 по 2009 гг. Среди обследуемых у 43 (24,4%) больных бы-

ла комедональная форма угревой болезни, у 16 (9,1%) - нодулокистозная, у 117 (66,5%) регистрировалась папулопустулёзная форма акне.

В проводимое исследование были включено 112 пациентов с папулопусту-лёзной формой угревой болезни, которые по способу лечения были распределены на 3 группы: I - контрольную группу составили 52 больных, получавших традиционное лечение; во II группу (основную) вошли 30 пациентов, которым в на фоне традиционного лечения проводилась локальная иммунокоррекция препаратом миелопид путём мезотерапии; в III группу (группу сравнения) были включены 30 больных, которые получали мезолечение препаратом гентамицин. Больные всех групп были сопоставимы по полу, возрасту и характеру патологического процесса в коже, распределение в них было случайным.

Программа диссертационного исследования утверждена на заседании Этического комитета медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет (протокол №3 от 13 апреля 2005 г.) в соответствии с требованиями Основ законодательства РФ «Об охране здоровья граждан». Отчёт по проделанной работе заслушан на заседании Этического комитета (протокол № 4 от 21 мая 2009 года).

Критериями исключения пациентов из проводимого исследования служили: возраст до 18 лет, сопутствующие соматические заболевания в стадии обострения или декомпенсации, беременность и лактация, острые инфекционные и воспалительные заболевания, склонность к патологическому рубцеванию, индивидуальная непереносимость или аллергическая реакция больного на препараты, используемые для мезотерапии, отказ больного от проводимого исследования.

Традиционное лечение проводилось всем пациентам с акне в зависимости от степени тяжести заболевания и включало использование топических и (или) системных антибактериальных средств, препаратов с противовоспалительным действием и средств, нормализующих процессы кератинизации.

Больным основной группы и группы сравнения на фоне традиционного лечения выполнялась мезотерапия техникой «папул» (Озёрская О.С., 2003; Са-жина Е.В., 2007), которую осуществляли с интервалом в 3 дня (2 раза в неделю). Полный курс лечения составлял 10 процедур. Мезотерапевтические инъекции выполнялись в проекции проблемной зоны, под угревые высыпания на глубину 1,5-2,0 мм. В качестве мезотерапевтического коктейля для процедуры локальной иммунокоррекции использовали 4 мл физиологического раствора, содержащего препарат миелопид (0,75 мг/мл). В состав композита для проведения процедуры мезотерапии у больных третьей группы был включен раствор гентамицина сульфата (ОАО «Мосхимфармпрепараты» им. H.A. Семашко», Россия) в дозе 20 мг/мл. Добавление в раствор препаратов производилось непосредственно перед проведением процедуры. Мезотерапия проводилась в соответствии с требованиями на применение медицинской технологии «Мезотерапия в дерматокосметологии». Процедура мезотерапии включала трёх кратную обработку кожи 0,05% раствором хлоргексидина (до нанесения анестезирующего 5% крема «Эмла» (АстраЗенека АБ, Швеция), после его удаления, по

окончании мезотерапии), локальную анестезию кремом «Эмла» (на 20-30 минут) и мезотерапию техникой «папул».

Эффективность лечения оценивали в баллах по разработанной нами на основе с классификаций С.Н. Cook et al. (1979) в модификации B.S. Allen, J.G. Smith (1982) и (1997) балльной шкале. При этом учитывали общее состояние, характер высыпаний, их распространённость, наличие поствоспалительных элементов, патологию ЖКТ и репродуктивной системы, отклонения в гормональном профиле, показатели локального иммунного статуса. Тяжесть состояния и клиническая картина заболевания в каждом конкретном случае характеризовалась суммой баллов по отдельным клинико-лабораторным показателям.

Для анализа качества жизни пациентов с акне нами был использован русифицированный вариант анкеты Finlay для расчета дерматологического индекса качества жизни (ДИКЖ), включающей 10 основных показателей, оцениваемых по 4-балльной системе (3, 2, 1, 0 баллов). Цифровой индекс, получаемый в результате ответов на все вопросы анкеты, отражал степень негативного влияния симптомов болезни на качество жизни больного (максимальный индекс равен 30 баллам). Кроме того, проводилось тестирование пациентов по Спилбергеру-Ханину для оценки уровней реактивной и личностной тревожности в процессе лечения (Адаскевич В.П., 2004; Собчик JI.H., 2001). Для определения нормы качества жизни было проведено анкетирование 50 здоровых лиц, сопоставимых по возрасту с пациентами исследуемых групп.

Экспериментальные и лабораторные исследования.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК) выделяли с использованием метода дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Фримель Г., 1980). Разделение суммарной фракции мононуклеаров на моноциты и лимфоциты осуществляли посредством избирательной адгезии моноцитов к пластику (Тотолян A.A., 2000).

С целью определения способности клеток к продукции антимикробных пептидов взвесь мононуклеарных фагоцитов (МНФ) в концентрации 2 млн./мл инкубировали в течение 1,5 часов в сывороточной среде RPMI-1640 при 37°С с препаратом миелопид (композит свиных миелопептидов; НПЦ Медицинская иммунология, Россия) или суперлимф (комплекс гетерологичных цитокинов и антимикробных пептидов; «Иммунохелп», Россия) в атмосфере 5% СО2. По окончании инкубации клетки в планшетах трижды отмывали средой 199, ре-суспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали в стандартных условиях в течение 18 часов. Для исследования брали су-пернатанты клеток, полученные путем 10-минутного центрифугирования культуральной смеси при 1500 об./мин.

Продукцию оксида азота (NO) МНФ оценивали по суммарной концентрации нитритов и нитратов в супернатантах культур данных клеток после их инкубации с изучаемыми препаратами в течение 22 часов в атмосфере 5% С02 при 37°С. Содержание NO в пробах определяли спектрофотометрически с помощью реактива Грисса. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия (Голиков П.П., 2004).

Для получения кожных смывов (КС) использовали фрагменты фильтровальной бумаги размером 2 см2, предварительно смоченные физиологическим раствором, которые прикладывали на кожу с экспозицией на 15-20 секунд. После аппликации пропитанную фильтровальную бумагу помещали в эпендорф с 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида на 1 час с последующим ее удалением.

Антимикробную активность препаратов определяли методом диффузии в агар по степени задержки роста микроорганизмов в зоне нанесения раствора препаратов миелопид, суперлимф и физиологического раствора. В качестве тест - культур использовали штаммы микроорганизмов из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича, а также клинические изоляты бактерий (S. aureus, S. pyogenes, P. aerugenosa, E. coli, P. vulgaris, K. pneumoniae). Учет результатов производили после 24 часов инкубации при 37°С по следующей схеме: 4 балла - полная задержка роста тест-культуры; 3 балла - рост единичных колоний; 2 балла - наличие в месте нанесения препарата 5-10 колоний; 1 балл - массивный рост (до 20 колоний); 0 баллов - сливной рост микроорганизмов.

