Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Прогностическое значение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических нарушений в клетках по-верхностной уротелиальной карциномы

На правах рукописи

БАШКАТОВ СЕРГЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В КЛЕТКАХ ПОВЕРХНОСТНОЙ УРОТЕЛИАЛЬНОЙ КАРЦИНОМЫ

14.00.14 - Онкология 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Обнинск 2008 год.

003451714

Работа выполнена в ГУ Медицинском радиологическом научном центре РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Карякин Олег Борисович

доктор биологических наук Немцова Марина Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Фигурин Константин Михайлович

доктор медицинских наук Петрин Александр Николаевич

Ведущая организация: ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росздрава

Защита диссертации состоится « » 2008 года в 10 часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.017.02) при ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского

онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан « » 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Рак мочевого пузыря является распространенным заболеванием. На протяжении последних трех лет ежегодно в России диагностируется 12,5 тыс. новых случаев, что составляет 2,7 % всех злокачественных новообразований в Российской Федерации. На момент первичной установки диагноза доля больных с 1-Й стадией в 2005 году составила 55% (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2007). Количество больных, у которых рак мочевого пузыря выявлен впервые, в 2006 году составило 12721 случая. Общий прирост заболевших с 1996 по 2006 год - 22,57%, среднегодовой прирост - 2,06%. В последнее время в России возрастает доля больных с поверхностным раком мочевого пузыря, что свидетельствует об актуальности проблемы и необходимости разработки новых методов ранней диагностики и лечения (Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. 2008).

По данным зарубежных авторов наиболее распространенной клинической формой заболевания является поверхностный (Та, Т1, карцинома in situ - CIS) рак мочевого пузыря (70-80% больных) (Sylvester R.J., van der meijden A.P., Oosterlinck W. 2006, Sylvester R., Kurth К., Denis L. 2001).

Стандартная лечебная тактика при поверхностном раке мочевого пузыря заключается в трансуретральной резекции опухоли и внутрипузырной химиоиммунопрофилактике. Однако до 85% поверхностных раков рецидивируют после лечения. Часто рецидивные опухоли возникают в разных областях слизистой мочевого пузыря, причем в 10-30% развиваются инвазивные и диссеминированные формы рака (Sylvester R.J., van der meijden

A.P., Oosterlinck W. 2006, Sylvester R., Kurth K., Denis L. 2001).

В связи с этим было предложено деление поверхностных переходно-клеточных карцином на три группы риска (Allard P., Bernard P., Fradet Y. 1998). К первой группе относятся опухоли с низким риском рецидивирования, единичные, Та, Gl, менее 3 см в диаметре. Ко второй группе можно отнести опухоли с высоким риском рецидивирования, Tl, G3, мультифокальные или часто рецидивирующие, имеющие сопутствующую карциному in situ (CIS) уротелия. Третью группу составляют опухоли с промежуточным риском: Та, Tl, Gl-2, мультифокальные, более 3 см в диаметре.

Под прогрессированием поверхностного рака мочевого пузыря понимают развитие инвазивного рецидива опухоли (критерий Т), возрастание степени клеточной анаплазии (критерий G) или наличие метастатического процесса (критерий М) (Fleming F., Huang A., Pu У. 1997, Malmstrom Р., Busch С., Norlen

B. J. 1987).

Формирование групп риска по прогрессированию заболевания также основано на морфологических параметрах опухоли (Millan-Rodrigez F., Chechile-Toniolo R., Salvador-Bayarri J. 2000).

1. Низкий риск: Ta-T1G1 без CIS. Прогрессирование не наблюдается.

2. Промежуточный риск: мультифокальный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS. Прогрессирование - 1,8%.

3. Высокий риск: мультифокальный T1G2, Та-ТЮЗ, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS. Прогрессирование - 15%.

Группировка больных по морфологическим характеристикам не полностью отражает биологический потенциал уротелиальной карциномы, в связи с этим большое значение приобретает поиск дополнительных маркеров диагностики и прогноза у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря.

В результате развития фундаментальной биологии было показано, что в основе неопластической трансформации клеток лежат генетические и цитогенетические нарушения. Каждый тип опухоли имеет свой индивидуальный профиль геномных повреждений, что может влиять на клинический характер заболевания и определять его прогноз. Таким образом, в настоящее время, в связи с развитием молекулярной генетики, происходит активное изучение дополнительных маркеров, объединенных термином «молекулярно-биологические». К ним относятся количественные изменения хромосом, генные структурные мутации и делеции, метилирование промоторных районов генов, определение экспрессии различных белковых продуктов в злокачественной клетке.

Достижения молекулярной биологии в изучении механизмов канцерогенеза должны иметь практическое применение в клинической онкологии. Основными направлениями использования этих данных в клинической практике являются: разработка систем ранней неинвазивной диагностики уротелиальной карциномы, и применение этих систем в качестве дополнительных маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря, а также для разработки нового класса «таргетных» противоопухолевых препаратов.

Необходимость определения прогностического значения молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров послужила основанием для проведения данной работы.

Цель работы: выявление дополнительных прогностических молекулярных цитогенетических и генетических маркеров у больных поверхностным раком мочевого пузыря.

Задачи исследования:

1. Определить наиболее часто встречающиеся цитогенетические нарушения в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

2. Определить наиболее часто встречающиеся молекулярно-генетические аномалии в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

3. Определить прогностическое значение гиперплоидии 3,7,17 хромосом и делеции локуса 9р21.

4. Выявить прогностическое значение мутации гена FGFR3, метилирования промоторного района гена р!6, делеции локуса Зр- и гена р53 при оценке

следующих клинических параметров: степени дифференцировки, глубины инвазии, длительности безрецидивного периода и размер опухоли. 5. Расширить панель прогностических критериев для поверхностного рака мочевого пузыря за счет новых молекулярных цитогенетических и генетических маркеров.

Научная новизна. Впервые для диагностики поверхностного рака мочевого пузыря, наряду с традиционными клинико-морфологическими методами, были применены современные молекулярно-цитогенетические и молекулярно-биологические методы исследования.

Были изучены наиболее часто встречающиеся молекулярно-цитогенетические аномалии в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, полученных при исследовании цитогенетических препаратов мочи этих больных. Доказано, что гиперплоидия 3,7,17 хромосом и делеция локуса 9р21, определенные в опухолевых клетках, выделенных с мочой пациентов, являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (Pycha A., Lodde M., Comploj Е. 2004, Pycha A., Mian С., Haitel А. 1997, Ribal M.J., Alcaraz A., Mengual L. 2004).

Определена частота встречаемости молекулярно-генетических повреждений в клетках опухоли, полученных после оперативного лечения поверхностного рака мочевого пузыря, а так же выявлены ассоциации этих повреждений с клинико-морфологическими параметрами уротелиальной карциномы. Показано, что аномальное метилирование промоторного района гена р16, является маркером инвазивного роста опухоли. Делеция короткого плеча 3 хромосомы (Зр-) наиболее часто обнаруживается в низкодифференцированных опухолях. Потеря гетерозиготности гена р53 является маркером развития раннего рецидива. Мутация гена FGFR3 достоверно чаще определяется в высокодифференцированных опухолях с хорошим прогнозом, поэтому может рассматриваться как маркер благоприятного течения поверхностного рака мочевого пузыря (Bakkar А. А., Wallerand H., Radvanyi F. 2003, Bas W.G., van Rhijn., Lurkin I. 2001).

