Автореферат и диссертация по медицине (14.01.05) на тему:Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники и коллатеральный ангиогенез при хронической ишемической болезни сердца и ишемии нижних конечностей

На правах рукописи

Талицкий Константин Александрович

Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники и коллатеральный ангиогенез при хронической ишемической болезни сердца и ишемии нижних

конечностей.

14.01.05— «Кардиология» 03.03.04 - «Клеточная биология, цитология, гистология»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

11 ОКТ 2012

Москва 2012 г.

005053086

Работа выполнена: в отделе ангиологии Института клинической кардиологии им. А. Л.Мясникова и в лаборатории ангиогенеза НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ. Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Карпов Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор Парфенова Елена Викторовна. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сидоренко Борис Алексеевич, заведующий кафедрой кардиологии и общей терапии (с курсом нефрологии) ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» УД Президента РФ,

доктор медицинских наук, профессор Тарарак Эдуард Михайлович, заведующий отделом клеточной биологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК МЗ РФ. Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова МЗ и СР РФ

Защита состоится «01» ноября 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РНКПК» МЗ РФ. Автореферат разослан /V7 ^

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н. Т.Ю. Полевая

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ССБ - Канадское кардиологическое общество

СО - коллатеральный индекс

С8 — индекс коллатерального сопротивления

О-СБИ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

М — выборочное среднее

р - уровень значимости

БП — стандартное отклонение

ЯЕ — стандартная ошибка

КУНА - Нью-Йоркская Ассоциация сердца

УЕОБ — фактор роста сосудистого эндотелия

АГ - артериальная гипертония

АД - артериальное давление

АПС — аорто-подвздошный сегмент

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент

БАБ - бета-адреноблокаторы

БКК — блокаторы кальциевых каналов

БРА - блокаторы рецепторов ангиотензина II

ВПА — внутренняя подвздошная артерия

вчСРБ - высокочувствительный С-реактивный белок

ГБА - глубокая артерия бедра

ДАД - диастолическое артериальное давление

ДББХ - дистанция безболевой ходьбы

ЗББА - задняя большеберцовая артерия

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИМ - инфаркт миокарда

ИМТ - индекс массы тела

КА — коронарные артерии

КАГ - коронароангиография

кДНК -кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота КШ - коронарное шунтирование

ЛДФ — лазерная допплеровская флоуметрия ЛПИ - лодыжечно-плечевой индекс МДХ - максимальная дистанция ходьбы МРТ — магнитно-резонансная томография НПА - наружная подвздошная артерия ПБА — поверхностная бедренная артерия ПББА - передняя болынеберцовая артерия ПХ - перемежающаяся хромота САД - систолическое артериальное давление СКФ - скорость клубочковой фильтрации ССО - сердечно - сосудистые осложнения

ТБКА - транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика

Тср02 - транскутанное напряжение кислорода

УЗДГ - ультразвуковая допплерография

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФК — функциональный класс

ФР - факторы риска

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей ХПН - хроническая почечная недостаточность ХСН - хроническая сердечная недостаточность ЭКГ - электрокардиография

ЭКП - эндотелиальные клетки-предшественники

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Эндотелиальные клетки — предшественники (ЭКП) представляют собой популяцию прогениторных клеток, выделяемых из крови и костного мозга, которые экспрессируют поверхностные маркеры, специфичные как для незрелых гематопоэтических клеток, так и для эндотелия, и дифференцируются в клетки эндотелиальной линии. В многочисленных экспериментальных работах было показано активное участие ЭКП в процессах васкулогенеза, ангиогенеза и артериогенеза, а также в репарации эндотелия. Тем не менее, клиническое значение этих экспериментально выявленных механизмов остается во многом неизученным. При сердечно-сосудистых заболеваниях уменьшается количество ЭКП в крови, снижается их жизнеспособность и функциональная активность (Urbich, Dimmeier, 2005). Низкий уровень циркулирующих ЭКП является независимым фактором риска сердечно-сосудистых осложнений, что может отражать недостаточность репарации эндотелия (Schmidt-Lucke et al., 2005). В то же время, связь циркулирующих ЭКП и процессов ангиогенеза в клинических условиях изучена недостаточно.

Снижение количества ЭКП в периферической крови и их функциональной активности в экспериментальных работах ассоциируется с ослаблением компенсаторного ангио-артериогенеза (коллатерального ангиогенеза) в ответ на ишемию (Urbich, Dimmeier, 2004), что может иметь определенное клиническое значение. Так, при ИБС коллатеральный ангиогенез оказывает влияние на прогноз, о чем свидетельствует обратная связь между развитием коронарных коллатералей и риском сердечно-сосудистых осложнений (Choi et al., 2005; Meier et al., 2007). Плохое развитие коронарных коллатералей наблюдается при повышенном уровне С-реактивного белка (Gulec et al., 2006), гомоцистеина (Yang et al., 2006), оксидативном стрессе (Demirbag et al., 2006), почечной недостаточности (Sezer et al., 2006); содержание ЭКП в крови при этих состояниях также снижено (Callaghan et al., 2005; Chen et al., 2004; van Grevenynghe et al., 2006; Verma et al., 2004). При ишемических поражениях у человека компенсаторный коллатеральный ангиогенез обычно оказывается недостаточным для сохранения адекватной перфузии.

Терапевтический ангиогенез - стимуляция роста новых сосудов в ишемизированных тканях с помощью ангиогенных факторов роста, их генов или стволовых и прогениторных

клеток - рассматривается как перспективный метод лечения пациентов с тяжелой ишемией нижних конечностей, который позволяет улучшить перфузию ткани, уменьшить ишемические симптомы и в ряде случаев предотвратить ампутацию. Несмотря на многочисленные завершенные исследования I-II фаз по терапевтическому ангиогенезу, факторы, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза у больного, остаются неясными.

При ХИНК, так же как и при ИБС, отмечается существенное уменьшение количества циркулирующих ЭКП со снижением их жизнеспособности и функциональной активности (Yamamoto et al., 2004), что может оказывать влияние на эффективность терапевтического ангиогенеза у этой категории больных (De Vriese et al., 2008). Вместе с тем, на сегодняшний день остается неясным, какая из популяций прогениторных клеток вносит основной вклад в развитие лечебного эффекта при терапевтическом ангиогенезе (Sieveking, Ng, 2009; Ishida et al., 2005).

Принимая во внимание активное участие ЭКП в компенсаторном ангио-артериогенезе, представляется актуальным исследовать связь циркулирующих ЭКП с состоянием коллатерального кровообращения, тяжестью заболевания и эффективностью ангиогенных вмешательств. Выяснение факторов, определяющих эффективность терапевтического ангиогенеза, важно для разработки дизайна клинических испытаний и определения подходов к повышению эффективности новых методов лечения больных с ишемическими заболеваниями, направленных на стимуляцию ангиогенеза.

Цель исследования:

исследовать связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников с состоянием коллатерального кровообращения, клиническим течением заболевания и процедурами терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ИБС и хронической ишемией нижних конечностей.

Задачи исследования:

1. Оценить взаимосвязь содержания циркулирующих ЭКП с факторами сердечнососудистого риска, состоянием коллатерального кровоснабжения и клиническим течением заболевания в ходе проспективного наблюдения у больных со стабильной стенокардией напряжения и больных с ишемией нижних конечностей атеросклеротического происхождения.

У части больных - исследовать динамику уровня ЭЬСП в крови до и после выполнения реваскуляризации, выяснить взаимосвязь выраженности ишемии и количества ангиографически визуализируемых коллатералей с уровнями циркулирующих ЭКП. У больных с тяжелой ишемией нижних конечностей, которым не планируется выполнение процедур реваскуляризации, оценить эффект местного введения мононуклеарной фракции собственной крови больного, обогащенной эндотелиальными клетками-предшественниками, на функциональный статус, уровни циркулирующих ЭКП, маркеров ангиогенеза, и показатели кровоснабжения нижних конечностей.

Провести клиническое исследование безопасности и эффективности внутримышечного введения препарата «Корвиан» (плазмидной конструкции, содержащей ген VEGF), у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (Fontaine II6-III), которые не являются кандидатами для выполнения процедур реваскуляризации.

