Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток и дисфункция эндотелия у больных ишемической болезнью сердца

На правах рукописи

□□3466239

РУДА Мария Михайловна

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК И ДИСФУНКЦИЯ ЭНДОТЕЛИЯ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА

14.00.06 - Кардиология 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 АР,?

Москва-2009

003466239

Работа выполнена в отделе ангиологии Института клинической кардиологии имени АЛ. Мясникова и лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Юрий Александрович Карпов

доктор медицинских наук, профессор

Елена Викторовна Парфёнова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

Фаиль Таипович Агеев

доктор медицинских наук, профессор,

Наталия Владимировна Перова

Ведущая организация: ГУО ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита диссертации состоится « 23 » апреля 2009 г. в 13ч. ЗОмин. на заседании диссертационного Совета (Д 208.073.04) по присуждению учёной степени кандидата медицинских наук в ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Автореферат разослан « ^■> ^^ 2009 г. Учёный секретарь диссертационного Совета,

Кандидат медицинских наук Татьяна Юльевна Полевая

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертония АД - артериальное давление

вч-СРБ - высокочувствительный С-реактивный белок

ГЛП - гиперлипидемия

ДАД - диастолическое артериальное давление

иАПФ - ингибитор ангиотензиниревращающего фермента

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИМ - инфаркт миокарда

ИМбп8Т - инфаркт миокарда без подъёма сегмента БТ

ИМТ - индекс массы тела

КАГ - коронарная ангиография

КШ - коронарное шунтирование

ЛЦ - лейкоциты

НС - нестабильная стенокардия

НУО - нарушенный углеводный обмен

ОКС - острый коронарный синдром

ОКСбп8Т - острый коронарный синдром без подъёма сегмента БТ

ОСА - общая сонная артерия

ОХС - общий холестерин

ПА - плечевая артерия

ПЗВД - поток-зависимая вазодилатация

ПЭК - предшественники эндотелиальных клеток

САД - систолическое артериальное давление

СС - стабильная стенокардия

ТГ - триглицериды

ТИМ - толщина комплекса интима-медиа

ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка

ХС-ЛПВП - холестерин липопротеидов высокой плотности

ХС-ЛПНП - холестерин липопротеидов низкой плотности

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭКГ - электрокардиограмма

N0 - оксид азота

N0* - метаболиты оксида азота (суммарное содержание 1Ч02 и N0} ) УЕСР - фактор роста эндотелия сосудов УЕСГ-И2 - рецептор 2 типа к фактору роста эндотелия сосудов у\\Т - фактор фон Виллебранда

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующую позицию в общей смертности, как в развитых странах, так и в России. Около половины случаев смертельных исходов от всех сердечнососудистых причин приходится на ишемическую болезнь сердца (ИБС) [World health report, 1999; Национальные клинические рекомендации ВНОК, 2008]. Атеросклероз - прогрессирующее заболевание с участием множества патофизиологических механизмов, приводящее к различным сердечнососудистым осложнениям. Одним из основных патофизиологических механизмов развития и самой ранней стадией атеросклероза, лежащим в основе ИБС, является дисфункция сосудистого эндотелия [Deanfield et al., 2007]. Целостность эндотелиальной выстилки сосуда зависит не только от степени повреждения её различными факторами риска, но и от эффективности её восстановления, что необходимо для поддержания функционирования эндотелия и предупреждения осложнений.

По современным представлениям в процессах репарации повреждённого сосудистого эндотелия, а также в неоваскуляризации ишемизированных тканей важную роль играют циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток (ПЭК) костно-мозгового происхождения [Asahara et al., 1997; Asahara et al., 1999; Shi et al, 1998]. Эти клетки характеризуются экспрессией ряда специфичных для предшественников (CD34, CD133) и зрелого эндотелия (VEGF-R2 (рецепторы 2 типа к фактору роста эндотелия сосудов), эндотелиалыгая NO-сиптаза, фактор фон Виллебранда (vWF) и др.) поверхностных клеточных маркёров [Asahara et al., 1997; Urbich et al., 2004].

Исходя из роли ПЭК в реэндотелизации и неоваскуляризации, мы предположили, что их количество в периферической крови может зависеть от степени повреждения эндотелия, тяжести клинического течения ИБС, и соответственно, характеризовать эти состояния.

Цель исследования: Изучить связь количества циркулирующих

предшественников эндотелиальных клеток с тяжестью течения заболевания и

4

оценить их роль в определении функционального состояния эндотелия у больных с различными формами ИБС. Задачи исследования

1. Изучить количество циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток в периферической крови больных со стабильной стенокардией и острым коронарным синдромом без подъёма сегмента БТ и сопоставить с этим показателем у группы практически здоровых лиц соответствующего пола и возраста.

2. Изучить динамику числа циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток у больных с ОКС без подъёма сегмента БТ за период госпитализации.

3. Исследовать количество циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток у больных ИБС при сопутствующих нарушениях углеводного обмена.

4. Оценить влияние пола, возраста, курения, артериальной гипертонии, гиперлипидемии и ряда других факторов риска ИБС на количество циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток.

5. Сопоставить количество циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток с функциональным состоянием эндотелия, оцененным по ультразвуковым показателям у больных с различными формами ИБС.

6. Сопоставить количество циркулирующих предшественников эндотелия с рядом биохимических маркеров эндотелиальной функции у указанных выше групп больных.

