Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Цитокинотерапия: роль естественного комплекса цитокинов в постожоговой регенерации роговицы

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РГБ ОД

РАДЫГИНА Татьяна Вячеславовна ^ ^

ЦИТОКИНОТЕРАПИЯ: РОЛЬ ЕСТЕСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ В ПОСТОЖОГОВОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ

(14.00.36.- Аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1999

Работа выполнена на кафедре иммунологии Российского Государственного медицинского университета.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Л. В. Ганковская

Научный консультант: доктор медицинских наук

И. П. Хорошилова - Маслова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

М. А. Стенина

доктор медицинских наук

Т. И. Ронкина

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Защита состоится "21" июня 1999 г. в_часов на заседании диссертационного совета

Д.084. 14. 06 в Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан " " мая 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент Т. Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время все большее внимание исследователей привлекают биорегуляторы местного и системного действия - цитокины, играющие важную роль в развитии иммунного ответа, воспаления и регенерации . В ряде рабо* получены данные об ускорении процессов заживления под действием рекомбинантных цитокинов (Jouce N. С., 1991; Nishida Т., Nakamura М., Otozi Т., 1992). Эффекты комбинации природных цитокинов, обусловленные плейотропностью, тандемностью, каскадностью, синергистично-стью и антагонистичностью воздействия на клетки-мишени, значительно отличаются от эффектов, вызываемых индивидуальными пептидами. В связи с этим, представляется перспективным использование комплексов цитокинов в качестве фармакологических средств при лечении различных заболеваний. Особую актуальность этот подход имеет в офтальмологии, так как даже незначительные нарушения в тканях глаза могут привести к необратимым последствиям.

На кафедре иммунологии РГМУ разработан новый лечебный принцип локальной цитокинотерапии (Ковальчук Л. В., Ганковская JI. В. и др., 1987 г.), основанный на местном применении комплекса цитокинов, вырабатываемых стимулированными клетками периферической крови пациентов ¡n vitro. Данный метод был успешно применен при проникающих травмах глаза и способствовал более быстрому купированию воспалительной реакции, сокращению сроков полного очищения и рубцевания раны, снижению риска посттравматических осложнений, в том числе формирования грубых рубцов роговицы (Гундорова Р. А,. 1993; Слепова О. С., 1993). Получен положительный эффект применения естественного комплекса цитокинов (ЕКЦ) в ограниченных клинических испытаниях с целью профилактики избыточного рубцевания в группе больных первичной открытоугольной глаукомой в послеоперационный период (Образцова Е. Н., Васи-ленкова JI. В., 1996).

Ожоговое повреждение роговицы приводит к массивной деструкции тканей глаза, воспалению, нарушению процессов репарации и возникновению осложнения трудно поддающихся лечению. В результате тяжелых ожогов глаз образуются грубые, интенсивно васкуляризованные бельма роговицы, представляющие неблагоприятную почву для пересадки роговицы с оптической целью (Мороз 3. И., 1987).

Вышеизложенные данные свидетельствуют об актуальности разработки лекарственного препарата на основе естественного комплекса иитокинов и изучение его влияния на процессы постожоговой регенерации роговицы. Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось изучение механизмов действия естественного комплекса ци-токинов (ЕКЦ) на модели постожоговой регенерации роговицы, а также разработка стандартизированной формы препарата на основе комплекса цитокинов. В соответствие с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение механизмов влияния естественного комплекса цитокинов на процессы " постожоговой регенерации роговицы в эксперименте.

2. Анализ содержания провоспалительных (ИЛ-1Р, ФНО-а) и противовоспалительных (ТФР-(31, ТФР-02) цитокинов в слезной жидкости больных ожоговой болезнью глаза в сравнении со здоровыми донорами.

3. Получение, характеристика и стандартизация препарата на основе естественного комплекса цитокинов.

Научная новизна.

В настоящем исследовании впервые проведено изучение влияния аутологичного и гетерологичного комплексов цитокинов на течение постожоговой регенерации роговицы. Показано, что применение естественного комплекса цитокинов, секретируемого аутологичными или гетерологичными лейкоцитами периферической крови, изменяет состав мигрирующих клеток в очаг повреждения (макрофаги - в опытной группе, ней-трофилы - в контрольной). ЕКЦ способствует ускорению эпителазиции, восстановлению эндотелия и уменьшению отека стромы роговицы. Под действием ЕКЦ активизируется миграция и пролиферация фибробластических элементов, что способствует быстрому замещению некротизированных тканей и сохранению частичной пластинчатости роговицы.

Получены новые данные о содержании провоспалительных (ИЛ-1р и ФНО-а) и противовоспалительных (ТФР- Р1, ТФР-Р2) цитокинов в слезной жидкости больных ожоговой болезнью глаза и выявлен их дисбаланс, смещенный в сторону провоспалительных цитокинов.

Разработана лабораторная технология получения лекарственного препарата на основе естественного комплекса цитокинов - "Суперлимф".

Практическая значимость.

В данной работе показано, что естественный комплекс цитокинов является перспективным лекарственным средством, способным регулировать постожоговую регенерацию роговицы и нормализовывать ее структуру, что создает благоприятные условия для последующей кератопластики.

Проведенный анализ содержания цитокинов в слезной жидкости больных ожоговой болезнью глаза позволяет уточнить иммунопатогенез этого заболевания, а также обосновывает применение цитокинов приданной патологии.