Изучить связь уровней циркулирующих ЭКП, клинических, лабораторных и инструментальных показателей с результатами терапевтического ангиогенеза. Научная новизна

Впервые установлено, что на фоне клеточной терапии с использованием стимулированной мононуклеарной фракции крови и генной терапии плазмидной конструкцией с кДНК сосудисто-эндотелиального фактора роста наблюдается значимое повышение циркулирующей популяции CD34+133+ ЭЬСП, а после эндоваскулярной реваскуляризации у больных ИБС и больных хронической ишемией нижних конечностей - значимое повышение циркулирующей популяции CD34+ kdr+ ЭКП.

Впервые выявлена связь уровня циркулирующих ЭКП с показателями коллатерального кровотока при хронической ИБС и хронической ишемии нижних конечностей: у больных с хорошо развитыми коллатералями количество циркулирующих ЭКП было в 1,5-5 раз выше, чем у больных с плохо развитыми коллатералями.

Впервые продемонстрировано, что добавление к стандартной консервативной терапии генной терапии препаратом Корвиан (плазмидной конструкцией с кДНК сосудисто-эндотелиального фактора роста) дает более выраженный лечебный эффект у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, чем стандартная консервативная терапия. Впервые установлена связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников с эффективностью генной терапии препаратом Корвиан, направленной на стимуляцию ангиогенеза у больных хронической ишемией нижних конечностей: у

5. Впервые установлены предикторы эффективности терапевтического ангиогенеза препаратом Корвиан у больных с хронической ишемией нижних конечностей: проходимый аортоподвздошный артериальный сегмент и меньшая длительность анамнеза перемежающейся хромоты.

Практическая значимость

В работе было установлены факторы, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей, и предложен подход к определению ожидаемой величины лечебного эффекта. Полученные в работе результаты важны для разработки дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий для терапевтического ангиогенеза, для определения подходов к повышению эффективности новых методов лечения тяжелой хронической ишемии, направленных на стимуляцию ангиогенеза.

Апробация. Состоялась 25 июня 2012 г. на заседании межотделенческой конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ РКНПК МЗ РФ. Основные положения работы доложены на российских и международных конференциях в гг. Москва (2009, 2011), Прага (2009), Лейпциг (2009), Гамбург (2010), Осло (2010), Милан (2009, 2011), Чикаго (2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Объем и структура. Диссертация изложена на 174 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками, 17 таблицами, 33 диаграммами. Библиографический указатель состоит из 14 отечественных и 133 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и структура исследования

Работа проводилась в отделе ангиологии (руководитель отдела — проф. Ю.А.Карпов) НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК МЗ РФ.

Всего в работе было обследовано 117 человек: 30 пациентов со стабильной стенокардией, 67 пациентов с ишемией нижних конечностей и 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза.

Критерии включения

В группу ИБС включались пациенты со стабильной стенокардией напряжения, направленные на коронарографию для решения вопроса о реваскуляризации миокарда. Показанием к включению была верифицированная ИБС: ИМ в анамнезе или положительная функциональная проба на ишемию.

Больные ХИНК П6-1У ст. по классификации Покровского-Фонтейна и ЛПИ менее 0,9. были консультированы сосудистым хирургом, 27 больным в дальнейшем была выполнена реваскуляризация нижних конечностей. Остальные 40 больных по заключению хирурга не являлись оптимальными кандидатами для реваскуляризации и были рандомизированы в группы стандартного лечения, либо терапевтического ангиогенеза. В группе терапевтического ангиогенеза больных рандомизировали в соотношении 1:4 в группы клеточной терапии, либо генной терапии.

В качестве группы сравнения были привлечены 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза, нарушений углеводного обмена, аутоиммунных и острых воспалительных заболеваний, не страдавших онкологическими и тяжелыми общими заболеваниями. Допускалось наличие гипертонической болезни I ст., умеренной гиперлипидемии, ожирения 1-П ст.

Критерии исключения:

острый коронарный синдром или ОНМК в предшествующие 3 мес., КШ или ТБКА в предшествующие 12 мес., клинически выраженная недостаточность кровообращения, сложные нарушения ритма и проводимости сердца, пороки сердца, заболевания миокарда (миокардиты, кардиомиопатии), тяжелая ХПН (клиренс креатинина менее 30 мл/мин), печеночная недостаточность, декомпенсированная дыхательная недостаточность, онкологические или аутоиммунные заболевания (в т.ч. в анамнезе), декомпенсированный сахарный диабет, пролиферативная ретинопатия, острые воспалительные заболевания или хронические воспалительные заболевания в стадии обострения в течение предшествующего месяца, длительно сохраняющаяся анемия (НЬ<100 г/л); тяжелые хронические заболевания. Для исключения латентных стадий онкопатологии у больных

ХИНК, которые не являлись кандидатами для выполнения реваскуляризации, перед рандомизацией проводился онкоскрининг, включая определение онкомаркеров крови.

Клиническая характеристика обследованных лиц. Детальная характеристика обследованных пациентов и добровольцев дана в таблице 1.

Таблица 1. Клинические характеристики сравниваемых групп при включении в исследование.

ИБС ХИНК Добровольцы без ИБС и ХИНК Р1-2 Р2-3 Р1-3

п 30 67 20

Женщины, п (%) 5 (16,7) 9 (13,4) 3 (15,0) 0,586 0,922 0,131

Возраст, годы, М±ш 61,2±5,4 62,6±7,63 45,6±14,4 0,422 0,021 0,018

Анамнез курения, п (%) 17 (56,7%) 60 (89,6%) 11 (55%) 0,0004 0,001 0,317

Курение на момент обследования,п (%) 8 (26,7%) 45 (67,2) 12 (60,0) 0,002 0,571 0,378

Стаж курения, лет 29,9±14,1 39,5±9,4 13,3±10,5 0,004 0,033 0,027

АГ, п(%) 30(100) 63 (94,0) 7(35) 0,931 0,026 0,009

Гиперлипидемия, п(%) 19 (63,3) 52 (77,6) 10 (50) 0,882 0,047 0,212

Сахарный диабет, п (%) 13 (43,3) 23 (34,3) 0 0,446 0,007 0,006

ИМТ, кг/м2, М±т 29,95±4,32 27,43±3,42 25,61±3,70 0,009 0,032 0,029

ИБС, п (%) 30(100) 35 (52,2) 0 0,003 0,026 0,011

Коронарный анамнез, лет, М±т 4,8±4,4 7,6±6,8 0 0,023 0,032 0,021

ИМ в анамнезе, п (%) 13 (43,3) 26 (38,8) 0 0,658 0,049 0,113

ОНМК/ТИА, п (%) 4(13,3) 8(11,9) 0 0,726 0,482 0,329

ХИНК, п (%) 4(13,3) 67(100) 0 0,007 0,011 0,481

Коронарная реваскуляризация в анамнезе, п (%) 4(13,3) 19(28,4) 0 0,003 0,226 0,364

Реваскуляризация нижних конечностей в анамнезе, п (%) 1 (3,3) 26 (38,8) 0 0,001 0,542 0,209

Реваскуляризации других сосудистых бассейнов в анамнезе, п (%) 1 (3,3) 22 (32,8%) 0 0,025 0,786 0,198

САД, мм рт.ст.,М±т 138,0±14,8 140,4±18,8 120,8±11,4 0,585 0,004 0,004

ОХС, ммоль/л,М±т 5,02±1,13 4,74±1,30 5,06±1,10 0.361 0.238 0,941

ХС-ЛПНП,ммоль/л, М±т 2,99±0,93 2,78±1,12 2,66±0,90 0.478 0.343 0,525

ХС-ЛПВП, ммоль/л,М±т 1,14±0,29 1,12±0,35 1,54±0,31 0,328 0,020 0,017

ТГ, ммоль/л,М±ш 2,05±1,12 1,95±1,09 1,15±0,42 0,488 0,030 0,045

Глюкоза, ммоль/л,М±ш 6,15±1,30 5,95±1,57 4,95±1,17 0,338 0,037 0,024

СКФ по Кокрофту-Гаулту, мл/мин,М±ш 95,98±33,21 84,85±22,4 98,33±23,13 0,101 0,336 0,034