Научная новизна: Впервые в рамках одного исследования изучены количество ПЭК в периферической крови больных с различными формами ИБС (стабильная стенокардия, нестабильная стенокардия и инфаркт миокарда без подъёма сегмента 8Т), динамика числа ПЭК за период госпитализации у больных с острым коронарным синдромом без подъёма сегмента БТ (ОКСбпБТ); связь с рядом факторов риска ИБС, особенно нарушений

5

углеводного обмена (НУО), а также взаимоотношения количества циркулирующих ПЭК с функциональными и биохимическими маркёрами эндотелиалыюй дисфункции. Установлено, что количество циркулирующих CD34+ клеток снижено у больных ИБС по сравнению с лицами без ИБС, причём у больных OKC6nST в большей степени, чем у больных СС, а максимальное их снижение отмечается в подгруппе HM6nST. Показано, что при СС наиболее выраженное снижение числа циркулирующих CD34+ клеток-предшественников наблюдается у больных с сопутствующими нарушениями углеводного обмена. Выявлена связь между количеством циркулирующих ПЭК и дисфункцией эндотелия по данным ультразвукового исследования. Практическая значимость: Результаты работы могут быть использованы при разработке новых методов выявления и коррекции эндотелиалыюй дисфункции.

Внедрение в практику: полученные результаты внедрены в научно-исследовательскую работу Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова и Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехно логий.

Апробация диссертации состоялась 2 марта 2009 года на межотделенческой конференции Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова и Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Материалы диссертации доложены на: Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы кардиологии в свете достижений медицинской науки», Москва, 2007г.; Artery 7, Прага, Чехия, 2007г.; 7lh International Congress on Coronary Artery Disease «From Prevention to Intervention», Венеция, Италия, 2007г.; 57th Annual Scientific Session of American College of Cardiology, Чикаго, США, 2008г.; European Society of Cardiology Congress, Мюнхен, Германия, 2008г.; Российский Национальный Конгресс Кардиологов «Повышение качества и доступности кардиологической помощи», Москва, 2008г.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, включающего v источников. Работа изложена на /43 страницах машинописного текста, содержит ^ таблиц и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Структура исследования. Критерии включения: В период с мая 2005 по май 2007 года в различных отделениях Института клинической кардиологии им. A.JL Мясникова, а также в отделении неотложной кардиологии ГКБ №64 (на базе кафедры пропедевтики внутренних болезней Российского Университета Дружбы Народов) в исследование были включены 78 человек в возрасте от 40 до 69 лет (5В мужчин и 20 женщин в периоде постменопаузы). Из них: 1) в контрольную группу вошло 17 лиц без ИБС (по данным нагрузочной пробы и/или КАГ) и нарушений углеводного обмена; 2) 33 больных ИБС со II-III функциональным классом стенокардии (по классификации Канадского Общества по изучению сердечно-сосудистых заболеваний) - в группу стабильной стенокардии (СС). Верифицированным диагноз ИБС считали: при ИМ в анамнезе и/или наличии на фоне ангинозного приступа ишемических изменений сегмента ST на ЭКГ, при мониторировании ЭКГ по Холтеру и/или положительной нагрузочной пробе и/или с гемодинамически значимым (>50%) стенозированием коронарных артерий по результатам КАГ. 3) 28 больных с впервые возникшей или прогрессирующей стенокардией, или затяжным ангинозным приступом (более 15-20 мин) вошло в группу OKC6nST в первые 24 часа от момента последнего ангинозного приступа, сопровождавшегося изменениями на ЭКГ (стенокардия покоя III В класса по классификации Braunwald). В дальнейшем в зависимости от уровня сердечных тропошшов больные с ОКС были подразделены на лиц с нестабильной стенокардией (НС) (17 человек) и инфарктом миокарда без подъёма сегмента ST (ИМбпБТ) (11 человек). У 17 (61%) пациентов из группы ОКС количество различных субпопуляций циркулирующих клеток-предшественников, а также ряд других

показателей определяли повторно в день выписки (срок госпитализации составил в среднем 11,4±0,8 дней).

Критерии искпючент: клинические и лабораторные признаки острого инфекционного заболевания в течение 2 предшествующих месяцев; наличие острого или хронического воспалительного заболевания; инфаркт миокарда, нарушение мозгового кровообращения, перенесенные менее 6 месяцев назад; наличие рефрактреной АГ (АД>180/100 мм рт.ст. на фоне комплексной гипотензивной терапии); системные заболевания (ревматизм, васкулиты, ревматоидный артрит и др.); заболевания эндокринной системы (за исключением НУО); пороки сердца; заболевания миокарда (миокардит и др.); анемия (гемоглобин<10,0 г/дл); тяжелые хронические заболевания (онкологические, гематологические, неврологические, алкоголизм, хроническая печеночная, почечная, дыхательная недостаточность); поражение артерий нижних конечностей, сопровождающееся перемежающейся хромотой (Ш-1У стадии); отказ от участия в исследовании.

Клиническая характеристика обследованных лиц. Лица контрольной группы оказались в среднем на 7 лет моложе больных СС. Несмотря па указанные различия в возрасте, участники обеих групп полностью соответствовали критериям включения/исключения, а при выравнивании групп по возрасту различия в числе циркулирующих ПЭК сохранялись. У больных СС анамнез ИБС был более длительным, чем у больных ОКС. Следует учитывать, что 52% больных с ОКС были госпитализированы по поводу впервые возникшей стенокардии. Длительность анамнеза ИБС у остальных 48% больных этой группы составила 45,7±14,8 мес. и не отличалась от группы СС (р=0,56).

Всем пациентам была подобрана адекватная гипотензивная, антиангинальная, гиполипндемическая, антиагрегантная, при необходимости -антикоагулянтная терапия. Для наиболее корректной оценки ультразвуковых показателей и уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови, а также количества циркулирующих ПЭК в периферической крови, больным со СС

8

Таблица 1. Клинические характеристики сравниваемых групп при включении в исследование.

