Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Цитогенетические критерии определения повышенного риска злокачественных заболеваний и характера опухолевого процесса при его развитии

/ (0 &

Г s

у

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

ИМ. ПРОФ.Н.Н. ПЕТРОВА

На правах рукописи

Монахов Александр Степанович

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЫШЕННОГО РИСКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ХАРАКТЕРА ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА ПРИ ЕГО РАЗВИТИИ

(клинико-экеперимснтальное исследование)

14.00.14 - онкология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

чл.-корр АМН РФ, профессор К.П.Хансон

профессор В.Ф.Семиглазов

Санкт-Петербург 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

список принятых сокращений:................................................................................... 5

В В ЕДЕН И Е.................................................................................

ГЛАВА I. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)..........................................................17

i.!. Особенности цитогенетического исследования спорадических и

семейных злокачественных заболеваний.....................................................................................17

1.2. Материт и методы цитозенетическоео наследования злоюсчествемных заболеваний 1,2.1,

Объекты исследования.............................................................................................................19

1. 2.2, Методы исследования.....................................................................................................25

I,2,3. Принципы медико-генетического консультирования онкологических пациентов...............28

1.3. цитогенетические исследования при опухолевых заболеваниях

молочной железы.............................................................................................................30

{.4. цитогенетические исследования при опухолевых заболеваниях

органов желудочно-кишечного тракта ................................................................... 44

I.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................ 58

Г ЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........ 59

II. 1. Материал исследований........................................................................................59

ILL1. Экспериментальные исследования;.................................................................................59

а) исследования на животных...............................................................................................................................19

б)исследования на клеточных культурах.......................................................................................„„...„,.....,.,.60

II.1.2. Обследование людей.......................................................................................................60

112. методы исследований............................................................................................62

11.2. t- Методы иссаедованш экспериментальных животных а переттемойклеточной культуры;........,,..,..................................................................................................................

а) патогенетическое обследование животных...................................................................................................62

б) исследование на краткосрочной культуре опухолевых клеток крысы и на клеточной ттт COLO HSR из карциномы толстого кишечника человека...........................................................................................64

i L 2.2. Методы обследования людей.......................................................................................... «50

а) иедикю-генетическое консультирование пациентов.....................................................................................66

б) онтогенетические обследование пюдей.................................................................................................„.„...70

Г ЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ....................

iii.i. цитогенетический и канцерогенный эффект

нитююметйлмочевины (НММ)..................................................................................7 Í

гü.2.цитогенешческие исследования на клеточной культуре:

COLO HSR и шванномы................................................................................................... 80

iii.3. цй'тогенетическое обследование доноров отделения переливания кгови нии онкологии и практически здоровых людей................................... 87

Ш.4. Медико-генетическое консультирование и цитогенетическое

обследование пациентов клиники НИИ онкологии отделения опухолей молочной железы.......................................................................................... 95

111.4.2. Обследование людей со спорадическими опухолевыми заболеваниями молочной ;жетэы95 ÍU. 4. В. Обследование членов семей с предполагаемой высокой тредрасположенностью к

опужигевым заболеваниям молочной железы...........................................................................110

Ш.5. медико-генетическое консультирование и цитогенетическое

обследование пациентов клиники НИИ онкологии проктолошческого

отделения.........................................................................................................................................126.

Ш.5.1. Обследование пациентов со спорадическими опухолевыми заболеваниями органов

¿■¡селудочно-киыечноео траюпа............................................................................................... 126

111. j. 2. ¡Обследование членов семей с предполагаемой высокой

предрасположенностью к опухолевым заболеваниям органов жепудочно-

к и шечнаго тракта.................................................................................................................. 13 5

ш,б. медико-генетическое консультирование и цитогенетическое

обследование пациентов при соответствующих жалобах или при

клинических признаках онкологических заболеваний других

локализаций, несвязанных с семейной предрасположенностью...........152

iii.7. медико-генетическое консультирование и цитогенетическое

обследование пациентов поликлинического отделения НИИ онкологии,

отобранных для терапии "кламином"...................................................................... í 59

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ......................... 165

IV«!. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ исследования:.............................................................. 165

