Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Циркулирующие клетки-предшественники у больных с различными формами ишемической болезни сердца

На правах рукописи

ВЫБОРОВ

Олег Николаевич

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ИШЕМИЧЕСКОЙ

БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

14.00.06 - кардиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

00316ВБ04

Москва - 2008

003166504

Работа выполнена в отделе хронической ишемической болезни сердц НИИ кардиологии им АЛ Мясникова ФГУ «Российски" кардиологический научно-производственный комплекс)

Росмедтехнологий

Научные руководители:

академик РАН и РАМН ЧАЗОВ Евгений Иванович

академик РАН и РАМН ТКАЧУК Всеволод Арсеньевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, профессор,

доктор медицинских наук МАРТЫНОВ Анатолий Иванови

Профессор,

доктор медицинских наук МАЗУРОВ Алексей Владимирович

Ведущая организация: ФГУ «Научно-исследовательский Цент профилактической медицины» Росмедтехнологий

Защита состоится 24 апреля 2008 года в _ на заседани

диссертационного совета Д 208 073 05 при ФГУ «Российско кардиологическом научно-производственном комплексе)

Росмедтехнологий по адресу 121552, Москва, ул 3-я Черепковская, 15-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК> Росмедтехнологий

Автореферат разослан »-^-о^у^тЛ_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат медицинских наук Полевая Т Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

В 1997 году впервые было показано, что в периферической крови взрослого человека существует популяция клеток, способная пролиферировать и дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro [Asahara Т et al, 1997] Эти клетки характеризуются наличием на их поверхности таких маркеров, как CD34, VEGFR2 и CD 133 CD34 -маркер, характерный для недифференцированных клеток гематопоэтического ряда и капиллярного эндотелия VEGFR2 - рецептор к фактору роста сосудистого эндотелия, называемый также KDR (kmase-msert domain-containing receptor, рецептор, содержащий киназный домен), он специфичен для эндотелиальных клеток CD 133 - трансмембранный гликопептид, экспрессирующийся на гематопоэтических стволовых клетках и предшественниках эндотелиальных клеток, а также нейроэпителиальных клетках, клетках почечного эпителия и опухолевых клетках [Barber CL et al, 2006] Предшественники эндотелиальных клеток (ПЭК) были выделены также из костного мозга, сосудистой стенки и некоторых других органов и тканей [Doyle В et al, 2006] Позднее было продемонстрировано, что фракция CD34+ клеток содержит в малом количестве клетки, способные как m vitro, так и m vivo приобретать не только эндотелиальный фенотип, но и фенотип кардиомиоцита, гладкомышечной клетки [Simper D et al, 2002, Badorff С. et al, 2003, Yeh E T H et al, 2003] В экспериментальных работах на животных было показано, что ПЭК привлекаются в места сосудистого повреждения, в частности, после баллонной ангиопластики [Griese D P. et al, 2003, Kong D et al, 2004a], и значительно ускоряют реэндотелизацию области повреждения Базальный уровень этих клеток в кровотоке невелик, но он многократно возрастает при введении цитокинов и ростовых факторов, а также при воспалительной реакции и физической нагрузке [Laufs U et al., 2004а, Rehman J et al, 2004] В экспериментальных и единичных клинических работах показано участие предшественников эндотелиальных клеток в процессах неоваскуляризации [Asahara T et al, 1999а, Shintani S et al, 2001]

Известно, что основой острого коронарного синдрома (ОКС) является эрозия эндотелиального слоя на поверхности атеросклеротической бляшки коронарной артерии или разрыв бляшки с последующим образованием тромба Так как ПЭК участвуют в репарации эндотелия, уменьшение их количества в кровотоке и/или нарушение их функциональных свойств могут являться предрасполагающим фактором возникновения эндотелиального повреждения Поэтому в ведущих

лабораториях мира идет активное изучение роли различных популяций циркулирующих недифференцированных клеток в патогенезе различных заболеваний сердца и сосудов Установлено, что число ПЭК в периферической крови здоровых лиц снижено при наличии факторов риска ишемической болезни сердца (ИБС) [Vasa М et al, 2001b, Hill J M et al, 2003] В то же время при острой ишемии конечности или миокардиальной ишемии, индуцированной физической нагрузкой, а также при остром инфаркте миокарда с зубцом Q отмечается увеличение количества клеток-предшественников в системном кровотоке [Takahashi Т et al, 1999, Shintam S et al, 2001, Adams V et al, 2004] Функциональные характеристики этих клеток, их способность пролиферировать, мигрировать, формировать сосудоподобные структуры in vivo и восстанавливать перфузию ишемизированной конечности -снижены у больных ИБС, перенесших трансмуральный инфаркт миокарда [Heeschen С et al, 2004] Однако, несмотря на большое количество исследований и интенсивное накопление экспериментальных и клинических данных, до сих пор нет однозначного мнения как об изменениях числа ПЭК у больных с различными формами ИБС, так и об их роли в неоваскуляризации и репарации поврежденного эндотелия

Цель работы

Исследование количества циркулирующих клеток-предшественников у пациентов с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST и пациентов со стабильной стенокардией напряжения, подвергшихся коронарной ангиопластике, сопоставление числа циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови, факторами риска сердечнососудистых осложнений, выраженностью коронарного атеросклероза и медикаментозной терапией

Задачи исследования

1 Определить количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стенокардией напряжения и больных с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST

2 Исследовать влияние коронарной ангиопластики на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией напряжения

3 Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови

4 Оценить взаимосвязь численности клеток-предшественников в крови с факторами риска сердечно-сосудистых осложнений.

5 Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ИБС и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных со стенокардией напряжения

6 Оценить взаимосвязь числа клеток-предшественников в периферической крови с медикаментозной терапией

Научная новизна

Впервые установлено снижение количества циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС, как стабильного, так и нестабильного течения, по сравнению с лицами, имеющими лишь факторы риска ишемической болезни сердца Показано, что коронарная ангиопластика сопровождается снижением количества клеток-предшественников в крови через 1 сутки после вмешательства с последующим восстановлением их числа на 3-5 сутки Впервые установлено, что количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов в крови и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных ИБС стабильного течения Практическая значимость Полученные данные свидетельствуют об участии циркулирующих клеток-предшественников в процессах репарации внутрисосудистого повреждения, что обосновывает перспективность разработки методов терапевтического применения циркулирующих клеток-предшественников для ускорения регенерации эндотелия после эндоваскулярных вмешательств у больных ишемической болезнью сердца

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на XX съезде Физиологического общества имени И П Павлова (Москва, 2007), European Society of Cardiology Annual Congress 2007 (Vienna, Austria), 5-м Съезде Российской ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине (Москва, 2007), 7th International Congress on Coronary Artery Disease. From prevention to intervention (Venice, 2007) Работа апробирована на заседании апробационной комиссии НИИ кардиологии им AJI Мясникова ФГУ «РКНПК» Росмедтехнологий (30 октября 2007 г)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ Структура и объем диссертации Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц Состоит из введения, 4 глав и практических рекомендаций Список литературы включает источников, в том

числе зарубежных и 3 отечественных

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Работа проведена на базе отдела хронической ишемической болезни сердца ФГУ «Российский Научно-Производственный Комплекс» Росмедтехнологий (руководитель акад Е И Чазов) совместно с лабораторией молекулярной эндокринологии (руководитель акад В А Ткачук), лабораторией ангиогенеза (руководитель проф Е В Парфенова), группой иммунологии атерогенеза (ст н с , к б н Т И Арефьева) и отделом нейрогуморальных и иммунологических исследований (руководитель проф В П Масенко)

В исследование было включено 60 человек 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST, 20 больных со стенокардией напряжения II-III ф к , и 18 лиц, составивших контрольную группу

В группу больных с ОКС без подъема сегмента ST включались пациенты (мужчины, женщины в менопаузе) с ангинозным приступом, возникшим в течение последних 24 часов и сопровождавшимся изменениями ЭКГ (стенокардия покоя III В класса по классификации Е Braunwald) [Hamm С W, Braunwald Е, 2000] В группу больных со стабильным течением ИБС были включены пациенты со стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса по NYHA, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 1,5 месяцев, направляемые по показаниям на коронарную ангиопластику со стентированием В контрольную группу вошли лица, сопоставимые по возрасту и полу, имеющие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний без клиники ИБС и не имеющие критериев исключения

Критерии исключения

• возраст моложе 40 и старше 70 лет,

• крупноочаговый инфаркт миокарда в острой и подострой стадиях,

• операция коронарного шунтирования или имплантация стента с лекарственным покрытием в анамнезе, имплантация стента без лекарственного покрытия в последние 6 месяцев,

• острое нарушение мозгового кровообращения,

• сахарный диабет,

• острое воспалительное заболевание,

• онкологическое заболевание,

• недостаточность кровообращения,

• тяжелая сопутствующая патология

Основные клинические характеристики групп представлены в таблицах 1, 2 и 3

Табл 1 Характеристика лиц, включенных в исследование

ОКС без подъема сегмента ST, п=22 Стенокардия напряжения, п=20 Контроль, п=18

Возраст, лет 56,8 ± 1,8 54,4 ± 1,6 50,7 ± 1,6 р=0,04

Мужчины, % 73 90 89 Р=0,24

Курящие, % 50 25 39 р=0,25

Артериальная гипертония, % 82 65 67 р=0,41

Перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе, % 18 40 р=0,18

ТБКА/КШ1 в анамнезе, % 0/0 10/0 р=0,22

Гиперхолестеринемия'1, % 82 85 50 р=0,02

Индекс массы тела, кг/м2 27,6 ± 0,7 28,2 ± 0,7 29,4 ± 1,1 Р=0,35

Фракция выброса левого желудочка, % 58 ± 1 59 ± 1 61 ± 1 р=0,06

Глюкоза, ммоль/л 5,3 ±0,1 5,5 ±0,1 5,2 ±0,1 р=0,07

СОЭ, мм/час 8 ± 1 8 ± 1 4 ± 1 р=0,05

С-РБ, мг/л 3,27 ±0,63 2,00 ± 0,58 1,95 ±0,69 р=0,16

Гомоцистеин, мкмоль/л 12,39 ±0,82 10,67 ±0,43 11,94 ±0,57 р=0,20

Примечание 1 - транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика / коронарное шунтирование, 2 - гиперхолестеринемия - общий холестерин >5,2 ммоль/л

Контрольная группа в нашем исследовании была несколько моложе, статистически значимо по сравнению с группой ОКС и не значимо по сравнению с группой больных со стенокардией напряжения Тем не менее, к настоящему моменту не проводилось масштабных популяционных исследований, которые могли бы продемонстрировать значимость разницы в несколько лет у лиц данного возраста В контрольной группе

был меньше процент лиц с гиперхолестеринемией независимо от получаемой терапии

Табл 2 Ангиографические характеристики групп

ОКС без подъема сегмента вТ, п=22 Стенокардия напряжения, п=20

Выполнение КАГ1, % 82 100 Р=0,11

0/1/2/3-сосудистое поражение, % 11/33/17/39 0 /35/55 / 10 р=0,03

Значимое поражение ствола ЛКА/ПНА/ОА/ПКА2, % 0/78/61 /44 0/85/40/50 р=0,63

Число значимо пораженных сегментов на 1 больного 3,0 ± 0,5 2,4 ± 0,3 р=0,65

Эндоваскулярное лечение, % 50 100 р=0,01

Среднее число имплантированных стентов 1,6 ±0,2 1,6 ±0,2 р=1,00

Примечание 1 - коронароангиография, 2 - левая коронарная артерия, передняя нисходящая артерия, огибающая артерия, правая коронарная артерия