Контроль 0) сс (2) OKCGnST (3) Pl-2 Pl-3 Р2-3

11 17 33 28

Мужской пол, п (%) 15(88) 23(70) 18(71) -0,13 =0,17 =0,55

Возраст, годы, М±т 50,5±1.6* 58,1±1,3 55,4+1,5 =0,002 =0,055 =0,22

Курение, п (%) 7(41) 12(38) 17(61) =0,52 =0,17 =0,06

АГ, п <%) 12(69) 30(91) 26(92) =0,063 =0,049 =0,99

Гиперлипидемия1, п (%) 7(41) 26(79) 23(82) =0,012 =0,008 =1,00

Нарушение углеводного обмена, п (%) — 16(48) 11(39) ... ... =0,61

ИМТ, кг/м\ М±т 29,4±1,1 27,8±0,6 28,1±0,7 =0,064 =0,16 =0,47

Давность ИБС, мес., М±т — 74,3±15,8 20.8±8,3 — — <0,001

ИМ в анамнезе, а (%) — 19(58) 5(18) ... — =0,002

Признаки ишемии других бассейнов', п (%) ... 11(33) 7(25) ... ... =0,39

ТБКА или КШ3 в анамнезе, п(%) ... 7(21) 0(0) ... ... =0,01

ФВЛЖ'. %, Mint >60 56,6±0,9 55,4iU =0,002 =0,001 =0,56

Зоны нарушения локальной сократимости, п (%) ... 15(45) 13(46) ... ... =0,98

Выполнение КАГ, п (%) 6(35) 29(88) 19(68) <0,001 =0,06 =0,07

Число поражённых коронарных артерий5, М±т ... 2,5±0,1 2,1 ±0,3 ... ... =0,23

САД, мм рт. ст., Mint 124±4 126±3 130±3 =0,54 =0.11 =0,18

ОХС, ммолъ/л, М±т 5,2±0,2 5,9±0,3 6,3±0,3 =0,11 =0,012 =0,31

ХС-ЛПНП, ммоль/л, М±т 3,1±0,3 3,4±0,3 4.2±0,2 =0,47 =0,02 =0,046

ХС-ЛПВП, лшоль/л, М±т 1,1±0,1 1,1±0,1 1,2±0,1 =0,79 =0.56 =0,71

ТГ, ммоль/л, M±nt 1,7±0,3 2,5±0,4 1,9±0,1 =0,048 =0,19 =0,34

Глюкоза, лшоль/л, М±т 5,2±0,1 6,0±0,2 6,1+0,4 =0,006 =0,07 =0,37

Инсулин, мкЕ/мл, М±т 7,0±1,6 8,4±0,7 13,3±2,2 =0,33 =0,17 =0,42

С-пептид, нг/мл, Mim 1,8±0,3 1,7±0,2 3.8±0,6 =0,66 <0,001 <0,0001

Вч-СРБ, мг/дл, М±т 0,21 ±0,07 0,28±0,07 0,55±0,09 =0,002 =0,002 =0,59

Мочевая кислота, мкмоль/л, М±т 360±25 340±11 329±14 =0,42 =0,25 =0,68

При уровне общего холестерина > 5,2 ммоль/л и/или триглицеридов > 2,3 лшоль/л

2 Наличие газодинамически значимых стенозов брахиоцефаньных, почечных артерий, артерий нижних конечностей по данным ультразвукового думексного сканирования ши ангиографии; нарушения мозгового кровообращения, инфаркта почки в анамнезе

3 ТБКА - транслюминальная баллонная ангиопластика; КШ - коронарное шунтирование

4 Для стандартизации оценки ФВ ЛЖ при ФВ>60% значение ФВ приравнивали к 60% J Учитывали только гемодинамически значимые стенозы (>50%)

принимающим нитраты, их отменяли за сутки. Больным с ОКС, находившимся на инфузии нитратов, их введение прекращали за 30-60 минут до момента взятия крови, проведения ультразвукового исследования сосудов; возобновляли

сразу после окончания обследования. При учащении приступов стенокардии в группе СС, возникновении приступа стенокардии в группе ОКС возобновляли исходную терапию; больного в исследование не включали.

Таблица 2. Терапия при включении в исследование1.

Вид терапии Контроль (1) СС (2) ОКСбпБТ (3) Р1-2 Р1-3 Рм

п 17 33 28

¡¡-б.чокаторы, п (%) 7(41) 32(97) 25(89) <0,0001 0,002 0,37

Антагонисты кальция, и ("/«) 1(6) 16(48) 0(0) 0,002 0,44 <0,0001

Гепарин2, п (%) 0(0) 0(0) 21(75) — <0,0001 <0,0001

Аспирин, п (%) 7(41) 29(88) 26(93) 0,002 0,001 0,48

Клопидогрел, п (%) 2(12) 10(30) 24(86) 0,11 <0,0001 <0,0001

иАПФ, п (%) 4(23) 22(67) 17(61) 0,003 0,015 0,43

Статины, п (%) 3(17) 20(61) 9(32) 0,003 0,24 0,021

Нитраты, и (%) 0(0) ! 2.2(67) 14(50) <0,0001 0,001 0,072

В таблице 2 приведены данные без учёта изменений в терапии, связанных с включением в исследование (см. в тексте).

2 Нефракционированный или низкомолекулярные гепарины.

Две группы больных ИБС по частоте приёма р-адреноблокаторов, аспирина и иАПФ не отличались. Отмечались различия в частоте назначения гепаринов и клопидогреля, что вполне объяснимо в связи с клиническими особенностями группы ОКС и соответствует общепринятым стандартам лечения. Кроме того, они отличались по частоте приёма антагонистов кальция и статинов, что, вероятно, связано с минимальными сроками от момента поступления до момента включения в исследование больных с ОКС, а также тот факт, что более половины больных из этой группы были госпитализированы по поводу впервые возникшей стенокардии и часть из них ранее никогда к врачам не обращались.