С целью оценки показателей системного иммунитета больных осуществлялся забор периферической крови до лечения и после лечения, при этом изучали фенотип лимфоцитов, уровень иммуноглобулинов A, M, G, антимикробных пептидов и цитокинов ИЛ-1(3, ИЛ-lRa, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-а, ТФР-р, в сыворотке крови, цитокинсинтезирующую активность МНК.

Определение антимикробных пептидов (кателицидина LL-37 и лактофер-рина) проводилось методом твердофазного ИФА с помощью набора реагентов Hbt (Нидерланды) и ЗАО "Вектор-Бест" (Россия).

Продукцию миелопероксидазы определяли по методике Азнабаевой Л.Ф. с соавт. (2002 г.) с расчетом показателя пероксидазной активности исследуемой биологической жидкости (ПОА). Оценку уровня гепсидина осуществляли методом ИФА с использованием тест-систем IBL (Германия).

Фенотип клеток определяли непрямым иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител (ТОО «Сорбент», г. Москва), согласно прилагаемым инструкциям и рекомендациям.

Концентрацию иммуноглобулинов оценивали методом радиальной имму-нодиффузии с помощью стандартных планшетов «Реафарм» (Москва).

Для определения иммунологических показателей, принимаемых за физиологическую норму, были обследованы 20 здоровых лиц (средний возраст 25,1 ±0,5 лет) для выявления у них фоновых показателей иммунного статуса и их сравнения с данными иммунограмм у больных с папулопустулёзной формой акне.

Иммунологические исследования выполнялись на кафедре иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ОГУ. Бактериологические исследования выполнены на кафедре микробиологии и инфекционных болезней медицинского института ОГУ и в бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Орловской области» в соответствии с методическими рекомендациями МЗ СССР (1985 г.).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программного комплекса Microsoft Excel ХР на компьютере «Pentium IV».

Исследования корреляционной взаимосвязи между показателями выполнялись по Пирсону.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментальных исследований.

По современным представлениям инфекционно-воспалительные заболевания кожи сопровождаются дисфункцией врождённых и приобретенных компонентов иммунитета, которая ограничивает возможности иммунной системы в своевременном распознавании и уничтожении микробных возбудителей (Harder J., 2007; Jones D., 2008; Yamasaki К., 2008). Исследованию роли нарушений иммунитета у больных с acne vulgaris посвящены исследования ряда авторов (На-ход Е.В., 2008; Nagy I., Zouboulis С.С., 2006; Jones D., 2008). Вместе с тем закономерности дисрегуляции компонентов врождённого иммунитета в процессе формирования acne vulgaris остаются практически не изученными.

Среди молекулярных компонентов врождённого иммунитета важное место отводится антимикробным пептидам (АМП), оказывающим прямое проти-вомикробное и иммунорегуляторное действие (Кокряков В.Н., 1999; Ковальчук JI.B., 2007; Bowdish D.J., 2005). Предположив, что нарушение их синтеза может быть одной из причин иммунной дисфункции при угревой болезни, были изучены особенности системной и локальной продукции антимикробных пептидов, а также возможности ее регуляции in vitro препаратами миелопид и суперлимф.

Как известно, белок LL37 (hCAP18) на сегодняшний день является единственным идентифицированным человеческим кателицидином, проявляющим иммунорегуляторное действие и антимикробную активность против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, а также грибов и вирусов (Ковальчук Л.В., 2007; Barlow P. G., 2006).

Рис. 1. Уровень 1X37 в крови и кожных Рис. 2. Показатели ПОА в крови и кожных смывах здоровых лиц и больных угревой смывах здоровых и больных угревой болез-болезнью. нью.

Примечание: 1 - показатели в сыворотке крови здоровых лиц; 2 - показатели в сыворотке крови больных; 3 - показатели КС здоровых лиц; 4 - показатели КС больных; р<0,01 между показателями здоровых и больных.

Определение концентрации кателицидина LL37 в кожных смывах (рис. 1) выявило ее повышение у больных с акне по сравнению со здоровыми лицами (0,1±0,03 мкг/мл), что может обеспечивать определенный уровень защиты от инфекционных агентов. Вместе с тем, была установлена широкая вариабельность значений LL37 в сыворотке крови больных: от «следовых» до 5-10 кратного повышения. При проведении клинико-иммунологических параллелей между изменением продукции кателицидина и тяжестью течения acne vulgaris было показано, что у 17% пациентов с хроническим рецидивирующим течением заболевания длительностью более 5 лет, белок LL37 в смывах с кожи (КС) регистрировался только в следовых количествах, что может иметь важное значение в формировании воспалительных форм акне и развитии инфекционных осложнений при данной патологии.

В последние годы в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний различной локализации активно обсуждается роль гепсидина, который выполняя роль антимикробного пептида, подобно белкам острой фазы, синтезируется в печени, а также участвует в регуляции транспорта железа в различных ком-партментах организма, включая клетки эпителия, макрофаги и др. (Nemeth Е., 2003; Dallalio G., 2003; Meldrum D.R., 2007). В связи с этим представляло интерес оценить уровень гепсидина у больных с акне. Установлено, что в КС у пациентов с acne vulgaris гепсидин не определялся, а повышение его концентрации в сыворотке крови (до 156,3±34,2 нг/мл, по сравнению с показателями здоровых лиц - 87,4±16,8 нг/мл) регистрировалось в 17,9% случаев, преимущественно у больных с сопутствующей патологией желудочно-кишечного тракта и нарушением менструальной функции.

Исследование в биологических жидкостях уровня железосвязывающего катионного пептида - лактоферрина (ЛФ), обладающего антибактериальной, противовирусной и антиоксидантной активностью, а также участвующего в регуляции роста и дифференцировки клеток фагоцитарного ряда (Тотолян A.A., 2001; Фрейдлин И.С., 2001; Baker Н.М., 2008) выявило преимущественное повышение его концентрации у большинства больных в смывах кожи (до 25,5±6,2 нг/мл), по сравнению с сывороткой крови. В смывах с кожи здоровых доноров концентрация ЛФ составляет в среднем 10,56 нг/мл (колеблется от 0 до 45 нг/мл). Уровень ЛФ в сыворотке крови здоровых лиц и больных составил 448±51,4 нг/мл и 536±62,2 нг/мл, соответственно.

Учитывая возможный синергический эффект действия лактоферрина и миелопероксидазы в фагосомной вакуоли в процессе фагоцитоза, либо внекле-точно в очаге воспаления (Кокряков В.Н., 2008; Baker Н.М., 2008), представляло интерес оценить продукцию миелопероксидазы на местном и системном уровне. Анализ результатов показал (рис. 2), что у пациентов с acne vulgaris уровень миелопероксидазы как в кожных смывах, так и в сыворотке крови, был значительно выше у больных, чем у здоровых лиц.