Полученные в работе данные, позволяют получить активный, стандартизированный лекарственный препарат на основе естественного комплекса цитокинов. Внедрение результатов исследования в практику.

Полученный стандартизированный препарат ("Суперлимф") был использован в комплексном лечении больных первичной отхрытоугольной глаукомой с целью предупреждения избыточного рубцевания в послеоперационный период. Была показана его эффективность. Разрешение на проведение клинических испытаний "Суперлимфа" было получено в ГИСК им. Тарасевича (решение фарм. комитета от 14 февраля 1999 г, протокол №1).

Апробация диссертационного материала.

Основные положения по материалам диссертации доложены и обсуждены на: 4-ом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997), 5-ом Международном конгрессе "International Cytokine Society" (Lake Tahoe, Nevada , 1998), 5-ом Международном конгрессе "Иммунореабилитация и реабилитация в медици-не"(Тенерифе, Испания , 1999), совместной научной конференции кафедры иммунологии и отдела экспериментальной и клинической иммунологии МЛК РГМУ (1999 г.). Объем и структура работы.

Диссертация изложена на страницах машинописи и состоит из введения, трех глав: "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", Результаты исследований и их обсуждение", заключения и выводов. Список литературы содержит 150 источников. Диссертация иллюстрирована таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

Естественный комплекс цитокинов получали при стимуляции лейкоцитов периферической крови животных (кролика, свиньи) по разработанной методике (Ковальчук JI. В., Ганковская Л. В., 1987).

Изучение действия ЕКЦ на постожоговую регенерацию глаза проводили на модели щелочного ожога роговицы в эксперименте. Эксперимент был выполнен на 24 половозрелых кроликах породы шиншилла массой ХО - 2.5 кг. Создание модели щелочного ожога роговицы, гистологический и морфометрический анализ проводили совместно со старшим научным сотрудником МНИИ ГБ им. Гельмгольца Илатовской Л. В. Стандартный ожог 3 степени был получен в обоих глазах с помощью круга из фильтровальной бумаги диаметром 8 мм, пропитанного 10% раствором ЫаОН, время экспозиции 20 с. Все манипуляции проводили под общей анестезией (2 мг/кг раствора калипсола внутримышечно) и местным обезболиванием (1% раствор дикаина). Глаза животных были ч разделены на две группы: опытная (правый глаз; п=24) и контрольная (левый глаз; п=24). В 1-ой опытной группе в качестве лечения применяли аутологичный комплекс цитокинов (12 глаз), а во 2-ой - гетерологичный комплекс цитокинов (12 глаз). Инсталляции супернатантов проводили по 50 мкл 5 раз в день в течение 2 недель. В контрольной группе в качестве лечения применяли инсталляции среды 199 по той же схеме. Ранее было показано, что надосадочная жидкость 24-часовых культур нестимулированных лейкоцитов не обладает активностью цитокинов и не оказывает влияния на регенерацию в модели проникающих ранений роговицы (авгореф. канд. дисс., Крайнева Т. А , 1994), поэтому такой контроль не проводили. Животных забивали методом воздушной эмболии. Энуклеированные глаза фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Центральную часть глаза заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Ппзон. Гистологическое исследование производили с использованием микроскопа МВЫ>. Морфометрическое исследование осуществляли на полуавтоматическом анализаторе А5М-68 фирмы Хеш".

Оценку клинической эффективности аутологичного и гетерологичного комплекса цитокинов на течение ожоговой болезни глаза проводили совместно с аспиранткой отделения травмы МНИИ ГБ им. Гельмгольца Чавлой Р. Эрозии и язвы роговицы выявляли с помощью флюоресцеина.

Забор слезной жидкости (СЖ) производили иа базе МНИИ им. Гельмгольца (зав. хирургическим отделением Еричев В. П., врач Василенкова Л. В.). Слезную жидкость забирали без стимуляции слезоотделения при помощи меланжера или стеклянного капилляра с оплавленным срезом, переносили в полистироловые микропробирки и хранили при -20°С. В случае выпадения осадка, перед проведением иммуноферментного анализа, образцы СЖ центрифугировали при 40С^ в течение 10 мин.

Цитокины определяли в слезной жидкости 62 здоровых доноров и 6 больных ожоговой болезнью глаза.

Концентрацию цитокинов в СЖ определяли иммуиоферментным методом с использованием коммерческих наборов отечественного (Протеиновый Контур, С.-Петербург -ИЛ-ip, ФНО-а) и зарубежного производства (R&D Systems, Quantikme, USA - ТФР-(51, ТФР-02).

Для получения активной, стандартизированной формы препарата на основе комплекса цитокинов использовали цитокин-содержащие супернатанты, полученные из культуры стимулированных клеток свиньи по стандартной методике (Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., 1987).

Фракционирование цитокин-содержащих супернатантов и электрофорез в полиак-риламидном геле проводили в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ (заведующий лабораторией Арион В. Я).

Концентрирование супернатантов проводили ультрафильтрацией и лиофилизацией.

Фракционирование сконцентрированных супернатантов проводили на хроматогра-фической колонке ("Whatman", Англия, 2,5 х 100 см или 1 х 100 см), заполненной сефа-дексом G-100. Элюцию проводили 0,9 % физиологическим раствором (рН = 7,4). Запись хроматографии вели в автоматическом режиме с помощью прибора "Uvicord" (LKB, Швеция), регистрируя экстинцию при длине волны 280 нм. Расчет молекулярных масс веществ, присутствующих во фракции,, проводили по результатам предварительно полученных данных об элюции маркеров с известной молекулярной массой.