Доказана возможность применения молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических маркеров в качестве дополнительных факторов для определения прогноза клинического течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Практическая значимость. Определение дополнительных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических маркеров в клетках поверхностной уротелиальной карциномы позволяет использовать их в качестве метода ранней неинвазивной диагностики поверхностного рака мочевого пузыря. Генетические маркеры имеют различное прогностическое значение, что позволяет дополнить и расширить систему клинико-морфологических факторов прогноза. Используя эти маркеры в клинической

практике, можно с большей уверенностью прогнозировать риск рецидива и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря. На основании полученных данных можно обосновать адекватную лечебную тактику -трансуретральная резекция опухоли, с последующей внутрипузырной терапией или радикальная цистэктомия. Изначальная оптимизация лечебной тактики приведет к повышению эффективности лечения больных. Разработанные методики могут быть рекомендованы для практического применения в онкологических клинических центрах и клиниках.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведенных научных исследований внедрены в практическую работу отделения лучевого и хирургического лечения урологических заболеваний ГУ-МРНЦ РАМН (г. Обнинск). Использование основных положений диссертации в практической работе позволило с помощью генетических маркеров дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в лечении 72 больных поверхностным раком мочевого пузыря, проводил анализ и статистическую обработку полученных результатов, овладел основными методиками молекулярно-цитогенетического и молекулярно-биологического исследования опухолевой ткани, проводил амбулаторное наблюдение за пациентами.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 19 мая 2008 года на научно-практической конференции клинического радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 3 статьи в центральных медицинских журналах, 10 работ в материалах конгрессов и конференций в РФ и одна за рубежом.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и документирована 19 таблицами. Библиографический указатель содержит 66 источника, из них 4 отечественных и 62 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В рамках этой исследовательской работы проанализированы клинико-морфологические характеристики опухоли с генетическими нарушениями в них у 72 больных поверхностным раком мочевого пузыря. Преобладали мужчины - 66 (91,7%), женщин было 6 (8,3 %). Возраст наблюдаемых больных от 23 до 80 лет, но наиболее часто встречались пациенты старше 50 лет (86,1%).

Стадию заболевания, размер и количество опухолей устанавливали при ультразвуковом исследовании, цистоскопии. Ультразвуковое исследование проводили в режиме серой шкалы, а также с применением доплеровских методик на аппаратах «Sonoline Antares» фирмы Siemens и «Hawk 2102 EXL» фирмы В&К Medical. Применяли мультичастотные датчики с переменной частотой 2-6 МГц и 2,5-5 МГц, соответственно.

Стадия заболевания Та установлена в 32 (44,4%), Т1 в 40 (55,6%) случаях. Одиночные опухоли встречались в 42 (58,3%), две и более в 30 (41,7%) случаев. Наиболее часто были обнаружены опухоли размером от 1 до 3 см - 47 (65,3%), опухоли менее 1 см наблюдались в 8 (11,1%) случаев, а опухоли размером более 3 см составили 17(23,6%).

Трансуретральная резекция мочевого пузыря выполнялась по общепринятой методике. После осмотра уретры и мочевого пузыря последовательно удалялись:

1. экзофитная часть опухоли (-ей);

2. основание опухоли (-ей) с захватом мышечного слоя;

3. биопсия петлей резектоскопа краев раны;

4. флуоресцирующие очаги;

5. биопсия «холодными щипцами» неизмененной слизистой.

Резецированный материал в маркированных пробирках доставлялся в

лабораторию патологической анатомии. Гистологические срезы опухолевой ткани окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. На светооптическом уровне оценивали степень дифференцировки опухоли согласно рекомендациям ВОЗ 1973 и 2004 годов. Стадия заболевания устанавливалась согласно Международной TNM классификации злокачественных опухолей (5 редакция). Категория Т и степень дифференцировки опухоли окончательно определялись на основании заключений двух морфологов. Согласно классификации ВОЗ 1973 года степень дифференцировки опухоли Gl установлена у 18(25 %) больных, G2 у 43 (59,7 %) больных и G3 11 (15,3 %). При использовании классификации ВОЗ 2004 года high grade и low grade опухоли встречались с одинаковой частотой.

Всем больным после оперативного лечения поведена внутрипузырная иммунопрофилактика с использованием вакцины БЦЖ 100 мг в виде шести еженедельных инсталляций.

Средний срок наблюдения за пациентами составил 22,8±6,01 месяцев. В течение данного периода наблюдения у тринадцати больных (18,1 %) возникли рецидивные опухоли. В девяти случаях (69,2%) рецидив развивался однократно. У четверых (30,8%) больных наблюдалось рецидивирующее течение поверхностного рака мочевого пузыря. В двух случаях (15,4%) мы наблюдали три рецидива, которые имели поверхностный характер, у одного больного (7,7%) два поверхностных рецидива. В одном случае (7,7%)

развился рецидив с инвазией в мышечный слой. Больные с рецидивами были подвергнуты повторным трансуретральным резекциям опухолей мочевого пузыря с последующей внутрипузырной иммунопрофилактикой. Пациенту с развившейся мышечной инвазией рака мочевого пузыря проведена химиолучевая терапия.

Молекулярно-цитогенетические маркеры. С целью выявления дополнительных диагностических и прогностических маркеров у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря, мы использовали флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) в цитогенетических препаратах, полученных при самостоятельном мочеиспускании этих больных. В данном исследовании флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) выполнена на цитогенетических препаратах 42 больных с впервые выявленным поверхностным раком мочевого пузыря. В рамках работы было обследовано сорок мужчин (95,2%) и две женщины (4,8%).

Для подтверждения диагноза уротелиальной карциномы у пациентов, при помощи исследования аномальных клеток в моче методом FISH, мы пользовались общепринятыми критериями и анализировали только морфологически аномальные клетки.

1. Анализ продолжали до тех пор, пока не обнаруживали 4 клетки с одновременным увеличением числа 2-х и более хромосом 3, 7, 17 или 12 клеток с гомозиготной потерей локуса 9р21. Двадцать пять проанализированных аномальных клеток являются необходимым условием.

2. Анализ продолжали до тех пор, пока не обнаруживали 4 клетки с одновременным увеличением числа 2-х и более хромосом 3, 7, 17 или 12 клеток с гомозиготной потерей локуса 9р21 независимо от количества проанализированных аномальных клеток.

3. Анализ продолжали до тех пор, пока не будут проанализированы все аномальные клетки в цитогенетическом препарате.

Полученные данные были проанализированы в группах, которые были сформированы на основании классических клинико-морфологических факторов прогноза (стадия Т, G, high/low grade, размер, количество опухолей, длительность безрецидивного периода).

Молекулярно-биологические маркеры. Изучаемая нами панель молекулярно-генетических маркеров состояла из шести параметров:

- определение делеции гена р53

- определение делеции Зр-

- определение мутации гена FGFR3(S249C)

- определение аномального метилирования генов р14, pió и CDH1

Молекулярно-биологические маркеры в клетках уротелиальной карциномы описывались с помощью качественных признаков: обнаружены или не обнаружены. Полученные данные были проанализированы в группах, которые

были сформированы на основании классических клинико-морфологических факторов прогноза (стадия Т, G, high/low grade, размер, количество опухолей, длительность безрецидивного периода).

Наличие хотя бы одного повреждения в опухолевой ткани зарегистрировано в нашем исследовании в 59,7% случаев (43/72). У 40,3% пациентов (29/72) исследуемых генетических нарушений не было обнаружено.

Статистический анализ результатов, полученных при исследовании, включал в себя сравнение клинических групп пациентов с помощью точного критерия Фишера. Уровень значимости а был принят равным 0.05. При обработке результатов использовалась программа GraphPad InStat v. 3.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ молекулярно-цитогенетических маркеров в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

Гиперплоидия 3, 7 и 17 хромосом (4%-100%) и потеря локуса 9р21 (0-85%) встречались у всех больных.