Исследование концентраций изучаемых антимикробных пептидов в супер-натантах МНФ больных, по сравнению со здоровыми лицами, выявило снижение продукции кателицидина LL37, лактоферрина и миелопероксидазы у 52%, 47% и 35% пациентов, соответственно (рис. 3,4, 6). При этом «нулевые» значе-

S3 II Я здоровые

ния уровня 1X37 определялись в 12,5% случаев, снижение концентрации 1X37 и лактоферрина было отмечено у 13,4% пациентов, 1X37, лактоферрина и мие-лопероксидазы регистрировалось в 9,8% образцов. Вероятно, выявляемый у большинства больных более низкий уровень АМП в супернатантах культур клеток, может свидетельствовать о снижении резервных возможностей фагоцитарных продуцентов антимикробных пептидов, в первую очередь 1X37.

к 1 2 3 4 £Z3i I Ёш~П -*— здоровые !

Рис. 3. Влияние препаратов суперлимф и Рис. 4. Влияние препаратов суперлимф и миелопид на продукцию лактоферрина миелопид на продукцию LL37 МНФ крови МНФ крови здоровых лиц и больных угре- здоровых лиц и больных угревой болезнью, вой болезнью.

Примечание: здесь и на рис 4-6: К - контроль (внесены клетки, необработанные препаратом); 1 - суперлимф 5 мкг/мл; 2 - суперлимф 10 мкг/мл; 3 - миелопид 600 мкг/мл; 4 -миелопид 750 мкг/мл; для рис. 3-4: I - больные с исходно высокими показателями; II - больные с исходно низкими показателями; р<0,01 по сравнению с контролем.

При сравнительном изучении уровня антимикробных пептидов ЛФ и кате-лицидина в супернатантах клеток после их инкубации с препаратами, было установлено иммуномодулирующее действие миелопида и суперлимфа на МНФ крови: повышение исходно сниженной продукции и снижение - исходно повышенной, что может иметь важное значение для купирования локального инфек-j ционно-воспалительного процесса при акне (рис. 3-4).

Как видно из рис. 6, при внесении изучаемых препаратов в культуру клеток больных наблюдалось снижение исходно повышенных (более чем у 50% пациентов) показателей продукции миелопероксидазы. Добавление препаратов в культуру МНФ крови здоровых лиц сопровождалось усилением продукции изучаемых АМП (рис. 3, 4, 6), наиболее значимым для кателицидина LL37 (повышение продукции в 5-10 раз по сравнению с контролем). Полученные in vitro данные указывают на возможность направленного изменения синтеза эндогенных противомикробных пептидов под действием миелопида и суперлимфа. Эффект препаратов был более выражен при использовании миелопида в дозе 750 мкг/мл, суперлимфа 10 мкг/мл.

Рис. 5. Влияние препаратов суперлимф и Рис. 6. Влияние препаратов суперлимф и миелопид на продукцию N0 МНФ крови миелопид на продукцию миелопероксидазы здоровых лиц и больных угревой болезнью. МНФ крови здоровых лиц и больных угревой болезнью.

Примечание: р<0,01 по сравнению с контролем.

В последние годы установлено, что наряду с АМП важным показателем функционирования врождённого иммунитета является продукция оксида азота, оказывающего мультимодальное действие на различные клетки-мишени и ре-гуляторные молекулы. Несмотря на то, что накоплен большой экспериментальный материал, касающийся роли оксида азота при многих физиологических процессах, а также воспалении и регенерации тканей (Голиков П.П., 2004; Singh Р.К., 2002), при угревой болезни особенности его продукции практически не изучены. В связи с этим представляло интерес исследовать уровень метаболитов NO в сыворотке крови, смывах кожи, а также в культуре клеток здоровых доноров и больных акне. Анализ результатов показал, что уровень суммарной продукции нитритов и нитратов, как в КС, так и в сыворотке крови, был значительно ниже у больных, чем у здоровых лиц (рис. 8). Кроме того, отмечалось снижение, по сравнению со здоровыми донорами, показателей спонтанного синтеза метаболитов NO в культуральной жидкости МНФ крови больных (рис. 5), что, может быть обусловлено NO-зависимой аутокринной регуляцией макрофагов в агрессивной среде фокуса воспаления и повышенной «востребованностью» NO для полноценного завершения воспалительного процесса. При этом обработка клеток, как здоровых лиц, так и больных, исследуемыми препаратами приводила к дозозависимому повышению уровня продукции метаболитов NO в культуральной среде. Как видно из рис. 5, максимальный эффект проявлялся при использовании миелопида в дозе 750 мкг/мл и суперлимфа - 10 мкг/мл.

Таблица 1.

Антибактериальная активность препарата суперлимф._

Доза препарата суперлимф Степень задержки роста тест-культуры (в баллах)

S.aureus S.pyogenes P. aeruginosa E.coli P. vulgaris K.pneumoniae

5 мкг/мл 3,54±0,28** 3,62±0,28** 0 0 0 0

10мкг/мл 3,62±0,28" 3,69±0,26** 0 0 0 0

Контроль 0 0 0 0 0 0

Примечание: здесь и в табл.2 - ** р<0,01 по сравнению с контролем; контроль - внесен физиологический раствор; п=35.

Как известно, препарат суперлимф, включающий комплекс гетерологич-ных свиных цитокинов и антимикробных пептидов, проявляет свойства антибиотика эндогенного происхождения в отношении музейных штаммов стафилококка и стрептококка, а также клинических изолятов данных бактерий (Снимщикова И.А., 2001; Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2003-2007). В связи с этим представляло интерес изучить возможное противомикробное действие препарата свиных миелопептидов (миелопида).

Таблица 2.

Антибактериальная активность препарата мнелопид._

Доза препарата миелопид Степень задержки роста тест-культуры (в баллах)

S.aureus S.pyogenes P. aeruginosa E.coli Р. vulgaris K.pneumoniae

3000 мкг/мл 3,04±0,28** 3,П±0,26" 0,57±0,1 3,29±0,2" 2,8±0,2" 3,3±0,3"

1500мкг/мл 3,01±0,26** 3,02±0,28** 0 3,43±0,3'* 2,75*0,1** 3,2±0,2**

750 мкг/мл 2,98±0,28" 3,01±0,26" 0 3,24±0,4** 2,7±0,2" 3,2±0,2**

Контроль 0 0 0 0 0 0

Проведённые эксперименты показали, что препарат миелопид активен в отношении всех исследуемых микроорганизмов, кроме P. aerugenosa Как видно из представленных результатов (табл. 1-2), не было выявлено достоверных различий при использовании миелопида в дозах 750,1500 и 3000 мкг/мл. При этом препарат суперлимф проявлял более выраженную антибактериальную активность в отношении штаммов стафилококка и стрептококка (табл. 1-2). Данные литературы (Кокряков В.Н., 2006; Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2004-2008) и наши наблюдения позволяют предположить, что прямое противомикробное действие миелопида опосредовано входящими в его состав гетерологичными антимикробными пептидами, что позволяет его рассматривать как эндогенный антибиотик животного происхождения и свидетельствует о перспективности клинического использования в качестве антибактериального средства.