Фракции, полученные после гель-хроматографии на сефадексе G-100, лиофилизова-ли и обессоливали на колонке с сефадексом G-15, уравновешенной дистиллированной водой. Фракции после обессоливания собирали, лиофилизовали и хранили при -20°С. Получение субстанции "Суперлимфа" проводили с помощью гель-хроматографии на хроматографической колонке ("Whatman", 2,5 х 100 см), уравновешенной дистиллированной водой. Определение области выхода фракции с необходимой молекулярной массой проводили по области элюции маркерных белков с известной молекулярной массой. Содержание белка во фракциях определяли методом Лоури (Lowry О. Н., 1951).

Гетерогенность полученных фракций оценивали с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с использованием SDS-Na. Молекулярную массу белков, входящих во фракции, определяли по кривой зависимости индекса миграции от логарифма молекулярных масс. Кривую зависимости строили, используя данные о разделении маркерных белков известной молекулярной массой (LKB Bromma, Швеция).

рН в субстанции (рН=7,3 + 0,5) определяли с помощью рН-метра по общепринятой методике. Биологическую активность во фракциях определяли в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции (J1XJI) и в тесте торможения миграция макрофагов. Регистрацию люминол-зависимой хемилюминесценции проводили на отечественном хемилюминометре ХЛМ-3. Перитониальные макрофаги крыс инкубировали с ЕКЦ в темноте при 37°С в течении 3 часов. После инкубации клетки дважды отмывались в бесцветном растворе Хенкса (рН=7.4). В кювету хемилюминометра помещали клетки, закапывали 2х10(-5) люминола ("Serva"). Регистрировали спонтанную хемилюминес-ценцию. Затем регистрировали индуцированную ЛХЛ под действием 0,025 мг/мл опсо-низированного зимозана ("Sigma"). В качестве контроля использовали клетки, проинкубированные в описанных выше условиях, но без добавления ЕКЦ. Инде*с предстиму-ляции (ИП) рассчитывали в относительных единицах: ИП = Ас/Ах, где Ас - амплитуда ЛХЛ стимулированных клеток, а Ак - амплитуда ЛХЛ контроля. За единицу активности принимали то максимальное разведение фракции, при котором ИП расен или больше 2-х.

Тест торможения миграции макрофагов проводили с помощью устройства для формирования клеточных микрокультур - "Мигроскрин" ("Ниармедик", Москва). Устройство представляет собой штатив для фиксации типсов в строго вертикальном положении над центром лунок 9б-луночного культурального планшета. В планшет предварительно вносили раститрованные образцы ЕКЦ в среде 199. В качестве контроля использовали лунки со средой 199. Штатив вставляли в крайние лунки планшета, в ячейки штатива вставляли типсы, заполненные суспензией клеток, выдерживали в течении 1 часа при комнатной температуре на строго горизонтальной поверхности. Штатив убирали и планшет инкубировали в COj-инкубаторе при 37"С в течении 20 часов. Количественный учет результатов после инкубации производили с помощью бинокулярной лупы. Размер клеточных колоний определяли по шкале внутри окуляра. Индекс миграции рассчитывали по формуле:

ИМ = .Do/Dk

Do - средний диаметр для 4-х параллельных опытных микрокультур,

Dk - средний диаметр для 4-х параллельных контрольных микрокулиур. За единицу активности в тесте торможения миграции макрофагов принимали то максимальное разведение фракции, при котором ИМ составляет <0,6.

Концентрацию цитокинов в субстанции "Суперлимфа" определяли иммунофер-ментным методом с использованием коммерческих наборов отечественного (Протвино-

вый Контур, С.-Петербург - ФНО-а) и зарубежного производства (R&D Systems, Quamikine, USA - ТФР-ß I, ТФР-р2).

Математическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.

Результаты исследования и их обсуждение. 1. Анализ состава цитокинов в слезной жидкости больных ожоговой болезнью глаза в сравнении со здоровыми донорами.

Цитокины играют важную роль в феномене иммунологической привилегированности глаза. Анализ содержания цитокинов в жидкости передней камеры глаза показывает преобладание содержания противовоспалительных цитокинов над провоспал«тельным и (Streilein J.W., 1992). Дисбаланс в системе цитокинов может приводить к развитию различных патологических состояний. Как стало известно в последнее время, в иммунопатогенезе ожоговой болезни глаза большое значение играют цитокины. С одной стороны, они могут вызывать повреждение, а с другой стороны, могут защищать от этого повреждения. Дисбаланс в системе цитокинов, вероятно, можно скоррегировать цитокинотерапией.

Для изучения действия экзогенных иммунопептидов на течение постожоговой регенерации роговицы исследовали цитокиновый статус у больных ожоговой болезнью глаза и здоровых доноров. Результаты исследования содержания провоспалительных (ИЛ-Iß, ФНО-а) и противовоспалительных (ТФР-ß 1, ТФР-32) цитокинов в СЖ здоровых доноров представлены в табл. 1.

Таблица 1

Содержание цитокинов в слезной жидкости здоровых доноров.