Гомоцистеин, мкмоль/л,М±т 13,81±6,22 15,78±7,17 11,23±1,26 0.338 0,495 0,283

Вч-СРБ, мг/дл,М±ш 0,42±0,44 0,51±0,38 0,17±0,38 0.393 0,035 0,013

Мочевая кислота, мкмоль/л, М±ш 404,6±106,5 328,3±77,7 298±56,6 0.155 0,037 0,042

Прием препаратов:

Аспирин 30 (100%) 50 (74,6%) 0 0,296 <0,001 <0,001

Клопидогрель 4 (13,3%) 13 (19,4%) 0 0,267 0,019 0,035

Статнны 23 (76,7%) 46 (68,7%) 0 0,437 <0,001 <0,001

Бета-блокаторы 23 (76,7%) 22 (32,8%) 2(10%) <0,001 <0,001 <0,001

Нитраты 11 (36,7%) 5 (7,5%) 0 0,005 0,032 0,003

Ингибиторы АПФ/БРА 20 (67%) 38(56,7%) 4 (20%) 0,672 0,002 0,006

БКК 11 (36,7%) 15 (22,4%) 2 (10%) 0,345 0,025 0,026

Мочегонные 6 (20%) 9(13,4%) 0 0,535 0,104 0,227

Трентал 0 5 (7,5%) 0 0,092 0,335 -

По сравнению с больными ИБС и ХИНК, добровольцы были достоверно моложе, имели менее длительный анамнез курения, меньшие средние значения ИМТ, более низкий средний уровень САД; кроме того, уровень глюкозы, триглицеридов и мочевой кислоты сыворотки крови у добровольцев также были достоверно ниже, а уровень холестерина

ЛПВП — достоверно выше. У добровольцев реже регистрировалась АГ, не было случаев сахарного диабета, достоверно меньше была доля постоянно получающих лекарственные препараты кардиологического и эндокринологического профиля. При этом доля лиц с гиперлипидемией и процент курящих достоверно не отличались от пациентов с ИБС и ХИНК.

По сравнению с больными ИБС, в группе ХИНК было достоверно больше курящих, анамнез курения был в среднем более длительным, а индекс массы тела - ниже. У больных ХИНК в анамнезе чаще встречалась реваскуляризация нижних конечностей и реже — коронарная реваскуляризация. 52,2% больных в группе ХИНК также страдали ИБС, а в группе ИБС в 13,3% случаев диагностировали сопутствующую ХИНК. В группе ХИНК больные достоверно реже принимали БАБ и нитраты, при этом различий по частоте приема антиагрегантов и статинов не было. Группы ИБС и ХИНК также не отличались по возрасту, уровню АД, липидов крови, мочевой кислоты, глюкозы, С-реакгивного белка и гомоцистеина. Доля больных с АГ, СД, гиперлипидемией также значимо не различалась между группами.

Методы исследования

Процедуры и ход исследования.

В группе ИБС всем больным выполняли стандартное обследование. Образцы крови для определения уровня циркулирующих прогениторлых клеток получали перед КАТ и через б мес. после реваскуляризации миокарда.

У 27 больных с ХИНК, которым была запланирована хирургическая или эндоваскулярная реваскуляризация нижних конечностей, помимо стандартного обследования, проводилось дуплексное сканирование и сц интиграфия нижних конечностей, определение ДББХ и МДХ по данным тредмил-теста, а также исследование уровня циркулирующих прогениторных клеток. Обследование повторяли через 6-9 мес. после реваскуляризации.

Все больные ХИНК, рандомизированные в группы генной терапии, клеточной терапии и стандартного лечения, получали базисную терапию (статины, ацетилсалициловая кислота, трентал, ингибиторы АПФ или блокаторы рецепторов ангиотензина II), всем больным при отсутствии противопоказаний проводились сеансы

тренировочной ходьбы на тредмиле. В группах генной и клеточной терапии дополнительно к стандартной терапии больные получали лечение, направленное на стимуляцию ангиогенеза в ишемизированных конечностях.

Больным группы генной терапии в ишемизированные мышцы путем обкалывания вводили Корвиан - стерильный апирогенный препарат плазмидной ДНК, включающей кодирующую часть (кДНК) гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-165), в дозе 28,6 мкг/кг. Введение препарата проводили дважды с промежутком одна неделя (у 10 больных) и трижды с промежутком 1 неделя между первым и вторым введениями и 2 недели -между 2-м и 3-м введениями. Клиническое исследование препарата Корвиан было одобрено МЗ РФ, этическим комитетом РФ и локальным этическим комитетом РКНПК. Все больные подписывали информированное согласие.

Больным группы клеточной терапии в ишемизированные мышцы вводили суспензию мононуклерных клеток, выделенную из собственной крови больного методом афереза на сепараторе MCS+ (т.н. мононуклеарная фракция). Для мобилизации прогениторных клеток перед проведением процедуры афереза больным назначался курс инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора роста (G-CSF; филграстим) в дозе 5 мкг/кг/сут в течение 5 дней. Полученная в ходе афереза клеточная суспензия вводилась в ишемизированные мышцы путем обкалывания в асептических условиях.

Для оценки эффективности терапевтического ангиогенеза, помимо стандартного клинического обследования, был использован комплекс современных лабораторных и клинико-инструментальных методов. ДББХ оценивали с помощью тредмил-теста по протоколу Гарднера-Скиннера. Проводили дуплексное сканирование и ангиографию нижних конечностей, сцинтиграфию нижних конечностей с 99mTc-MIBI, MPT нижних конечностей с контрастированием, транскутанную оксиметрию. ДББХ оценивалась исходно, через 2 недели и 1,3,6 месяцев после начала лечения. Повторная ангиография, сцинтиграфия и МРТ нижних конечностей проводились через 3 месяца после начала лечения. Пробы для определения циркулирующих ЭКП брали исходно, на фоне терапии, через 1, 3 и 6 мес. после лечения.

Стандартное обследование. Всем больным проводили подробные опрос и физикальное обследование пациента; общий клинический, биохимический анализы крови (включая липидный спектр, вч-СРБ и гомоцистеин), коагулограмму и уровень фибриногена крови; анализы мочи; ЭКГ в 12 отведениях, суточное мониторирование ЭКГ

по Холтеру, трансторакальную двухмерную эхокардиографию, по показаниям -нагрузочную пробу, тест толерантности к глюкозе; гликемический профиль, определение гормонов, характеризующих функцию щитовидной железы.

Определение уровня циркулирующих ЭКП. Содержание циркулирующих ЭКП оценивали в образцах мононуклеарной фракции крови, полученной путем центрифугирования на градиенте плотности 1,077 г/л. Визуализацию поверхностных маркеров клеток осуществляли методом прямой иммунофлуоресценции. Содержание ЭКП оценивалось методом поточной цитометрии на приборе «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США) на основании фенотипа CD45-CD34+kdr+. Анализировали 0,8-1 млн событий (клеток) для каждого образца. Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния. Далее из популяции CD451ow/- клеток по экспрессии CD34 и kdr выделяли популяции CD34+kdr- и CD34+kdr+ клеток и для каждого пациента рассчитывали их число в пересчете на 1 миллион мононуклеаров (см. рис.1).

У больных ХИНК дополнительно визуализировали маркер CD 133. На основании фенотипа CD45-CD34+CD133+ и CD45-CD34-CD133+, а также CD45-CD34+kdr+ идентифицировали фракции прогениторных клеток, которые, по данным литературы, содержат популяцию циркулирующих ЭКП (Rustemeyer et al., 2006). При этом CD133-позитивные ЭКП считаются более «ранними» эндотелиальными предшественниками, недавно покинувшими костный мозг. Также определяли популяцию С034-негативных СВ133-позитивных предшественников, которые, как считается, обладают более высокой ангиогенной и репаративной активностью (Friedrich et al., 2006).

CD 45 tow/-

Рис. 1. Идентификация CD451ow/-CD34+kdr+ ЭКП методом поточной цитометрии

В качестве контроля использовались образцы мононуклеарной фракции крови от 20 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза.