В работе проанализирована частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в зависимости от степени дифференцировки опухоли, согласно классификации ВОЗ 1973г. У 11 больных установлена высокодифференцированная уротелиальная карцинома, частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в цитологических образцах, полученных из мочи пациентов, составила 13,5±6,9%. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 8,7±4,9% и 6,3±4,0%, соответственно.

Больные с умеренно дифференцированной уротелиальной карциномой в исследовании наблюдались наиболее часто и составили группу из двадцати человек. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в онтогенетических образцах этих больных составила 24,2±15,8%. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 20,1±13,4% и 15,8±9,1%, соответственно (табл.1).

Таблица 1. Встречаемость гиперплоидных клеток в моче у больных с высоко (в1) и умереннодифференцированной (в2) карциномой.

.......'■;......;......|Г,.;..........-■-.......1 Л'. Р... 1

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом (%)

I-el11 . ~rfIР>С^05 !

[гШпермоЩией:3 хртосомьг ;.Г J}.............'',-j;.....' ........-.^...'jГ-'J, ..........i

Частота встречаемости клеток с! 8,7—4,9 20,1-13,4 Р>0,05 гиперплоидией 7 хромосомы

.• Частота ¿стречасмости клеток "с]!.....6,3±4,0 15,8±9,1

tranig^ ¿ij ¡|;" " '* " ' ' "'

Jt:

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в образцах мочи у больных со степенью дифференцировки опухоли 01-02 не различается и не превышает 25%.

У восьми больных при стандартном морфологическом исследовании установлена низкодифференцированная уротелиальная карцинома. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в цитогенетических образцах этих больных составила 65±18,6%, частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 62,6±20,1% и 58,6±20,4%, соответственно (табл.2).

Таблица 2. Встречаемость гиперплоидных клеток в моче у больных с умеренно (02) и низкодифференцированной (вЗ) карциномой. _______

Г Степень дифференцировки »„„ . /32, _______]1 .Г" ]

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом (%)

¡Частота встречаемости клеток сР.г 24,2±15,8

: 65±I8,6 ;iP=0,0024 I

Частота встречаемости клеток с ; 20,Iii3,4 62,6±20,1 Р-0,0017

гиперплоидией 7. хромосомы ........

рЧа5юта™1«5ечЯостй~Г" Г5"Дь9Л | Г~58^Й0,4 1 |Р=0,0018 ] ¡¡.mi^OTpi^^afTt'^MOcOMH __ Jj „_.____I;_______,_____________»j

Различия в группах 02-03 статистически значимые, то есть частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в образцах мочи зависит от степени дифференцировки опухоли (ВОЗ 1973г) и она выше в случае низкодифференцированной опухоли. Аналогичные результаты получены при сравнении групп 01-03, но различия более выражены (табл. 3).

Таблица 3. Встречаемость гиперплоидных клеток в моче у больных с высоко (01) и низкоодифференцированной (ОЗ) у карциномой.

рСтепень.щфференцировки Ii,_ ___G1__,_____4 _ G3 jj р~~

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом (%)

1 Частота" встрёчаемости клеток сп 13,5±6,9 , ' ]{" " 65±18,6 ]IP=0,00Ö4 j

"Частота встречаемости клеток с • гиперплоидией 7 хромосомы 8,7±4,9 62,6±20,1 Р=0,0005

["Частота ^встречаемости клеток elf 1 гиперплоидией 17 хромосомы 11 6,3i4,0 II 58,6±20,4 |^0,0008 j

Высокое содержание клеток (более 60%) с гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря

является неблагоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (классификация ВОЗ 1973 года).

Используя классификацию ВОЗ 2004 года, высокодифференцированная опухоль (low grade) обнаружена в нашем случае у 21 больного. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в среднем составила 14,4±6,9%, с гиперплоидией 7 хромосомы - 9,3±5,7%, а с гиперплоидией 17 хромосомы составила 7,1±5,8%.

Низкодифференцированная (high grade) уротелиальная карцинома была обнаружена в восемнадцати случаях. Частота клеток с гиперплоидией 3 хромосомы составила 47,2±27,9%, с гиперплоидией 7 хромосомы - 44,7±17,8%, а с гиперплоидией 17 хромосомы - 39,2±17,1% (табл.4).

Таблица 4. Встречаемости гиперплоидных клеток в моче у больных с low grade и high grade карциномой.

Частота клеток встречаемости с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом (%)

^¡ымйгшГс] •— 1 -......

______1 [_,„....,_,,_ .л

Частота встречаемости клеток с 9,3±5,7 44,7±17,8 Р=0,0001

гиперплоидией 7 хромосомы

........ 39Щ7Х".....0007*|

¡^Частота встречаемости "клеток "с

JL,

Высокое содержание клеток (более 40%) с гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря является неблагоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (классификация ВОЗ 2004 года).

В работе проанализированы различия частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 в цитологическом препарате больных в зависимости от степени инвазии (Та/Т1) опухоли. Среднее значение частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в цитогенетических образцах больных неинвазивной папиллярной уротелиальной карциномой (Та) составило 18,2% . Среднее значение частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в образцах мочи у этих больных было 32,8% .

Сравнение средних значений частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в цитогенетических образцах больных с различными стадиями рака мочевого пузыря показало, что в группе минимально инвазивной карциномы этот признак встречается чаще. Различия имеют тенденцию к достижению статистической значимости (р=0,07).

Таким образом, высокая частота встречаемости (30% и более) клеток с делецией 9р21 хромосомы в цитогенетических образцах больных с поверхностным раком мочевого пузыря является неблагоприятным фактором

прогноза течения заболевания, так как ассоциирована с минимально инвазивной уротелиальной карциномой (Т1).

Анализ молекулярно-генетических маркеров в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

Аномальное метилирование гена р16 в группе (Та) обнаружено у одного 1 из 32 (3,125%), во группе (Т1) у 10 из 40, что составило 25%. Двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,018.

Таким образом, метилирование гена р16 достоверно чаще выявлено у пациентов с минимально инвазивной уротелиальной карциномой, что позволяет использовать это молекулярно-генетическое повреждение генома в качестве одного из показателей инвазивного роста опухоли.

Используя в работе классификацию ВОЗ 1973 года, было установлено, что степень дифференцировки опухоли 01 обнаружена у 18, в2 - у 43 и вЗ - у 11 пациентов. При исследовании панели молекулярно-генетических маркеров в зависимости от степени дифференцировки опухоли были получены следующие результаты.

Делеция короткого плеча 3 хромосомы (Зр-) в группе а не встречалась, в группе С2 обнаружена у 4 (10,3%) больных, а группе низкодифференцированного рака вЗ была найдена у 5 (45,5%).

При с анализе получены статистически значимые различия по частоте встречаемости делеции Зр- в группах в2 - вЗ. Двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,017.

При сравнении групп - вЗ так же получены статистически значимые различия (р=0,0039). Частота встречаемости делеции Зр- увеличивается при нарастании степени клеточной анаплазии и наиболее часто встречается в низкодифференцированных (вЗ) опухолях.

Частота встречаемости мутации гена FGF^?i в группе и 02 составили 27,7% (5/18) и 30,2% (13/43), соответственно. В группе низкодифференцированных опухолей (вЗ) мутаций гена ГОРЯЗ не было обнаружено. Получены статистически значимые различия по частоте встречаемости этого генетического нарушения в группах

умереннодифференцированной и низкодифференцированной уротелиальной карциномы. Двухсторонний точный критерий Фишера равен р=0,048. Частота встречаемости мутации гена РОРЯЗ в опухолевых клетках высокодифференцированной и умереннодифференцированной уротелиальной карциномы не различаются (р=1), это позволило нам сравнить объединенную группу с низкодифференцированной карциномой. Двухсторонний точный критерий Фишера равен р=0,05.