Цитокины (п-колнч.наблюдений) Частота выявления (%) Концентрация (п кг/мл)

min-max М+ш

ИЛ-Iß (п=31) 0 0 0

ФНО-а (п=62) 30 10-220 82+45

ТФР-ß 1 (ч=9) 100 90-443 236+71

ТФР-в2 (п=5) 100 10-65 30+11

Анализ полученных данных показал, что ИЛ-Ip не определяется ни в одном образце (в концентрации превышающей порог чувствительности иммуноферментного набора -20 пкг/мл). Отсутствие ИЛ-1 можно объяснить высоким содержанием в тканях глаза антагониста ИЛ-1. ФНО-а в СЖ здоровых доноров определяется в 30% в концентрации 82+45 пкг/мл. Содержание ФНО-а объясняется, как показано в одной из работ (Ferguson Т., 1994), его ролью в феномене иммунологической привилегированности глаза. ТФР-Р1 и ТФР-р2 определяются в 100% случаев. ТФР-pi определяется в концентрации 236+71 пкг/мл, ТФР-Р2 в концентрации 30+11. ТФР-р - один из основных иммуносу-прессивных факторов, обеспечивающих иммунопривилегированность глаза. Таким образом, в норме равновесие в системе цитокинов СЖ смещено в сторону противовоспалительных иммунопептидов, что согласуется с данными, полученными при исследовании цитокинов в жидкости передней камеры глаза.

Результаты исследования содержания цитокинов в СЖ больных ожоговой болезнью глаза представлены в табл 2.

Таблица 2.

Содержание цитокинов в слезной жидкости больных ожоговой болезнью

глаза.

Цитокины (n-кол и ч. на бл юден и й) Частота выявления <%) Концентрация (пкг/мл)

min-max M+m

ИЛ-ip (п=б) 100 35-67 52+1Г.5

ФНО-а (п=4) 100 22-206 60+45

ТФР-Р 1 (п=5) 100 50-112 87+23*

ТФР-Р2 (п=4) 100 10-74 45+21

*- значения достоверно отличаются от контроля (содержание цитокинов в СЖ здоровых доноров) по критерию Вилкоксона.

В результате проведенного исследования было показано, что ИЛ-1р выявляется в концентрации порядка 52+11,5 пкг/мл в 100% случаев, в то время как в норме он не выявляется. ФНО-а выявляется в 100% случаев, но в концентрации достоверно не отличающейся от нормы. У больных ожоговой болезнью глаза происходит снижение выработки ТФР-Р 1 в 2 раза, в то время как содержание ТФР-Р2 достоверно не отличается от

нормы. Таким образом, у больных ожоговой болезнью глаза наблюдается дисбаланс в системе цитокинов, смещенный в сторону провоспалительных цитокинов. ИЛ-1 является регулятором воспалительной реакции на всех ее уровнях и повышение его выработки у больных ожоговой болезнью глаза, вероятно, является ответом на массивное разрушение тканей глаза, возникающее в результате ожогового повреждения. Показано, что при ожоговом повреждении глаза наблюдается деструкция кератоцитов, которые, как известно, являются продуцентами ТФР-01 и это, вероятно, является одной из причин снижения уровня ТФР-Р1 в СЖ больных ожоговой болезнью глаза. Эти результаты свидетельствуют о правомерности использования цитокинотерапии при лечении больных ожоговой болезнью глаза.

2. Изучение механизмов действия естественного комплекса цитокинов на модели постожоговой регенерации роговицы в эксперименте.

Глаз является иммунологически привилегированным органом. Этот феномен возник как физиологическая адаптация, так как развитие иммунных и воспалительных реакций в пределах глаза может привести к необратимым нарушениям основной его функции - зрения фгеНеш I. V/., 1989). Поддержание иммунологической привилегированности возможно, благодаря особенностям строения глаза, заключающимся в наличии гемато-глазного барьера, афферентных дренажных путей, отсутствии лимфатических сосудов, проходящих через сосуды крови, а также в результате действия ряда факторов. Эти факторы включают: иммуносупрессивное микроокружение (ТФРР, а-МСГ, ВИП), лидирующую роль С08+-лимфоцитов и ТЬ-2 типа, а также конститутивную внутриглазную экспрессию Рав-лиганда (промотор удаления активированных Т-лимфоцитов) (21егЬи1 М. е( а!1, 1996).

Ожоговое повреждение роговицы приводит к деструкции, развитию воспаления , нарушению регенерации, изменению ее структуры. Все это приводит к тяжелым осложнениям трудно поддающимся лечению. При кератопластике по поводу ожоговых бельм трансплантат мутнеет или отторгается в 18-79% случаев (Мороз 3. К, 1987).

Цитокины являются регуляторами процесса заживления на всех его стадиях.

В связи с этим была разработана схема применения аутологичного и гетерологич-ного комплексов цитокинов на модели щелочного ожога роговицы. Схема лечения была предложена в результате анализа патогенеза ожоговой болезни глаза, а также данных, полученных после применения ЕКЦ на модели проникающих ранений роговицы (автореф. канд. дис., Крайнева Т. А., 1994).

Изучение клинических характеристик влияния естественного комплеса иитокинов на П9СТ<?ЖРГ<?РУ)0 регенерации р<?ГРРНЦЬ),

Клиническую оценку действия аутологичного и гетерологичиого комплексов цитокинов проводили по следующим критериям: динамика заживления эрозий роговицы, степень изъявления роговицы, степень неоваскуляризации, степень воспалительной реакции.