Методы исследования. Стандартное обследование. Проводили подробные опрос и физикальное обследование пациента; общий клинический, биохимический (включающий липидный спектр и высокочувствительный С-реактивный белок (вч-СРБ)), коагуалогический анализы крови; общий анализ мочи и анализ мочи по Нечипоренко; определение концентрации инсулина и С-пептида; ЭКГ в 12 отведениях, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру,

ю

нагрузочную пробу, трансторакальную двухмерную Эхо-кардиографию. По показаниям - тест толерантности к глюкозе; определение гормонов, характеризующих функцию щитовидной железы; коронарную ангиографию (КАГ). Больным с OKConST определяли тропонин I или Т.

Специальное обследование. Подсчёт количества циркулирующих ПЭК методом поточной цитофлюориметрии. Получение и обработка образцов крови. Взятие крови осуществлялось из кубитальной вены самотёком натощак. Забор крови у больных с ОКС происходил через 12,2±1,6 часа от начала приступа. 2 мл крови брали в пробирку с ЭДТА. Окрашивание антителами полученных образцов крови проводили согласно протоколу, рекомендованному производителем. Клетки крови отмывали от плазмы путём центрифугирования при температуре +4°С, с ускорением 500g в холодном фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина трижды. 250 мкл отмытой крови переносили в отдельную пробирку и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре с 5 мкг мышиного иммуноглобулина (Becton Dickinson, США) для устранения неспецифического связывания антител через Fc-фрагмент. Затем в пробу добавляли меченные флюоресцентной меткой моноклональные антитела, специфичные к антигенам человека: к CD45 - антитела, меченные флюоресцеин изотиоцианатом, к CD34 - перидинин хлорофилл-а протеином (Becton Dickinson, США), к VEGF-R2 -фикоэритрином (R&D Systems Inc., США). Одновременно с опытной пробой аналогичным образом подготавливали контрольную, в которую вместо антител к CD34 и VEGF-R2 вносили контрольные иммуноглобулины соответствующего изотипа. После инкубации эритроциты лизировали в растворе FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, США) в течение 10 минут при комнатной температуре. Суспензию клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, при 300g и ресуспендировали в 1% растворе параформальдегида в том же буфере. Цитофлюориметрический анализ проводили на приборе «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CeüQuest» или

Ii

«WinMDI». Анализировали 300-500 тысяч событий (клеток) для каждого образца. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Далее из популяции CD451ow/- клеток по экспрессии CD34 и VEGF-R2 выделяли популяции CD34+/VEGF-R2- и CD34+/VEGF-R2+ клеток и для каждого пациента рассчитывали их число в пересчете на 1 миллион лейкоцитов, а также их суммарное количество - общее число CD34 положительных (CD34+) клеток.

Ультразвуковое исследование структурно-функционального состояния сосудистой стенки. Оценивали поток-зависимую вазодилатацию (ПЗВД-) плечевой артерии (ПА) в пробе с реактивной гиперемией, по методу, описанному Celermajer с сотр. в 1992г. на аппаратах VIVID 7 (General Electric, США), ACUSON 128 ХР 10 и HDI 5000 SonoCT (Philips, США). Манжету сфигмоманометра накладывали на плечо проксимальное места сканирования ПА, затем путём нагнетания воздуха в манжету производилась артериальная окклюзия с давлением на 30-50 мм рт.ст. выше систолического АД (САД). Через 5 минут проводили декомпрессию манжеты, после чего непрерывно на протяжении 90 секунд регистрировали продольное изображение ПА. В течение всего исследования изображение ПА синхронизировалось с R-зубцом ЭКГ; все измерения диаметра (D) сосуда производились в конце диастолы. Изображения ПА фиксировались одновременно на видеомагнитофонную плёнку SVHS для последующего анализа. Диаметр ПА оценивали исходно, через 60 сек и 90 сек после декомпрессии манжеты. ПЗВД вычисляли по формуле: ПЗВД={(Ореак.гип. - Ducx.)/ Ducx.} • 100%, где Вреакт.гип. - максимальный диаметр ПА через 60 или 90 сек. после декомпрессии манжеты, Оисх. -исходный диаметр ПА. Для измерения толщины комплекса интима-медиа сканировали дистальную треть (10-20 мм) правой и левой общих сонных артерий (ОСА) в продольном сечении. Измерения ТИМ производили трижды в различных сердечных циклах, затем значения усреднялись. Рассчитывались ТИМправ. ОСА - ТИМ задней стенки правой ОСА и ТИМлев. ОСА - ТИМ задней стенки левой ОСА, ТИМмакс. ОСА - максимальное значение из

12

ТИМправ. ОСА и ТИМлев. ОСА. ТИМ более 0,9 мм рассматривали как утолщение стенки ОСА. Для оценки растяжимости и жёсткости ОСА, сканирование проводили в B-режиме на участке 15-20 мм проксимальнее бифуркации. По результатам измерения диаметра ОСА во время систолы и диастолы в М-режиме (усреднённое по 3 сердечным циклам значение), САД и ДАД рассчитывали: 1) DC (Distensibility coefficient) - коэффициент растяжения сосуда под действием растягивающего пульсового АД [Па-1 ] и 2) индекс жесткости р (Stiffness parameter ß), характеризующий зависимость напряжение-растяжение стенки сосуда, выраженный с помощью экспоненциальной функции (безразмерная величина). Использовали следующие формулы: DC=2 • {(Dsys - Ddia)/Ddia}/BPpul [Riley et al., 1992]; ß=In (BPs/BPd) • Ddia/(Dsys-Ddia) [Wada et al., 1994], где Ddia - диаметр сосуда в диастолу (min), Dsys -диаметр сосуда в систолу (max), BPpul - пульсовое давление, BPs -систолическое АД, BPd - диастолическое АД, я=3,14 - константа.