1 У. IJ. Обсуждениерезультатов, полученных в эксперименте на животых............................ i 65

i V. 1.2. Обсуждение результатов, полученных на клеточных культурах................................. 167

IV .2 .Обследование людей............................................................................................. 169

1 ¥. 2.1. Обсуждение результатов цшпогенегпического обследования пациентов I группы........169

IV.2.2. Обсуждение результатов ццтогенетическояо обследования пациентов II группы.......171

I Г. 2.3. Обсуждение результатов цшпоген&пическоае обследования )шциентов III аруппы..... 184

IV. 2.4. Обсуждение результатов цитояенетическово обследования пациентов I Угруппы.......191

1К2.5. Обсуждение результатов цитагеметычеекою обследования пациентов V группы........194

IV.2.6. Компышшрная программа по ц1тоеенетииестму обследованию пациентов с

опухолевыми заболеваниями ореановжелудвчно-кишечнозо тракта.......................................201

IV. 2.7. Обсуждт * ие резул ьтатов ц итозеи&п ического обследования па ц изшов VI группы.......202

I У. 2.8. Обсуждение результатов цитогенетииескозо обследования пациентов VII группы..... 205

'ик'ЛЮЧРНИК »117

ЛИТЕРАТУРА

217

приложение..

Список принятых сокращении;

Он - опухоль; Хр - хромосома ;

ХрА - хромосомные аберрации: нарушения структуры хромосом; t - транслокация: структурные изменения хромосом (Хр), в ходе которых Хр сегмент включается й другое место той же Хр или переносится в другую Хр, либо происходит обмен двумя сегментами между гомологичными или негомологичными Хр. В двух последних случаях говорят о реципрокной транслокации:tгер;

del - делеция; потеря интерстнциального (не содержащего нуклеиновой кислоты или бедного ею участка) хромосомного или хроматидноге фрагмента в результате, как правило, двух разрывов; при одном разрыве - потеря концевого ацентрического фрагмента; терминальная деления - ter deader - обломки хромосом;

(+ или -) - если знак стоит перед номером Хр, это означает дополнительную или отсутствующую Хр; если знак стоит после номера Хр, это означает уменьшение или увеличение длины Хр;

luv - инверсия: внутрихромосомная структурная перестройка, сопровождающаяся перевертыванием хромосомного или хроматидного сегмента па 180 ;

ins - ннсерция: вставка или добавление в хромосому или хроматиду недифференцированного генетического материала;

ï изохромосома; моноцентрические хромосомы с двумя генетически идентичными плечами;

end - -эндоредушшкация: парное увеличение числа хроматид на каждой центромере без деления ядра или клетки;

пшерянеуплоидия - увеличение числа хромосом, не кратное гаплоидному (46+1; 46+2; 46+3 и т.д.);

полиплоидия - увеличение диплоидного числа хромосом путем добавления целых хромосомных наборов (трпплоидня-Зп; тетраплоидия-4п и т.д.);

DMS - (ДМХ) двойные маленькие хромосомы (принято считать их делегированными внутрихромосомными фрагментиками с амплифнцированными онкогенами); Гн - ген;

КМ - костный мозг;

fra-сайты или СЛХ наиболее ломкие участки (сайты) на Хр;

HSR - (ГОР) гомогенно-окрашенные районы Хр;

ЛФ * лимфоцит;

МЖ - молочная железа;

ОМЖ - опухоль молочной железы;

РМЖ - рак молочной железы;

ИПР - шшазивный протоковый рак;

ФАМ - фиброаденоматоз;

МЭ (по Х)-мастэктомия по Холстеду;

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт;

ТК - толстый кишечник*.