Действие аутологичного и гетерологичиого комплексов цитокинов начинало наблюдаться на 7-е сутки после ожога и характеризовалось уменьшением воспалительной реакции, степени эрозии и степени неоваскуляризации роговицы. Так, в контрольной группе эрозия роговицы составляла 2,5 мм, а в опытной группе • 1 мм. В этот период в контрольной группе наблюдалось врастание в роговицу поверхностных новообразованных сосудов со стороны лимба (II степень густоты), а в опытной - отмечалось образование единичных сосудов. К 30-м суткам формируется помутнение различной интенсивности с эрозивной поверхностью в центре. Размер эрозий в опытной группе составлял в среднем 2 мм, а в контрольной группе 3 мм. В контрольной группе, в 50% случаев , наблюдалось врастание сосудов в виде густой сети (6 мм от лимба). В опытной группе, в 25% случаев, наблюдалось врастание сосудов негустой сетью (4 мм от лимба).

Таким образом, под действием естественного комплекса цитокинов происходит уменьшение размера эрозий и степени неоваскуляризации роговицы. Разницы в действие аутологичного и гетерологичиого комплексов цитокинов выявлено не было.

Гистологический и морфометрический анализ действия естественного комплекса иитокинов на течение постожоговой регенерации роговицы,

Как показала сравнительная оценка процессов заживления ожогового повреждения роговицы, в первые три дня разницы в морфологической картине контрольной и опытных групп не наблюдалось.

Во всех группах была выявлена определенная закономерность поражения роговицы, связанная, по-видимому, со спецификой поражения структур, вызванных ожоговой травмой. В морфологической картине роговицы при щелочном ожоге выявлены 3 зоны поражения:

1 - зона эпицентра ожогового поражения,

2 - переходная зона, где преобладали реактивные изменения,

и

3 - лимбальная зона, где выявлялись уже более сохранные структуры роговичной ткани.

Характерным для щелочных ожогов роговицы является преобладание некротических процессов в роговице в первые три дня после травмы. В течении первых суток отмечалось полное разрушение и исчезновение роговичных клеток, эпителия, а также деструкция эндотелиальных клеток в зоне ожога во всех экспериментальных группах. Вместе с тем, в этот период сохранялась структура коллагенового каркаса роговицы - ее пластинчатость.

Наряду с полным отсутствием роговичных клеток в зоне эпицентра ожога, в переходной зоне выявлялось обилие фибробластических элементов в строме роговицы. Для щелочных ожогов роговицы характерно развитие процессов: альтерации, воспаления и регенерации. Причем, в течении первых 7-ми дней преобладали альтеративные изменения. В их основе было разрушение коллагенового каркаса роговицы , которое происходило на 3-ий день в поверхностных слоях эпицентра, достигая наибольшей выраженности к 7-м суткам. Формировался язвенный дефект.

Воспалительные изменения в ткани роговицы в первые три дня были небольшими и в основном локализовались в области лимба. Однако, к 7-м суткам воспалительные явления несколько усиливались.

В течение первой недели после ожога отмечалась активная регенерация эпителия в виде однослойного пласта. Однако, регенерированный эпителий отличался плохой жизнеспособностью, наблюдалась его десквамация (особенно в контрольной труппе) с образованием широкой эрозивной поверхности. К 7 дню в эпицентр начинают проникать единичные клеточные элементы, среди которых можно выявить макрофаги и фибробла-стические элементы. В этот период впервые при морфологическом исследовании в области эпицентра ожога выявлялась разница между контрольной и опытными группами. В опытной группе по сравнению с контрольной выявлялось значительное количество клеточных элементов, состоящих из макрофагов и фибробластических элементов. Однако, более четкая разница между контролем и опытом наблюдалась через 14 дней (рис.1).

В этот период репаративные процессы начинали четхо выявляться как в контроле, так и в опыте, но в опытной группе фибробластическая реакция ткани роговицы была более выраженной.

а 6

Рис. I .Зона эпицентра через 14 дней после щелочного ожога.

а - контроль. Постожоговая язва роговицы. Активизация фибробластических элементов в зоне эпицентра и в переходной зоне. В глубоких слоях роговицы клеточные элементы отсутствуют; б - после воздействия ЕКЦ. Врастание фибробластических элементов в строму роговицы, как в поверхностных, так и в глубоких слоях роговицы. Увеличение х 160. Окраска гематоксилином и эозином.

Если в контроле через 14 дней в эпицентре роговицы формировался язвенный дефект и в области дна язвы выявлялась лишь небольшая макрофагальная инфильтрация, состоящая из единичных фибробластических элементов, то в опытной группе в эпицентре только самые поверхностные слои находились в состоянии некроза. Язвенный дефект не формировался. В средних и глубоких слоях эпицентра, помимо макрофагов, было большое количество фибробластических элементов, прослаивающих сохранившиеся роговичные пластинки.

В этот период наблюдалась активная пролиферация эндотелиальных клеток, формирующих тонкую ретрокорнеальную шварту, которая отмечалась как в опытной, так и в контрольной группах. Это осложнение было связано с тотальным поражением эндотелия после ожога, включая и периферическую зону.