Определение биохимических маркёров эндотелиальпой функции. 10 мл крови набирали в пробирку с активатором свёртывания для получения сыворотки, столько же - в пробирку с ЭДТА для получения плазмы. Образцы крови центрифугировали при 1500g в течение 20 минут при комнатной температуре (для сыворотки) и при +4С° (для плазмы). Аликвоты хранили при -70°С. Определение концентрации метаболитов NO (нитритов и нитратов) в сыворотке крови проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе LC-10AD (Shimadzu, Япония). Содержание в плазме эндотслина-1 (набор фирмы «Biomedica Gruppe», США), Р- и Е-селектипов (наборы human sE-selectin ELISA и human sP-selectin ELISA соответственно, фирма «Bender MedSystems», Австрия) на приборе Tecan Sanrise (Австрия), а также фактора фон Виллебранда (на приборе Multiskan EFLABoy (Финляндия) [Янушевская Е.В. и соавт., 2005] определяли методом иммуноферментного анализа.

Статистический анализ: Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (М±т). Учитывая небольшие объёмы выборок, для более

13

корректной оценки полученных результатов весь анализ проводили, используя ненараметрическне методы: для попарного сравнения применяли и тест Манна-Уитни, для множественного - тест Краскела-Уоллиса. Взаимосвязь между показателями оценивали с помощью корреляционного анализа методом Спирмана. Для сравнения групп по номинативным признакам использовали точный критерий Фишера (двухсторонний) и критерий %2. Для выявления многофакторных взаимосвязей проводили регрессионный и дискриминантный анализы. Статистически значимым считали различие при р<0,05. Статистическую обработку данных производили при помощи программного пакета "БТАШПСА 6".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Циркулирующие ПЭК у больных с различными формами ИБС. Количество циркулирующих ПЭК у различных групп обследованных при включении в исследование. Количество циркулирующих предшественников суммарной фракции СБ34+ клеток оказалось снижено в обеих группах ИБС: на 43% - у больных с ОКС и на 23% - у больных со СС по сравнению с их числом в контрольной группе (ОКС, 166±12; СС, 224±18; контроль, 291±29 клеток/106 ЛЦ) (Рис. 1А). Более того, у больных с ОКС этот показатель был на четверть ниже по сравнению с больными со СС.

(А) (Б)

350 300 К 250

0 200 | 150-

1 100* 50

р=0,0003

350

300

=г

с; 250

2 СО

О 150

о й 100

50

р-0,0045

р~0,0003

Контроль (п=17) СС (п=33) ОКС (п=28) Контроль (п=17) СС (п=331 НС (п=28) ИМ (п=11)

Рис. 1. Количество С 1)34+ клеток у больных с различными формами ИБС.

При подразделении группы ОКС на больных с НС и ИМбп8Т (187±15 и 134±18 клеток/106 ЛЦ соответственно), выяснилось, что у пациентов с НС

14

количество циркулирующих CD34+ клеток снижено в сравнение с группой контроля (на 36%) и значимо не отличается от группы С-С, хотя тенденция к снижению сохраняется (на 16,5%). Больные с [IMonST имели наименьшее количество циркулирующих клеток-предшественников, которые были снижены не только в сравнении с лицами без ИБС (на 54%) и больными СС (на 40%), но и больными с НС (на 28%) (Рис. 1Б). Таким образом, чем тяжелее была клиническая форма ИБС, тем ниже оказывался уровень этих клеток в крови.

Можно предположить следующие механизмы снижения числа ПЭК в крови: нарушение процессов мобилизации клеток-предшественников из костного мозга [Iwami et al., 2004]; повышенное «потребление» этих клеток в зонах ишемии, повреждения эндотелия [Hristov et al., 2003]; непосредственное повреждение самих ПЭК воздействием различных факторов риска [Hill et al., 2003]; наконец, возможно какое-либо сочетание перечисленных выше механизмов. Не исключено, что максимальное снижение количества циркулирующих CD34+ предшественников при ИМбпБТ может косвенно свидетельствовать об их участии в процессах репарации и неоангигенеза при повреждении миокарда.

В то же время популяция CD34+/VEGF-R2+ клеток по нашим и многим другим данным [Peichev et al., 2000; Rabelink et al, 2004] настолько малочисленна (среднее количество этих клеток в нашей работе составило 8±1 клеток/106 ЛЦ, а разброс показателя оказался достаточно велик (SD±7, доверительный интервал 2-17 клеток/106 ЛЦ)), что выявить достоверные различия между группами нам не удалось. При подразделении группы ОКС на больных с НС и HM6nST отмечались лишь тенденции к снижению числа этих клеток у больных с ИМ по сравнению с группой контроля (р=0,06) и подгруппой НС (р=0,08).

Динамика числа циркулирующих ПЭК у больных с OKC6nST. У больных с OKC6nST ко дню выписки отмечалась чёткая тенденция к увеличению числа CD34+ клеток по сравнению с днём поступления (с 152±14 до 191±25 клеток/106 ЛЦ соответственно) (Рис. 2), что было подтверждено положительной

15

корреляцией между приростом числа этих клеток (разность количества клеток между 2й и I й точками, ДС034-ь клеток) и длительностью периода наблюдения (1=0,59, р-0,01). Важно отметить, что количество СБ34+ клеток у больных с ОКС к моменту выписки практически достигло уровня этих клеток, найденного при СС, оставаясь достоверно ниже, чем в группе контроля.