ПК - прямая кишка;

РЖ - рак жеяудка;

АП - адепоматозиый поли поз;

САП - семейный адсноматозный пошгаоз;

МПТК- малиг нязнро&здшый иолиооз толстой кишки;

ДПТК диффузный пояипоз толстой кишки;

РТК - рак толстого кишечника;

СПК - семейный поли поз кишечника;

СП - семейный полипоз;

ССР - синдром семейного рака;

РПК - раж прямой кишки;

РОК - рак ободочной кишки;

АКЖ - адеиокарцииома желудка;

АТК - аденома толстого кишечника;

ФАМ-фиброаденоматоз;

ФКС фиброколонскопия;

ФГС-фиброгастро<жопия;

УЗИ- ультрозвуковое исследование;

РЯ - рак яичника;

XI - химиотерапия (поТМР: тиофосфамид + метотрексат ■+• З-фторурацнл: по СЫТ: циююфосфан + метотрексат + 5-фторурация; по СВР: цшшофосфан + доксанутицин + 5-фторурацил); ПХТ - полихимиотерания; РТ - рентгеио-радиотерапия; ГТ - гамма-терапия; 1ЦЖ - щитовидная железа; ЛУ~лимфатические узлы; ЯО - .ядрышкрвый организатор; пробанд - первично обратившийся в онкологическую клинику пациент, в семье которого выявлены медико-генетические признаки высокой предрасположенности к злокачест венным заболеваниям; сибс - кровный родственник пробанда; ХМЛ-хроническая миелоидная лейкемия; ОНЛЛ острая неяимфоциарная лейкемия.

ВВЕДЕНИЕ

Посаге длительных научных дискуссий и экспериментальных проверок было доказано, что опухолевое (Оп) заболевание имеет в своей основе нарушение генетического материала в соматических клетках, т.е. является генетическим (Kiiudsoii с соавт.,1976; Knudson,1985; Сгосе,198б; Heim, Maiidahl, Mitelman,1988; Evans, 1989; Mite)man, Heim, 1990,1993). Эти доказательства получены как при цитогенетических, так и при молекулярно-генетических исследованиях, которые успешно применяются в мировой практике при обследовании онкологических пациентов. Это дает возможность во многих случаях решать основные проблемы онкологии: определять наиболее раннюю диагностику Оп заболеваний, разрабатывать более целенаправленное специфическое их лечение и контролировать эффективность применяемой терапии при таких заболеваниях.

В отечественной онкологической практике применение указанных методов обследования онкологических пациентов на ранних этапах развития Оп заболевания происходит крайне редко. В то же время при таких обследованиях во многих случаях имеется возможность до клинического проявления Оп заболевания выявлять специфические и неспецифические цитогенетические и/или молекулярно-генетические нарушения в соматических клетках, свидетельствующие о высокой вероятности развития в организме пациента определенного злокачественного заболевания (Sandberg, 1980,1984,1987,1991,1994; Mitelman, 1985,1988,1994; Miielmaii, Mertens, Johansson, 1997; Trent с соавт.,1989; Patliak, de Lucca, Polyzos,1992; Wolman с соавт.,1992; Mertens с соавт.,1997). Кроме того, по количеству и типу неспецифических хромосомных (Хр) нарушений имеется возможность определять степень распространенности и вероятность мегасгазирования Оп процесса (Hagmar с соавт.,1994; Brooks, 1995). To-есть при применении цитогенетических и молекулярно-генетнческих методов обследования онкологических пациентов име-ется реальная возможность наиболее ранней диагностики и прогноза развивато-щегоея Оп заболевания у каждого пациента.

При цитогенетическом исследовании канцерогенеза, индуцированного различными вредными воздействиями, определен спектр принципиально

возможных структурных и числовых Хр нарушении (Захаров с соавт.,1982; Haraden, Klm-ger,1985 ) в соматических клетках, как у животных, так и у человека.

Практически все структурные и числовые (геномные) Хр нарушения, определяющие характер и уровень мутационных изменений в клетках организма, с современной точки зрения рассматриваются, как источник непрерывной и самоподдерживающейся изменчивости, которая является потенциально онкогенной. Установлено, что такие структурные Хр нарушения (Хр аберрации -ХрА), как рециирокные транслокации (t rep), делении (del), инверсии (inv), инсерции (ins), а также геномные нарушения - эидоредупликации (end), пшеранеупяоидна (46-И,+2,+3 и т.д. Хр ) и полиплоидии (2а,Зп и т.д.), лежат в основе инициирующей стадии канцерогенна. Все Хр изменения являются сигнальными индивидуальными генетическими проявлениями изменчивости клеток, а их частота отражает сложность одновременных изменений многих структурных и функциональных особенностей генов (Гн), Исходя из этого делается вывод, что ХрА - это маркеры Гн изменений, а рак - результат нарушений регуляторных Гн (Полищук,1988).