Таким образом, в используемой нами панели делеция Зр- является неблагоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря, а мутация гена FGF/?5 может рассматриваться как благоприятный фактор. Совместно эти молекулярно-генетические нарушения встречались

только у одного пациента, следовательно, наличие того или иного генетического повреждение определяет злокачественный потенциал уротелиальной карциномы.

При использовании классификации ВОЗ 2004 года уротелиальные карциномы низкой степени злокачественности (low grade) и высокой степени злокачественности (high grade) в работе встречались с одинаковой частотой, по тридцать шесть случаев каждая. Делеция Зр- в группе low grade была обнаружена у 3 (9,375%) больных, а в группе high grade - у 9 (26,7%) больных.

Статистически значимого уровня различий по частоте встречаемости делеции Зр- в группах low grade и high grade получено не было. Двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,11, но имеется тенденция в виде увеличения частоты встречаемости этой хромосомной аберрации в группе high grade уротелиальной карциномы.

Размер опухоли является важным фактором прогноза течения заболевания. В нашей работе опухоли менее одного сантиметра в диаметре встречались в восьми случаях (11,1%), более трех сантиметров в семнадцати случаях (23,6%). Самую многочисленную группу составили опухоли размером от одного до трех см — 47 (65,5%) случаев. Среди опухолей малого размера мутация гена FGFR3 встречалась в 50% случаев, а среди опухолей промежуточного размера только у шести больных из сорока семи, что составило 12,8%. Рассчитанный двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,028.

Аномальное метилирование гена кадгерина (CDH1) у больных с опухолями размером до одного сантиметра встречалось у 3 больных из 8 (37,5%), у пациентов с размером опухоли от одного до трех сантиметров в 6 случаях из 47 (12,8%). Различия по частоте встречаемости аномального метилирования гена CDH1 имеют тенденция к достижению статистически значимого уровня

(Р=0,11).

В нашем исследовании показано, что мутация гена FGFR3 чаще встречается в опухолях размером менее одного сантиметра, следовательно, с учетом литературных данных и в этом случае мутация может рассматриваться как благоприятный дополнительный прогностический признак, так как чаще встречается в неинвазивных папиллярных опухолях (Та) малого размера (менее 1 см).

Мультифокальность опухоли является важным неблагоприятным прогностическим фактором течения поверхностного рака мочевого пузыря. Монофокальные опухоли в исследовании встречались в 42 случаях, мультифокальные опухоли были обнаружены у 30.

Делеция Зр- в группе больных с одиночной опухолью встречалась в 8 случаях из 39 (20,5%), а в группе с множественным опухолевым поражением мочевого пузыря только у одного больного из 28 (3,6%).

Частота делеции Зр- выше в группе монофокальных опухолей, но достоверных статистических различий по этому признаку между группами

получено не было, рассчитанный двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,067, но есть тенденция к достижению статистической значимости. Однако, сделать заключение о том, что данное генетическое нарушение является благоприятным прогностическим фактором нельзя, так как шесть из восьми одиночных опухолей (75%) с делецией Зр- имели неблагоприятные морфологические характеристики: T1 high grade.

Развитие рецидивной опухоли в первый год после установления диагноза поверхностного рака мочевого пузыря является важным неблагоприятным прогностическим признаком. В нашей работе рецидивы развились у тринадцати больных (18,1%). У 59 (81,9%) больных за время наблюдения рецидивов не было. Количество рецидивов варьировало от одного до трех. У одной пациентки (7,7%) развился мышечноинвазивный рак. Рецидивы развивались в срок от трех до тридцати месяцев. Локализация рецидивных опухолей мочевого пузыря отличалась от месторасположения первичной опухоли.

Несмотря на малое количество наблюдений, нами была проанализирована безрецидивная выживаемость в зависимости от потери гетерозиготности гена р53. При анализе нашего материала обращает на себя внимание, что это генетическое нарушение в клетках опухоли часто встречается у больных с рецидивирующим течением поверхностного рака мочевого пузыря. При сроке наблюдения 30 месяцев в группе больных с нормальным р53 безрецидивная выживаемость составила 71%, а в группе больных с потерей гетерозиготности р53 - 32% (р=0,028). Различия в группах статистически значимы.

Таким образом, потеря гетерозиготности р53 является неблагоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Исходя из вышеизложенных данных, мы считаем, что молекулярно-цитогенетические и молекулярно-генетические изменения в клетках уротелиальной карциномы имеют важное клиническое значение. Нам представляется обоснованным их использование в качестве дополнительных прогностических факторов. Дополнение к классическим клинико-морфологическим факторам прогноза риска рецидивирования и прогрессирования можно представить следующим образом.

Риск рецидива:

1. Низкий риск - единичные, Та, G1, менее 3 см в диаметре, мутация гена FGFR3( S249C).

2. Высокий риск - Tl, G3, мультифокальные или часто рецидивирующие, имеющие сопутствующую CIS уротелия, делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р!6 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

3. Промежуточным риск - Та, Т1, 01-2, мультифокальные, более 3 см в диаметре, мутация гена /Г(?^;7?5(Б249С), делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р!6 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

Промежуточный риск рецидивпрования: Та, TI, G1-2, мультифокальные, более 3 см

мутация гена FGFR3{S249C)

Низкий рис

единичные, Та, G1 менее 3 см.

делеция Зр-, потеря гетерозиготностир53, аномальное метилирование промоторного района генар16, высокая частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате

Высокий риск:

TI, G3, мультифокальные, сопутствующая CIS.

Рис. № 1. Клиническое применение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров прогноза в формировании групп риска рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря.

Риск прогрессирования:

1 .Низкий риск - Ta-T1G1 без CIS, мутация гена FGFR3(S249C). 2.Высокий риск — мультифокальный TIG2, Ta-T1G3, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS, делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

3.Промежуточный риск - мультифокальный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS, мутация гена FGFR3( S249C), делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р1б, высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

Рис. № 2. Клиническое применение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров прогноза в формировании групп риска прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря.

Использование панели молекулярных и цитогенетических маркеров дает дополнительную информацию о злокачественном потенциале опухоли и позволяет разделить группу промежуточного риска рецидивирования и прогрессирования. Уротелиальные карциномы этих групп можно с большей уверенностью отнести к группам низкого или высокого риска на основании преобладающих генетических нарушений.

Промежуточный риск прогрессирования:

мультифокальный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS

мутация гена FGFi

Низкий риск Ta-T1G1 без С

делеция Зр-, потеря гетерозиготностир53, аномальное метилирование промоторного района гена р16, высокая частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате

Высокий риск:

мультифокальный Т1G2, Ta-T1G3, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS

выводы

1. Наиболее часто встречающимися молекулярно-цитогенетическими нарушениями в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, из исследуемых нами, являются гиперплоидия 3,7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса, которые наблюдались в 93% случаев.

2. Гиперплоидия 3,7,17 хромосом и делеция 9р21 локуса являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря:

- при использовании классификации ВОЗ 1973 года обнаружение более 60% клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря ассоциировано с низкодифференцированной (G3) уротелиальной карциномой (р<0,05).

- при использовании классификации ВОЗ 2004 года обнаружение более 40% клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря ассоциировано с уротелиальной карциномой высокой степени злокачественности - high grade (р<0,05).

- делеция 9р21 локуса ассоциирована с развитием минимально инвазивной уротелиальной карциномой (р=0,07).

3. Наиболее часто встречающимися молекулярно-генетическими нарушениями в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, из исследуемой нами панели, являются аномальное метилирование промоторных районов генов р1б, делеция Зр-, мутация гена FGFR3, которые встречаются в 55,2% случаев.