Таким образом, проведённые исследования показали, что одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных акне является нарушение продукции эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактофер-. рина, миелопероксидазы, гепсидина) и оксида азота, а полученные данные об иммуномодулирующем и антибактериальном действии изучаемых препаратов могут служить экспериментальным обоснованием их локального применения при угревой болезни.

Результаты клинических наблюдений.

На основании полученных результатов экспериментальных исследований, а также данных литературы об эффективности применения иммуномоду-ляторов в комплексном лечении угревой болезни (Адаскевич В.П., 2003; Озёр-ская О.С., 2003; Ozolins М., 2004; Bowdish D., 2005; Jones D., 2008) нами изучена клиническая эффективность локальной иммунокоррекции у больных с па-пулопустулёзной формой acne vulgaris.

Локальная иммунокоррекция препаратом миелопид путём мезотерапии использована в комплексном лечении 30 пациенток (II - основная группа) среднего возраста 2б,5±2,7 лет (женщин - 26; мужчин - 4). В III группу (группу сравнения) были включены 30 больных (средний возраст 25,1±2,8 лет; женщин - 24;

мужчин - 6), которые получали мезолечение препаратом гентамицин. Контрольную (I группу) составили 52 больных (среднего возраста 25,5±1,9 лет; женщин - 36; мужчин -16), получавших традиционную терапию.

Из общего числа больных 29,5% страдали частыми ОРВИ (до 4-6 раз в год), 22,3% - хроническими заболеваниями мочевыделительной системы, у 42,9% пациентов имелись заболевания желудочно-кишечного тракта (гастрит, колит, дисбактериоз), у 14,3% - ЛОР - патология (гайморит, этмоидит, отит). Нарушения репродуктивной функции регистрировались у 38,4% женщин исследуемых групп: олигоменорея - у 10,7%, альгодисменорея - у 12,5%, вторичная аменорея - у 8,04%, первичное и вторичное бесплодие - у 4,5% и 2,7% пациенток, соответственно.

Клинические проявления акне характеризовались как папуло-пустулёзными элементами, так и поствоспалительными косметическими дефектами (дисхромиями, псевдоатрофиями, рубцами). Поствоспалительные деструктивные изменения кожи были выявлены у 11,6% больных при продолжительности заболевания от 1 до 3 лет и в 87,5% случаев - при длительности течения акне более 5 лет. У большей части пациентов (78,6%) акне - элементы локализовались на лице, у 21,4% - на лице и туловище.

Качественный состав микрофлоры с поверхности кожи и акне - элементов отличался разнообразием выделенных штаммов: Staphylococcus epidermidis выделен в 62,5 % случаев, Staphylococcus aureus - в 46,4 %, Propionbacterium acnes - в 57,1%, коринебактерии - в 9,8%, дрожжеподобные грибы - в 15,2%, ассоциации микроорганизмов идентифицированы в 87,5% случаев.

Тяжесть течения заболевания и эффективность лечения оценивали в 4-балльной системе по разработанным нами критериям до лечения, через две недели и после лечения. Совокупная оценка acne vulgaris в 5-17 баллов соответствовала лёгкому течению; в 18-35 - средней степени тяжести; в 36 и более баллов — тяжёлому течению. Течение заболевания средней степени тяжести отмечалось в 75,5% случаев, тяжёлое течение - в 24,5%.

Результаты лечения анализировали по следующим клиническим критериям: клиническое выздоровление — полный регресс элементов сыпи; значительное улучшение — разрешение высыпаний более чем на 75%; улучшение — регресс элементов менее чем на 50%; без эффекта — отсутствие положительной динамики кожного процесса к моменту окончания лечения.

Анализ результатов локального применения препарата миелопид путём ме-зотерапии в комплексном лечении acne vulgaris выявил его высокую клиническую эффективность по сравнению с традиционным лечением и мезотерапией препаратом гентамицин. Так, сравнительная балльная оценка клинических и лабораторных данных, проведенная до лечения, через две недели (после 4 процедур) и после лечения показала, что выраженность их в группе больных, получавших ЛИ, снизилась с 35,3±0,5 до 4,2±0,5 баллов, контрольной - с 34,4±0,5 до 16,5±0,5 баллов, в группе сравнения - с 34,8±0,3 до 10,5±0,5 баллов (рис. 7). Уже после 4 процедуры лечения отмечалась существенная разница в течение угревой болезни по динамике клинических симптомов. У больных, получавших мезотерапию с препаратом миелопид, выраженность процесса уменьшилась до

14,8±0,5 баллов (рис. 7), в то время как у пациентов первой и второй групп сумма баллов оставалась на достаточно высоком уровне (27,1±0,7 и 24,2±0,6 балла, соответственно).

группы и группы сравнения.

Примечание: р<0,05 между показателями больных исследуемых групп после лечения; р<0,01 между показателями внутри групп до и после лечения.

Следует отметить, что включение в комплексное лечение локальной им-мунокоррекции препаратом миелопид сопровождалось регрессом высыпаний, прекращением появления новых элементов и уменьшением воспалительного компонента к пятой процедуре у 77% больных. При этом у больных первой и второй групп клинически значимое улучшение состояния кожи регистрировалось только через 3-4 недели лечения (17,3±0,2 и 14,2±0,1 балла, соответственно).

К окончанию курса лечения клиническое выздоровление (полное разрешение акне - элементов) констатировано у 100% пациентов II группы и только у 15,4 % и 36,7% I и III групп, соответственно. При этом значительное клиническое улучшение наблюдалось у большинства больных первой и третьей групп (51,9% и 56,7%, соответственно), а клиническое улучшение (регресс акне - элементов менее чем на 50%) - у 15 (28,9%) пациентов контрольной группы и у 2 (6,6%) больных группы сравнения. Отсутствие положительной динамики кожного процесса к моменту окончания лечения имело место лишь у 2 пациенток контрольной группы с гиперандрогенией. Ухудшения или обострения кожного процесса на фоне лечения у больных основной группы и группы сравнения выявлено не было. Однако у 9 (17,3%) пациентов на фоне традиционной терапии отмечалось обострение акне, которое потребовало коррекции лечения (назначение повторных курсов системных антибактериальных средств). Особо следует отметить улучшение состояния кожи после лечения у большинства пациентов второй и третьей групп (86,7% и 53,3%, соответственно), а также коррекцию поствоспалительных косметических дефектов (по-стакне). Так, проявления постакне (расширенные поры и капилляры, неравномерная пигментация кожи, ее дефекты с неровной текстурой и усиленным микрорельефом, рубцы) уменьшились, соответственно у 66,7% и 30% больных, получавших мезотерапию.