Четкая разница между контролем и опытом наблюдалась на 14-й день в переходной зоне. Обращало внимание большое накопление фибробластических элементов (рис. 2) и их активность в переходной зоне роговицы в опытной группе по сравнению с контрольной. Наиболее четкая разница в состоянии роговицы после лечения комплексом

цитокинов выявлялась через 30 дней после ожога (рис.3). Как в контрольной, так и опытных группах, в эпицентре ожогового повреждения роговицы выделяются 3 слоя: поверхностный, средний и глубокий. В опытной группе выявляется большое количество фибробластов. Поверхностный слой представлен новообразованной фиброзной тканью, заместившей разрушенную роговицу при ожоге. В опытных группах происходит восстановление базального слоя эпителия в отличии от контрольной группы. Средние и глубокие слои отличаются более сохранной структурой по сравнению с контрольной группой. В опытных группах выявляются хорошо дифференцируемая пластинчатость роговицы, равномерное распределение фибробластических элементов между пластинками во всех слоях. В контрольной группе фибробластические элементы отсутствуют в глубоких слоях.

Применение комплекса цитокинов оказывает благоприятное влияние на восстановительные процессы в роговице. Под действием ЕКЦ изменяется состав мигрирующих клеток в очаг поврежедения. В опытных группах - это макрофаги, а в контрольной -нейтрофилы. В основе механизма действия комплекса цитокинов воздействие на макрофаги и фибробластические элементы роговиц, направленное на стимуляцию их функциональной активности. Это способствовало более быстрой резорбции продуктов распада и более активной пролиферации фибробластических элементов, замещающих нек-ротизированные ткани после ожога. Быстрое восстановление фибробластических элементов в роговице позволяет сохранить частичную пластинчатость роговицы в очаге ожога, значительно отграничивая зону рубцовых изменений в роговице после ожога, по сравнению с контрольной группой. Такая структура роговицы под действием ЕКЦ существенно отражается на ее оптической характеристике, формируя более нежное, полупрозрачное постожоговое помутнение. Вероятно также, что под действием ЕКЦ активизируется выработка эндогенных цитокинов сохранившимися клетками роговицы. Гистологический и морфомегрический анализ не выявил отличий в действие аутоло-гичного и гетерологичного комплексов цитокинов на течение постожоговой регенерации роговицы.

Поверхностные слои

Средние слои

Глубокие слои

Рис.2.Количество фибробластических элементов в гистологических срезах (в переходной зоне) роговицы глаза кролика на 14-е сутки после ожога По оси абсцисс:

1 Контроль ( п = 13 )

2 Применение аутологичного комплекса цитокинов ( п = 13 )

3 Применение гетерологичиого комплекса цитокинов (п = 13 )

Рис.3.Зона эпицентра через 30 дней после щелочного ожога, а - контроль. Сохраняется активная воспалительная инфильтрация в поверхностных и средних слоях. Гомогенизация роговичных пластинок и отсутствие клеточных элементов в глубоких слоях; б - после воздействия ЕКЦ. Восстановление базального слоя эпителия. Замещение поверхностных слоев стромы роговицы фиброзной тканью. Врастание фибробластических элементов в глубокие слои стромы и восстановление ее пла-стинчатости. Увеличение х160. Окраска гематоксилином и эозином. Цифрами обозначены: 1 - поверхностные слои, 2 - средние слои, 3 - глубокие слои. Ф- обозначение фибробластических элементов.

3, Отработка технологии получения лекарственной формы препарата на основе естественного комплекса цитокинов.

Как было показано, ЕКЦ является перспективным лекарственным средством, ускоряющим процессы регенерации. Для внедрения в клиническую практику необходимо было разработать технологию получения лекарственной формы препарата. Наиболее удобным источником клеток для получения цитокинов является свиная кровь. Такой выбор объясняется несколькими факторами:

1. Цитокнны свиньи и человека имеют большой процент гомологии.

2. Известно, что при различных патологиях происходит нарушение выработки ци-токинов, поэтому кровь больных в качестве источника получения собственных цигоки-нов использовать не следует.

3. Исследование по изучению влияния аугологичного и гетерологичного комплексов цитокинов на постожоговую регенерацию роговицы не выявило отличий между их действием.

4. Одномоментно можно получать большие объемы крови.

Оптимизация получения фракции, содержащей комплекс цитокинов.

Получение цитокин-содержащих фракций проводили по схеме, описанной в работах Карасевой М. В. (дисс. к.м.н., 1991) и Крайневой Т. А. (дисс. к.м.н., 1993). Суперна-танты, содержащие естественный комплекс щггокинов, полученные по стандартной методике (Ковальчук JI. В., Ганковская Л. В., 1987) в объеме 350 мл, концентрировали с помощью ультрафильтрации на установке фирмы "Amicon" (Голландия) до конечного объема 13-15 мл. Фракционирование проводили методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной физиологическим раствором и предварительно откалиброванной маркерными белками с известной молекулярной массой. Фракции с молекулярной массой 60-80 кДа (Ф1), 30-60 кДа (Ф2), 10-30 кДа (ФЗ) лио-филизовали и обессоливали. Фракции после обессоливания лиофилизовали. Во всех фракциях определяли активность (тест ЛХЛ и тест торможения миграции макрофагов) распределялась следующим образом: Ф1- 200 усл. ед./мг , Ф2 - 400 усл. ед./мг, ФЗ -1000 усл. ед/мг.

Цикл очистки цитокин-содержащих супернатантов по технологии описанной выше, занимает много времени и не приспособлен для работы с большими объемами супернатантов. Возникла проблема оптимизации этого процесса. Была предложена другая схема (рис. 4) получения субстанции, содержащей комплекс цитокинов. По предложенной схеме, ультрафильтрацию, как метод концентрирования, заменили на лиофилизацию. Фракционирование супернатантов стали проводить на колонке с сефадексом G-100, уравновешенной дистиллированной водой, что позволило избежать нескольких промежуточных этапов. Область выхода фракции с молекулярной массой 10-40 кДа (область наибольшего выхода цитокинов) определяли по области выхода маркерных белков, предварительно запущенных на колонку.