4. Молекулярно-биологические нарушения в клетках поверхностной уротелиальной карциномы имеют различное прогностическое значение:

- аномальное метилирование гена р16 достоверно чаще (р=0,018) встречается в клетках минимально инвазивных (Т1) уротелиальных карцином, следовательно, может рассматриваться как маркер инвазивного роста опухоли

- делеция Зр- достоверно чаще (р=0,017) встречается в клетках низкодифференцированных опухолей (G3) и может рассматриваться как маркер неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

- при сроке наблюдения 30 месяцев безрецидивная выживаемость больных с делецией р53 достоверно ниже (р=0,028), чем у пациентов с нормальным р53, следовательно, это генетическое нарушение может рассматриваться как маркер неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

- мутация гена FGFR3 достоверно чаще встречается в клетках умеренно и высокодифференцированных опухолей маленького размера (р=0,05 и р=0,028 соответственно), следовательно, может рассматриваться как маркер благоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

5. Использование в клинической практике молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения

поверхностного рака мочевого пузыря.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Теплов A.A., Ульянов Р.В., Морозов A.A., Немцова М.В. Поиск молекулярно-генетических маркеров при раке мочевого пузыря // Материалы II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва 2005г., С-170.

2. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В. Сравнительная характеристика молекулярно-генетических изменений в неопластическом уротелии больных поверхностным раком мочевого пузыря // Материалы IX Российского Онкологического Конгресса Москва 2005г, С-236.

3. Башкатов C.B., Карякин О.Б., Немцова М.В. Клиническое значение молекулярно-генетических изменений в клетках уротелия при поверхностном раке мочевого пузыря //«Онкоурология» №3 2006г. С-54-60.

4. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетические повреждения, выявленные в опухолевой ткани пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря // Материалы I Конгресса Российского общества онкоурологов. Москва 2006г. С-93.

5. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Сафиуллин К.Н. Характеристика молекулярно-генетических изменений в уротелиальных клетках при поверхностном раке мочевого пузыря // Материалы II Научно-практической конференции врачей онкологов ФМБА « Актуальные вопросы онкологии и онкологической помощи в системе ФМБА» Москва 2006г. С-63.

6. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Сафиуллин К.Н. Молекулярно-генетические изменения в уротелиальных клетках в группах благоприятного и неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря. // Материалы I Конгресса Российского общества онкоурологов. Москва 2006г. С-72.

7. Башкатов C.B., Севанькаев A.B., Карякин О.Б., Михайлова Г.М., Голуб Е.В. Сравнительная характеристика молекулярно-цитогенетических нарушений в уротелии в группах благоприятного и неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря// Материалы I Конгресса Российского общества онкоурологов. Москва 2006г. С-73.

8. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Сафиуллин К.Н., Неборак Ю.Т. Корреляция молекулярно-генетических нарушений в клетках переходноклеточного рака мочевого пузыря с

клиникоморфологическими параметрами опухоли // Материалы X Российского Онкологического Конгресса, Москва 2006г, С-179.

9. Башкатов C.B., Севанькаев A.B., Карякин О.Б., Михайлова Г.М., Голуб Е.В. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH): практическое применение в онкоурологии // //«Онкоурология» №3 2008г. С-9-16.

10. Башкатов C.B., Севанькаев A.B., Карякин О.Б., Михайлова Г.М., Голуб Е.В. Сравнительная характеристика цитогенетических нарушений в клеткахуротелиальной карциномы в зависимости от степени дифференцировки опухоли // Материалы II Конгресса Российского общества онкоурологов. Москва 2007г. С- 69.

11. Башкатов C.B., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Бабаян А.Ю. Мутации гена FGFR3 и делеции локусов 3p-, 9p-, 9q- и р53 при поверхностном раке мочевого пузыря. // Материалы II Конгресса Российского общества онкоурологов. Москва 2007г. С- 96.

12. Башкатов C.B., Севанькаев A.B., Карякин О.Б., Михайлова Г.М., Голуб Е.В. Результаты применения молекулярно-генетических методов исследования в диагностике степени дифференцировки поверхностного рака мочевого пузыря.// Материалы XI Съезда урологов России. Москва 2007г. С-348.

13. Немцова М.В., Кузнецова O.A., Карякин О.Б., Залетаев Д.В., Михайленко Д.С., Башкатов C.B., Кекеева Т.В., Курынин Р.В., Попов A.M., Попова О.П., Шегай П.В., Андреева Ю.Ю., Алексеев Б .Я., Еникеев М.Э., Аляев Ю.Г., Русаков И.Г., Франк Г.А. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии // «Молекулярная медицина» №3 2007 г, С-25-38.

14. S.V. Bashkatov., Babayan A.Y., O.A. Kuznetsova, O.B. Karyakin, D.V. Zaletaev, M.V. Nemtsova FGFR3 mutations and 3p, 9p, p53 deletions in noninvasive bladder cancer.// European Journal of Human Genetics. Volume 16, Supplement 2. May 2008. P-22.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразования в России и странах СНГ в 2005году. Вестник российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН №2,2007 г, том 1В, приложение 1.

2. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в Росси в 2006 году (Заболеваемость и смертность). Москва 2008 год.

3. Sylvester R.J., van der meijden A.P., Oosterlinck W. Predicting recurrence and progression in individual patients with stage Та T1 bladder cancer using EORTC risk tables: a combined analysis of2596 patients from seven EORTC trials. European Urology 49(2006) 466-477.

4. Sylvester R., Kurth K., Denis L. Predicting the short-term and long-term prognosis of patients with Та, T1 bladder cancer: Result of EORTC/MRC randomized clinical trials.Europ.Urol.2001; 39:471-480.

5. Allard P., Bernard P., Fradet Y. The early clinical course of primary Та and T1 bladder cancer. Europ.Urol.l998;Vol.8.1 :P692-698.

6. Fleming F., Huang A., Pu Y. Urinary bladder. In: Cancer staging manual. Philadelphia:Lippincot-Raven; 1997.241 -24).

7. Malmstrom P., Busch C., Norlen B.J. Recurrences, progression and survial in bladder cancer. Scand.J.Urol.Nephrol.1987; 21(2):185.

8. Millan-Rodrigez F., Chechile-Toniolo R., Salvador-Bayarri J. Multivariate analysis of the prognostic factors of primary superficial bladder cancer. J. Urol. (Baltimore) 2000; 163:68-7.

9. Pycha A., Lodde M., Comploj E. Intermediate-risk urothelial carcinoma: an unresolved problem? Urology 63(3), 2004;472-75.

10. Pycha A., Mian C., Haitel A. Fluorescence in situ hybridization identifies more aggressive types of primarily noninvasive (stage Та) bladder cancer. J. Urology 1997; 157:2116-9.

11. Ribal M.J., Alcaraz A., Mengual L. Chromosomal high-polysomies predict tumor progression in T1 transitional cell carcinoma of the bladder. European Urology, 2004 May;45(5):593-9.

12. Bakkar A. A., Wallerand H., Radvanyi F. FGFR3 and TP53 gene mutation two distinct pathways in urothelial cell carcinoma of the bladder. Cancer Research 63, 8108-8112, December 1,2003.

13. Bas W.G., van Rhijn., Lurkin I. The fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) mutation is a strong indicator of superficial bladder cancer with low recurrence rate. Cancer Research 61, 1265-1268, February 15,2001.

Подписано к печати 13.10.2008г. Формат 60x84/16 Усл.п.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ№ 18 Отпечатано в ГУ «ВНИИГМИ-МЦЦ», 249035, Обнинск, ул. Королева, 6

Рак мочевого пузыря является распространенным заболеванием. На протяжении последних трех лет ежегодно в России диагностируется 12,5 тыс. новых случаев, что составляет 2,7 % всех злокачественных новообразований в Российской Федерации. На момент первичной установки диагноза доля больных с I-II стадией в 2005 году составила 55% [1]. Количество больных с впервые выявленным раком мочевого пузыря в 2006 году составило 12721 случая. Общий прирост заболевших с 1996 по 2006 год - 22,57%, среднегодовой прирост - 2,06%. В последнее время в России возрастает доля больных с поверхностным раком мочевого пузыря, что говорит об актуальности проблемы и необходимости разработки новых технологий ранней диагностики и лечения [4].