Кроме того, следует отметить, что у 30,8% пациентов первой группы и у 23,3% - третьей группы отмечено появление рецидивов заболевания в срок от 6 до 12 месяцев наблюдения. При этом использование локальной имму-нокоррекции путём мезотерапии позволило в 33,3% случаев избежать назначения антибиотиков, а также исключить число больных, получавших повторные курсы антибиотикотерапии, что согласуется с полученными данными об антибактериальной активности препарата миелопид.

Кроме того, после лечения в основной группе с поверхности кожи высевался только эпидермальный стафилококк (в 73,3% случаев), что, согласно данным литературы (Адаскевич В.П., 2003; Озёрская О.С., 2008; Braff М. Н., 2005) соответствует нормальному микробиоценозу кожи. В тоже время у больных контрольной группы, получавших традиционное лечение, а также после курса применения мезотерапии с гентамицином при посеве содержимого единичных акне - элементов ассоциации микроорганизмов определялись в 53,9% и 33,3% случаев, соответственно.

В последние годы одним из основных показателей эффективности использования различных способов лечения является оценка качества жизни больных (Монахов С.А., Самгин М.А., 2002; Адаскевич В.П., 2004; Lucky A.W. 2001, 2005). В связи с этим, до лечения и в отдаленном периоде после лечения (10-12 месяцев) нами была проведена оценка качества жизни пациентов, получавших традиционную и предложенную схемы лечения, путем расчета дерматологического индекса качества жизни. Изучение качества жизни больных с акне показало, что до лечения у всех пациентов регистрировалось снижение интегрального показателя качества жизни (повышение ДИКЖ), по сравнению со здоровыми лицами, у которых он составлял 3,45±0,5 балла. При этом установлено, что применение традиционного лечения приводило к улучшению качества жизни у 36,5% пациенток, мезотерапии с препаратом гентамицин - у 46,7% больных и локальной иммунокоррекции - у 63,3% пациентов. ДИКЖ пациентов основной группы уменьшился с 27,8+1,8 до 5,1±2,7 баллов (р<0,01), а у больных контрольной группы и группы сравнения - с 26,9±2,1 до 15,1±3,4 и с 27,5+1,7 до 11,3±2,1 баллов (р<0,01), соответственно. Кроме того, следует отметить, что до лечения у всех пациентов наблюдался средний и высокий уровень реактивной тревоги (от 5 до 65%). После проведенного курса локальной иммунокоррекции с высоким уровнем тревоги остался лишь 3,3% больных, а у 66,7% пациентов уровень тревожности стал низким. При этом в контрольной группе зарегистрировано увеличение (+26,9%) лиц со средним уровнем тревоги за счет уменьшения числа (-26,9%) пациентов с высокой тревожностью. У больных группы сравнения высокий уровень тревожности наблюдался у 16,7% больных, средний - у 56,7%, низкий - у 26,7% лиц. Улучшение психоэмоционального здоровья (повышение самооценки, числа межличностных контактов, уменьшение комплекса социальной неполноценности и др.) отмечено у большинства больных I, II и III групп (51,9%, 83,3% и 63,3%, соответственно).

Динамика показателей иммунитета у больных угревой болезнью на фоне лечения.

Учитывая результаты проведённых экспериментов и данные литературы об иммуномодулирующем влиянии локальной иммунокоррекции (Ковальчук Л.В., 2004; Юдина С.М., 2005), нами исследованы показатели иммунного статуса больных acne vulgaris на фоне топического применения препарата миелопид путем мезотерапии.

Результаты исследований показали, что до начала лечения у большинства больных (94,6% обследованных пациентов) выявлялись нарушения в иммунной системе, наиболее выраженные в продукции антимикробных пептидов и метаболитов оксида азота, что, как уже отмечалось, вероятно, обусловлено участием этих медиаторов в патогенезе акне.

Как видно из рис. 8, фоновые показатели уровня N0 в сыворотке крови и кожных смывах, взятых до лечения, у большинства больных всех групп были значительно ниже, чем у здоровых лиц и достоверно не различались. При этом после лечения у больных, получавших ЛИ, регистрировалось восстановление суммарной продукции нитратов и нитритов в сыворотке крови и кожных смывах до уровня показателей здоровых лиц (3,47±0,01 и 2,8±0,01 мкмоль/л, соответственно), в контрольной группе и группе сравнения полной нормализации концентрации NO не наблюдалось (рис. 8).

Как уже отмечалось, угревая болезнь сопровождается дисбалансом продукции антимикробных пептидов, что является одним из критериев иммуно-обусловленности акне. Результаты проведенных исследований показали, что у большинства больных с acne vulgaris, в отличие от здоровых лиц, наблюдалось повышение уровня АМП в сыворотке крови и кожных смывах (рис. 1,2, 9), что сочеталось с нарушением их синтеза МНФ периферической крови (рис. 3,4, 6).

□ I группа ш II группа и III группа о здоровые

14 12 10 8 6 4 2 О -2

гШЙ

1

1

1

1 д

1 пг

II I iiil ii Щ ■ II

J-1--2- —3- .........- 4 J

! I группа S II группа

¡I группа ш здоровые

Рис. 8. Динамика уровня метаболитов N0 в Рис. 9. Динамика уровня 1131 в сыворотке сыворотке крови и КС у больных с угревой крови и КС у больных с угревой болезнью, болезнью.

Примечание: 1 - показатели в сыворотке крови до лечения; 2 - показатели в сыворотке крови после лечения; 3 - показатели в смывах с кожи до лечения; 4 -показатели в смывах с кожи после лечения; р<0,05 - между показателями до и после лечения и по сравнению со здоровыми лицами.

Следует отметить, что изменения продукции АМП и N0 были взаимосвязаны. Заслуживают внимания результаты об обратной корреляции между уровнями кателицидина ЬЬ37 и N0 в сыворотке крови (г=-0,89; р>95%) и кожных смывах (г—0,91; р>95%), что отражало тяжесть течения патологического процесса в коже. Статистически значимая обратная корреляционная зависимость отмечена и между уровнями миелопероксидазы, лактоферрина и оксидом азота (г=-0,92; г=—0,95; р>95%).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли антимикробных пептидов и оксида азота в формировании иммунной дисфункции при угревой болезни, что обосновывает возможность их определения в качестве маркёров тяжести течения заболевания и оценки эффективности терапии (табл. 3).