Коронароангиография. Селективную КАТ проводили у больных ИБС по стандартной методике в соответствии с рекомендациями АСС/АНА. При определении степени стенозирования КА руководствовались заключением рентгенохирурга. Для оценки развития коронарных коллатералей для бассейна каждой КА (ПНА, OA, ПКА) применяли шкалу Рентропа (Rentrop et al., 1985), для последующего анализа использовали наилучший показатель. При 0-1 ст. развитие коллатералей считали слабым, при 2-3 ст. - хорошим. Также использовали модифицированный коронарный коллатеральный индекс (CD), предложенный Choi и соавт. (2006). Индекс определяется как частное от суммы баллов по Рентропу (Ren) для каждой эпикардиальной КА и суммы т.н. индексов коллатерального сопротивления (CS), представляющих собой произведение максимального стеноза эпикардиальной KA (maxSt) и скорости контрастирования данной артерии по TIMI (CTFC). Для каждой КА скорость контрастирования определяли как число кадров от момента начала заполнения контрастом проксимального сегмента артерии до достижения контрастом характерных ориентиров в наиболее дистальном сегменте данной КА (Gibson et al., 1996).

Общая формула расчета коллатерального индекса: CD = 1000*(Ren ПНА+Ren OA+Ren I1KA+1)/(CS ПНА+CS OA+CS ПКА), где CS maxSt KA*CTFC KA.

Относительную и абсолютную дистанцию безболевой ходьбы оценивали по стандартной методике в ходе тредмил-теста по протоколу Гарднера-Скиннера.

Сцинтиграфия нижних конечностей с 99mTc-MIBI проводилась для оценки перфузии конечностей у больных с ХИНК на аппарате Siemens SkyLight. Радиофармпрепарат вводили внутривенно в дозе 370МБк, через 1 час выполняли пленарное сканирование всего тела во фронтальной плоскости со скоростью 12 см/мин. Для каждого сегмента конечности (бедро, голень, стопа) определяли показатель перфузии, который выражался как доля накопленной радиоактивности данного сегмента по отношению к общей накопленной радиоактивности всего тела.

Дуплексное сканирование и ультразвуковую допплерографию артерий нижних конечностей проводили на аппаратах VIVID 7 (GeneralElectric, США), ACUSON 128 ХР 10 и HDI 5000 SonoCT (Philips, США), в покое, по стандартной методике.

Ангиографию нижних конечностей проводили у больных с ХИНК по стандартной методике феморальным или радиальным доступом. Для оценки эффективности коллатерального кровотока применяли коллатеральный индекс Choi и соавт. (2006), модифицированный нами для нижних конечностей (Талицкий и соавт., 2011). При наличии окклюзирующих поражений также использовали метод Vajanto и соавт. (2009): подсчитывали все видимые коллатерали, пересекающие прямую, перпендикулярную длиннику окклюзированного сегмента артерии на границе его средней и дистальной трети.

Магнитно-резонансная томография. Обследование пациентов выполнялось на MP-томографе «Magnetom Avanto», 1.5 Тл (Siemens AG, ФРГ). Контрастный препарат («Омнискан», GE Healthcare, США) вводился внутривенно болюсно в покое и на высоте нагрузки - максимального тыльного сгибания и разгибания стоп обеих ног. Перфузию мышц характеризовали как изменение максимальной интенсивности сигнала, а артериальный кровоток - как максимальную интенсивность контрастирования артерии.

Транскутанная оксиметрия. Исследование проводили на приборе ТСМ 400 (RadiometerCopenhagen). Электрод располагали на коже тыльной поверхности стопы в I межпальцевом промежутке. Тср02 определяли в положении лежа, сидя и во время позиционной пробы с пассивным подъемом конечности на угол 45° в течение 3 мин. и последующим восстановлением.

Статистический анализ. Количественные характеристики выражены как среднее±стандартное отклонение, качественные показатели - в абсолютных величинах и процентах. Для непрерывных показателей анализировали распределение на его соответствие нормальному (тест Комогорова-Смирнова). При несоответствии распределения изучаемых параметров нормальному, для анализа применяли непараметрические методы расчета. Межрупповые различия оценивались с помощью критерия Манна-Уитни, для повторных измерений использовали критерий Вилкоксона. Для оценки корреляций использовали ранговый тест Спирмена. Для нормально распределенных показателей межгрупповые различия оценивали с помощью t-теста для количественных показателей (с поправкой Бонферрони в случае множественных сравнений) и критерия % для качественных показателей. Для оценки влияния клинических, лабораторных и инструментальных показателей (в качестве независимых величин) на клиническую эффективность лечения ишемии нижних конечностей использовали простую

модель линейной регрессии. Критерий значимости приняли 0,05. Обработку данных проводили с помощью пакета программ 81айзйса 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Циркулирующие ЭКП у больных хронической ИБС.

Уровень циркулирующих С034+кс3г+ ЭКП у больных ИБС был достоверно ниже, чем у лиц контрольной группы, в среднем в 2,16 раза. После реваскуляризации отмечался достоверный прирост уровня ЭКП, в среднем в 1,99 раза, при этом исчезало достоверное различие между больными и добровольцами контрольной группы (рис. 2).

исходно после ТБКА/КШ здоровые

п=30 * р<0,05

Рис. 2. Динамика уровня СП34+к<1г+ ЭКП у больных ИБС до и через 6 мес. после коронарной реваскуляртацни

Уровень ЭКП обратно коррелировал с функциональным классом стенокардии (г=-0.66; р=0,003) и числом пораженных коронарных артерий (г=-0,659, р=0,004). У больных с трехсосудистым поражением уровень ЭКП был в 2 раза ниже (10,9±6,70), чем у больных с однососудистым поражением (20,69±10,43) (р<0,05). Отрицательная корреляция также была обнаружена с такими ФР ССО, как стаж курения (г=-0.22, р=0,046), уровень СРБ (тенденция: г=-0.29, р=0,060) и фибриногена (г=-0.46, р=0,011).

Уровень ЭКП у больных с хорошо развитыми коллатералями (2-Зст. по Рентропу) был на 47% выше, чем у больных с малоразвитыми коллатералями (0-1 ст), (р=0,0047)

(рис. 3). Вместе с тем, линейной корреляции уровня ЭКП с индексом Рентропа обнаружено не было (г=0,22; р=0,112).

(л - 30)

балл по Рентролу

1*ис. 3. Содержание циркулирующих СШ4+Ыг+ ЭКП у больных ИБС с плохим и хорошим развитием коронарных коллатсралей

В то же время, для коллатерального индекса СО отмечалась достоверная положительная корреляция с уровнем циркулирующих ЭКП (г=0.73; р=0,008), что может быть связано с большей чувствительностью этого показателя по сравнению с индексом Рентропа (рис. 4).

Рис. 4. Корреляция между коллатеральным индексом (СО) и уровнем циркулирующих i D.l l к(1г ЭКП у больных ИБС

Таким образом, было установлено, что уровень циркулирующих ЭКП у больных ИБС достоверно снижен по сравнению с лицами без клинических проявлений атеросклероза. Степень этого снижения прямо пропорциональна тяжести заболевания и обратно пропорциональна степени развития коронарных коллатералей. Коронарная или периферическая реваскуляризация приводит к значимому повышению уровня циркулирующих ЭКП.

2. Циркулирующие ЭКП у больных ХИНК.

Уровни циркулирующих СВ34+133+ и СВ34+кс1г+ ЭКП были в равной степени снижены у больных с ХИНК по сравнению с добровольцами, в среднем на 38,7% (р<0,05). СВ34+133- и СВ34-С0133+ популяции не демонстрировали значимых различий между больными ХИНК и здоровыми добровольцами. После выполненной реваскуляризации уровни СВ34+133+ и С034+к<1г+ ЭКП повышались на 35-36%, при этом оставаясь достоверно ниже значений контрольной группы. Уровни СБ34-негативных клеток не демонстрировали достоверной динамики. Наблюдалась тенденция к снижению уровня СБ34+133- клеток на 20% (рис. 5).