По ангиографическим характеристикам группы ОКС и стабильной стенокардии сходны между собой И хотя в группе ОКС больше больных с трехсосудистым поражением коронарного русла, а в группе стенокардии напряжения - с двухсосудистым, по числу гемодинамически значимо пораженных сегментов коронарных артерий в расчете на 1 больного группы значимо не различаются

Табл 3 Медикаментозная терапия больных

ОКС без подъема сегмента вТ, п=22 Стенокардия напряжения, п=20

Аспирин 91% 100% р=0,49

Клопидогрель 77% 100% р=0,05

Гепарин 45% 0 р=0,01

Статины 32% 70% р=0,03

Р-адреноблокаторы 86% 100% р=0,23

Ингибиторы АПФ 41% 45% р=0,96

Нитраты 59% 30% р=0,11

Антагонисты кальция 5% 5% р=1,00

В группе больных со стенокардией напряжения большее число больных получали клопидогрель и статины и никто не получал гепарин Влияние клопидогреля и гепарина на количество ПЭК в кровотоке к настоящему моменту не исследовано Статины же обладают протективным действием по отношению к численности и функциональным способностям ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001, Vasa M et al, 200 la]

Получение образцов крови

Взятие крови осуществлялось из кубитальной вены натощак между 8 и 10 часами утра При поступлении больных с ОКС в рабочее время взятие крови осуществлялось непосредственно при поступлении 2 мл крови брали в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта, 10 мл - в пробирку с активатором свертывания для получения сыворотки Полученные образцы крови находились при комнатной температуре от 1 до 5 часов до дальнейшей обработки Для получения сыворотки кровь центрифугировали в течение 20 минут при 1500g Аликвоты сыворотки хранили при -70°С

Анализ мембранной экспозиции CD45, CD34, VEGFR2 в лейкоцитарной фракции

Образцы крови, взятые в ЭДТА, трижды отмывали в холодном (+4°С) фосфатно-солевом буфере (ФБ) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) по 5 минут при 500g 250 мкл отмытой крови переносили в отдельную пробирку и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре с 5 мкг мышиного иммуноглобулина (Becton Dickinson, США) для устранения неспецифического связывания антител через Fc-фрагмент В пробу добавляли флюоресцентно-меченые моноклональные антитела, специфичные к антигенам человека. CD45-ФИТЦ (флюоресцеин изотиоцианат) (Becton Dickinson, США), С034-ПХП (перидинин хлорофилл-a протеин) (Becton Dickinson, США), VEGFR2-®3 (фикоэритрин) (R&D Systems Inc, США) Антитела вносили в насыщающей концентрации (согласно инструкции производителя) и инкубировали в течение 30 минут в темноте при +4°С Для точного подсчета количества клеток и исключения неспецифической флюоресценции одновременно с опытной пробой аналогичным образом приготавливали контрольную В контрольную пробу вместо антител к CD34 и VEGFR2 вносили контрольные иммуноглобулины соответствующего изотипа После инкубации эритроциты лизировали в буфере (FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, США)) в течение 10 минут при комнатной температуре Суспензию клеток отмывали в ФБ, содержащем 0,5% БСА, и ресуспендировали в 1% растворе

параформальдегида в ФБ До проведения цитометрического анализа образцы хранили в темноте при +4°С не более 3 суток

Связывание антител с клетками измеряли методом цитофлюориметрии в потоке на приборе «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQuest» и «WinMDI», анализируя 300-500 тысяч событий для каждого образца Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния, клетки с экспрессией CD34 и VEGFR2 выделяли из популяции CD451ow/- клеток

Анализ содержания ростовых факторов, С-реактивного белка и гомоцистеина в сыворотке крови

Анализ содержания VEGF и HGF в сыворотке крови осуществлялся иммуноферментным методом Концентрация VEGF определялась с помощью набора Human VEGF Quantikine® ELISA kit (R&D Systems Inc , США), а концентрация HGF - набором фирмы «BioSource International, Inc », США Концентрация С-РБ в сыворотке крови определялась высокочувствительным нефелометрическим методом на приборе «BN ProSpec», Dade-Behnng Marburg GmbH, Германия Содержание гомоцистеина в сыворотке крови измеряли иммуноферментным методом с помощью набора «Axis® Homocysteine EIA», Axis-Shield Diagnostics Ltd, Великобритания

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) Для определения значимости различий между независимыми группами использовали непарный t-критерий Стьюдента при нормальном распределении и непараметрический тест Манна-Уитни в случае ненормального распределения Для определения значимости различий между связанными выборками применяли парный t-критерий, а в случае ненормального распределения - критерий Уилкоксона Для сравнения 3 и более групп использовали тест ANOVA Для сравнения групп по номинативным признакам использовался точный критерий Фишера и критерий х Для нахождения корреляции между количеством клеток и концентрацией ангиогенных ростовых факторов при нормальном распределении данных использовался коэффициент Пирсона, а при ненормальном распределении - коэффициент Спирмена Во всех случаях нормальность распределения проверялась критерием Колмогорова-Смирнова Статистическая обработка данных производилась при помощи программных пакетов «SigmaStat» и «Microsoft Excel»

Результаты исследования

1. Циркулирующие клетки-предшественники у больных ОКС без подъема сегмента 8Т и больных хронической ИБС

Общее количество циркулирующих клеток-предшественников (СЭ34'-клеток) было снижено на 38% у больных с ОКС без подъема сегмента БТ (173±14 ув. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,01) и на 26% (206±23 Ув. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,05) у больных со стабильной стенокардией по сравнению с контролем (см. рис. 1). Разница между группами ОКС и стабильной стенокардии напряжения не достигла уровня статистической значимости, р=0,219. Число лейкоцитов в крови в исследуемых группах не отличалось.

Контроль

ОКС

Стен. напр.

Рис. 1. Количество С034-позитивных клеток в периферической крови больных с ОКС без подъема сегмента БТ, больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц.

Из 22 больных с ОКС без подъема сегмента 8Т девяти впоследствии на основании содержания в крови биохимических маркеров некроза миокарда был выставлен диагноз мелкоочагового острого инфаркта миокарда, а тринадцати - диагноз нестабильной стенокардии. При сравнении данных групп было выявлено достоверное снижение количества С034+ клеток в крови у больных острым мелкоочаговым

инфарктом миокарда на 36% по сравнению с больными нестабильной стенокардией (см табл 4) Однако наличие достоверно более высокого числа лейкоцитов в крови у больных острым мелкоочаговым инфарктом миокарда и относительность показателя количества циркулирующих клеток-предшественников не позволяет исключить то, что разница, по крайней мере, частично может быть обусловлена разным содержанием лейкоцитов в крови

Табл 4 Количество СБ34+, СЭ34+УЕОРЯ2+ клеток в кровотоке у больных нестабильной стенокардией и мелкоочаговым инфарктом миокарда

Количество CD34+ клеток на 1 млн лейкоцитов Количество CD34+VEGFR2+ клеток на 1 млн лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Нестабильная стенокардия,п=13 202 ± 16 7 ± 2 6,45 ±0,41

Мелкоочаговый инфаркт миокарда, п=9 130 ± 19 4 ± 1 8,71 ±0,65

р=0,01 р=0,28 р=0,01

Снижение общего пула CD34+ клеток у больных ИБС может, с одной стороны, свидетельствовать о повышенном привлечении данных клеток в области эндотелиального повреждения и ишемии и их участии в процессе репарации и неоваскуляризации А с другой стороны, может быть следствием нарушения процесса мобилизации клеток-предшественников из костного мозга у больных ИБС [Aicher A et al, 2005] Мы считаем, что первый механизм, скорее всего, объясняет снижение числа циркулирующих клеток-предшественников при остром эндотелиальном повреждении (например, при ОКС, коронарной ангиопластике), а второй, возможно, ответственен за это снижение у больных хронической стабильной ИБС

Число предшественников эндотелиальных клеток (CD34+VEGFR2+ клеток) в периферической крови очень мало и составляет единичные клетки в расчете на 1 миллион лейкоцитов, что согласуется с данными литературы [Vasa М et al, 2001а, Rabelink Т J et al., 2004]. Достоверных различий в количестве циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток между группами не выявлено

2. Влияние коронарной ангиопластики со стентированием на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией

Для оценки влияния коронарного вмешательства количество циркулирующих клеток-предшественников исследовали у больных со стабильной стенокардией, направляемых по показаниям на проведение коронарной ангиопластики со стентированием, до процедуры, через 1 день (19,5±0,2 часа) и на 3-5 день (4,0±0,2 сут) после вмешательства. Внутрисосудистое повреждение, возникающее в процессе проведения коронарной ангиопластики со стентированием, у больных со стенокардией напряжения сопровождалось достоверным снижением общего пула предшественников на 21% (162± 13 vs. 206±23 клеток на I миллион лейкоцитов, р=0,03) через 1 сутки после процедуры, (см. рис. 2).

250

ш о

II 200

>5

Ш

С

¡Ё 150 S

го

* 100 о

I-

0>

о 50

и S X

0

Рис. 2. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих С034' клеток у больных со стенокардией напряжения.

Учитывая экспериментальные данные об участии циркулирующих клеток-предшественников в репарации эндотелия, можно предположить, что это снижение обусловлено привлечением клеток-предшественников в область повреждения и их участием в репаративном процессе в сосудистой стенке. К 3-5 суткам число клеток-предшественников восстанавливалось почти до исходного уровня. Количество ПЭК (С034+УЕ0Р112+) в кровотоке уменьшалось на 40% через сутки после

р=0,36

До ТБКА 1 сут после ТБКА 3-5 сут после ТБКА

коронарного вмешательства, но изменения не достигли уровня статистической значимости (см. рис. 3). Также не было выявлено статистически значимых различий в численности, как общего пула предшественников в крови, так и ПЭК, между лицами с 1-, 2- и 3-сосудистым поражением коронарного русла (см. табл. 5).

Рис. 3. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих С034+УЕСР112+ клеток у больных со стенокардией напряжения.

Табл. 5. Количество С034+, С034+\НЕ0РЛ2Т клеток в кровотоке у больных ИБС с различной степенью поражения коронарного русла по данным коронароангиографии.

Количество СБ34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество СВ34+УЕОРЯ2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

1-сосудистое поражение, п=15 186 ± 16 10 ± 3 7,76 ±0,57

2-сосудистое поражение, п=14 208 ± 32 8 ± 2 6,55 ±0,47

3-сосудистое поражение, п=9 181 ±24 6 ± 2 6,65 ± 0,65

р=0,73 р=0,93 р=0,22

3. Циркулирующие клетки-предшественники и факторы ангиогенеза у больных ИБС

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в мобилизации клеток-предшественников из костного мозга участвуют ангиогенные факторы роста: фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) [Asahara Т. et al., 1999b; Ishizawa К. et al., 2004]. Учитывая это, мы сопоставили количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией VEGF и HGF в крови больных ИБС. Хотя отмечалась тенденция к увеличению концентрации данных ангиогенных факторов у больных ИБС по сравнению с контрольной группой, достоверных различий между группами мы не обнаружили. Коронарная ангиопластика со стентированием не вызывала значимых изменений содержания VEGF и HGF в крови через 1 сутки и на 3-5 сутки после вмешательства. Несмотря на наличие большого количества данных о роли VEGF в мобилизации ПЭК из костного мозга [Kalka С. et al., 2000а; Moore М.А. et al., 2001], мы не обнаружили достоверных корреляций между количеством клеток-предшественников и концентрацией VEGF в крови. В то же время количество циркулирующих клеток-предшественников достоверно положительно коррелировало с уровнем HGF (см. рис. 4), что согласуется с экспериментальными данными, показавшими способность фактора роста гепатоцитов мобилизовать предшественники эндотелиальных клеток из костного мозга [Ishizawa К. et al., 2004].