Таблица 3.

Лабораторные показатели оценки выраженности локального воспалительного __процесса при акне.__

Показатель 0 баллов 1 балл 2 балла 3 балла

LL-37 0,1-0,5 мкг/мл 0,6-2,0 мкг/мл 2,1-4,5 мкг/мл >4,6 мкг/мл

Оксид азота 3,0-2,5 мкмоль/л 2,4-2,0 мкмоль/л 1,9-1,1 мкмоль/л <1,0 мкмоль/л

В процессе проведения комплексного лечения с применением ЛИ и мезо-терапии препаратом гентамицин, по сравнению с традиционной терапией, отмечалось улучшение показателей продукции АМП и N0, более выраженное у пациентов второй группы (рис. 8, 9).

Принимая во внимание интегрирующую и регулирующую роль цитокинов в реализации реакций врождённого и адаптивного иммунного ответа на патогены, а также данные об иммуномодулирующем действии миелопида, представляло интерес оценить состояние цитокинового статуса больных акне на фоне предложенного лечения.

Примечание: на рис. 10, 11, 13: 1 - показатели больных I группы до лечения; 2 - II группы до лечения; 3 - III группы до лечения; 4 - показатели больных I группы после лечения; 5 - больных II группы после лечения; 6 - больных III группы после лечения; 7 - показатели здоровых лиц; р<0,05 - между показателями до и после лечения и по сравнению со здоровыми лицами.

Проведённое исследование концентраций цитокинов в сыворотке крови показало, что у 46,4% больных acne vulgaris, в отличие от здоровых лиц, наблюдалось повышение уровня воспалительных (ИЛ-ip, ИЛ-6, ФНО-а) и имму-носупрессорных (ИЛ-10 и ТФР-|31) цитокинов (рис. 10, 11). При анализе показателей ИЛ-lRa до лечения в сыворотке крови больных его отклонений от значений физиологической нормы выявлено не было, а ИЛ-8 в сыворотке крови ни у здоровых лиц, ни у больных не определялся. Кроме того, более чем в 50% случаев статистически значимых изменений концентраций цитокинов в сыворотке крови больных выявлено не было.

При исследовании спонтанной выработки цитокинов мононуклеарами периферической крови больных были выделены две группы: с исходно пониженным и повышенным уровнем секреции цитокинов, что может быть обусловлено предстимуляцией клеток-продуцентов in vivo (рис. 12). ФГА оказывал стимулирующее действие на продукцию цитокинов в обеих группах, более выраженное в отношении ИЛ-1(3, ФНО-а и ИЛ-10 (рис. 13). Однако достоверное увеличение выработки цитокинов in vitro в ответ на стимуляцию ФГА было более значимым у здоровых лиц (максимальный прирост ИЛ-1(3 составил 45%, ФНО-а - 42%, ИЛ-10 - 30%), чем у больных (прирост 17%, 21% и 15%, соответственно).

S ИЛ-1Р □ ИЛ-6 н ФНО-а о ИЛ-8 о ИЛ-10

Рис. 12. Показатели спонтанной продукции цитокинов МНК здоровых лиц (4) и больных до лечения.

Примечание: 1 - показатели больных первой группы; 2 - второй группы; 3 - третьей группы; А - исходно сниженные показатели; В - исходно повышенные показатели; р<0,05 по сравнению с показателями здоровых лиц.

Рис. 13. Динамика ФГА-стимулированной продукции цитокинов МНК здоровых лиц и больных с исходно повышеными показателями на фоне лечения. Примечание: р<0,05 - между показателями до и после стимуляции ФГА.

Клиническая эффективность локальной иммунокоррекции сочеталась у большинства больных с восстановлением исходно нарушенных показателей цитокинового статуса, а также цитокинсинтезирующей функции МНК (рис. 10, 11, 13). После курса традиционной терапии и мезотерапии препаратом гента-мицин концентрации исследуемых цитокинов достоверно снижались, однако,

значений нормы достигали лишь у 25% и 33,3% пациентов, соответственно (рис. 10,11,13).

Известно, что в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний кожи важную роль отводится нарушениям Т-клеточного и B-клеточного адаптивного иммунного ответа. Однако исследования клеточного и гуморального звена иммунитета при угревой болезни достаточно противоречивы, в связи с чем нами были изучены показатели системного иммунитета при acne vulgaris.

Результаты исследований показали, что до лечения у больных с папулопус-тулёзной формой акне, по сравнению со здоровыми лицами, число CD4+ и CD8+ лимфоцитов было снижено незначительно (до 32,7+1,5% и 18,9+0,5%, соответственно; 38,9±2,5% и 22,6±1,8% - у здоровых лиц). В количестве CD19+В-лимфоцитов достоверных изменений у большинства пациентов выявлено не было (12,6+1,6%). Однако у 11% пациентов акне отмечалось снижение числа CD 19+ клеток (до 6-9%), что сочеталось с исходно сниженной продукцией у этих пациентов IgG (до 6,8+0,5 г/л). Следует также отметить, что у большинства больных численность лимфоцитов, экспрессирующих индуцибельные маркеры (CD25, CD71, HLA-DR) была в среднем в 1,5-2 раза меньше, чем у здоровых лиц. На фоне лечения полная нормализация числа CD4+, CD8+, CD19+ лимфоцитов наблюдалась у 93,3% больных основной группы и только у 55,8% и у 63,3% пациентов контрольной группы и группы сравнения, соответственно. Это сочеталось с усилением экспрессии CD25+, CD71+ маркеров и повышением до нормы количества HLA-DR+ клеток у 96,7% пациентов II группы, у 57,7% и 66,7% I и III групп, соответственно. Достоверная положительная динамика после ЛИ путем мезотерапии отмечалась также в отношении исходно сниженного числа B-лимфоцитов и уровня IgG (повышение концентрации в сыворотке крови до 11,6±0,5 г/л).

Таким образом, полученные данные показали положительное влияние локальной иммунотерапии на восстановление иммунологической реактивности больных с акне, приводящее у большинства пациентов к нормализации показателей системного и местного иммунитета.

Анализ результатов проведённых исследований позволяет сделать заключение о перспективности использования в программах лечения папулопусту-лёзной формы acne vulgaris локальной иммунокоррекции путем мезотерапии.

Выводы.

1. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных acne vulgaris является нарушение продукции эндогенных антимикробных пептидов (катели-цидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина) и оксида азота.

2. Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной активностью в отношении грамположительных (S. aureus, S. pyogenes) и грамотрицательных бактерий (Е. coli, Р. vulgaris и К. pneumoniae).