Рис. 5. Уровень различных фракций циркулирующих прогеииториых клеток у больных с ишемией ешжцих конечностей до и после реваскулнризации # - сравнение между больными ХИНК и здоровыми добровольцами (р<0,05)

*- сравнение показателей до и после реваскуляризации у бальных ХИНК (р<0,05)

Была обнаружена прямая корреляция между уровнем С034+133+ ЭКП и ДББХ (г= 0.31; р= 0,02); и обратная корреляция с возрастом (г= -0.317; р= 0,02) и стадией ХИНК (г =-0.316; р = 0,02).

При межквартильном анализе уровень СВ34+кс1г+ ЭКП при высоких значениях коллатерального индекса был в 3,74 раза выше, чем при низких значениях (рис. 6). Уровни же «молодой», более проангиогенной СВ34-СВ133+ популяции ЭКП при межквартильном анализе различались в 5,16 раз. Была обнаружена прямая корреляция между уровнем СБ34-СО!33+ ЭКП и коллатеральным индексом (г = 0,62, р = 0,0059).

Рис. 6. Содержание циркулирующих СШ4-Мг+ ЭКП у больных ХИНК с различными значениями коллатерального индекса.

Таким образом, уровень циркулирующих ЭКП у больных ХИНК достоверно снижен по сравнению с добровольцами. Степень этого снижения, как и у больных ИБС, прямо пропорциональна тяжести заболевания и обратно пропорциональна степени развития коллатералей. Реваскуляризация также приводит к значимому повышению уровня циркулирующих ЭКП.

3. Влияние терапевтического ангиогенеза на уровни циркулирующих ЭКП и коллатеральное кровообращение у больных ХИНК.

Клинический эффект лечения. Диагностические и лечебные процедуры в рамках протокола протекали без серьезных осложнений. В группе генной терапии в течение 6 мес. у 20% больных не наблюдалось существенных изменений в клиническом статусе конечности, у 30% пациентов - минимальное улучшение (4 1 по Рутерфорду), у 50% -умеренное улучшение (+2 по Рутерфорду). В группе стандартной терапии у 13% больных наблюдали минимальное улучшение, у 60% больных - без существенных изменений, у четверти больных - минимальное ухудшение (-1 по Рутерфорду). В группе клеточной терапии у двух больных наблюдали минимальное улучшение, у трех — умеренное улучшение. В связи с недостаточным количеством наблюдений в группе клеточной терапии данные приводятся без статистического сравнения с контрольной группой.

Функциональные показатели. У больных, получавших Корвиан, уже через 1 мес. наблюдали достоверное увеличение ДББХ и МДХ и прирост ЛПИ, достигавшие максимума к 3 мес. и сохранявшиеся более 6 мес. В среднем, дистанция ходьбы возрастала в 2,75 раза, прирост ЛПИ достигал 18%. В группе стандартной терапии достоверного прироста функциональных показателей не наблюдалось, хотя имелась тенденция к увеличению на сроке 1 мес. (рис. 7)

Генная терапия

дистанция ходьбы

800 700 600 500 400 300 200 100 О

(п - 20) исходно 1 мес 3 мое

= üi *р<0.05

lili

800 700 600 500 400 300 200 100 о

as

лодыжечно-плечевои индекс

.......................... *_______

* р<0,05

1

6 мес

0.44 0.42

0.40

(п = 15) 1,оход"°

lili

(п = 15) исходно 1 мес Змее 6мес Я дистанция безболевой ходьбы И максимальная дистанция ходьбы

лодыжечно-плечевои индекс

Рис. 7. Динамика функциональных показателей на фоне генной терапии и стандартного лечения

В группе клеточной терапии через 3 мес. после лечения ДББХ увеличивалась более чем в 2 раза, а ЛПИ - в 1,5 раза; изменения были статистически значимыми, однако малое число больных не позволяет проводить сравнение с контрольной группой (рис. 8).

А. уровень лейкоцитов крови

Б. функциональные показатели

°г г V!

4 5 7 9 11 14

днилечения

исходно через 3 мес.

э)

-■-ДББХ -»-МДХ -*-ЛПИ

Рис. 8. Динамика уровня лейкоцитов крови (А) и функциональные показатели (Б) на фоне клеточной терапии

А. Показаны уровни лейкоцитов крови для каждого из больных, получавших клеточную терапию, в течение первых 14 сут. лечения. Красными стрелками обозначены дни инъекций С■ (.'МГ, двойная красная черта - процедураафереза ыононуклеарной фракция крови.

Б. Приведены средние значения ДББХ, МДХ и ЛПИ в группе клеточной терапии до и через 3 мес. после лечения.

Ангиография нижних конечностей. У больных в группах терапевтического ангиогенеза через 3 мес. наблюдалось снижение индекса коллатерального сопротивления на 17%. Средний балл, характеризующий развитие коллатералей, вырос на 38%, с 1,12 до 1,55. Среднее число видимых коллатералей также увеличилось - на 35%, до 15,1±1,4 (рис.

9).

20 400

18 16 14 12 10 8

(п=20)

* р<0,05

350 300 250 200 150

исходно

■ коллшерали

3 мес. -копл. сопротивление

Рис. 9. Динамика показателей коллатерального кровообращении через 3 мес. после генной терапии

Следует отметить наличие достоверной обратной корреляции между величиной коллатерального индекса после лечения и такими показателями, как число выкуриваемых

сигарет (r=-0.635, р<0,05) и наличием проходимого подвздошного сегмента (г=0.536, р<0,05).

Сцинтиграфия нижних конечностей. Показатели перфузии голени и бедра в группе пациентов были достоверно ниже, чем среди здоровых добровольцев, в среднем, на 25%. Через 3 месяца перфузия достоверно возрастала только у больных, получавших Корвиан: в среднем на 7,3% для бедра и на 7,8% для голени.

МРТ нижних конечностей. В ответ на нагрузку в условиях хронической ишемии достоверного прироста перфузии не происходило, наблюдалась даже тенденция к снижению уровня перфузии на 5,3%. При этом артериальный кровоток при нагрузке достоверно возрастал на 14%. У больных, получавших Корвиан, через 3 месяца после лечения перфузия мышц и кровоток в покое остались прежними, в то же время показатель перфузии мышц при нагрузке достоверно вырос на 21% по сравнению с аналогичным показателем до лечения, и наблюдалась явная тенденция к увеличению кровотока при нагрузке на 14% (р=0,07) (рис. 10). Прирост кровотока в ответ на нагрузку увеличился с 14% до 43%, однако эта тенденция не достигла уровня статистической значимости. В контралатеральной конечности, куда не проводилось инъекций Корвиана, через 3 месяца после лечения показатели перфузии мышц и кровотока, как покое, так и при нагрузке, не продемонстрировали значимой динамики.

А_ КРОВОТОК ПО АРТЕРИЯМ ГОЛЕНИ в ПЕРФУЗИЯ МЫШЦ ГОЛЕНИ

100 80 60 40 20

° „ * р<0.05 --------*р<0,05

(п=20) исходно Змее исходно Змее

■ покой и нагрузка (п-20) ■ покой ■ нагрузка

Рис. 10. Кровоток по артериям голени (А) и перфузия мьшщ голени (Б) в покое и при нагрузке в у больных, получавших Корвиан

А. Кровоток по артериям голени в ответ на ншрузху значимо возрастал на14% до лечения и на 43% через 3 мес. после введения Корвиана.

Б. Уровень перфузии мышц голени при нагрузке достоверно возрастал на фоне терапии Корвианом на 21%.

* i * Т 16.00 * Л

НИ

Транскутанная оксиметрия. Исходно напряжение кислорода было снижено в среднем в 2 раза по сравнению с нормой. На фоне лечения наблюдался достоверный прирост показателя как в положении лежа, так и в положении сидя, и только у больных в группах терапевтического ангиогенеза (рис. 11).