4500

4000

| 3500

= 3000 lies

X 2500 к

£ 2000 |

£ 1500 z

£ 1000 500 0

0 100 200 300 400 500 600

Число CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов

Рис. 4. Корреляция между числом циркулирующих CD34+ клеток и концентрацией HGF в сыворотке крови у больных со стенокардией напряжения.

4. Циркулирующие клетки-предшественники и факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС

В настоящее время имеются данные о влиянии факторов риска сердечно-сосудистых осложнений (гиперхолестеринемии, ожирения, сахарного диабета 1 и 2 типа, курения, артериальной гипертонии) на различные популяции клеток-предшественников [Vasa M et al, 2001a, Tepper ОМ et al, 2002, Hill J M. et al, 2003, Chen JZ et al, 2004a, Loomans С J M et al, 2004, Fadim G P et al, 2006, Werner N et al, 2006] Однако, в большинстве работ влияние факторов риска изучалось у людей без ишемической болезни сердца В нашей работе мы сопоставили количество CD34+ и CD34+VEGFR2+ клеток в кровотоке с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений у лиц с верифицированной ИБС Для увеличения достоверности оценки группа больных с ОКС без подъема ST и группа больных со стабильной стенокардией напряжения были объединены в группу больных с ИБС Влияния таких факторов риска, как пол, возраст, инфаркт миокарда в анамнезе, курение, артериальная гипертония, ожирение, гиперхолестеринемия, а также концентрации С-реактивного белка и гомоцистеина в сыворотке крови на количество CD34+ клеток и собственно предшественников эндотелиальных клеток (CD34+VEGFR2+) обнаружено не было

При сопоставлении количества циркулирующих клеток-предшественников с объемом интракоронарного вмешательства, а именно числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий, у больных со стабильной стенокардией напряжения через 1 сутки и через 35 суток после процедуры мы обнаружили, что общее число клеток-предшественников в крови у больных стабильной ИБС через 3-5 суток после коронарного вмешательства негативно коррелирует с количеством эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий (см рис 5), что может косвенным образом свидетельствовать о привлечении CD34+ клеток в области внутрисосудистого повреждения. В экспериментальных работах показано, что ПЭК участвуют в репарации эндотелия после повреждения, в том числе после баллонной ангиопластики [Griese D P et al, 2003, Kong D et al, 2004a] Полученные данные о кратковременном снижении числа циркулирующих клеток-предшественников после ангиопластики и об отрицательной корреляции между количеством клеток-предшественников и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий хорошо согласуются с результатами экспериментальных работ и свидетельствуют об участии этих клеток в репаративных процессах в сосудистой стенке Несмотря на существенное уменьшение числа циркулирующих клеток-предшественников через 1

сутки после коронарной ангиопластики, достоверной корреляции между количеством клеток-предшественников в крови и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения выявлено не было. Данные результаты, возможно, обусловлены тем, что после коронарного вмешательства на численность циркулирующих клеток-предшественников, помимо эндотелиального повреждения, влияют также и другие факторы: устранение хронической миокардиальной ишемии, развитие локальной воспалительной реакции. Поэтому взаимосвязь между количеством клеток-предшественников в крови и объемом эндотелиального повреждения «проясняется» только через несколько суток.

г=-0,47 р=0,04

50 100 150 200 250 300 350 400 Число С034+ клеток на 1 млн. лейкоцитов

Рис. 5. Корреляция между количеством циркулирующих С П34 клеток и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения на 3-5 сутки после коронарного вмешательства.

Учитывая, что количество клеток-предшественников снижено у больных ИБС, можно предположить, что для усиления репаративных процессов (реэндотелизации) после ангиопластики и стентирования целесообразно введение предшественников эндотелиальных клеток,

полученных из крови или костного мозга пациентов и наращенных in vitro до необходимого количества

5. Циркулирующие клетки-предшественники и медикаментозная терапия

В ряде работ показано влияние таких препаратов, как статины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), н количественные и функциональные характеристики циркулирующи клеток-предшественников [Dimmeler S et al, 2001, Vasa M et al, 2001a, MinTQ et al, 2004]

При исследовании связи между численностью циркулирующи клеток-предшественников у больных ИБС с получаемой на момент взяти крови медикаментозной терапией мы не выявили значимой разниць между лицами, получавшими и не получавшими статины, ингибиторь АПФ, нитраты, клопидогрель и гепарин (см табл 6)

Табл 6 Сопоставление количества циркулирующих СБ34+ С0344УЕСРЯ2+ клеток у больных ИБС с получаемой медикаментозно" терапией на момент взятия крови

Лекарственный препарат Количество CD34+ клеток на 1 млн лейкоцитов Количество CD34+VEGFR2+ клеток на 1 млн лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Статины да п=21 188 ± 19 9 ± 2 6,57 ± 0,47

нет п=21 189 ±20 7 ± 1 7,46 ± 0,38

Р 0,978 0,900 0,144

Ингибиторы да п=18 191 ±22 7 ± 2 7,80 ± 0,46

АПФ нет п=24 187 ± 17 5 ± 2 6,42 ± 0,38

Р 0,881 0,381 0,024

Нитраты да п=19 163 ± 14 7 ± 3 7,56 ± 0,46

нет п=23 210 ± 21 5 ± 2 6,56 ± 0,39

Р 0,083 0,596 0,103

Клопидогрель* да п=17 165 ±17 5 ± 1 7,58 ± 0,47

нет п=5 201 ± 22 9 ± 5 6,68 ± 1,02

Р 0,290 0,695 0,385

Гепарин* да п=10 152 ±23 5 ± 1 7,89 ± 0,52

нет п=12 190 ± 16 7 ± 2 6,95 ± 0,65

Р 0,172 0,442 0,282

Примечание * — для оценки влияния терапии клопидогрелем и гепарино исследовались лишь больные с ОКС без подъема сегмента 8Т в связи с отсутствие сопоставимых групп среди больных со стабильной стенокардией

выводы

1 По сравнению с лицами без ИБС у больных с ОКС без подъема сегмента БТ и больных со стабильной стенокардией напряжения общее количество циркулирующих СБ34+ клеток снижено, соответственно, на 38 и 26%

2 У больных со стабильной стенокардией отмечается достоверное уменьшение общего числа СЭ34+ клеток-предшественников в крови через сутки после проведения коронарной ангиопластики со стентированием Через 3-5 суток после коронарного вмешательства общее количество клеток-предшественников восстанавливается

3 У больных со стабильным течением ИБС количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов

4 Взаимосвязь между факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, выраженностью атеросклероза коронарных артерий и количеством циркулирующих клеток-предшественников не обнаружена

5 Выявлена отрицательная корреляция между числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий и количеством циркулирующих СЭ34+ клеток у больных стабильной ИБС через 3-5 суток после коронарного вмешательства

6 Не установлена взаимосвязь между получаемой больными ИБС медикаментозной терапией и количеством циркулирующих клеток-предшественников

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенный протокол определения количества циркулирующих СЭ34+ клеток-предшественников в пробах цельной крови рекомендуется использовать для научно-исследовательских работ, направленных, в частности, на исследование процессов репарации внутрисосудистого повреждения у различных групп больных

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Физиология циркулирующих предшественников эндотелиальны клеток и их роль в ангиогенезе /НИ Калинина, О Н Выборов, М М Руда, Е В Парфенова, В А Ткачук // XX съезд Физиологическог общества имени И П Павлова Тезисы докладов -М Издат до «Русский врач», 2007 - стр 43

2 Circulating progenitor cells in patients with acute coronary syndrom without ST elevation and patients with stable angina undergoing coronai stenting /ON Vyborov, TI Arefieva, Ye V Parfyonova, E I Chazov / European Heart Journal - 2007 - Vol 28 (Abstract Supplement) - p 772

3 Ультразвуковые показатели функции эндотелия и циркулирующи клетки-предшественники (CD34+) у больных с различными формам ИБС / М М Руда, М И Трипотень, О Н Выборов, Т И Арефьева, Е В Парфенова, Ю А Карпов, Т В Балахонова // Сборник тезисов 5-г Съезда Российской ассоциации специалистов ультразвуково" диагностики в медицине. - Москва, 2007 - стр 99

4 The number of CD34+ cells in patients with stable angina pectoris influenc of abnormal glucose metabolism and coronary angioplasty / M Ruda, О Vyborov, T Arefieva, Yu Karpov, Ye Parfyonova // Artery - 2007 - Vol 1(2) -p 61-62

5 Circulating progenitor cells - a new marker of endothelial dysfunction? M M Ruda, О N Vyborov, T I Arefieva, M I Tnpoten, T V Balakhonova A V Mazurov, Y.V Parfyonova, Y A Karpov // The Journal of Coronai Artery Disease -2007 - Vol 7(1) -p 81

6 Количество циркулирующих предшественников эндотелия у пациенто со стабильной стенокардией напряжения и пациентов с остры коронарным синдромом без подъема сегмента ST / О Н Выборов, Т И Арефьева, Н И Калинина, Е В Парфенова // Терапевтический архив 2007 -№11 -стр 64-66

7 Предшественники эндотелиальных клеток и дисфункция эндотелия больных ишемической болезнью сердца и сопутствующим сахарны диабетом /ММ Руда, Т И Арефьева, О Н Выборов, М.И. Трипотень Т В Балахонова, Е В Парфенова, Ю А Карпов // Кардиологически вестник -2008 -т III (XV), №1 -стр 53-60

В 1997 году впервые было показано, что в периферической крови взрослого человека существует популяция клеток, способная пролиферировать и дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro [Asahara T. et al., 1997]. Эти клетки характеризуются наличием на их поверхности таких маркеров, как CD34, VEGFR2 и CD 133. CD34 - маркер, характерный для недифференцированных клеток гематопоэтического ряда и капиллярного эндотелия. VEGFR2 — рецептор к фактору роста сосудистого эндотелия, называемый также KDR (kinase-insert domain-containing receptor; рецептор, содержащий киназный домен); он специфичен для эндотелиальных клеток. CD 133 - трансмембранный гликопептид, экспрессирующийся на гематопоэтических стволовых клетках и предшественниках эндотелиальных клеток, а также нейроэпителиальных клетках, клетках почечного эпителия и опухолевых клетках [Asahara T. et al., 1997; Barber C.L. et al., 2006]. Предшественники эндотелиальных клеток (ПЭК) были выделены также из костного мозга, сосудистой стенки и некоторых других органов и тканей [Doyle В. et al., 2006]. Позднее было продемонстрировано, что фракция CD34+ клеток содержит в малом количестве клетки, способные как in vitro, так и in vivo приобретать не только эндотелиальный фенотип, но и фенотип кардиомиоцита, гладкомышечной клетки [Simper D. et al., 2002; Badorff С. et al., 2003; Yeh E.T.H. et al., 2003]. В экспёриментальных работах на животных было показано, что ПЭК привлекаются в места сосудистого повреждения, в частности, после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], и значительно ускоряют реэндотелизацию области повреждения. Базальный уровень этих клеток в кровотоке невелик, но он многократно возрастает при введении цитокинов и ростовых факторов, а также при воспалительной реакции и физической нагрузке [Laufs U. et al., 2004а; Rehman J. et al., 2004]. В экспериментальных и единичных клинических работах показано участие ПЭК в процессах неоваскуляризации [Asahara T. et al., 1999а; Shintani S. et al., 2001].