3. Препараты миелопид и суперлимф оказывают in vitro дозозависимое имму-номодулирующее влияние на продукцию эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопероксидазы) и оксида азота моно-

нуклеарными фагоцитами периферической крови больных акне и здоровых лиц.

4. Локальная иммунокоррекция путём мезотерапии препаратом миелопид повышает эффективность лечения папулопустулёзной формы угревой болезни: ускоряет санацию очагов акне и купирование перифолликулярного инфильтра-тивного процесса, снижает частоту поствоспалительных косметических дефектов, сокращает сроки лечения, частоту рецидивов, способствует повышению качества жизни у 63,3% больных.

5. Применение в комплексном лечении папулопустулёзной формы acne vulgaris локальной иммунокоррекции путем мезотерапии приводит у большинства больных к восстановлению в периферической крови числа CD4+, CD8+, CD 19+ CD25+, HLA-DR+, С071+лимфоцитов, уровня IgG, концентрации воспалительных и противовоспалительных цитокинов, нормализации в сыворотке крови и кожных смывах содержания эндогенных антимикробных пептидов (кателици-дина ЬЬ-37,.лактоферрина, миелопероксидазы) и оксида азота, а также спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов (HJI-lfJ, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-10) МНК периферической крови.

Практические рекомендации. 1. В комплексном лечении папулопустулёзной формы угревой болезни рекомендуется использовать локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид, которую следует проводить путём мезотерапии с интервалом в 3 дня (2 раза в неделю) в течение 5 недель. В составе мезотерапевтического коктейля для процедуры локальной иммунокоррекции рекомендуется использовать 4 мл физиологического раствора, содержащего препарат миелопид (0,75 мг/мл). Технология мезотерапии должна включать трехкратную обработку кожи 0,05% раствором хлоргексидина (до нанесения анестезирующего крема «Эмла», после его удаления, по окончании мезотерапии), локальную анестезию 5% кремом «Эмла» (на 20-30 минут) и мезотералию техникой «папул» в проекции проблемной зоны, под угревые высыпания.

2. В лечении больных acne vulgaris целесообразно использовать разработанную шкалу балльной оценки выраженности угревой болезни и эффективности лечения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Лялюхина, Е.И. Роль иммунологических механизмов в патогенезе гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей / И. А. Снимщикова, И.Д. Баранова // Учёные записки «Актуальные вопросы медицины и образования». - Т.З -Орёл, 2004.-с. 3-10.

2. Антибактериальная активность препарата миелопид и его эффективность при гнойно-воспалительных заболеваниях / И. А. Снимщикова, Е.И. Лялюхина, И.А. Ререкин // Медицинская иммунология. - 2005. Т.7, № 2-3. - с.322-323.

3. Лялюхина, Е.И. Новые подходы к локальному применению препаратов иммунорегуляторных пептидов / И. А. Снимщикова, М. А. Халилов, И.А, Шма-нева // Russian Journal of Immunology. - 2006. - V.9., S.3. - с. 152.

4. Лялюхина, Е.И. Новые подходы к локальному применению препаратов иммунорегуляторных пептидов в педиатрической практике / И. А. Снимщико-ва, М. А. Халилов, B.C. Анцупова // Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8, № 2-3. - с. 464.

5. Лялюхина, Е.И. Перспективные направления лечения инфекционно-воспалительных процессов кожи и слизистых / И. А. Снимщикова, М. А. Халилов, И.А. Молдованов //Медицинская иммунология. -2007, Т.9, № 2-3. - с. 355.

6. Лялюхина, Е.И. Эффективность топической терапии при инфекционно-воспалительных процессах / М. А. Халилов, И. А. Снимщикова, И.А. Молдова-нов [и др.] // Сб. материалов VI Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине. - Тула. -2007.-с.252-253.

7. Лялюхина, Е.И. Экспериментальное обоснование применения препарата миелопид при иммунодефицитах / И. А. Снимщикова, М. А. Халилов, О.В. Ильина [и др.] //Russian Journal of Immunology. -2007. - V.9, S.4. - с. 149 - 150.

8. Лялюхина, Е.И. Участие эндогенных антимикробных пептидов в регуляции инфекционно-воспалительных процессов / И. А. Снимщикова, И.А. Шма-нева, Ильина О.В. [и др.] // Вестник Российского государственного мед. университета. - 2008, №4 (63). - с. 50.

9. Роль эндогенных антимикробных пептидов в регуляции воспалительных процессов / И. А. Снимщикова, М. А. Халилов, Е.И. Лялюхина, О.В. Ильина, B.C. Анцупова, И.А. Шманева // Российский иммунологический журнал. -2008. - V.2 (11), N 2-3. - с. 187.

10. Лялюхина, Е.И. Клинико-иммунологическая эффективность локальной иммунокоррекции при угревой болезни / И. А. Снимщикова, О.В. Игнатова // Российский аллергологический журнал.-2010.-№.1, вып. 1.- с. 110-111.

Список сокращений

ДИКЖ

ИЛ

ИФА

МНК

МНФ

ЛИ

ТФР

ФНО

CD

Ig

Дерматологический индекс качества жизни Интерлейкин

Иммуноферментный анализ Мононуклеарные клетки крови Мононуклеарные фагоциты Локальная иммунокоррекция Трансформирующий фактор роста Фактор некроза опухолей Кластер дифференцировки Иммуноглобулин Оксид азота Антимикробный пептид Лактоферрин кателицидин 1X37 рецепторный антагонист ИЛ-1 Т-хелперы

Пероксидазная активность

NO АМП ЛФ LL37

ИЛ-lRa

Th ПОА

Сдано в набор 08.04.2010 г. Подписано в печать 09.04.2010 г. Формат 30х4278. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 310 Полиграфический центр ИП Киселев. 302030, г. Орел, ул. Московская, 65.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Одной из актуальных проблем современной медицины остается профилактика и лечение воспалительных заболеваний кожи, распространенность которых не имеет тенденции к снижению. Угревая болезнь поражает до 85% людей, преимущественно молодого возраста, что приводит к их психосоциальной дезадаптации и нарушению качества жизни [2,31,70, 113, 114, 150, 189,211].

Результаты лечения различных форм угревой болезни, несмотря на использование широкого арсенала лекарственных средств и способов воздействия на пораженную кожу, не удовлетворяют полностью дерматологов. Длительное лечение, значительные материальные затраты, частые осложнения, косметические изъяны — это все требует изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов терапии данной, группы больных [56, 57, 73, 74, 75, 108, 111, 122].

Многочисленные исследования показывают сложный мультифакторный характер патогенеза угревой болезни, важную роль в котором играют иммунные нарушения. Изучению роли дисфункций иммунитета у больных с acne vulgaris посвящены работы отечественных и зарубежных авторов [52, 59, 132, 133, 141, 173, 216, 222]. Вместе с тем, несмотря на то, что в литературе накапливается все больше данных о роли врождённых иммунных механизмов в регуляции гомеостаза кожи и слизистых, их значение в патогенезе угревой болезни изучено недостаточно и является дискутабельным.