А Б

исходно 3 мес

(ч=25) * р<0,05

■ Тср02 лежа ■ Тср02 сидя

исходно Змее

(п=20) Р=тс

■ ТсрОЭ лежа в Тср02 сидя

Рис. 11. Динамика транскутанного напряжения кислорода на фоне терапевтического ангиогенеза (А) и стандартного лечения (Б)

Циркулирующие ЭКП. Через 1 и 3 мес. после введения Корвиана наблюдалось увеличение уровня циркулирующих С034+СБ133+ ЭКП, но не СЭ34+кс1г+ ЭКП. Содержание других фракций прогениторных клеток не претерпело достоверных изменений.

На фоне клеточной терапии значительно повышался уровень незрелых гематопоэтических предшественников, что вероятнее всего являлось следствием введения О-СЭР. Количество циркулирующих С034+СБ133+ЭКП возрастало в 30 раз. Достоверного прироста уровня СВ34+кс1г+ЭКП не отмечалось.

В группе стандартной терапии значимых изменений уровня циркулирующих прогениторных клеток отмечено не было. Отмечалась тенденция к росту количества СВ34-СВ133+ ЭКП к 3 мес. после лечения на 20%, не достигавшая статистической значимости.

У больных с хорошим ответом на терапию Корвианом исходный уровень СБ34+С0133+ЭКП был в 2,12 раза выше, чем у пациентов, не ответивших на терапию (рис. 12). При этом прирост ЛПИ через 3 мес. от начала терапии коррелирует с исходным уровнем С034+СБ133+ЭКП как в группе генной терапии (г = 0,68, р<0,05), так и в группе клеточной терапии (г = 0.97, р = 0,008).

SSO 550

es

03

о о.

* 450 С

О

£ 350

<а ю о а

250 150

(п=20)

Рис. 12. Зависимость эффекта лечения в группе генной терапии от исходного уровня циркулирующих CD4510W/-CD34+CD133+ ЭКП

Предикторы эффективности терапевтического ангиогенеза. По данным однофакторного анализа, хороший эффект терапии Корвианом ассоциирован с проходимым аортоподвздошным сегментом, меньшей длительностью курения, более высоким исходным лодыжечно-плечевым индексом и меньшей давностью симптомов (табл. 2).

Таблица 2. Показатели, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза, по данным однофакторного анализа.

г Р

Проходимый подвздошный сегмент 0,505 0,02

Стаж курения -0,485 0,037

ЛПИ до лечения 0,477 0,033

Давность анамнеза Г1Х -0,579 0,007

По данным многофакторного логистического регрессионного анализа и построения простой модели линейной регрессии, независимыми предикторами эффективности терапии по шкале Рутерфорда оказались наличие проходимого подвздошного сегмента (|3=0,418; р=0,038) и меньшая давность анамнеза ПХ (Р=-0,426; р=0,035).

А

1. * Р<0,05

о г* клинический эффект по Рутерфорду

Выводы

1. Содержание циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников в крови больных ИБС и больных ХИНК достоверно снижено по сравнению с лицами без клинических проявлений атеросклероза, величина этого снижения прямо пропорциональна степени тяжести заболевания.

2. У больных ИБС и больных ХИНК имеется прямая зависимость между уровнем циркулирующих ЭКП и степенью развития коронарных и периферических коллатералей по данным ангиографии.

3. Через 6 мес. после выполненной коронарной реваскуляризации содержание ЭКП в крови больных ИБС возрастает на 99%, в аналогичные сроки после реваскуляризации нижних конечностей у больных ХИНК наблюдается рост уровня ЭКП на 35%. Степень прироста уровня ЭКП после реваскуляризации зависит от отягощенности пациента по факторам риска сердечно-сосудистых осложнений, а у больных ХИНК - также от стадии заболевания и объема реваскуляризации.

4. Уровень циркулирующих ЭКП у больных ХИНК значимо повышается на фоне терапевтического ангиогенеза с помощью генной и клеточной терапии и возвращается к исходному уровню в течение 6 мес. Стандартная консервативная терапия при ишемии нижних конечностей не вызывает прироста уровня циркулирующих ЭКП.

5. Использование генной терапии препаратом Корвиан (плазмидной конструкции, содержащей ген \' ЕСГ) у больных с ХИНК безопасно и приводит к значимому улучшению клинического статуса по шкале Рутерфорда, дистанции ходьбы и показателей перфузии конечностей, а также показателей коллатерального кровообращения. Применение генной терапии дает более выраженный лечебный эффект, чем стандартная консервативная терапия.

6. Наилучший эффект терапевтического ангиогенеза препаратом Корвиан наблюдается у пациентов с менее длительным анамнезом перемежающейся хромоты, с проходимым подвздошно-бедренным сегментом, имеющих более высокий исходный ЛПИ и меньший стаж курения. Больные с хорошим эффектом ангиогенной терапии имеют более высокий исходный уровень циркулирующих ЭКП по сравнению с больными, не ответившими на терапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение уровня циркулирующих ЭКП наряду с оценкой проходимости подвздошно-бедренного сегмента, ЛПИ и данных анамнеза (длительности перемежающейся хромоты и стажа курения) рекомендуется проводить при отборе больных ХИНК для участия в клинических испытаниях терапевтического ангиогенеза с помощью генной терапии и прогнозирования эффективности данного метода лечения.

2. Выявленные в работе взаимосвязи позволяют определять больных ХИНК, у которых ожидается низкая эффективность терапевтического ангиогенеза, что следует учитывать при разработке дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий, направленных на стимуляцию ангиогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Талицкий К.А., Карпов Ю.А., Парфенова Е В.Терапевтический ангиогенез в лечении ишемии нижних конечностей. //Кардиология 2007, №12, с.81-84.

2. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О Н., Балахонова Т В., Самко А Н., Левицкий И.В., Филатов Д.Н., Сергиенко В.Б., Стукалова О.В., Елисеев А О., Кухарчук В В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А.Циркулирующие прогениторные клетки в условиях стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей.//Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения. Под ред. В.А.Ткачука. М., Литгерра, 2009. С. 163-175.

3. К.А. Талицкий, О С. Булкина, Т.И Арефьева, О Н. Воробьева, ИВ. Левицкий, А.А. Федорович, ПИ. Макаревич, ЕВ. Парфенова, Ю.А. Карпов. Эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; т. VI, № 3, с. 1-10.

4. Шевченко Е.К., Талицкий А.К., Парфенова ЕВ.Перспективы повышения эффективности генной и клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний: генетически модифицированные клетки. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010: 5(2): 19-28.

5. Traktuev DO, Tsokolaeva ZI, Shevelev A A, Talitskiy KA, Stepanova VV, Johnstone BH, Rahmat-Zade TM, Kapustin AN, Tkachuk VA, March KL, Parfyonova YV. Urokinase gene transfer augments angiogenesis in ischemic skeletal and myocardial muscle. Mol Ther. 2007; 15(11):1939-46.

6. Talitskiy K., Arefieva Т., Samko A., Parfyonova Ye., Karpov Yu. Decreased level of circulating endothelial progenitor cells in patients with stable angina is partially restored after coronary revascularization. //New approaches In coronary Artery disease. Proceedings of the 8th international congress on Coronary artery disease Prague (Czech Republic), October 1114, 2009. MEDIMOND S.r.l. Bologna, 2009. p. 39-43.

7. Талицкий K.A., Булкина О С., Арефьева Т.И., Воробьева О Н., Балахонова Т В., Самко АН., Филатов Д.Н., Елисеев А О., Кухарчук В В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А. Применение терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних

8. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О.Н., Балахонова Т.В., Самко А.Н., Филатов Д.Н., Елисеев А.О., Кухарчук В.В., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А. Циркулирующие прогениторные клетки в условиях стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Всероссийская научная школа-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (МГУ им. М.В.Ломоносова) 21-23.09.2009. Сборник тезисов. - Москва, 2009. с. 12.

9. К. А. Талицкий, О. С. Булкина, О. Н. Воробьева, И. В. Левицкий, Е. В. Парфенова, Ю. А. Карпов. Применение стимулятора ангиогенеза Корвиана у больных с хронической ишемией нижних конечностей. //Всероссийская конференция «Фундаментальные и клинические аспекты изучения ангиогенеза. Подходы регенеративной медицины», Сборник тезисов. М., 2011. с. 21

10. Talitskiy К.A, Bulkina O S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.N., Filatov D.N., Zotikov A.E., Pokrovskiy A.V., Eliseev A.O., Kuharchuk V.V., ParfyonovaYe. V., KarpovYu.A. Decreased level of circulating endothelial progenitor cells in patients with hypertension and chronic limb ischemia can be restored after stem cell therapy or vascular surgery. 19th European Meeting on Hypertension. Milan, June 12 - 16, 2009. //Journal of Hypertension. 2009; 27(Suppl. 4): S91.