По данным зарубежных авторов наиболее распространенной клинической формой заболевания является поверхностный (Та, Т1, карцинома in situ -CIS) рак мочевого пузыря (70-80% больных) [56,55].

Стандартная лечебная тактика при поверхностном раке мочевого пузыря заключается в трансуретральной резекции опухоли и внутрипузырной химиоиммунопрофилактике. Однако 30-85% поверхностных раков рецидивируют после лечения, часто рецидивные опухоли возникают в другом месте слизистой мочевого пузыря, причем в 10-30% развиваются инвазивные и диссеминированные формы рака[56,55].

В связи с этим было предложено деление поверхностных переходно-клеточных карцином на три группы риска [5]. К первой группе относятся опухоли с низким риском рецндивирования, единичные, Та, G1, менее 3 см в диаметре. Ко второй группе можно отнести опухоли с высоким риском рецндивирования, Tl, G3, мультифокальные или часто рецидивирующие, имеющие сопутствующую CIS уротелия. Третью группу составляют опухоли с промежуточным риском: Та, Tl, G1-2, мультифокальные, более 3 см в диаметре.

Под прогрессированием поверхностного рака мочевого пузыря понимают развитие инвазивного рецидива опухоли (критерий Т), возрастание степени клеточной анаплазии (критерий G) или наличие метастатического процесса (критерий М) [22,34].

Формирование групп риска по прогрессированию заболевания также основано на морфологических параметрах опухоли [38].

1.Низкий риск: Ta-T1G1 без CIS. Прогрессирование не наблюдается.

2.Промежуточный риск: многоместный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS. Прогрессирование - 1,8%.

3.Высокий риск: многоместный T1G2, Ta-T1G3, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS. Прогрессирование - 15%.

Группировка больных по морфологическим характеристикам не полностью отражает биологический потенциал уротелиальной карциномы, в связи с этим большое значение приобретает поиск дополнительных маркеров диагностики и прогноза у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря.

В результате развития фундаментальной биологии было показано, что в основе неопластической трансформации клеток лежат генетические и цитогенетические нарушения. Каждый тип опухоли имеет свой индивидуальный профиль геномных повреждений, что может влиять на клинический характер заболевания и определять его прогноз. Таким образом, в настоящее время, в связи с развитием молекулярной генетики, происходит активное изучение дополнительных маркеров, объединенных термином «молекулярно-биологпческие». К ним относятся количественные изменения хромосом, генные и структурные мутации, метилирование промоторных районов генов, определение экспрессии различных белковых продуктов в злокачественной клетке.

Однако, достижения фундаментальной биологии в изучении механизмов канцерогенеза должны иметь практическое применение в клинической онкологии. Основными направлениями использования этих данных в клинической практике являются: разработка систем ранней неинвазивной диагностики уротелиальной карциномы, применение в качестве дополнительных маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря и для разработки нового класса «таргетных» противоопухолевых препаратов.

Необходимость определения прогностического значения молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров послужила основанием для проведения данной работы.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключается в выявлении дополнительных прогностических молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров у больных поверхностным раком мочевого пузыря. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить наиболее часто встречающиеся молекулярно-цитогенетические нарушения в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

2. Определить наиболее часто встречающиеся молекулярно-биологические аномалии в клетках поверхностной уротелиальной карциномы.

3. Определить прогностическое значение гиперплоидии 3,7,17 хромосом и делеции локуса 9р21.

4. Определить прогностическое значение мутации гена FGFR3, метилирования промоторного района гена р16, делеции локуса Зр- и гена р53.

5. Расширить панель прогностических критериев для поверхностного рака мочевого пузыря за счет новых молекулярно-генетических и молекулярпо-цитогенетических маркеров.

Научная новизна

Впервые для диагностики поверхностного рака мочевого пузыря, наряду с традиционными клин ико-морф о логическими методами, были применены современные молекулярно-цитогенетические и молекулярно-биологические методы исследования.

Были изучены наиболее часто встречающиеся молекулярно-цптогепетические аномалии в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, полученных при исследовании цитогенетических препаратов мочи этих больных. Доказано, что гиперплоидия 3,7,17 хромосом и делеция локуса 9р21, определенные в опухолевых клетках пациентов, являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Определена частота встречаемости молекулярно-генетических повреждений в клетках опухоли, полученных после оперативного лечения поверхностного рака мочевого пузыря, а так же выявлены ассоциации этих повреждений с клинико-морфологическими параметрами уротелиальной карциномы. Показано, что аномальное метилирование промоторного района гена р16, является маркером инвазивного роста опухоли. Делеция короткого плеча 3 хромосомы (Зр-) наиболее часто обнаруживается в низкоднфференцированных опухолях. Потеря , гетерозиготности гена р53 является маркером развития раннего рецидива. Мутация гена FGFR3 является маркером благоприятного течения поверхностного рака мочевого пузыря, т.к. эта мутация достоверно чаще определяется в высокодифференцированных опухолях с хорошим прогнозом.

Доказана возможность применения молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических маркеров в качестве дополнительных факторов для определения прогноза клинического течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Практическая значимость

Определение дополнительных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических маркеров в клетках поверхностной уротелиальной карциномы позволяет использовать их в качестве метода ранней неинвазивной диагностики поверхностного рака мочевого пузыря. Генетические маркеры имеют различное прогностическое значение, что позволяет дополнить и расширить систему клинико-морфологических факторов прогноза. Используя эти маркеры в клинической практике, можно с большей уверенностью прогнозировать риск рецидива и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря. На основании полученных данных можно обосновать адекватную лечебную тактику — трансуретральная резекция опухоли, с последующей внутрипузырной терапией или радикальная цистэктомия. Изначальная оптимизация лечебной тактики приведет к повышению эффективности лечения больных. Разработанные методики могут быть рекомендованы для практического применения в онкологических клинических центрах и клиниках.

Глава 5. ВЫВОДЫ

1. Наиболее часто встречающимися молекулярно-цитогенетическими нарушениями в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, из исследуемых нами, являются гиперплоидия 3,7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса, которые наблюдались в 93% случаев.

2. Гиперплоидия 3,7, 17 хромосом и делеция 9р21 локуса являются неблагоприятными факторами прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря:

- обнаружение более 60% клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря ассоциировано с низкодифференцированной (G3) уротелиальной карциномой (ВОЗ 1973г) (р<0,05).

- обнаружение более 40% клеток с гиперплоидией 3,7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря ассоциировано с уротелиальной карциномой высокой степени злокачественности - high grade (ВОЗ 2004г) (р<0,05).

- делеция 9р21 локуса ассоциирована с развитием минимально инвазивной уротелиальной карциномой (р=0,07).

3. Наиболее часто встречающимися молекулярно-биологическими нарушениями в клетках поверхностной уротелиальной карциномы, из исследуемой нами панели, являются аномальное метилирование промоторных районов генов р!6 (15,3%), делеция Зр- (14,9%), мутация гена FGFR3 (25%).

4. Молекулярно-биологические нарушения в клетках поверхностной уротелиальной карциномы имеют различное прогностическое значение:

- аномальное метилирование гена р1б встречается в клетках минимально инвазивиых (Т1) уротелиальных карцином в 25% случаев, следовательно, может рассматриваться как маркер инвазивного роста опухоли (р=0,018).