Известно, что в основе острого коронарного синдрома (ОКС) лежит эрозия эндотелиального слоя на поверхности атеросклеротической бляшки коронарной артерии или разрыв бляшки с последующим образованием тромба. Так как ПЭК участвуют в репарации эндотелия, с одной стороны, уменьшение их количества в кровотоке и/или нарушение их функциональных свойств могут являться предрасполагающим фактором возникновения эндотелиального повреждения, а с другой стороны, патогенетически может быть обосновано их введение при необходимости ускорения эндотелизации внутрисосудистого повреждения. Поэтому в ведущих лабораториях мира идет активное изучение роли различных популяций циркулирующих недифференцированных клеток в патогенезе различных заболеваний сердца и сосудов. Установлено, что число ПЭК в периферической крови здоровых лиц снижено при наличии факторов риска ишемической болезни сердца (ИБС) [Vasa М. et al., 2001b; Hill J.M. et al., 2003]. В то же время при острой ишемии конечности или миокардиальной ишемии, индуцированной физической нагрузкой, а также при остром инфаркте миокарда с зубцом Q отмечается увеличение количества клеток-предшественников в системном кровотоке [Takahashi Т. et al., 1999; Shintani S. et al., 2001; Adams V. et al., 2004]. Функциональные характеристики этих клеток: их способность пролиферировать, мигрировать, формировать сосудоподобные структуры in vivo и восстанавливать перфузию ишемизированной конечности - снижены у больных ИБС, перенесших трансмуральный инфаркт миокарда [Heeschen С. et al., 2004]. Однако, несмотря на большое количество исследований и интенсивное накопление экспериментальных и клинических данных, до сих пор нет однозначного мнения как об изменениях числа ПЭК у больных с различными формами ИБС, так и об их роли в неоваскуляризации и репарации поврежденного эндотелия.

Целью данной работы явилось исследование количества циркулирующих клеток-предшественников у пациентов с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST и пациентов со стабильной стенокардиейнапряжения, подвергшихся коронарной ангиопластике; сопоставление числа циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови, факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, выраженностью коронарного атеросклероза и медикаментозной терапией.

В работе были поставлены следующие задачи:1. Определить количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стенокардией напряжения и больных с острым коронарным синдромом без подъема сегмента 8Т.

2. Исследовать влияние коронарной ангиопластики на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией напряжения.

3. Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови.

4. Оценить взаимосвязь численности клеток-предшественников в крови с факторами риска сердечно-сосудистых осложнений.

5. Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ИБС и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных со стенокардией напряжения.

6. Оценить взаимосвязь числа клеток-предшественников в периферической крови с медикаментозной терапией.

Научная новизнаВпервые установлено снижение количества циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС, как стабильного, так и нестабильного течения, по сравнению с лицами, имеющими лишь факторы риска ишемической болезни сердца. Показано, что коронарная ангиопластика сопровождается снижением количества клеток-предшественников в крови через 1 сутки после вмешательства с последующим восстановлением их числана 3-5 сутки. Впервые установлено, что количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов в крови и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных ИБС стабильного течения.

Практическая значимостьПолученные данные свидетельствуют об участии циркулирующих клеток-предшественников в процессах репарации внутрисосудистого повреждения, что обосновывает перспективность разработки методов терапевтического применения циркулирующих клеток-предшественников для ускорения регенерации эндотелия после эндоваскулярных вмешательств у больных ишемической болезнью сердца.

Заключение

Роль клеток-предшественников костномозгового происхождения в репаративных процессах в сердечно-сосудистой системе, открытая в последние годы, позволяет по-новому взглянуть на механизмы репарации сосудистого повреждения и механизмы реваскуляризации ишемизированных тканей.

Предшественники эндотелиальных клеток способны аккумулироваться в участке повреждения сосуда, дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки и участвовать в процессах репарации и формирования новых сосудов в ишемизированных тканях [Asahara T. et al., 1997; Gehling U.M. et al., 2000; Kong D. et al., 2004а]. В экспериментальных исследованиях показано, что ретрансплантация ауто логичных циркулирующих ПЭК, предварительно культивированных in vitro, животным после ангиопластики значительно ускоряет реэндотелизацию области повреждения и препятствует избыточной пролиферации неоинтимы и развитию посттравматического стеноза [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004b]. Клетки-предшественники, аккумулирующиеся в области ишемии или повреждения, секретируют факторы роста, действующие на соседние зрелые сосудистые эндотелиальные клетки и стимулирующие их пролиферацию и миграцию [Asahara T. et al., 1999а; Kamihata H. et al., 2001]. Причем этот механизм действия ПЭК, возможно, даже более важен для процессов репарации и реваскуляризации, чем процесс пролиферации и дифференциации самих предшественников. Данные исследования демонстрируют терапевтический потенциал этих клеток в репарации сосуда. Первый опыт применения клеток-предшественников с терапевтической целью продемонстрировал безопасность их использования при наблюдении сроком до полутора лет. Численность и функциональная активность клеток-предшественников, в том числе предшественников эндотелиальных клеток, уменьшается под воздействием сердечно-сосудистых факторов риска; количество циркулирующих ПЭК негативно коррелирует с функциональными индексами эндотелиальной функции (реактивностью плечевой артерии), что указывает на их важную роль в обеспечении функции сосудистого эндотелия [Hill J.M. et al., 2003]. Таким образом, число клеток-предшественников в кровообращении может представлять собой новый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний и осложнений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика лиц, участвовавших в исследовании

В исследование было включено 60 человек: 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST, 20 больных со стенокардией напряжения II-III ф.к., и 18 лиц, составивших контрольную группу.

В группу больных с ОКС без подъема сегмента ST включались пациенты (мужчины; женщины в менопаузе) с ангинозным приступом, возникшим в течение последних 24 часов и сопровождавшимся изменениями ЭКГ (стенокардия покоя III В класса по классификации Е. Braunwald) [Hamm C.W., Braunwald E., 2000]. В группу больных со стабильным течением ИБС были включены пациенты со стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса по NYHA, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 1,5 месяцев, направляемые по показаниям на коронарную ангиопластику со стентированием. Взятие крови осуществлялось до проведения коронарной ангиопластики, через день и на 3-5 сутки после процедуры. В контрольную группу вошли лица, сопоставимые по возрасту и полу, имеющие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний без клиники ИБС и не имеющие критериев исключения. Критерии исключения:

• возраст моложе 40 и старше 70 лет;

• крупноочаговый инфаркт миокарда в острой и подострой стадиях;

• операция коронарного шунтирования или имплантация стента с лекарственным покрытием в анамнезе; имплантация стента без лекарственного покрытия в последние 6 месяцев;

• острое нарушение мозгового кровообращения;

• поражение периферических артерий нижних конечностей с перемежающейся хромотой и трофическими нарушениями;

• сахарный диабет;

• наличие хронической сердечной, хронической почечной или печеночной недостаточности;

• плохо поддающаяся медикаментозной коррекции артериальная гипертония (АД выше 180/100 мм рт.ст.) на фоне комплексной гипотензивной терапии;

• пороки сердца;

• эндокардит, миокардит, перикардит, гипертрофическая или дилатационная кардиомиопатия;

• онкологическое заболевание;

• тяжелые бронхообструктивные, гематологические, неврологические, эндокринные заболевания;

• системные заболевания (васкулиты, ревматизм в анамнезе, системная красная волчанка и т.д.);

• клинические и лабораторные признаки острого инфекционного заболевания в течение 2 предшествующих месяцев;

• анемия (гемоглобин менее 10,0 г/дл);

• отказ от участия в исследовании.

Основные клинические характеристики групп представлены в таблицах 2,

Табл. 2. Характеристика лиц, включенных в исследование.

ОКС без подъема сегмента 8Т, п=22 Стенокардия напряжения, п=20 Контроль, п=18

Возраст, лет 56,8 ± 1,8* 54,4 ± 1,6 50,7 ± 1,6 р=0,04

Мужчины, % 73 90 89 р=0,24

Курящие, % 50 25 39 р=0,25

Продолжение табл. 2

Артериальная гипертония, % 82. 65 67 р=0,41

Перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе, % 18 40 р=0,18

ТБКА/КШ1 в анамнезе, % 0/0 10/0 р=0,22

Гиперхолестеринемия2, % 82 85 50 р=0,02

Индекс массы тела, кг/м2 27,6 ± 0,7 28,2 ± 0,7 29,4 ± 1,1 р-0,35

Фракция выброса левого желудочка, % 58 ± 1 59 ± 1 61 ± 1 р=0,06

Гемодинамически значимые стенозы б/ц0 артерий или артерий ПБС4 (по данным УЗДГ5), % 9 10 0 р=0,40

Глюкоза, ммоль/л 5,3 ±0,1 5,5 ±0,1 5,2 ±0,1 р=0,07

СОЭ, мм/час 8 ± 1 8 ± 1 4 ± 1 р=0,05

С-РБ, мг/л 3,27 ± 0,63 2,00 ± 0,58 1,95 ± 0,69 р=0,16

Гомоцистеин, мкмоль/л 12,39 ±0,82 10,67 ± 0,43 11,94 ±0,57 р=0,20

Примечание: * - здесь и далее данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего;1 - коронарное шунтирование;2 - гиперхолестеринемия - общий холестерин >5,2 ммоль/л;3 - брахиоцефальные; 4 - подвздошно-бедренный сегмент;5 — ультразвуковая допплерография.

Контрольная группа в нашем исследовании была несколько моложе, статистически значимо по сравнению с группой ОКС и не значимо по сравнению с группой больных со стенокардией напряжения. Тем не менее, к настоящему моменту не проводилось масштабных популяционных исследований, которые могли бы продемонстрировать значимость разницы в несколько лет у лиц данного возраста. В контрольной группе был меньше процент лиц с гиперхолестеринемией независимо от получаемой терапии.

Табл. 3. Ангиографические характеристики групп.

ОКС без подъема сегмента 8Т, п=22 Стенокардия напряжения, п=20

Выполнение КАГ1, % 82 100 Р=0,11

0/1/2/3-сосудистое поражение, % 11/33/17/39 0/35/55/10 р=0,03

Значимое поражение ствола Л1СА/ПНА/ОА/ПКА2, % 0/78/61/44 0/85/40/50 р=0,63

Число значимо пораженных сегментов на 1 больного 3,0 ±0,5 2,4 ± 0,3 р=0,65

Эндоваскулярное лечение, % 50 100 р=0,01

Среднее число имплантированных стентов 1,6 ±0,2 1,6 ±0,2 р=1,00

Коронарное шунтирование, % 18 0 р=0,11

Примечание: 1 - коронароангиография; 2 - левая коронарная артерия, передняя нисходящая артерия, огибающая артерия, правая коронарная артерия.

По ангиографическим характеристикам группы ОКС и стабильной стенокардии сходны между собой. И хотя в группе ОКС больше больных с трехсосудистым поражением коронарного русла, а в группе стенокардии напряжения - с двухсосудистым, по числу гемодинамически значимо

пораженных сегментов коронарных артерий в расчете на 1 больного группы значимо не различаются.

Табл. 4. Медикаментозная терапия больных.

ОКС без подъема сегмента ST, п=22 Стенокардия напряжения, п=20

Аспирин 91% 100% р=0,49

Клопидогрель 77% 100% р=0,05

Гепарин 45% 0 р=0,01

Статины 32% 70% р=0,03

Р-адреноблокаторы 86% 100% р=0,23

Ингибиторы АПФ 41% 45% р=0,96

Нитраты 59% 30% Р=0Д1

Антагонисты кальция 5% 5% р=1,00

В группе больных со стенокардией напряжения большее число больных получали клопидогрель и статины и никто не получал гепарин. Влияние клопидогреля и гепарина на количество ПЭК в кровотоке к настоящему моменту не исследовано. Статины же обладают протективным действием по отношению к численности и функциональным способностям ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; VasaM. et al., 2001a].