Рис.4.Основные этапы получения субстанции.

Полученную фракцию лиофилизовали (субстанция). ИП в тесте люминол- зависимой хемилюминесценции был более 2 при дозе 0.1 мкг/мл по белку. ИИ был равен 50% при той же дозе препарата. Таким образом, активность субстанции составляла 10000 усл. ед. в обоих тестах в пересчете на 1 мг белка. При меньших затратах времени и реактивов, мы получили на порядок большую активность препарата, чем во фракциях получаемых по первоначальной схеме.

Определение молекулярных масс белков с помощью 5Р5-электро(Ьореза в полиакрила-мидном геле.

Для характеристики субстанции и определения гетерогенности входящих в нее белков провели вОБ- электрофорез в полиакриламидном геле. Анализ электрофореграммы показал, что в субстанции присутствуют две мажорные полосы с молекулярной массой 12.3 кДа и 10.47 кДа. По данному электрофорезу была проведена денситометрия на приборе Шговсап ХЬ (ЬКВ, Швеция). На рис. 5 представлены денситограммы маркеров и субстанции. Результаты анализа денситограммы субстанции показали, что на 11 пик (Мг = 12.3 кДа) и на 12 пик (Мг = 10.47 кДа) приходится 80.2 % всего белка.

< о

А

Относительный икаете миграции (1«)

Рис. 5. а- Деиснтограмма маркеров

1- овочрансферрин (Мг-77кДа), 2- альбумин (Мг=66,25кДа), 3- овальбумин (Мг=43кДа),

2- карбанп1драза'(Мг=30кДа), 5- миоглобин (Мг-17,2кДа), б- цитохрои С (Мг-12,ЗкДа)

б- Деиснтограмма субстанции

I- пик выхода белка с Мг=12,ЗкДа, 2- пик выхода белка с Мг-10,47кДа

Стандартизация субстанции, содержащей комплекс цитокинов.

Одной из задач данной работы явилось получение стандартизированной формы ге-терологичного комплекса цитокинов, так как для практического применения необходимо знать точную дозу используемого препарата и его активность.

Стандартизацию осуществляли двумя группами методов. Первую группу составили биохимическим методы. В каждой серии препарата измеряли концентрацию белка, рН. Определение молекулярной массы белков, входящих в субстанцию, осуществляли с помощью гель- хроматографии на колонке с сефадексом О-100, уравновешенной 0,9% физиологическим раствором. Самая высокая точка пика составила 25 кДа (рис.б). Пик начинает выходить в области, соответствующей молекулярной массе 40 кДа, и заканчивает выходить в области 10 кДа. Гетерогенность субстанции определяли с помощью БОЭ-электрофореза в ПААГ. Электрофорез показан на рис.7. В субстанции выявляются две мажорные полосы (10,47 кДа и 12.3 кДа), которые повторяются от серии к серии.

Рис. 6. Профиль элюции субстанции "Суперлимфа" на колонке с сефадексом G-100. По оси ординат - экстинция при длине волны 280 нм, по оси абсцисс - объем элюции в мл. Стрелками показан выход маркеров - ГД(2000 кДа), БСА (68 кДа), МГЛ (17 кДа), ЦитС (12,3 кДа), ДНФ (0,256 кДа).

в, в, в,

г

2

3

5

6

£ ->

А - маркеры I В(1-3) - субстанция | "Суперлимфа"разных серий

'' ''' С - "Суперлимф"

Рис. 7. 505-электрофорез в ПААГ. I - овотрансферрин ( 77 кДа), 2 - альбумин ( 66,25 кДа), 3 - овальбумин ( 43 кДа), 4 -карбангидраза ( 30 кДа), 5 - миоглобин ( 17,2 кДа), 6 - цитохром С ( 12,3 кДа).

В 3-х сериях субстанции было проведено определение известных цитокинов. Результаты представлены в табл.3. Таблица 3.

Цнтокины, выявляемые в субстанции.

Цнтокины Концентрация (пкг/мл) п=3 Активность (усл. ед.)

ТФР-Р1 470 + 35

ТФР-Р2 270 + 20

ИЛ-6* 200 + 65

ИЛ-1* 3200

ФНО-а 350 +55

МИФ 1000

*- отмечены цитокины, определение которых было проведено Крайневой Т. А.

Цитокины были определены с помощью коммерческих наборов .предназначенных для выявления человеческих иммунопептидов. Так как свиные и человеческие ТФР - р 1, Р2 обладают 100% гомологией, а ФНО-а 80%. ИЛ-1 и МИФ определялись в биологических тестах.

Определение цитокинов в каждой серии препарата трудоемко и дорогостояще, поэтому были предложены тесты на биологическую активность - ЛХЛ, тест торможения миграции макрофагов (вторая группа методов стандартизации препарата). Выбор этих тестов обусловлен мощным стимулирующим эффектом комплекса цитокинов на клетки макрофагально-моноцитарного ряда. Во всех сериях препарата билогическая активность составляла 10000 усл. ед./мг.

Для удобства использования субстанцию соединили с наполнителем. В качестве наполнителя использовали полиглюкин, разрешенный в офтальмологической практике. На 100 мкг субстанции приходится 50 мкл стандартного раствора полиглюкина. В таком виде препарат получил название "Суперлимф".