- делеция Зр- встречается в клетках низкодифференцированных опухолей (G3) в 45,5% случаев, следовательно, может рассматриваться как маркер неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (р=0,017).

- при сроке наблюдения 30 месяцев безрецидивная выживаемость больных с потерей гетерозиготности р53 составила 32%, следовательно, это генетическое нарушение может рассматриваться как маркер неблагоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (р=0,028).

-мутация гена FGFR3 встречается в только клетках умеренно и высокодифференцироваиных опухолей в 27,7% и 30,2% случаев, следовательно, может рассматриваться как маркер благоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (р=Ю,05).

- мутация гена FGFR3 встречается в клетках опухолей маленького размера в 50% случаев, следовательно, может рассматриваться как маркер благоприятного прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря (р=0,028).

5. Использование в клинической практике молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров позволяет расширить общепринятую систему клинико-морфологических маркеров прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак мочевого пузыря является распространенным заболеванием. На протяжении последних трех лет ежегодно в России диагностируется 12,5 тыс. новых случаев, что составляет 2,7 % всех злокачественных новообразований в Российской Федерации. На момент первичной установки диагноза доля больных с 1-Й стадией в 2005 году составила 55% [1]. Количество больных с впервые выявленным раком мочевого пузыря в 2006 году составило-12721 случая. Общий прирост заболевших с 1996 по 2006 год - 22,57%, среднегодовой прирост - 2,06%. В последнее время в России возрастает доля больных с поверхностным раком мочевого пузыря, что говорит об актуальности проблемы и необходимости разработки новых технологий ранней диагностики и лечения [4].

По данным зарубежных авторов наиболее распространенной клинической формой заболевания является поверхностный (Та, Т1, карцинома in situ -CIS) рак мочевого пузыря (70-80% больных) [56,55].

Стандартная лечебная тактика при поверхностном раке мочевого пузыря заключается в трансуретральной резекции опухоли и внутрипузырной хнмпоиммунопрофилактике. Однако 30-85% поверхностных раков рецидивируют после лечения, часто рецидивные опухоли возникают в другом месте слизистой мочевого пузыря, причем в 10-30% развиваются пнвазивпые и диссеминированные формы рака [56,55].

В связи с этим было предложено деление поверхностных переходно-клеточных карцином на три группы риска [5]. К первой группе относятся опухоли с низким риском рецидивирования, единичные, Та, G1, менее 3 см в диаметре. Ко второй группе можно отнести опухоли с высоким риском рецидивирования, Tl, G3, мультифокальные или часто рецидивирующие, имеющие сопутствующую CIS уротелия. Третью группу составляют опухоли с промежуточным риском: Та, Tl, G1-2, мультифокальные, более 3 см в диаметре.

Под прогрессированием поверхностного рака мочевого пузыря понимают развитие инвазивного рецидива опухоли (критерий Т), возрастание степени клеточной анаплазии (критерий G) или наличие метастатического процесса (критерий М) [22,34].

Формирование групп риска по прогрессированию заболевания также основано на морфологических параметрах опухоли [38].

1.Низкий риск: Ta-T1G1 без CIS. Прогрессирование не наблюдается.

2.Промежуточный риск: многоместный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS. Прогрессирование - 1,8%.

3.Высокий риск: многоместный T1G2, Ta-T1G3, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS. Прогрессирование - 15%.

Группировка больных по морфологическим характеристикам не полностью отражает биологический потенциал уротелиальной карциномы, в связи с этим большое значение приобретает поиск дополнительных маркеров диагностики и прогноза у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря.

В исследовании изучены молекулярно-цитогенетические, молекулярно-биологические нарушений в клетках поверхностной уротелиальной карциномы и проанализирована их взаимосвязь с классическими клинико-морфологическими факторами прогноза течения заболевания — стадия, степень дифференцировки, размер и количество опухолей, длительность безрецидивного периода.

В настоящее время фирмой «UroVysion» разработан многоцветный FISH -набора. Набор характеризуется наличием цептромерных ДНК-зондов к 3, 7, 17 паре хромосом и локус-специфическим ДНК-зондом к 9р21 хромосоме. ДНК-зонды окрашены в красный, зеленый, голубой и золотой цвет, соответственно. (Vysis, Downers Grove,Illinois).

Для нормальной клетки характерен диплоидный набор хромосом, что будет выражаться в наличии двух сигналов каждого цвета. Опухолевая клетка больше нормальной уротелиальной клетки по размерам, количество флуоресцентных сигналов в ней может отличаться от двух.

В результате проведенной работы показано, что гипоплоидия 3,7 и 17 пар хромосом встречается редко и варьирует от 0 до 10%. Гипреплоидия локуса 9р21 так же варьирует 0-10%), лишь в трех случаях была обнаружена - 60100% клеток. В то же время гиперплоидия 3, 7 и 17 хромосом (4%-100%) и потеря локуса 9р21 (0-85%) встречались у всех больных.

В работе проанализирована частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в зависимости от степени дифференцировки опухоли, согласно классификации ВОЗ 1973 года. У 11 больных установлена высокодифференцированная уротелиальная карцинома. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в цитогенетических образцах этих больных составила 13,5±6,9%. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 8,7±4,9% и 6,3±4,0%, соответственно.

Больные с умеренно дифференцированной уротелиальной карциномой в исследовании наблюдались наиболее часто и составили группу из двадцати человек. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в цитогенетических образцах этих больных составила 24,2±15,8%. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 20,1±13,4% и 15,8±9,1%, соответственно.

В работе показано, что клетки с гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетических препаратах встречались во всех случаях, частота гиперплоидных клеток не превышала 25%. Статистически значимых различий в частоте встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетических образцах больных с высоко и умеренно дифференцированной уротелиальной карциномой обнаружено не было.

У восьми больных при стандартном морфологическом исследовании установлена низкодифференцированная уротелиальная карцинома. Цитогенетический анализ с помощью FISH-метода позволил обнаружить клетки с большим количеством хромосомных нарушений у каждого пациента. Частота таких клеток варьировала от 26% до 100%, составляя в среднем 75%. Только у одного пациента частота клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосомы была сходной с пациентами из групп G1-G2.

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в цитогенетических образцах этих больных составила 65±18,6%, частота встречаемости клеток с гиперплоидией 7 и 17 хромосомы - 62,6±20,1% и 58,6±20,4%, соответственно.

В группе больных с G3 степенью дифференцировки опухолевых клеток все результаты FISH-анализа были положительны, но частота клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах значительно выше и составляет около 65%.

Различия в частоте встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетических препаратах больных в группах G1-G2 и G3 статистически значимые (р<0,05), то есть частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в образцах мочи зависит от степени дифференцировки опухоли (ВОЗ 1973 год) и она выше в случае низкодифференцированной опухоли.

При использовании классификации ВОЗ 2004 года высокодифференцированная опухоль (low grade) обнаружена в нашем случае у 21 больного. Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3 хромосомы в среднем составила 14,4±6,9%, с гиперплоидией 7 хромосомы - 9,3±5,7%, а с гиперплоидией 17 хромосомы составила 7,1 ±5,8%.

Таким образом, частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в образцах мочи больных с высокодифференцированной (low grade) уротелиальной карциномой не превышает 15%.

Низкодифференцированная (high grade) уротелиальная карцинома была обнаружена в восемнадцати случаях. Частота клеток с гиперплоидией 3 хромосомы составила 47,2±27,9%, с гиперплоидией 7 хромосомы -44,7±17,8%, а с гиперплоидией 17 хромосомы - 39,2±17,1%.

Частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в образцах мочи больных с низкодифференцированной (high grade) уротелиальной карциной значительно выше, чем в случае высокодифференцированной (low grade) и составляет около 40% ((р<0,05).