В последние годы показано, что одним из перспективных способов лечения акне и коррекции поствоспалительных изменений кожи является мезотерапия - интрадермальное введение малых доз лекарственных препаратов (антибиотиков, витаминов и др.) в зону патологического очага [62, 64, 65, 72, 148].

Учитывая регулирующее влияние иммунотропных препаратов эндогенных пептидов на течение и исход локальных воспалительных процессов, патогенетически обоснованным представляется их топическое использование при угревой болезни.

В связи с этим приобретает актуальность разработка комплексного подхода к лечению acne vulgaris с включением в программы терапии локальной иммунокоррекции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Повышение эффективности лечения больных с акне путем применения локальной иммунокоррекции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Уточнить некоторые механизмы развития иммунной дисфункции у больных угревой болезнью.

2. Изучить in vitro антимикробную активность препарата миелопид.

3. Исследовать in vitro влияние препаратов миелопид и суперлимф на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопероксидазы) и оксида азота мононуклеарными фагоцитами здоровых доноров и больных акне.

4. Разработать способ локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и оценить его клиническую эффективность в комплексной терапии пациентов с угревой болезнью в сравнении с традиционным лечением и мезотерапией препаратом гентамицин.

5. Исследовать влияние локальной иммунотерапии препаратом миелопид на динамику показателей иммунного статуса больных с acne vulgaris.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены данные об изменении продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы и гепсидина) и оксида азота при угревой болезни, которые расширяют представления о роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе акне.

Впервые установлена прямая антибактериальная активность препарата миелопид в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae.

Впервые показано иммуномодулирующее влияние препаратов миелопид и суперлимф на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопероксидазы) и оксида азота мононуклеарными фагоцитами крови больных акне.

Впервые разработан и внедрен в клиническую практику способ лечения угревой болезни с локальным использованием препарата миелопид путём мезотерапии; проведена оценка его эффективности в сравнении с традиционным лечением и мезотерапевтическим введением препарата гентамицин.

Выявлено положительное влияние локальной иммунокоррекции препаратом миелопид на динамику показателей врождённого и адаптивного иммунитета больных с угревой болезнью.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

В результате проведенных исследований патогенетически обосновано локальное применение препаратов иммунорегуляторных пептидов (миелопида, суперлимфа) в комплексном лечении угревой болезни.'

Разработаны критерии балльной оценки тяжести течения различных форм acne vulgaris и определена их значимость при проведении локальной иммунотерапии.

Предложенный способ локальной иммунокоррекции путём мезотерапии позволяет улучшить результаты лечения угревой болезни и постакне: сократить сроки лечения и частоту рецидивов заболевания, ускорить санацию очагов акне, снизить риск развития поствоспалительных косметических дефектов и повысить качество жизни пациентов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных с угревой болезнью является нарушение продукции эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы и гепсидина) и оксида азота.

Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Препараты миелопид и суперлимф in vitro оказывают иммуномодулирующее влияние на продукцию антимикробных пептидов и оксида азота мононуклеарными фагоцитами периферической крови пациентов с угревой болезнью.

Использование в комплексном лечении папулопустулёзной формы угревой болезни локальной иммунокоррекции препаратом миелопид ускоряет санацию очагов акне и купирование перифолликулярного инфильтративного процесса, снижает частоту поствоспалительных косметических дефектов, сокращает сроки лечения, частоту рецидивов и способствует повышению качества жизни у 63,3% больных.

Локальное применение препарата миелопид путём мезотерапии при папулопустулёзной форме acne vulgaris приводит к восстановлению исходно нарушенных показателей врождённого и адаптивного иммунитета.

ВНЕДРЕНИЯ В КЛИНИЧЕСКУЮ ПРАКТИКУ.

Способ локальной иммунокоррекции препаратом миелопид путем мезотерапии внедрён в практику работы ОГУЗ «Орловская областная поликлиника №2», ОГУЗ «Областной кожно-венерологический диспансер». Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

СВЯЗЬ С ПЛАНОМ НИР.

Работа проведена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (номер госрегистрации комплексной темы 14.00.03).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии и педиатрии» (Орел, 2005); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы педиатрии и иммунологии» (Санкт-Петербург, 2005), «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006); межкафедральной конференции медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (Орёл, 2009).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ (6 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками, 9 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (3 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 93 отечественных и 129 зарубежных источника.

ВЫВОДЫ.

1. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных acne vulgaris является нарушение продукции эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина) и оксида азота.

2. Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной активностью в отношении грамположительных (S. aureus, S. pyogenes) и грамотрицательных бактерий (Е. coli, P. vulgaris и К. pneumoniae).

3. Препараты миелопид и суперлимф оказывают in vitro дозозависимое иммуномодулирующее влияние на продукцию эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина и миелопероксидазы) и оксида азота мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных акне и здоровых лиц.

4. Локальная иммунокоррекция путём мезотерапии препаратом миелопид повышает эффективность лечения папулопустулёзной формы угревой болезни: ускоряет санацию очагов акне и купирование перифолликулярного инфильтративного процесса, снижает частоту поствоспалительных косметических дефектов, сокращает сроки лечения, частоту рецидивов, способствует повышению качества жизни у 63,3% больных.

5. Применение в комплексном лечении папулопустулёзной формы acne vulgaris локальной иммунокоррекции путем мезотерапии приводит у большинства больных к восстановлению в периферической крови числа CD4+, CD8+, CD 19+ CD25+, HLA-DR+, С071+лимфоцитов, уровня IgG, концентрации воспалительных и противовоспалительных цитокинов, нормализации в сыворотке крови и кожных смывах содержания эндогенных антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы) и оксида азота, а также спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов (ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-10) МНК периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1. В комплексном лечении папулопустулёзной формы угревой болезни рекомендуется использовать локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид, которую следует проводить путём мезотерапии с интервалом в 3 дня (2 раза в неделю) в течение 5 недель. В составе мезотерапевтического коктейля для процедуры локальной иммунокоррекции рекомендуется использовать 4 мл физиологического раствора, содержащего препарат миелопид (0,75 мг/мл). Технология мезотерапии должна включать трехкратную обработку кожи 0,05% раствором хлоргексидина (до нанесения анестезирующего крема «Эмла», после его удаления, по окончании мезотерапии), локальную анестезию 5% кремом «Эмла» (на 20-30 минут) и мезотерапию техникой «папул» в проекции проблемной зоны, под угревые высыпания.

2. В лечении больных acne vulgaris целесообразно использовать разработанную шкалу балльной оценки выраженности угревой болезни и эффективности лечения.