Препарат считается стандартным, если на электрофореграмме выявляются две мажорные полосы (10,47 и 12,3 кДа) на которые приходится не менее 80% ; биологическая активность в тестах люминол-зависимой хемилюминесценции и торможения миграции макрофагов составляет 10000 усл. ед./мг.

Эффективность полученного препарата была показана в ограниченных клинических испытаниях в группе больных первичной открыгоугольной глаукомой с целью предупреждения избыточного рубцевания в послеоперационный период.

ВЫВОДЫ

1. Изучено действие аутологичного и гетерологичного комплексов цитокинов в модели постожоговой регенерации роговицы.

Гистологический и морфометрический анализ показали, что ЕКЦ изменяет состав клеток, мигрирующих в очаг повреждения, ускоряет эпителизацию, восстановление эндотелия роговицы, миграцию макрофагов и фибробластических элементов с активацией их функциональных показателей. Все это способствует быстрому замещению некроти-зированных тканей и восстановлению частичной пластинчатости роговицы, что существенно отражается на ее оптической характеристике.

Применение естественного комплекса цитокинов способствует уменьшению размеров эрозий и степени иеоваскуляризации.

2. Не выявлено достоверных различий в эффективности действия аутологичнго и гетерологичного комплексов цитокинов на постожоговую регенерацию роговицы.

3. Выявлен дисбаланс в системе цитокинов слезной жидкости у больных ожоговой болезнью глаза. ИЛ-ip выявлялся в концентрации 52+11,5 пкг/мл, в то время как в норме он не выявляется. ТФР-Р1 определяется в концентрации 87+23 пкг/мл, что в 2 раза меньше по сравнению с нормой.

4. Разработана технология получения стандартизированной формы препарата на основе естественного комплекса цитокинов ("Суперлимф"). В состав препарата входят белки с молекулярной массой меньше 40 кДа, 80,2% из которых приходится на пептиды с молекулярной массой 10,47 кДа и 12,3 кДа. Удельная биологическая активность в тестах люминол-зависимой хемилюминесценшш и торможения миграции макрофагов составляет 10000 усл. ед / мг белка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Эндогенные иммунопептиды в лечении ожоговой болезни глаза в эксперименте.// Тр. 1 национ. конф. по аллергол. и клин, иммунол. 29-31 янв. 1997. Сб. трудов, М. стр. 455. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук JI. В., Илатовская Л. В.)

2. Цитокинотерапия в постожоговой регенерации роговицы в эксперименте.// 4 Российский Национальный конгресс "Человек и лекарство".Тез. докл. - Москва.- 1997 г. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В.).

3. Combination of natural cytokines in regulation of regeneration of rabbit cornea. // Annual meeting of the international society for interferon and cytokine research. Journal oflnterferon and cytokines research.- 1997,- Vol.17.- Suppl. 2.- w 19. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В.).

4. Effect of natural cytokines on regeneration of rabbit cornea.// The 5th annual conference International Cytokine Society. Nov. 9-13. 1997. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В.).

5. Цитокинотерапия репаративных процессов при антиглаукоматозных операциях.// Сб. трудов 2-го Национального Конгресса РААКИ 21-24 сентября. Москва,- 1998 г.- стр. 344. (Соавт. Ганковская Л. В., Еричев В. П., Ковальчук Л. В.)

6. Цптокиновая концепция патогенеза и лечения воспалительных заболеваний па-родонта.// Сб. трудов 2-го Национального Конгресса РААКИ 21-24 сентября. Москва-1998 г.- стр. 371. (Соавт. Ганковская Л. В., Иванюшко Т. И., Ковальчук Л. В.).

7. The use of natural complex cytokine in ocular wounds treatment.// Second Joint Meeting of the International Cytokine Society and the International Society for Interferon and Cytokine Research. 25-30 Oct. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В.).

8. Естественный комплекс цитокинов как лекарственный биорегулятор при заживлении щелочных ожогов роговицы (экспериментально-морфологическое исследование).// Вестник офтальмологии, № 1 , 1998, стр. 41-45. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В.).

9. Комплекс цитокинов в регуляции постожоговой регенерации в эксперименте.// Russian Journal of Immunoloigy.- Vol. 3,- num. 1,- p. 53-60.(Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В., Константинова Н. А.).

10. Стимуляция постожоговой регенерации роговицы комплексом цитокинов в эксперименте. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, №3, 1999, стр. 314316. (Соавт. Ганковская Л. В., Хорошилова-Маслова И. П., Ковальчук Л. В., Илатовская Л. В., Константинова Н. А.).

Список сокращений

БСА - Бычий сывороточный альбумин

ВИЛ' - Вазоинтестинальный пептид

гд - Голубой декстран

ДНФ - ДНФ-Ь-аланин

ЕКЦ - Естественный комплекс цитокинов

ИЛ - Интерлейкин

ИМ - Индекс миграции

ИП - Индекс предстимуляции

ЛХЛ - Люминол-зависимая хемилюминесценция

МГЛ - Миоглобин

МИФ - Миграцию ингибирующий фактор

МСГ - Меланоцитстимулирующий гормон

ПААГ • Полиакриламидный гель

СЖ - Слезная жидкость ТФР - Трансформирующий фактор роста ФНО - Фактор некроза опухоли ЦитС - Цитохром С