Таким образом, показано, что частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3, 7 и 17 хромосом в цитогенетических препаратах больных поверхностным раком мочевого пузыря увеличивается в случае низкодифференцированной (high grade) уротелиальной карциномы, следовательно, высокое содержание (более 40%) таких клеток в цитогенетическом препарате является неблагоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Делеция 21 локуса короткого плеча 9 хромосомы (9р21) в исследовании встречалась с частотой от 0 до 85%. В работе проанализированы различия частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 в цитогенетическом препарате больных в зависимости от степени инвазии (Та/Т 1) опухоли. В исследование включены 14 больных со стадией заболевания Та. Среднее значение частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в цитогенетических образцах больных неинвазивной папиллярной уротелиальной карциномой (Та) составило 18,2%. У двадцати пяти больных установлена стадия Т1. Среднее значение частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в образцах мочи у этих больных было 32,8% .

Сравнение средних значений частоты встречаемости клеток с делецией 9р21 хромосомы в цитогенетических образцах больных с различными стадиями рака мочевого пузыря показало, что в группе минимально инвазивной карциномы этот признак встречается чаще. Различия имеют тенденцию к достижению статистической значимости (р=0,07).

Молекулярно-биологические нарушения в клетках уротелиальной карциномы проанализированы у 72 больных поверхностным раком мочевого пузыря.

Аномальное метилирование гена р16 в группе больных с папиллярной неинвазивной карциномой обнаружено у одного 1 из 32 (3,125%), а в группе минимально инвазивной карциномы у 10 из 40, что составило 25%. Двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,018.

Таким образом, метилирование гена р16 достоверно чаще выявлено у пациентов с минимально инвазивной уротелиальной карциномой, что позволяет использовать это молекулярно-генетическое повреждение генома в качестве одного из показателей инвазивного роста опухоли.

Используя в работе классификацию ВОЗ 1973 года, было установлено, что степень дифференцировки опухоли G1 обнаружена у 18, G2 - у 43 и G3 - у 11 пациентов.

При исследовании панели молекулярно-биологических маркеров в зависимости от степени дифференцировки опухоли были получены следующие результаты.

Делеция короткого плеча 3 хромосомы (Зр-) в группе G1 не встречалась, в группе G2 обнаружена у 4 (10,3%) больных, а группе низкодифференцированного рака (G3) была найдена у 5 (45,5%).

При статистическом анализе получены статистически значимые различия по частоте встречаемости делеции Зр- в группах G2 - G3. Двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,017.

При сравнении групп Gl - G3 так же получены статистически значимые различия (р=0,0039). Частота встречаемости делеции Зр- увеличивается при нарастании степени клеточной анаплазии и наиболее часто встречается в низкодифференцированных (G3) опухолях, что позволят использовать данное молеклярно-биологическое нарушение в качестве маркера неблагоприятного течения рака мочевого пузыря.

Частота встречаемости мутации гена FGFR3 в группе G1 и G2 составили 27,7% (5/18) и 30,2%) (13/43), соответственно. Различий между группами по этому признаку нет, позволило нам сравнить объединенную группу (Gl- G2) с низкодифференцированной (G3) карциномой. В группе низкодифференцированных опухолей (G3) мутаций гена FGFR3 не было обнаружено. Получены статистически значимые различия по частоте встречаемости этого генетического нарушения (р=0,05).

Таким образом, мутация гена FGFR3 является благоприятным фактором прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря, а делеция короткого плеча 3 хромосомы (Зр-) - неблагоприятным.

Размер опухоли является важным фактором прогноза течения заболевания. В нашей работе опухоли менее одного сантиметра в диаметре встречались в восьми случаях (11,1%), более трех сантиметров в семнадцати случаях (23,6%). Самую многочисленную группу составили опухоли размером от одного до трех см - 47 (65,5%) случаев. Среди опухолей малого размера мутация гена FGFR3 встречалась в 50% случаев, а среди опухолей промежуточного размера только у 6 больных из 47, что составило 12,8%. Рассчитанный двухсторонний точный критерий Фишера составил р=0,028. Таким образом, мутацию гена FGFR3 можно рассматривать как благоприятный фактор прогноза течения поверхностного рака мочевого пузыря.

Развитие рецидивной опухоли в первый год после установления диагноза поверхностного рака мочевого пузыря является важным неблагоприятным прогностическим признаком. В нашей работе рецидивы развились у 13 больных (18,1%). У 59 (81,9%) больных за время наблюдения рецидивов не было. Количество рецидивов варьировало от одного до трех. У одной пациентки (7,7%) развился мышечноинвазивный рак. Рецидивы развивались в срок от трех до тридцати месяцев. Локализация рецидивных опухолей мочевого пузыря отличалась от месторасположения первичной опухоли. При сроке наблюдения 30 месяцев в группе больных с нормальным р53 безрецидивная выживаемость составила 71%, а в группе больных с потерей гетерозиготности р53 - 32% (р=0,028). Различия в группах статистически значимы.

Исходя из вышеизложенных данных, мы считаем, что молекулярно-цитогенетические и молекулярно-биологические изменения в клетках уротелиальной карциномы имеют важное клиническое значение. Нам представляется обоснованным их использование в качестве дополнительных прогностических факторов. Дополнение к классическим клинико-морфологическим факторам прогноза риска рецидивирования и прогрессирования можно представить следующим образом.

Риск рецидива:

1. Низкий риск - единичные, Та, G1, менее 3 см в диаметре, мутация гена FGFR3(S249С).

2. Высокий риск - Tl, G3, мультифокальные или часто рецидивирующие, имеющие сопутствующую CIS уротелия, делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р!6 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

3. Промежуточным риск - Та, Tl, G1-2, мультифокальные, более 3 см в диаметре, мутация гена FGFR3{ S249C), делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16, высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

Промежуточный риск рецидивирования:

Та, Tl,Gl-2, мультифокальные, более 3 см мутация гена FGFR3{S249C) делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16, высокая частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и с гипоплоидией \9р21 в цитогенетическом препарате

Низкий риск: единичные, Та, G1, менее 3 см.

Высокий риск:

Tl, G3, мультифокальные, сопутствующая CIS.

Рис. № 14. Клиническое применение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров прогноза в формировании групп риска рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря.

Риск ирогрессироваиия:

1.Низкий риск - Ta-T1G1 без CIS, мутация гена FGFR3{S249C).

2.Высокий риск - многоместный T1G2, Ta-T1G3, первичная CIS или другие опухоли совместно с CIS, делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

3.Промежуточный риск - многоместный T1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS, мутация гена FGFR3{S249C), делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16 , высокая частота встречаемости клеток гиперплоидией 3,7,17 хромосом в цитогенетическом препарате, высокая частота встречаемости клеток с гипоплоидией 9р21 в цитогенетическом препарате.

Промежуточный риск прогрессирования: многоместный Т1G1, TaG2, солитарная опухоль T1G2 без CIS мутация гена FGFR3(S249C) делеция Зр-, потеря гетерозиготности р53, аномальное метилирование промоторного района гена р16, высокая частота встречаемости клеток с гиперплоидией 3,7,17 хромосом и с гипоплоидией \,9р21 в цитогенетическом препарате

Низкий риск:

Ta-T1G1 без CIS

Высокий риск: многоместный T1G2, Ta-T1G3, первичная

CIS или другие опухоли совместно с CIS

Рис. № 15. Клиническое применение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-биологических маркеров прогноза в формировании групп риска прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря.

Использование панели молекулярных и цитогенетических маркеров дает дополнительную информацию о злокачественном потенциале опухоли и позволяет разделить группу промежуточного риска рецидивирования и прогрессирования. Уротелиальные карциномы этих групп можно с большей уверенностью отнести к группам низкого или высокого риска на основании преобладающих генетических нарушений.