До сих пор остается много вопросов по значимости различных специфических и неспецифических Хр нарушений в разнонаправленных процессах малигиизации соматических згаеток. Характер взаимосвязи мутагенеза с канцерогенезом по этим критериям изучен недостаточно, и его исследование является высокоактуальным, гак как отражает механизм развития Оп процесса. Для изучения этого механизма необходимы исследования мутагеиоа-канцерогемеза в динамике in vivo. Такие исследования в основном проводятся на экспериментальных животных, но они немногочисленны (Косиченко, 1976-1978; Labauve с соавт.,1980; Монахов, 1985, 1987,1988,1991; Монахов с соавт. 1987,1991-1993). В то же время, только такие исследования могут определить связь развития в организме Оп процесса, его характера и его интенсивности с предшествующими специфическими и неспецифическими цнтогенетичеекими нарушениями в соматических клетках этого же организма.

К неенецнфичшктш цитогенетическим нарушениям относят Хр и хроматидные разрывы, полиплоидии и эидоредупликации, двойные маленькие Хр - double minute chromosomes (ДМХ или DMS), К. специфическим цитогенетическим нарушениям относят стабильные Хр и геномные нарушения, которые не мешают

клеткам делиться и образовывать клоны аномальных клеток: симметричные t, inv,

del, гомогенно-окрашенные районы Хр (ГОР), потерю или добавление части или целых определенных Хр, В зависимости от локализации на Хр указанных нарушений или в зависимости от потери или добавления части или целых определенных Хр эти нарушения могут определять возможную специфическую малигнизацию клеток, а при клонировании в организме таких аномальных клеток -развитие Оп процесса определенного типа (Pathak,!980; Pathak, Goodacre,1986; Pathak с соавт.,1991; Pathak,1992; Heim, Mitelman, 1992). Поэтому для выяснения вероятности развития в организме Оп процесса, его ранней характеристики и прогноза важно определить уровень и характер как неспецифических, так и специфических Хр и геномных нарушений в его соматических клетках.

Практически установлено, что злокачественные новообразования представляют собой очаги клоновых клеток со специфическими изменениями кариотипа. Решающая роль клонов аномальных клеток со стабильными Хр нарушениями в процессах возникновения и развития Он подтверждается постоянно увеличивающимся количеством фактов, свидетельствующих об активации онкогенов или инактивации генов-супрессоров, локализованных в участках Хр, которые вовлечены в неслучайные перестройки. Такие неслучайные, стабильного типа Хр нарушения (структурные или количественные), с которыми клетки способны делиться и образовывать клоны, являются цитогснетическими маркерами Оп процессов.

К настоящему времени определены цнтогенетические маркеры большинства лейкозов, лимфом и многих солидных Оп: ретинобластомы, рака легкою, почечно-клсточного рака, рака желудка (РЖ), толстой кишки (РТК), яичника (РЯ), рака молочной железы (РМЖ), поджелудочной железы, остеосарком, гепатобластом, рака носоглотки, щитовидной железы (ЩЖ) и некоторых других. Банк имеющихся цитогенетических маркеров уже в настоящее время используют при доклиническом прогнозировании и .диагностике некоторых видов злокачественных заболеваний (Trent с соавт.,1989,1995; Mitelman, 1988,1994; Mitelman, Heim,1990,1993; Sandberg,1991,1994). Однако в виду гетерогенности практически каждой Оп банк соответствующих специфических цитогенетических маркеров еще далеко не полный. И дальнейший поиск таких маркеров остается особенно актуальным, как для дальнейшего исследования механизма канцерогенеза, так и для применения этих данных в клинической практике.

Генетические исследования On процесса у людей проводятся, как при спорадических злокачественных заболеваниях, так и при так называемых "семейных" злокачественных заболеваниях,

Как отмечают Li, Frauraeni (Í982) и Knudson (1989), успех поиска специфических цитогенетическнх маркеров злокачественных Оп у членов высокораковых семей в 100000 раз выше, чем при спорадическом раке, т.к. при "семейном" раке специфический генетический признак возможного развития определенного ража нередко наследуется. При наследов