Контроль (n=17) СС (n=33) V Поступление —> Выписка^ _ОКС (п=17)_

Рис. 2. Изменение количества CD34+ клеток у больных с ОКС за период

госпитализации.

Мы предполагаем, что некоторый прирост числа CD34+ клеток у больных с OKC6nST за период госпитализации может косвенно говорить о снижении «потребности» в этих клетках в соответствующих зонах в связи с уменьшением выраженности ишемии, завершением репаративных процессов и стабилизацией состояния на фоне проведённого курса лечения. В результате количество ЦКП в периферической крови восстанавливается за счёт успешного их восполнения костным мозгом.

Сердечно-сосудистые факторы риска. Сопоставление с количеством циркулирующих ПЭК. В ряде исследований было показано, что некоторые факторы риска сердечно-сосудистых осложнений негативно влияют на число и функциональные способности ПЭК [Vasa et al., 2001; Hill et al., 2003; Chen et al., 2004; Loomans et al., 2004; Fadini et al., 2006; Werner et al., 2006]. Однако, в большинстве работ воздействие факторов риска изучалось в экспериментальных условиях или у лиц без ИБС. Поэтому мы решили провести комплексный анализ: оценить влияние нескольких классических факторов риска и попытаться определить наиболее значимые из них.

16

Для оценка влияния нарушенного углеводного обмена на количество ПЭК в крови, обе группы больных ИБС были подразделены на лиц без НУО и больных с его наличием. К лицам с НУО относили больных с гипергликемией натощак, нарушенной толерантностью к глюкозе или сахарным диабетом 2 типа. Оказалось, что у больных со СС количество СБ34+ клеток в подгруппе с НУО достоверно снижено по сравнению с контролем (190±18 и 291±29 клеток/106 ЛЦ соответственно, р=0,03) и имеет тенденцию к снижению по сравнению с этим показателем у больных из той же группы без НУО (190±18 и 255±29 клеток/106 ЛЦ соответственно, р=0,1) (Рис. 3). При этом подгруппа без нарушений углеводного обмена по уровню Сй34+ клеток значимо не отличалась от группы контроля (255±29 и 291 ±29 клеток/106 ЛЦ соответственно, р=0,38), а подгруппа с НУО - от обеих подгрупп ОКС. Таким образом, снижение числа С034+ клеток в группе СС относительно контроля происходило в основном за счёт подгруппы с НУО. По-видимому, при стабильном течении ИБС нарушенный углеводный обмен является одним из наиболее значимых факторов уменьшения количества клеток-предшественников в циркуляции, наряду с хронической ишемией и постоянным идущим повреждением сосудистой стенки.

(НУО).

В то же время, у больных с ОКС значимых различий в подгруппах с отсутствием (171±15 клеток/106 ЛЦ) и наличием сопутствующих НУО (158±22 клеток/106 ЛЦ) не обнаружено. Обе подгруппы достоверно отличались от группы контроля, а также от подгруппы СС без НУО (255±29 клеток/106 ЛЦ). Возможно, что при ОКС острая ишемия миокарда и наличие выраженного повреждения сосудистой стенки, приводят к настолько значительной аккумуляции клеток-предшественников в соответствующих зонах, что вклад НУО в снижение количества С034+ клеток в крови нивелируется. Кроме того, при анализе всей выборки, отмечалась слабая, но достоверная отрицательная корреляция между уровнем глюкозы венозной крови и количеством СБ34+ клеток (г=-0,23, р=0,04), что ещё раз подчёркивает негативное влияние НУО на число этих клеток в крови и свидетельствует о существовании связи между СБ34+ клетками и НУО, даже когда очевидного снижения их уровня при НУО (группа ОКС) не происходит.

При оценке влияния других классических факторов риска ИБС на количество циркулирующих предшественников в крови, при ОКСбпБТ выявлено снижение уровня СЮ34+ клеток у женщин по сравнению с мужчинами (184±14 и 120&16 клеток/106 ЛЦ соответственно, р=0,03). Это может быть обусловлено тем, что помимо быстрого «потребления» этих клеток при ОКС, у женщин в периоде постменопаузы страдают и эстроген-зависимые механизмы мобилизации ПЭК из костного мозга [81геЫо\у е! а1., 2003; Ьуакига й а1., 2003; Ра<1ш е1 а1., 2008]. Количество С1)34+/УЕС}Г-Я2+ клеток при анализе всей выборки при нормальном САД (САД < 130 мм рт.ст.) (п=53) было достоверно выше, чем у больных с повышенным САД (131 и более мм рг.ст.) (п=25) (10±2 и 5±1 клеток/106 ЛЦ соответственно, р=0,02). Отмечалось умеренное, но достоверное снижение числа С034ь'УЕСГ-К2-1 с возрастом (г=-0,23, р=0,04). Уровни ОХС, ХС-ЛПВП и ХС-ЛПНП обратно (г=-0,35, р=0,065; г=-0,58, р=0,001; г=-0,38, р=0,049 соотвтственно), а уровень ТГ - прямо (г=0,39, р=0,04) коррелировали с количеством СБ34+ клеток у больных с ОКСбпЗТ. В то же время, влиянии курения, ожирения, концентрации вч-СРБ и мочевой

18

кислоты на количество клеток какой-либо из двух изучаемых популяций предшественников не выявлено.

ЛС034+

200 1^=0,68, р=0,0014

-200

100 200

Предсказанное ДС034+ клеток

О

-200 -1

Рис. 4. Предсказанное изменение количества С034+ клеток у больных с ОКСбиБТ за период госпитализации (п=15).