11. Talitskiy K.A, Bulkina O S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.N., Filatov D.N., Eliseev A.O., Kuharchuk V.V., Parfyonova Ye.V., KarpovYu.A. Circulating progenitor cells after angiogenic gene therapy or stem cell therapy in patients with chronic limb ischemia. //Regenerative Medicine. 2009; 4(6): Suppl. 2, p. S293.

12. Talitskiy K.A, Bulkina O.S, Arefieva T.I., Vorobieva O.N., Balakhonova T.V., Samko A.M., Filatov D.N., ParfyonovaYe.V., KarpovYu.A. Direct comparison of angiogenic gene therapy and stem cell therapy in patients with chronic limb ischemia. //Atherosclerosis Supplements. 2010; 11 (2): 179.

13. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, O. Vorobieva, T. Balakhonova, A. Samko, I. Levitskiy, D. Filatov, O. Stukalova, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Blood pressure response and higher count of circulating endothelial progenitors predict angiogenic gene therapy effectiveness in

14. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, A. Samko, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Predictors of angiogenic therapy effectiveness in hypertensive patients with chronic limb ischemia. //J. Hypertens. 2011; Vol. 29, e-Supplement A, p. e277.

15. K. Talitskiy, O. Bulkina, A. Fedorovich, A. Samko, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Angiogenic therapy in hypertensive patients with chronic limb ischemia improves microcirculation and promotes collateral formation. //J. Hypertens. 2011; Vol. 29, e-Supplement A, p. e201.

16. K. Talitskiy, O. Stukalova, O. Bulkina, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Magnetic resonance imaging is useful for the estimation of therapeutic angiogenesis effect in patients with chronic limb ischemia. //J. Am. Coll. Cardiol. 2012; 59; E2069.

17. K. Talitskiy, O. Bulkina, T. Arefieva, Y. Parfyonova, Y. Karpov. Predictors of angiogenic therapy effectiveness in patients with chronic limb ischemia. //J. Am. Coll. Cardiol. 2012; 59; E2062.

Подписано в печать 12 сентября 2012 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 140912442

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http://www.imiverprint.ru

Актуальность проблемы.Ангиогенез является естественной реакцией организма на ишемию, направленной на восстановление кровоснабжения ишемизированной ткани. При ишемических поражениях у человека компенсаторный ангиогенез, как правило, оказывается недостаточным для сохранения адекватной перфузии. Механизмы этого окончательно не выяснены, к числу причин относят, в частности, нарушение продукции ряда ангиогенных факторов роста ишемизированными тканями, снижение численности и функциональной активности эндотелиальных клеток-предшественников (ЭКП). Эндотелиальные клетки - предшественники (ЭКП) представляют собой популяцию прогениторных клеток, выделяемых из крови и костного мозга, которые экспрессируют поверхностные маркеры, специфичные как для незрелых гематопоэтических клеток, так и для эндотелия, и дифференцируются в клетки эндотелиальной линии. В ряде исследований, в том числе выполненных сотрудниками РКНПК, было установлено, что снижение уровня циркулирующих прогениторных клеток коррелирует с уровнем сердечно-сосудистого риска и маркерами эндотелиальной дисфункции (Urbich, Dimmeier, 2005; Руда и др., 2008). Дисфункция системы ЭКП усугубляется по мере увеличения риска сердечнососудистых осложнений: снижается количество ЭКП в периферической крови и их функциональная активность, что в экспериментальных работах ассоциируется с ослаблением компенсаторного ангиогенеза (Urbich, Dimmeier, 2004).

Компенсаторный ангиогенез при ИБС оказывает влияние на прогноз. В клиническом исследовании Choi et al. (2005) была продемонстрирована обратная связь между количеством коронарных коллатералей у больных ИБС, страдающих сахарным диабетом, и риском сердечно-сосудистых осложнений при дальнейшем наблюдении. В когортных исследованиях показано, что плохое развитие коронарных коллатералей наблюдается при повышенном уровне С-реактивного белка (Gulec et al., 2006), гомоцистеина (Yang et al., 2006), оксидативном стрессе (Demirbag et al., 2006), почечной недостаточности (Sezer et al., 2006); при этих состояниях содержание ЭКП в крови также снижено (Callaghan et al., 2005; Chen et al., 2004;vanGrevenynghe et al., 2006; Verma et al., 2004). Увеличение количества коронарных коллатералей наблюдалось на фоне терапии статинами (Dincer et al., 2006). Данный эффект может быть связан с ранее обнаруженной способностью статинов стимулировать дифференцировку CD34+ гематопоэтических предшественников в направлении ЭКП (Vasa et al., 2001). В работе Lev et al. (2005) была показана связь коллатерального индекса с уровнем циркулирующих ЭКП у больных с острым коронарным синдромом.У больных хронической ИБС, ишемией нижних конечностей такая связь не исследовалась, хотя известно, что уровень циркулирующих ЭКП у них снижен (Urbich, Dimmeler, 2004, 2005).Поскольку при остром коронарном синдроме наблюдается усиленный выход ЭКП из костного мозга в кровь, результаты работы Lev и соавт. не могут быть автоматически перенесены на популяцию хронических больных, необходимо проведение специально спланированного исследования, которое позволит выявить взаимосвязь содержания различных фракций циркулирующих ЭКП с коллатеральным ангиогенезом, традиционными факторами риска и клиническим течением заболевания у больных хронической ИБС и хронической ишемией нижних конечностей. Кроме того, остается практически неизученным вопрос о влиянии различных методов реваскуляризации на уровень ЭКП в крови.

Ишемические поражения нижних конечностей занимают важное место в структуре сердечно-сосудистой заболеваемости. Периферический атеросклероз является главной причиной ишемии нижних конечностей и ассоциирован с 3-6-кратным повышением сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности. Распространенность ишемии нижних конечностей в популяции старше 50 лет составляет 5-8%, а при наличии таких факторов риска, как гиперлипидемия, курение, артериальная гипертония или сахарный диабет, достигает 30% (Hirsch et al., 2005). Ишемия нижних конечностей представляет серьезную медицинскую и социальную проблему в связи с частой инвалидизацией и высокой смертностью больных, недостаточной эффективностью существующих методов лечения, особенно при распространенном поражении артериального русла нижних конечностей, что делает актуальным поиск новых терапевтических технологий (Rutherford et al., 1997; Clagett et al., 2004).

Терапевтический ангиогенез - лечение, направленное на стимуляцию роста новых сосудов в ишемизированных тканях с помощью ангиогенных факторов роста, их генов или стволовых и прогениторных клеток - рассматривается как перспективный метод лечения пациентов с рефрактерной ишемией нижних конечностей, позволяющий улучшить перфузию конечности, уменьшить ишемические симптомы и в ряде случаев предотвратить ампутацию. В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях, проведенных в ведущих медицинских центрах мира, было показано, что введение в ишемизированные мышцы или в сосуды нижних конечностей факторов роста или их генов стимулирует ангио-артериогенез, улучшает перфузию тканей и уменьшает симптоматику, обусловленную ишемией (Талицкий и др., 2007). Наиболее изученным на сегодняшний день является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) - основной регулятор ангиогенеза как в эмбриогенезе так и в постнатальном периоде развития организма. Генетические конструкции, содержащие ген YEGF, прошли 2 фазу клинических испытаний в нескольких медицинских центрах США, Европы и Азии, показавших хорошую переносимость, безопасность применения подобных генетических конструкций как при введении в ишемизированные мышцы конечностей, так и при введении в миокард у больных ИБС (Baumgartner et al., 1998; Simovic et al., 2001; Makinen et al., 2002; Rajagopalan et al., 2003; Shyu et al.,

2003; Kim et al., 2004; Kusumanto et al., 2006; Бокерия и соавт., 2006; Швальб и соавт., 2011).