Из 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST девяти впоследствии на основании содержания в крови биохимических маркеров некроза миокарда был выставлен диагноз мелкоочагового острого инфаркта миокарда, а тринадцати -диагноз нестабильной стенокардии. У 45% больных с ОКС ангинозный приступ развился впервые в жизни. Длительность анамнеза ИБС у остальных 55% больных составила 2,1 ± 0,8 лет. В среднем взятие крови происходило через 12±2 часа от момента начала ОКС. Среди 20 больных со стабильной стенокардией у 70% был определен II функциональный класс стенокардии

напряжения, у 30% - III. Средняя продолжительность анамнеза ИБС в данной группе составила 3,2 ± 0,7 лет.

Получение образцов крови

Анализ мембранной экспозиции CD45, CD34, VEGFR2 в

лейкоцитарной фракции

Связывание антител с клетками измеряли методом цитофлюориметрии в потоке на приборе «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQuest» и «WinMDI», анализируя 300-500 тысяч событий для каждого образца. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния, клетки с экспрессией CD34 и VEGFR2 выделяли из популяции CD45low/" клеток (см. рис. 3, 4).

Рис. 3. Выделение фракции CD450W клеток среди лейкоцитов (SSC (sideward scatter) - боковое светорассеяние).

Контроль

С034+УЕСЕ]*2-

СБ34+УЕСРШ+

СВ34+УЕСЕЯ2- С034+УЕСРИ2+

у •. ■

Ю2 УЕЭРР?2

Рис. 4. Выделение СБ34+УЕСГК2 и СБ34+УЕСЕЫ2+ клеток из популяции

С0451,т/ клеток>

Для определения общего числа С034-позитивных клеток количество CD34+VEGFR2" и CD34+VEGFR2+ клеток суммировалось.

Таким образом, для каждого пациента было определено число CD45,ow/ CD34 VEGFR2 и суммарное количество CD45,ovv/"CD34+ клеток в пересчете на 1 миллион лейкоцитов.

Анализ содержания ростовых факторов, С-реактивного белка и

гомоцистеина в сыворотке крови

Анализ содержания VEGF, HGF и эндостатина в сыворотке крови осуществлялся иммуноферментным методом. Концентрация VEGF определялась с помощью набора Human VEGF Quantikine® ELISA kit (R&D Systems Inc., США), концентрация HGF - набором фирмы «BioSource International, Inc.», США, а концентрация эндостатина - набором Human Endostatin Quantikine® ELISA kit (R&D Systems Inc., США). Анализ сыворотки на содержание VEGF был осуществлен у 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 20 больных со стенокардией напряжения до и после коронарной ангиопластики и у 16 лиц контрольной группы. Определение концентрации HGF было выполнено у 15 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 20 больных со стенокардией напряжения до и после коронарной ангиопластики и у 16 контрольных лиц. В связи с терапией гепарином, который приводит к быстрому значительному повышению концентрации фактора роста гепатоцитов в крови [Seidel С. et al., 1999], у 7 больных с ОКС определение «истинного» содержания HGF в крови не представлялось возможным. Концентрация эндостатина была определена у 11 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 19 больных со стенокардией напряжения и у 7 контрольных лиц.

Концентрация С-РБ в сыворотке крови определялась высокочувствительным нефелометрическим методом на приборе «BN ProSpec», Dade-Behring Marburg GmbH, Германия. Содержание гомоцистеина в сыворотке

крови измеряли иммуноферментным методом с помощью набора «Axis® Homocysteine EIA», Axis-Shield Diagnostics Ltd., Великобритания.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для определения значимости различий между независимыми группами использовали непарный t-критерий Стьюдента при нормальном распределении и непараметрический тест Манна-Уитни в случае ненормального распределения. Для определения значимости различий между связанными выборками применяли парный t-критерий, а в случае ненормального распределения - критерий Уилкоксона. Для сравнения 3 и более групп использовали тест ANOVA. Для сравнения групп по номинативным признакам использовался точный критерий Фишера и критерий Для нахождения корреляции между количеством клеток и концентрацией ангиогенных ростовых факторов при нормальном распределении данных использовался коэффициент Пирсона, а при ненормальном распределении - коэффициент Спирмена. Во всех случаях нормальность распределения проверялась критерием Колмогорова-Смирнова. Статистическая обработка данных производилась при помощи программных пакетов «SigmaStat» и «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Циркулирующие клетки-предшественники у больных ОКС без подъема сегмента 8Т и больных хронической ИБС

Общее количество циркулирующих клеток-предшественников (С034+-клеток) было снижено на 38% (173±14 уэ. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,01) у больных ОКС без подъема сегмента 5Т и на 26% (206±23 ув. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,05) у больных со стабильной стенокардией по сравнению с их количеством в контрольной группе (см. рис. 5). Разница между группами ОКС и стабильной стенокардии напряжения не достигла уровня статистической значимости, р=0,22. Число лейкоцитов в крови в исследуемых группах достоверно не отличалось (см. рис. 6).

о с; и X

Рис. 5. Количество С034-позитивных клеток в периферической крови больных ОКС без подъема сегмента 8Т, больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц.

г Г - р=0,05 р=0,01 1

-г-

Контроль ОКС Стен. напр.

Рис. 6. Количество лейкоцитов в крови исследуемых.

Из 22 больных с ОКС без подъема сегмента 8Т девяти на основании содержания в крови биохимических маркеров некроза миокарда был выставлен диагноз мелкоочагового острого инфаркта миокарда, а тринадцати - диагноз нестабильной стенокардии. При сравнении данных групп было выявлено достоверное снижение количества С034+ клеток в крови у больных острым мелкоочаговым инфарктом миокарда на 36% по сравнению с больными нестабильной стенокардией (см. табл. 5). Однако поскольку число СОЭ4 клеток рассчитывалось в пересчете на 1 миллион лейкоцитов, наличие достоверно более высокого числа лейкоцитов в крови у больных острым мелкоочаговым инфарктом миокарда не позволяет исключить то, что разница, по крайней мере, частично может быть обусловлена разным содержанием лейкоцитов в крови.

ллн/мл

Контроль

Стен. напр.

Табл. 5. Количество СБ34+, СБ34+УЕСРЯ2+ клеток в кровотоке у больных нестабильной стенокардией и мелкоочаговым инфарктом миокарда.

Количество CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество CD3 4+VEGFR2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Нестабильная стенокардия, п=13 202 ± 16 7 ±2 6,45 ±0,41

Мелкоочаговый инфаркт миокарда, п=9 130 ± 19 4± 1 8,71 ± 0,65

р=0,01 р=0,28 р=0,01

Снижение общего пула CD34+ клеток у больных ИБС может, с одной стороны, свидетельствовать о повышенном привлечении данных клеток в области эндотелиального повреждения и ишемии и их участии в процессе репарации и неоваскуляризации. А с другой стороны, основываясь на результатах работ Aicher А. [2003, 2005], можно предположить, что снижение числа CD34+ клеток у больных ИБС обусловлено нарушением процесса мобилизации клеток-предшественников из костного мозга. Мы считаем, что первый механизм, скорее всего, объясняет снижение числа циркулирующих клеток-предшественников при остром повреждении сосудистой стенки и ишемии миокарда (например, при ОКС, коронарной ангиопластике), а второй, возможно, ответственен за это снижение у больных хронической стабильной ИБС.

Число предшественников эндотелиальных клеток (CD34+VEGFR2+ клеток) в периферической крови очень мало и составляет единичные клетки в расчете на 1 миллион лейкоцитов, что согласуется с данными литературы [Vasa М. et al., 2001а; Rabelink T.J. et al., 2004]. Достоверных различий в количестве циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток между группами не выявлено (см. рис. 7).

Контроль

Стен. напр.

Рис. 7. Количество СВ34+УЕСРН2+ клеток в периферической крови больных ОКС без подъема сегмента N1, больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц.

У 10 из 22 больных ОКС без подъема сегмента ST ангинозный приступ развился впервые в жизни, у остальных - ОКС развился на фоне уже установленной ранее ИБС (длительность анамнеза 2,1 ± 0,8 лет). Предполагая, что на фоне существующей хронической ИБС на количество циркулирующих клеток-предшественников в крови могут оказывать влияние дополнительные факторы, например: нарушение мобилизации клеток-предшественников из костного мозга [Aicher A. et ai., 2003], повторные эпизоды ишемии миокарда [Adams V. et al., 2004], - мы сравнили численность CD34+ и CD34+VEGFR2+ клеток в крови данных подгрупп больных (см. табл. 6). Статистически значимых различий между подгруппами выявлено не было. Возможно, это обусловлено схожестью данных групп больных вследствие достаточно короткого анамнеза ранее установленной ИБС, а также приема лекарственных

средств, улучшающих коронарный кровоток и снижающих число эпизодов миокардиальной ишемии.

Табл. 6. Количество СБ34\ СБ34+УЕСГК2+ клеток в кровотоке у больных ОКС без подъема сегмента вТ с впервые в жизни возникшим ангинозным приступом и ОКС, развившимся на фоне существующей стабильной ИБС.

Количество С034+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Ангинозный приступ развился впервые в жизни, п=10 160 ±20 5 ± 2 7,78 ± 0,74

ОКС развился на фоне существующей ИБС, п=12 177 ± 21 7 ± 2 7,06 ± 0,54

р=0,56 р=0,67 р=0,43

Влияние коронарной ангиопластики со стентированием на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией

Коронарная ангиопластика сопровождается повреждением сосудистой стенки, эпизодами ишемии миокарда, поэтому мы исследовали количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией, направляемых по показаниям на проведение коронарной ангиопластики со стентированием: до процедуры, через 1 день (19,5±0,2 часа) и на 3-5 день (4,0±0,2 сут) после вмешательства. Внутрисосудистое повреждение, возникающее в процессе проведения коронарной ангиопластики со стентированием, у больных со стенокардией напряжения сопровождалось

достоверным снижением общего пула предшественников на 21% (162=ЫЗ 206±23 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,03) через 1 сутки после процедуры (см. рис. 8).

ДоТБКА

1 сут после ТБКА 3-5 сут после ТБКА

Рис. 8. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих СЭ34+ клеток у больных со стенокардией напряжения.

Учитывая экспериментальные данные об участии циркулирующих клеток-предшественников в репарации эндотелия [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], можно предположить, что это снижение обусловлено их привлечением в область повреждения и участием в репаративном процессе в сосудистой стенке. К 3-5 суткам число клеток-предшественников восстанавливалось почти до исходного уровня. Количество ПЭК (CD34+VEGFR2+) в кровотоке уменьшалось на 40% через сутки после коронарного вмешательства, но изменения не достигли уровня статистической значимости (см. рис. 9).

До ТБКА 1 сут после ТБКА 3-5 сут после ТБКА

Рис. 9. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих С034+УЕСГК2+ клеток у больных со стенокардией напряжения.

Не было установлено связи между количеством циркулирующих клеток-предшественников и распространенностью атеросклеротического поражения коронарного русла. Численность, как общего пула предшественников, так и ПЭК не различалась у больных с 1-, 2- и 3-сосудистым поражением коронарного русла (см. табл. 7).

Табл. 7. Количество СЭ344, С034+УЕСП12+ клеток в кровотоке у больных ИБС с

различной степенью поражения коронарного русла поданным ангиографии.