Многофакторный анализ позволил определить устойчивую и статистически значимую модель взаимосвязи изменения числа циркулирующих предшественников в группе ОКСбпБТ (ДСБ34+ клеток) с исходной концентрацией в крови С-пептида, глюкозы и с изменением уровня общего холестерина за период госпитализации. Предсказанное изменение количества СБ34+ клеток = (45 * С-пептид) + (14,5 * глюкоза) + (41 * ЛОХС) - 253,4. Коэффициент детерминации составил г2=0,68, с уровнем значимости - р=0,0014 (Рис. 4). Эта зависимость подчёркивает влияние углеводного и липидного обмена на количество (ЮЗ4+ клеток у больных с ОКС. При увеличении числа наблюдений подобная зависимость, по-видимому, позволила бы говорить о показателе, определив который можно с -70% предсказательной способностью спрогнозировать характер изменения количества СВ34+ клеток у больных с ОКС за период госпитализации.

Ультразвуковые показатели эндотелиалыгой функции и состояния сосудистой стенки у больных различными формами ИБС. Сопоставление с количеством циркулирующих ПЭК. Поток-зависимая вазодилатация

плечевой артерии - общепризнанный показатель эндотелиальной функции -при проведении пробы с реактивной гиперемией была нарушена у больных е ОКС по сравнению с лицами без ИБС (7,1±1,0 и 12,2±1,8% соответственно, р=0,02), в то время как у больных со СС отмечалась лишь подобная тенденция (8,9±0,8 и 12,2±1,8% соответственно, р=0,1) (Рис. 5А). Тем не менее, именно в группе СС количество СЭ34+ клеток прямо коррелировало с ПЗВД (Рис. 5Б). Значимого изменения этого показателя за период госпитализации у больных с ОКС выявлено не было. Однако, чем больше был прирост числа СБ34+ клеток у этих больных, тем лучше по данным ультразвукового исследования оказывалось состояние эндотелиальной функции при выписке (г=0,72, р=0,008). Всё это в той или иной степени подтверждает наше предположение, что функционирование эндотелия, непосредственно связанное с целостностью эндотелиального слоя, зависит и от числа этих клеток в крови.

(А) (Б)

Рис. 5. Поток-зависимая вазодилатация плечевой артерии у различных групп исследуемых (А). Взаимосвязь ПЗВД с количеством С 1)34+ клеток у больных СС (п=32) при поступлении (Б).

Толщина комплекса интима-медиа общей сонной артерии - показатель

структурных изменений при атеросклерозе, также как и ПЗВД, является

прогностически значимым методом оценки состояния сосудистой стенки. В

обеих группах ИБС ТИМ была увеличена по сравнению с контролем, тогда как

между собой две группы больных по этому показателю не отличались (Рис.

6А). Изменения ТИМ в группе ОКС за период госпитализации не отмечалось.

Однако, чем ниже был исходный уровень СБ34+ клеток у больных этой

20

группы, тем больше у них были выражены УЗ-признаки атеросклероза как при поступлении (г=-0,41, р=0,046) (Рис. 6Б), так и при выписке (г=-0,7, р=0,012).

(Л) (Б)

Рис. 6. Толщина комплекса интима-медна общей сонной артерии у различных групп исследуемых (А). Связь числа СМ4+ клеток с ТИМ у больных с ОКСбпвТ (п=24) при поступлении.

Повреждение эндотелия и его дисфункция могут приводить к снижению эластичности сосудов. В ходе проведённого обследования межгрупповых различий в коэффициенте растяжимости и индексе жёсткости ОСА между всеми группами исследуемых не отмечено. Тем не менее, при анализе всей выборки коэффициент растяжимости положительно (г=0,27, р=0,03), а индекс жёсткости отрицательно (г=-0,28, р=0,03) коррелировали с числом СВ34+/УЕСЕ-Я2+ клеток.

Биохимические маркёры зндотелиальной дисфункции у больных с различными формами ИБС. Сопоставление с количеством циркулирующих ПЭК. Три группы исследуемых по уровню фактора фон Виллебранда и Е-еелектина не различались. Концентрация эндотелинаА имела тенденцию к повышению, а уровень метаболитов оксида азота - к снижению у больных с ОКСбпБТ. Уровень Р-селектина оказался также наименьшим в группе ОКС (Таб. 3). Если первые две тенденции были вполне ожидаемы, то причина снижения уровня Р-селектина у больных с ОКС до конца не ясна. Возможно, это связано с терапией антикоагулянтами, которую получали больные только данной группы.

Таблица 3. Биохимические маркёры эндотелиальной дисфункции у различных групп обследованных.

Контроль (1) СС (2) ОКСбпвТ (3) Р1-2 Р1-3 Рм

Я И 31 28

,\0х, мкмоль/л 37,2±5,7 31,1±2,3 28,7±2,8 =0,29 =0,1 =0,29

Эндотелии-!, фмоль/л 0,52±0,02 1,06±0,35 1,00±0,26 =0,31 =0,07 =0,17

хР-селектии, пг/мл 353±80 296±36 139±21 =0,72 =0,01 =0,0004

яЕ-селек/пии, пг/мл 28±4 34±4 32±3 =0,74 =0,55 =0,91

уИ'Е, мг/мл 15,3±1,2 17,6±1.0 15,4*1,1 =0,235 =0,925 =0,13

Значимых взаимосвязей между концентрацией метаболитов оксида азота, эндотелина, Р- и Е-селектинов, фактора фон Виллебранда и количеством клеток какой-либо из двух изучаемых популяций предшественников не выявлено.