Количество СП34" клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество С034" УЕ0РЯ2" клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

I -сосудистое поражение, п= 15 186 ± 16 10 ± 3 7,76 ± 0,57

Продолжение табл. 7

2-сосудистое поражение, п=14 208 ±32 8 ± 2 6,55 ± 0,47

3-сосудистое поражение, п=9 181 ±24 6 ± 2 6,65 ± 0,65

р=0,73 р=0,93 р=0,22

При сопоставлении количества циркулирующих клеток-предшественников с объемом интракоронарного вмешательства, а именно числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий, у больных со стабильной стенокардией напряжения через 1 сутки и через 3-5 суток после процедуры (см. табл. 8) мы обнаружили, что общее число клеток-предшественников в крови у больных стабильной ИБС через 3-5 суток после коронарного вмешательства негативно коррелирует с количеством эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий (см. рис. 10). То есть, чем большее количество сегментов коронарных артерий подвергалось ангиопластике, тем ниже был уровень клеток-предшественников в крови. Это может косвенным образом свидетельствовать о привлечении СБ34+ клеток в области внутрисосудистого повреждения.

Табл. 8. Корреляции между количеством циркулирующих клеток-

предшественников и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных

артерий у больных стенокардией напряжения через 1 и 3-5 суток после коронарного вмешательства.

1 сутки после коронарного 3-5 суток после коронарного

вмешательства, п=20 вмешательства, п=20

СЪ34+ г=-0,34 г=-0,47

р=0,14 р=0,04

СЭЗ 4+УЕЮРК2+ г=-0,25 г=0,34

р=0,29 р=0,14

г=-0,47 р=0,04

50 100 150 200 250 300 350 Число CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов

Рис. 10. Корреляция между количеством циркулирующих СШ4+ клеток и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения на 3-5 сутки после коронарного вмешательства.

В экспериментальных работах показано, что ПЭК участвуют в репарации эндотелия после повреждения, в том числе после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004а]. Полученные данные о кратковременном снижении числа циркулирующих клеток-предшественников после ангиопластики и об отрицательной корреляции между количеством клеток-предшественников и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий хорошо согласуются с результатами экспериментальных работ и свидетельствуют об участии этих клеток в репаративных процессах в сосудистой стенке. Несмотря на существенное уменьшение числа циркулирующих клеток-предшественников через 1 сутки после коронарной ангиопластики, достоверной корреляции между количеством клеток-

предшественников в крови и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения выявлено не было. Данные результаты, возможно, обусловлены тем, что после коронарного вмешательства на численность циркулирующих клеток-предшественников, помимо эндотелиального повреждения, влияют также и другие факторы: устранение хронической миокардиальной ишемии, развитие локальной воспалительной реакции. Поэтому взаимосвязь между количеством клеток-предшественников в крови и объемом эндотелиального повреждения «проясняется» только через несколько суток.

Учитывая, что количество клеток-предшественников снижено у больных ИБС, можно предположить, что для усиления репаративных процессов (реэндотелизации) после ангиопластики и стентирования целесообразно введение предшественников эндотелиальных клеток, полученных из крови или костного мозга пациентов и наращенных in vitro до необходимого количества.

Циркулирующие клетки-предшественники и факторы ангиогенеза у больных ИБС

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в мобилизации клеток-предшественников из костного мозга участвуют ангиогенные факторы роста: фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) [Asahara Т. et al., 1999b; Ishizawa К. et al., 2004]. Учитывая это, мы сопоставили количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией VEGF и HGF в крови больных ИБС. Хотя отмечалась тенденция к увеличению концентрации данных ангиогенных факторов у больных ИБС по сравнению с контрольной группой, достоверных различий между группами мы не обнаружили (см. рис. 11, 12). Коронарная ангиопластика со стентированием не вызывала значимых изменений содержания VEGF и HGF в крови через 1 сутки и на 3-5 сутки после вмешательства (см. рис. 11, 12).

Контроль ОКС Стен. напр. 1 сут после 3-5 сут

(до ТБКА) ТБКА после ТБКА

п=16 п=22 п=20 п=20 п=20

Рис. 11. Концентрация УЕСР в сыворотке крови.

Контроль ОКС Стен. напр. 1 сут после 3-5 сут

(до ТБКА) ТБКА после ТБКА

п=16 п=15 п—20 п=20 п=20

Рнс. 12. Концентрация НвР в сыворотке крови.

В экспериментальных работах показано, что ингибитор ангиогенеза эндостатин, являющийся С-концевым фрагментом коллагена XVIII, стимулирует апоптоз эндотелиальных клеток, ингибирует эндотелизацию внутрисосудистого повреждения, препятствует мобилизации ПЭК из костного мозга, стимулируемой фактором роста сосудистого эндотелия [ОЬапаЬа! М. ех а!., 1999; НиПег Я. Ы а1., 2003; ВсЫсИ в. еХ а1., 2003]. В связи с этим у части больных мы определили содержание эндостатина в крови. Однако значимых различий между группами выявлено не было (см. рис. 13).

160 140 120 100 80 60 40 20 0

1 р=0,24 р=0,86 р=0,23 -л

Контроль п=7

ОКС п—11

Стен. напр. п=19

Рис. 13. Концентрация эндостатина в сыворотке крови.

С целью определения взаимосвязи между концентрацией \nEGF, НОИ и количеством клеток-предшественников в кровотоке нами были изучены корреляции между данными параметрами у больных ОКС, у больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц (см. табл. 9).

Табл. 9. Корреляции меяеду числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией VEGF, HGF.

Контроль OKC без подъема сегмента ST Стенокардия напряжения

VEGF HGF VEGF HGF VEGF HGF

CD34+ r=-0,13 р=0,63 r=0,13 p=0,63 r=0,12 p=0,59 r=-0,02 p-0,93 r=-0,06 p=0,80 r=0,51 p=0,03

CD34+VEGFR2+ r=0,05 р=0,84 r=0,19 P=0,47 r=-0,07 p=0,75 i=0,06 p=0,84 r=-0,15 p=0,53 r=0,43 p=0,07

Несмотря на наличие большого количества данных о роли VEGF в мобилизации ПЭК из костного мозга [Kalka С. et al., 2000а; Moore М.А. et al., 2001], мы не обнаружили достоверных корреляций между количеством клеток-предшественников и концентрацией VEGF в крови. В то же время количество циркулирующих клеток-предшественников достоверно положительно коррелировало с уровнем HGF (см. рис. 14), что согласуется с экспериментальными данными, показавшими способность фактора роста гепатоцитов мобилизовать предшественники эндотелиальных клеток из костного мозга [Ishizawa К. et al., 2004]. Схожая корреляция, не достигшая, однако, статистической значимости, наблюдалась между числом циркулирующих ПЭК и. концентрацией HGF у больных со стабильной стенокардией (см. рис. 15).

г=0,51 р=0,03

0 100 200 300 400 500

Число С034+ клеток на 1 млн. лейкоцитов

Рис. 14. Корреляция между числом циркулирующих С034+ клеток и концентрацией ЬЮГ в сыворотке крови у больных со стенокардией напряжения.

к х 3" ш а

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

5 10 15 20 25 30 35 40 45 Число С034+УЕ6РР2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов

Рнс. 15. Корреляция между числом циркулирующих С034"УЕСРК2+ клеток и концентрацией НвГ в сыворотке крови у больных со стенокардией напряжения.

Показано, что введение эндостатина животным значительно снижало мобилизацию ПЭК фактором роста сосудистого эндотелия [БсЬисЬ О. е1 а1., 2003]. Однако в нашей работе достоверных корреляций между количеством циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией эндостатина в крови выявлено не было (см. табл. 10), что может быть связано, в частности, с отсутствием значимых различий в концентрации УЕОБ между исследуемыми группами, а также недостаточным количеством больных, у которых мы определяли уровень эндостатина.

Табл. 10. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией эндостатина.

Контроль ОКС без подъема сегмента ST Стенокардия напряжения

CD34+ г=0,71 г=0,46 г=0,07

р=0,07 р=0,15 р=0,77

CD34+VEGFR2+ г=0,56 г=0,36 г=-0,04

р-0,19 р=0,27 р=0,87

Циркулирующие клетки-предшественники и факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС

В настоящее время имеются данные о влиянии факторов риска сердечнососудистых осложнений (гиперхолестеринемии, ожирения, сахарного диабета 1 и 2 типа, курения, артериальной гипертонии) на различные популяции клеток-предшественников [Vasa М. et al., 2001а; Tepper О.М. et al., 2002; Hill J.M. et al., 2003; Chen J.Z. et al., 2004a; Loomans C.J.M. et al., 2004; Fadini G.P. et al., 2006; Werner N. et al., 2006]. Однако в большинстве работ влияние факторов риска изучалось у людей без ишемической болезни сердца. В нашей работе мы сопоставили количество CD34+ и CD34+VEGFR2+ клеток в кровотоке с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений у лиц с

верифицированной ИБС, а также определили корреляции с возрастом, концентрацией общего холестерина и триглицеридов в крови (см. табл. 11). Для увеличения достоверности оценки группа больных с ОКС без подъема сегмента ВТ и группа больных со стабильной стенокардией напряжения были объединены в группу больных с ИБС.

Табл. II. Сопоставление количества циркулирующих СЭ34+, СЭ34+УЕСЕЯ2+ клеток с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений у больных

Фактор Количество С034" клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество С034+УЕСРЯ2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Пол мужской п=34 205 ± 15 9 ± 2 6,91 ±0,36

женский п=8 120 ± 16 5 ± 2 7,45 ± 0,56

Р 0,01 0,58 0,50

Возраст, лет корреляция г=-0,26 р=0Д0 г=-0,О2 р=0,89

Возрастная группа <55 лет п=21 194 ± 17 9 ± 2 7,02 ±0,51

>55 лет п=21 183 ± 21 7 ± 1 7,01 ±0,35

Р 0,66 0,74 0,98

ИМ в анамнезе Нет п=30 185 ± 17 7 ± 2 7,17 ±0,39

Да п=12 198 ±21 10±3 6,63 ± 0,45

Р 0,67 0,20 0,43

Курение Нет п=26 190 ± 16 10 ±2 6,23 ± 0,30

Да п=16 186 ±23 5 ± 1 8,29 ± 0,50

Р 0,87 0,24 0,01

АГ Нет п=11 202 ±32 11 ±3 6,91 ±0,60

Да п=31 184 # 14 7 ± 1 7,05 ± 0,36

Р 0,57 0,29 0,84

Ожирение Нет п=31 180 ± 16 9 ± 2 7,15 ±0,34

Да п=8 221 ±32 5 ± 1 6,10 ±0,77

Р 0,26 0,52 0,18

Продолжение табл. 11

гхс Нет п=7 197 ±21 10 ± з 6,82 ± 0,34

Да п=35 187 ± 16 7 ± 2 7,05 ± 0,36

Р 0,52 0,27 0,78

охс, корреляция г=-0,10 г=-0,11

ммоль/л р=0,53 р=0,49

тг, корреляция г=-0,01 г=-0,22

ммоль/л р=0,93 р=0,17

Было установлено, что у женщин с ИБС общее число циркулирующих клеток-предшественников снижено почти в 2 раза по сравнению с мужчинами (р=0,01). При этом число лейкоцитов в крови у мужчин и женщин достоверно не различалось. Влияния других факторов риска (возраста, инфаркта миокарда в анамнезе, курения, артериальной гипертонии, ожирения, нарушения липидного обмена) на количество клеток-предшественников в кровотоке не обнаружено. При сопоставлении концентрации УЕвР и НОР у больных ИБС разного пола мы не обнаружили существенной разницы (см. табл. 12), хотя среднее значение концентрации НОР было у женщин на 15% ниже, чем у мужчин.