ВЫВОДЫ

1. Количество СБ34+ клеток снижено в периферической крови больных ИБС. Значимых различий по уровню СВ34+/УЕСР-112+ клеток между тремя группами обследованных не найдено. У больных со стабильной стенокардией СБ34+ клеток на 23% меньше по сравнению с группой контроля; у больных с острым коронарным синдромом без подъёма сегмента 5Т - на 43% по сравнению с группой контроля и на 26% по сравнению с группой СС. Наименьшее количество СБ34+ клеток определяется у больных с ИМбпЗТ, подобная тенденция обнаружена и для С034+/УЕ0Р-К2+.

2. По мере стабилизации состояния больных с ОКСбпБТ число циркулирующих СБ34+ клеток-предшественников имеет тенденцию к увеличению, достигая ко дню выписки уровня у больных со СС. Прирост числа С034+ клеток в крови больных с ОКСбпБТ тем больше, чем больше времени прошло с момента развития ОКС.

3. При стабильной стенокардии наиболее выраженное снижение количества циркулирующих С034+ клеток наблюдается у лиц с нарушенным углеводным обменом. Различий в числе этих клеток у больных с ОКСбп8Т в зависимости от наличия или отсутствия НУО не найдено. Чем выше уровень глюкозы, тем меньше С034+ клегок в периферической крови.

4. Количество циркулирующих СВ34+/\/'Е017-Я2+ клеток уменьшается с возрастом и при повышении АД. При ОКСбпБТ число С034+ клеток снижено у женщин и у лиц с повышенным уровнем ОХС, ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП и пониженным - ТГ. Влияния курения, ожирения, концентрации вч-СРБ и мочевой кислоты на количество клеток какой-либо из двух изучаемых популяций предшественников не выявлено.

5. Снижение уровня С034+ клеток в крови больных ИБС коррелирует с нарушением функции эндотелия, определённой с помощью ультразвукогового исследования сосудов. Чем выше уровень СБ34+ клеток в крови, тем больше ПЗВД ПА у больных С С и меньше ТИМ ОСА у больных ОКСбпБТ. Количество С034+/УЕ0Е-К2+ клеток положительно коррелирует с коэффициентом растяжимости и отрицательно - с индексом жёсткости ОСА.

6. Значимых взаимосвязей между числом циркулирующих ПЭК и уровнем таких биохимических маркёров дисфункции эндотелия, как метаболиты N0, эндотелии, яР-, яЕ-селктины и у\¥Е не найдено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенный протокол определения количества циркулирующих СГ334+ клеток-предшественников рекомендуется использовать для научно-исследовательских работ, направленных на изучение числа этих клеток при различных патологиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1. М.М. Руда, Е.В. Парфёнова, Ю.А. Карпов. Предшественники эндотелиальных клеток: роль в восстановлении функции эндотелия и перспективы терапевтического применения // Кардиология - 2008. - Т. 48, № 1. - С. 66-73.

2. М.М. Руда, Т.И. Арефьева, М.И. Трипотень, Т.В. Балахонова, Е.В. Парфёнова, Ю.А. Карпов. Циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток и дисфункция сосудистого эндотелия // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова - 2009. - Т. 95, № , С. -

23

3. М.М. Руда, Т.И. Арефьева, О.Н. Выборов, М.И. Трипотень, Т.В. Балахопоиа, Е.В. Парфёнова, Ю.А. Карпов. Предшественники эндотелиальных клеток н дисфункция эндотелия у больных с ИБС и сопутствующим сахарным диабетом /У Кардиологический вестник - 2008. - Т. III(XV), .М> 1. - С. 53-60.

4. Руда М.М. Циркулирующие клетки-предшественники у больных с различными формами ИБС // Российский национальный конгресс кардиологов. Материалы конгресса 7-9 октября 2008 г. - Москва. - С. 316-317.

5. Руда М.М., Трипотень М.И., Выборов О.Н., Арефьева Т.И., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А., Балахонова Т.В. Ультразвуковые показатели функции эндотелия и циркулирующие клетки-предшественники (CD34+) у больных с различными формами ИБС // 5-й Съезд Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине. Сборник тезисов 18-21 сентября 2007 г. - Москва. - С. 99,

6. Maria М. Ruda, Alexey V. Mazurov, Olga A. Antonova, Valery P. Mascnko, Tatyana V. Kuznetsova, German A. Tkachev, Oleg N. Vyborov, Tatiana I. Arefieva, Tatyana V. Balakhonova, Maria I. Tripoten, Yuriy A. Karpov, Yelena V. Parfyonova. Circulating Progenitor Cells and Endothelial Dysfunction in Patients With Coronary Heart Disease and Concomitant Abnormal Glucose Metabolism // J Am Coll Cardiol. - 2008. - Vol. 51 - SupplA. - P. A289 (Abstract 1007-209).

7. M.M. Ruda, O.N. Vyborov, T.I. Arefieva, M.I. Tripoten, T.V. Balakhonova, A.V. Mazurov, Y.V. Parfyonova, Y.A. Karpov. Circulating progenitor cells - a new marker of endothelial dysfunction? // The Journal of Coronary Artery Disease. -2007. - Vol. 7 - P. 81 (Abstract 276).

8. M.M. Ruda, O.N. Vyborov, T.I. Arefieva, Y.A. Karpov, Y.V. Parfyonova. CD34+ cells in patients with non-ST elevation acute coronary syndrome // Europ Heart J. - 2008. - Vol. 29 - Abstract Suppl. - P. 443 (Abstract P2756).

9. M. Ruda, O. Vyborov, T. Arefieva, Yu. Karpov, Ye. Parfyonova. The number of CD34+ cclls in patients with stable angina pectoris: influence of abnormal glucose metabolism and coronary angioplasty // Artery. - 2007. - Vol. 1 - P. 61 (Abstract P.039).

Подписано в печать 19 марта 2009 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 222 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37