Табл. 12. Сопоставление концентрации \HEGF и в сыворотке крови у

больных ИБС разного пола.

УЕОР, пг/мл НОР, пг/мл

Мужчины п=34 424 ± 54 п=27 1120± 136

Женщины п=8 474± 140 п=7 973 ± 144

р=0,88 р=0,77

Выявленное значительное снижение количества СС)34+ клеток у женщин (почти в 2 раза) по сравнению с мужчинами оказалось зависимым также от возраста (см. табл. 13), вероятно, может быть связано с более высокой

концентрацией общего холестерина в крови и, возможно, меньшим приемом статинов женщинами.

Табл. 13. Сравнительная характеристика мужчин и женщин с ИБС.

Мужчины, п=34 Женщины, п=8

Возраст, лет 54,2 ± 1,3 62,0 ± 2,4 р=0,01

Курящие, % 41 25 р=0,69

Артериальная гипертония, % 71 88 р=0,66

Индекс массы тела, кг/м2 27,8 ± 0,5 28,4 ± 1,4 р=0,63

Гиперхолестеринемия, % 82 88 р=1,00

Концентрация общего холестерина в крови, ммоль/л 5,57 ± 0,30 6,68 ±0,51 р=0,10

Статины, % 56 25 р=0,24

0/1/2/3-сосудистое поражение, % 3/37/40/20 13/25/25/37 р=0,48

Число значимо пораженных сегментов на 1 больного 2,6 ± 0,3 2,9 ± 0,7 р=0,58

При исследовании зависимости количества клеток-предшественников в кровотоке от функционального класса стенокардии у больных со стабильной стенокардией напряжения мы не выявили статистически значимых отличий между больными со 2 и 3 функциональным классом (см. табл. 14).

Табл. 14. Сопоставление количества циркулирующих клеток-предшественников

у больных с различным функциональным классом стенокардии напряжения.

Количество СБ34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество СБЗ 4+УЕСР112+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Функциональный класс 2 п=14 213 ±32 7 ± 3 6,57 ± 0,49

3 п=6 190 ±23 15 ±6 6,73 ± 0,97

р=0,66 р=0,23 р=0,88

В настоящее время уровень С-РБ в крови рассматривается как дополнительный фактор сердечно-сосудистого риска. Считается, что умеренное повышение концентрации С-РБ в крови (не более 10 мг/л) отражает хроническое субклиническое воспаление сосудистого эндотелия, которое, в свою очередь, способствует развитию и прогрессированию атеросклероза [Pearson Т.A. et al., 2003; Szmitko Р.Е. et al., 2003].

Хотя средний уровень С-РБ в группе больных с ОКС без подъема сегмента ST был выше, чем у больных со стабильной стенокардией напряжения (соответственно 3,27 ± 0,63 мг/л и 2,00 ± 0,58 мг/л, р=0,10), статистически значимая разница между ними отсутствовала.

Для выявления возможного влияния хронического субклинического воспаления в сосудистой стенке на циркулирующие клетки-предшественники мы исследовали корреляции между их количеством и концентрацией С-РБ в сыворотке крови у больных ИБС (см. табл. 15). Кроме того, мы сравнили численность клеток-предшественников в кровотоке между группами низкого, среднего и высокого риска сердечно-сосудистых осложнений, разделенными на основании уровня С-РБ в сыворотке крови [Pearson T.A. et al., 2003] (см. табл. 16).

Табл. 15. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников

и концентрацией С-реактивного белка в сыворотке крови.

ОКС без подъема Стенокардия Объединенная группа

сегмента ST, напряжения, больных ИБС,

п=22 п=20 п=42

CD34+ г=-0,19 г=0,04 г=-0,14

р=0,39 р=0,85 р=0,37

CD3 4+VEGFR2+ г=-0,06 г=-0,39 г=-0,23

р=0,78 р=0,09 р=0,15

Табл. 16. Количество СБ34\ СБ34+УЕСГЫ2+ клеток в кровотоке у больных ИБС различных групп риска, выделенных на основании уровня С-РБ в сыворотке крови.

Количество CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество CD34+VEGFR2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл

Низкий риск С-РБ < 1 мг/л, п=20 187 ± 18 10 ± 2 6,73 ± 0,39

Средний риск 1 < С-РБ < 3 мг/л, п=10 183 ±27 7 ± 3 6,78 ± 0,64

Высокий риск 3 < С-РБ < 10 мг/л, п=12 196 ±31 6± 1 7,68 ± 0,67

р=0,94 р=0,54 р=0,40

Значимых различий между группами риска и статистически значимых корреляций между численностью клеток-предшественников в кровотоке и концентрацией С-РБ в сыворотке крови выявлено не было.

В экспериментальных исследованиях in vitro было показано, что гомоцистеин снижает количество культивируемых ПЭК и негативно влияет на их способность к адгезии, пролиферации, миграции и ангиогенезу [Chen J.Z. et al., 2004Ь]. Предполагают, что избыточная концентрация гомоцистеина приводит к повреждению сосудистого эндотелия, нарушению локальной секреции компонентов гемостаза и возникновению тромбозов [Карпов Ю.А. и др., 2003; Woo K.S. et al., 1997]. В группе больных с ОКС без подъема сегмента ST и больных со стабильной стенокардией напряжения средние концентрации гомоцистеина в сыворотке крови статистически не различались (12,39 ± 0,82

мкмоль/л и 10,67 ± 0,43 мкмоль/л, соответственно; р=0,17). При сопоставлении количества клеток-предшественников и концентрации гомоцистеина в сыворотке крови у больных ИБС мы не обнаружили статистически значимых корреляций (см. табл. 17).

Табл. 17. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией гомоцистеина в сыворотке крови у больных ИБС.

ОКС без подъема Стенокардия Объединенная группа

сегмента ST, напряжения, больных ИБС,

п=22 п=20 п=42

CD34+ г=0,31 г=0,12 г=0,19

р=0,15 р=0,60 р=0,22

CD34+VEGFR2+ г=0,05 г=0,23 г=0,10

р=0,83 р=0,33 р=0,54

Циркулирующие клетки-предшественники и медикаментозная

терапия

В ряде работ показано влияние таких препаратов, как статины, ингибиторы АПФ, на количественные и функциональные характеристики циркулирующих клеток-предшественников [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001a; Min T.Q. et al., 2004]. При исследовании связи между численностью циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС с получаемой на момент взятия крови медикаментозной терапией мы не выявили значимой разницы между лицами, получавшими и не получавшими статины, ингибиторы АПФ, нитраты, клопидогрель и гепарин (см. табл. 18).

Табл. 18. Сопоставление количества циркулирующих С034+, С034+УЕСЕН2+ клеток у больных ИБС с получаемой медикаментозной терапией на момент взятия крови.

Лекарственный Количество Количество Число

препарат С034" клеток CD34+VEGFR2+ лейкоцитов.

на 1 млн. клеток на 1 млн. млн/мл

лейкоцитов лейкоцитов

Статины да п=21 188 ± 19 9 ± 2 6,57 ± 0,47

нет п=21 189 ±20 7 ± 1 7,46 ± 0,38

Р 0,98 0,90 0,14

Ингибиторы АПФ да п=18 191 ±22 7 ± 2 7,80 ±0,46

нет п=24 187 ± 17 5 ± 2 6,42 ± 0,38

Р 0.88 0,38 0,02

Нитраты да п=19 163 ± 14 7 ± 3 7,56 ± 0,46

нет п=23 210 ±21 5 ±2 6,56 ± 0,39

Р 0,08 0,60 0,10

Клопидогрель* да п=17 165 ± 17 5 ± 1 7,58 ± 0,47

нет п=5 201 ±22 9 ± 5 6,68 ± 1,02

Р 0,29 0,70 0,39

Гепарин* да п=10 152 ±23 5 ± 1 7,89 ±0,52

нет п=12 190 ± 16 7 ± 2 6,95 ± 0,65

Р 0,17 0,44 0,28

Примечание: * - для оценки влияния терапии клопидофелем и гепарином исследовались лишь больные ОКС без подъема сегмента 8Т в связи с отсутствием сопоставимых групп среди больных со стабильной стенокардией.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Десять лет назад было обнаружено, что в крови взрослых людей существует популяция недифференцированных клеток костномозгового происхождения, способных приобретать эндотелиальный фенотип [Asahara Т. et al., 1997]. В экспериментальных работах на животных было показано, что ПЭК привлекаются в места сосудистого повреждения, возникающего в частности, после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], и значительно ускоряют реэндотелизацию области повреждения. Установлено, что число ПЭК в периферической крови здоровых лиц снижено при наличии факторов риска ИБС [Vasa M. et al., 2001b; Hill J.M. et al., 2003]. Несмотря на большое количество исследований и интенсивное накопление экспериментальных и клинических данных, до сих пор нет однозначного мнения как об изменениях числа ПЭК у больных с различными формами ИБС, так и об их роли в неоваскуляризации и репарации поврежденного эндотелия. Исследование числа циркулирующих ПЭК у больных ИБС, как острого, так и хронического течения, и роли данных клеток в процессе репарации сосудистой стенки представляет значительный интерес и имеет большое значение для разработки в перспективе методов терапевтического применения клеток-предшественников как для ускорения регенерации эндотелия, так и для стимуляции васкуляризации миокарда. Данная работа была посвящена исследованию количества циркулирующих клеток-предшественников у пациентов с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST и пациентов со стабильным течением ИБС, исследованию влияния коронарной ангиопластики на число клеток-предшественников в кровотоке у больных со стенокардией напряжения.

Мы обнаружили, что общее количество циркулирующих клеток-предшественников (CD34+) снижено у больных ИБС, как стабильного, так и нестабильного течения, по сравнению с лицами без ИБС. Полученные данные

согласуются с данными других работ, в которых также описано снижение числа этих клеток в кровотоке у больных ИБС [Eizawa Т. et al., 2004; Fadini G.P. et al., 2006]. В нашей работе контрольная группа была в среднем на 6 лет моложе группы с ОКС и на 4 года моложе группы больных со стенокардией напряжения. Показано, что способность ПЭК пролиферировать и мигрировать снижается с возрастом [Heiss С. et al., 2005]. Однако к настоящему моменту не проведено масштабных популяционных исследований, которые продемонстрировали бы значимое влияние разницы в 5-7 лет на уровень циркулирующих клеток-предшественников.

Хотя показано, что количество клеток-предшественников в крови негативно коррелирует с концентрацией общего холестерина [Hill J.M. et al., 2003; Chen J.Z. et al., 2004a], на наш взгляд, различия между контрольной группой и больными ИБС также не могут быть объяснены и меньшим процентом лиц с гиперхолестеринемией в контрольной группе. Повышенный уровень общего холестерина имели 73% больных ОКС, 35% больных со стенокардией напряжения, 39% контрольных лиц. Статины же получали 32% больных ОКС, 70% больных со стабильной стенокардией и 17% контрольных лиц. Следовательно, учитывая протективное действие статинов по отношению к численности и функциональным способностям ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001a], если бы гиперхолестеринемия оказывала негативное влияние на уровень циркулирующих клеток-предшественников, можно было бы ожидать, что различия в их количестве между контрольной группой и больными ИБС были бы еще выраженнее.

Влияние таких препаратов, как клопидогрель и гепарин, которые принимали больные ИБС, на количество ПЭК в кровотоке к настоящему моменту не исследовано. По ангиографическим характеристикам группы ОКС и стабильной стенокардии были сходны между собой. Таким образом, есть основания считать, что полученные нами данные о снижении числа клеток-предшественников в крови у больных ИБС не могут быть обусловлены

межгрупповыми различиями в факторах риска, степени выраженности коронарного атеросклероза или медикаментозной терапии.

Мы впервые показали, что ТБКА со стентированием у больных со стабильным течением ИБС сопровождается достоверным уменьшением общего числа клеток-предшественников в крови через сутки после процедуры. Эти данные, наряду с данными об уменьшении количества клеток-предшественников у больных ОКС без подъема сегмента ST, косвенно подтверждают нашу гипотезу о повышенном привлечении циркулирующих клеток-предшественников в области внутрисосудистого повреждения как искусственного (при ангиопластике), так и «естественного» (при ОКС) происхождения, что согласуется с результатами экспериментальных работ [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], в которых внутривенно вводимые или мобилизованные гранулоцитарным колониестимулирующим фактором ПЭК обнаруживались в месте повреждения сосудистой стенки после баллонной ангиопластики и значительно ускоряли эндотелизацию области повреждения. Эта гипотеза также подкрепляется обнаруженной нами отрицательной корреляцией между числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий и количеством CD34+ клеток в кровотоке у больных стабильной ИБС через 3-5 суток после интракоронарного вмешательства.

Нельзя исключить, что фактором, способствующим снижению числа

циркулирующих клеток-предшественников у больных с хроническим течением ИБС, может являться нарушение процесса их мобилизации из костного мозга. Так, в работе Aicher А. [2003] было показано, что эндотелиальная NO-синтаза является важным участником процесса мобилизации ПЭК из костного мозга. Следовательно, у тех больных ИБС, у которых наблюдается выраженная системная дисфункция эндотелия, сопровождаемая сниженной активностью оксида азота, дисфункция может распространяться и на эндотелий синусоидов костного мозга, что неизбежно приведет к снижению мобилизации клеток-предшественников.

Учитывая, что количество клеток-предшественников снижено у больных ИБС, можно предположить, что для усиления репаративных процессов (реэндотелизации) после ангиопластики и стентирования целесообразно введение предшественников эндотелиальных клеток, полученных из крови или костного мозга пациентов и наращенных in vitro до необходимого количества.

Мы не обнаружили статистически значимого изменения содержания ПЭК (CD3 4+VEGFR2+) в кровотоке у исследуемых групп. Это может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, количество этих клеток в кровообращении очень мало (единичные клетки в расчете на 1 миллион лейкоцитов). Во-вторых, причиной может являться недостаточный «ответ» данного ростка ввиду относительной слабости стимула и/или его десенсибилизации из-за хронической стимуляции. В-третьих, показано, что CD34+ клетки представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, включающую гематопоэтические предшественники, предшественники эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и кардиомиоцитов [Simper D. et al., 2002; Badorff С. et al., 2003; Yeh E.T.H. et al., 2003]. Можно предположить, что при ИБС патологические факторы влияют на различные типы циркулирующих предшественников, и это объясняет более выраженную реакцию общего пула CD34+ клеток по сравнению с реакцией ПЭК — CD34+VEGFR2+ клеток.

В экспериментальных работах показана способность VEGF и HGF мобилизовать клетки-предшественники из костного мозга [Kalka С. et al., 2000а; Kalka С. et al., 2000b; Ishizawa К. et al., 2004]. В клинических работах продемонстрировано повышение концентрации VEGF при остром крупноочаговом инфаркте миокарда, после эпизода миокардиальной ишемии, индуцированной физической нагрузкой. Причем увеличение уровня VEGF положительно коррелировало с количеством ПЭК в кровотоке [Shintani S. et al., 2001; Adams V. et al., 2004]. Отмечено также повышение уровня HGF в крови в течение суток с момента возникновения острого инфаркта миокарда,

нестабильной стенокардии [Yoshitomi Y. et al., 1999; Matsumori A., 2004]. В нашей работе не обнаружено достоверных различий в концентрации HGF и VEGF в крови больных ОКС, хронической ИБС и контрольных лиц. Это отчасти согласуется с данными George J. [2004], также не обнаружившим различий в концентрации VEGF между больными с нестабильной и стабильной стенокардией. В то же время наблюдаемая нами тенденция к увеличению концентрации HGF у больных ИБС согласуется с данными Matsumori А. [2004], выявившим повышение концентрации HGF у больных с нестабильной стенокардией и в первые сутки острого инфаркта миокарда. Нами впервые была обнаружена положительная корреляция между концентрацией HGF и числом клеток-предшественников в крови у больных со стабильным течением ИБС, что позволяет предположить участие HGF наряду с другими факторами в мобилизации клеток-предшественников из костного мозга; способность HGF мобилизовать ПЭК из костного мозга была показана в экспериментальной работе Ishizawa К. [2004]. Известно также, что HGF стимулирует пролиферацию, клеточную подвижность [Matsumoto К. et al., 1996], ангиогенез [Grant D.S. et al., 1993], ингибирует апоптоз [Zamegar R. et al., 1995] и стимулирует рост CD34+ гематопоэтических предшественников [Kmiecik Т.Е. et al., 1992]. На уровень HGF в крови существенное влияние оказывает гепарин. Его внутривенное или подкожное введение (как нефракционированного, так и низкомолекулярного) сопровождается быстрым и значительным (5-50-кратным) повышением концентрации HGF [Okada М. et al., 1999; Seidel С. et al., 1999; Salbach P.B. et al., 2000]. В'озможно, одной из составных частей положительного эффекта гепарина при ОКС без подъема сегмента ST является мобилизация клеток-предшественников в кровоток, опосредованная значительным повышением уровня HGF. Однако, отсутствие статистически значимых корреляций между концентрацией HGF, VEGF и числом клеток-предшественников в группе больных с ОКС, заставляет предположить участие

других факторов, влияющих на численность предшественников в крови у больных этой категории.

На поверхности CD34+ клеток имеются многочисленные хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии [Rabelink T.J. et al., 2004]. Это позволяет предположить, что в их мобилизации и «хоуминге» участвуют многие факторы, которые не исследовались в нашей работе. Число этих клеток в крови при ОКС, вероятно, является результатом действия всех этих факторов, среди которых в данной ситуации VEGF и HGF не являются самыми значительными.

При сопоставлении количества циркулирующих клеток-предшественников с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений мы не обнаружили значимой взаимосвязи.

По уровню С-РБ в. сыворотке крови группы значимо не различались между собой, хотя в группе ОКС без подъема сегмента ST его концентрация была закономерно выше. Статистически значимой корреляции между концентрацией С-РБ и числом циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС обнаружено не было. По-видимому, сопутствующее атеросклерозу воспаление, оцениваемое нами по содержанию С-РБ в сыворотке крови, не оказывает прямого влияния на количество исследуемых клеток-предшественников в кровотоке. Однако эти данные нуждаются в уточнении с использованием дополнительных маркеров воспаления, например, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли а.

По содержанию гомоцистеина в сыворотке исследуемой крови группы также значимо не различались между собой и статистически значимых корреляций между количеством клеток-предшественников в кровотоке и концентрацией гомоцистеина в сыворотке крови не обнаружено. Однако следует отметить, что у лиц, участвовавших в нашем исследовании, значительной гипергомоцистеинемии не наблюдалось. В исследовании in vitro было показано, что гомоцистеин снижает количество культивируемых ПЭК и негативно влияет на их функциональные способности. Но данный эффект

проявлялся при высоких концентрациях гомоцистеина 50 мкмоль/л и выше, а концентрация гомоцистеина 10 мкмоль/л не оказывала влияния на количество и функции культивируемых ПЭК [Chen J.Z. et al., 2004Ь]. Возможно, отсутствие в исследуемых нами группах больных с выраженным повышением концентрации гомоцистеина (более 50 мкмоль/л) не позволило выявить связи между его уровнем и количеством циркулирующих клеток-предшественников.

Больные ИБС с различной степенью атеросклеротического поражения коронарного русла по результатам ангиографии не различались по количеству клеток-предшественников в кровотоке. При этом выраженность периферического атеросклероза по результатам дуплексного сканирования сонных, подключичных артерий и артерий подвздошно-бедренного сегмента была одинаковой в подгруппах с 1-, 2- и 3-сосудистым поражением коронарного русла. Это могло нивелировать различия между этими подгруппами по величине «суммарного» атеросклеротического поражения.

Учитывая имеющиеся в литературе данные о влиянии некоторых групп лекарственных средств на количество циркулирующих клеток-предшественников [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001a; Min T.Q. et al., 2004], мы также исследовали взаимосвязь между получаемой медикаментозной терапией и количеством циркулирующих клеток-предшественников. В исследованной выборке больных статистически значимых различий между больными, получавшими и не получавшими статины, ингибиторы АПФ, нитраты, клопидогрель и гепарин, получено не было. В отношении статинов появляются новые данные о меньшем количестве циркулирующих ПЭК у больных стабильной ИБС, получающих большие дозы статинов, и об уменьшении числа ПЭК в кровотоке через 3 месяца лечения статинами [Hristov М. et al., 2007а]. Авторы объясняют наблюдаемый эффект стабилизацией атеросклеротических бляшек и снижением «потребности» в ПЭК. Ранее же считалось, что статины всегда способствуют увеличению количества циркулирующих ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001а]. В свете

этих новых данных о статинах, так как в исследуемых группах продолжительность приема и дозировка препарата сильно варьирует, интерпретация результата еще более затрудняется.

В заключение хотелось бы отметить, что уже появились первые сообщения об исследованиях, включающих до нескольких сотен лиц, демонстрирующих прогностическую значимость количества циркулирующих CD34+ [Fadini G.P. et al., 2006] и CD34+VEGFR2+ клеток [Schmidt-Lucke С. et al., 2005; Werner N. et al., 2005]: сниженное количество клеток-предшественников ассоциируется с худшим прогнозом независимо от общеизвестных факторов риска. Тем не менее, полномасштабных, длительных исследований, прояснивших бы прогностическую значимость числа клеток-предшественников в кровотоке у больных ИБС, не проводилось, так же как до сих пор не выработано единой общепринятой методики их подсчета.

Наши данные, полученные на меньшей группе больных ИБС, хорошо соотносятся с данными этих работ и могут явиться основанием для дальнейшего, более углубленного изучения циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС как, возможно, нового фактора риска и предиктора неблагоприятного прогноза ишемической болезни сердца. Полученные данные также обосновывают необходимость разработки подходов к повышению количества циркулирующих клеток-предшественников при ИБС.

ВЫВОДЫ

1. По сравнению с лицами без ИБС у больных с ОКС без подъема сегмента БТ и больных со стабильной стенокардией напряжения общее количество циркулирующих СОЭ4+ клеток снижено, соответственно, на 38 и 26%.

2. У больных со стабильной стенокардией отмечается достоверное уменьшение общего числа С034+ клеток-предшественников в крови через сутки после проведения коронарной ангиопластики со стентированием. Через 3-5 суток после коронарного вмешательства общее количество клеток-предшественников восстанавливается.

3. У больных со стабильным течением ИБС количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов.

4. Взаимосвязь между факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, выраженностью атеросклероза коронарных артерий и количеством циркулирующих клеток-предшественников не обнаружена.

5. Выявлена отрицательная корреляция между числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий и количеством циркулирующих СБ34+ клеток у больных стабильной ИБС через 3-5 суток после коронарного вмешательства.

6. Не установлена взаимосвязь между получаемой больными ИБС медикаментозной терапией и количеством циркулирующих клеток-предшественников.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенный протокол определения количества циркулирующих С034+ клеток-предшественников в пробах цельной крови рекомендуется использовать для научно-исследовательских работ, направленных, в частности, на исследование процессов репарации внутрисосудистого повреждения у различных групп больных.