Важнейшим свойством ЭКП является их способность дифференцироваться в клетки эндотелиальной линии. Экспериментальным путем было установлено, что в определенных условиях ЭКП также могут дифференцироваться в гладкомышечные клетки и кардиомиоциты (Badorff et al., 2003; Shoji et al., 2004). Эти сведения открывают перспективы использования ЭКП, выделенных из наиболее доступных источников, например периферической крови, в клеточной терапии и терапевтическом ангиогенезе. Аутотрансплантация циркулирующих прогениторных клеток крови все чаще рассматриваются в качестве перспективного средства при рефрактерной ишемии. В пилотных клинических исследованиях аутотрансплантация мононуклеарной фракции крови при острой и хронической ишемии нижних конечностей приводит к значимой стимуляции коллатерального ангиогенеза, улучшению перфузии конечности и клинического течения заболевания (Kawamura et al., 2005; Lenk et al., 2005; Huang et al., 2005).

Лечебный эффект процедур терапевтического ангиогенеза связывают с СБ34+прогениторными клетками, в том числе эндотелиальными клетками-предшественниками (ЭКП), мобилизуемыми из костного мозга, которые, помимо секреции ангиогенных факторов роста, могут дифференцироваться в эндотелиоциты (Urbich, Dimmeier, 2004). При периферическом атеросклерозе отмечается существенное уменьшение количества циркулирующих ЭКП со снижением их жизнеспособности и функциональной активности (Yamamoto et al., 2004), что может оказывать влияние на эффективность терапевтического ангиогенеза (DeVriese et al., 2008). Вместе с тем, на сегодняшний день остается неясным, какая из популяций прогениторных клеток вносит основной вклад в развитие лечебного эффекта при терапевтическом ангиогенезе (Sieveking, Ng, 2009; Ishida et al., 2005). Учитывая ключевую роль эндотелиальных предшественников и ангиогенных факторов роста в процессах ангиогенеза, их содержание в крови больных может отражать динамику ангиогенной стимуляции и быть одним из доступных для изучения факторов, влияющих на общую эффективность ангиогенной терапии.

В лаборатории молекулярной эндокринологии (рук. - академик В.А. Ткачук) и лаборатории ангиогенеза (рук. - проф. д.м.н. Е.В.Парфенова) ИЭК РКНГЖ был разработан препарат «Корвиан» - плазмидная конструкция, содержащая ген УЕОБ. Результаты проведенных токсикологических и общефармакологических испытаний препарата показали отсутствие токсичности и его безопасность при введении лабораторным животным, а доклинические исследования на моделях ишемии конечностей и инфаркта миокарда продемонстрировали его эффективность в стимуляции ангио-артериогенеза и регенеративных процессов в тканях (ТгакШеу е1 а1., 2007).

Вместе с тем, эффективность процедур терапевтического ангиогенеза в целом остается ограниченной. Принимая во внимание ключевую роль ЭКП в ангиогенезе, представляется актуальным исследовать связь циркулирующих ЭКП с состоянием коллатерального ангиогенеза, показателями ишемии и эффективностью ангиогенных вмешательств.

Цель исследования- исследовать связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников с состоянием коллатерального кровообращения, клиническим течением заболевания и процедурами терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ИБС и хронической ишемией нижних конечностей.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи: 1. Оценить взаимосвязь содержания циркулирующих ЭКП с факторами сердечно-сосудистого риска, состоянием коллатерального кровоснабжения и клиническим течением заболевания в ходе проспективного наблюдения у больных со стабильной стенокардией напряжения и больных с ишемией нижних конечностей атеросклеротического происхождения.

2. У части больных - исследовать динамику уровня ЭКП в крови до и после выполнения реваскуляризации, выяснить взаимосвязь выраженности ишемии и количества ангиографически визуализируемых коллатералей с уровнями циркулирующих ЭКП.

3. У больных с тяжелой ишемией нижних конечностей, которым не планируется выполнение процедур реваскуляризации, оценить эффект местного введения мононуклеарной фракции собственной крови больного, обогащенной эндотелиальными клетками-предшественниками, на функциональный статус, уровни циркулирующих ЭКП, маркеров ангиогенеза, и показатели кровоснабжения нижних конечностей.

4. Провести клиническое исследование безопасности и эффективности внутримышечного введения препарата «Корвиан» (плазмидной конструкции, содержащей ген УЕвР), у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (РоггёатеНб-Ш), которые не являются кандидатами для выполнения процедур реваскуляризации.

5. Изучить связь уровней циркулирующих ЭКП, клинических, лабораторных и инструментальных показателей с результатами терапевтического ангиогенеза.

Научная новизна

1. Впервые установлено, что на фоне клеточной терапии с использованием стимулированной мононуклеарной фракции крови и генной терапии плазмидной конструкцией с кДНК сосудисто-эндотелиального фактора роста наблюдается значимое повышение циркулирующей популяции С034+133+ ЭКП, а после эндоваскулярной реваскуляризации у больных ИБС и больных хронической ишемией нижних конечностей - значимое повышение циркулирующей популяции СОЭ4+ кс!г+ ЭКП.

2. Впервые выявлена связь уровня циркулирующих ЭКП с показателями коллатерального кровотока при хронической ИБС и хронической ишемии нижних конечностей: у больных с хорошо развитыми коллатералями количество циркулирующих ЭКП было в 1,5-5 раз выше, чем у больных с плохо развитыми коллатералями.

3. Впервые продемонстрировано, что добавление к стандартной консервативной терапии генной терапии препаратом «Корвиан» (плазмидной конструкцией с кДНК сосудисто-эндотелиального фактора роста) дает более выраженный лечебный эффект у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, чем стандартная консервативная терапия.

4. Впервые установлена связь уровня циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников с эффективностью генной терапии препаратом «Корвиан», направленной на стимуляцию ангиогенеза у больных хронической ишемией нижних конечностей: у больных, хорошо ответивших на терапию (+2 по Рутерфорду), уровень циркулирующих С034+С0133+ ЭКП был более чем в два раза выше, чем у больных, не ответивших на терапию.

5. Впервые установлены предикторы эффективности терапевтического ангиогенеза препаратом «Корвиан» у больных с хронической ишемией нижних конечностей: проходимый аортоподвздошный артериальный сегмент и меньшая длительность анамнеза перемежающейся хромоты.

Практическая значимость.

В работе было установлены факторы, определяющие эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей, и предложен подход к определению ожидаемой величины лечебного эффекта. Полученные в работе результаты важны для разработки дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий для терапевтического ангиогенеза, для определения подходов к повышению эффективности новых методов лечения тяжелой хронической ишемии, направленных на стимуляцию ангиогенеза.

Внедрение результатов работы.

Полученные в работе результатыприменются при разработке дизайна и планировании клинических испытаний новых препаратов для терапевтического ангиогенеза, проводимых в отделе ангиологии НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова РКНПК МЗ РФ.

Публикации.

Основные положения работы отражены в 16 печатных работах в центральных медицинских журналах, материалах конференций и съездов (из них 3 статьи и 1 глава в монографии).

Работа изложена на 175страницах, содержит рисунков - 8, таблиц - 16, диаграмм -31.

ВЫВОДЫ

1. Содержание циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников в крови больных ИБС и больных ХИНК достоверно снижено по сравнению с лицами без клинических проявлений атеросклероза, величина этого снижения прямо пропорциональна степени тяжести заболевания.

2. У больных ИБС и больных ХИНК имеется прямая зависимость между уровнем циркулирующих ЭКП и степенью развития коронарных и периферических коллатералей по данным ангиографии.

3. Через 6 мес. после выполненной коронарной реваскуляризации содержание ЭКП в крови больных ИБС возрастает на 99%, в аналогичные сроки после реваскуляризации нижних конечностей у больных ХИНК наблюдается рост уровня ЭКП на 35%. Степень прироста уровня ЭКП после реваскуляризации зависит от отягощенности пациента по факторам риска сердечно-сосудистых осложнений, а у больных ХИНК - также от стадии заболевания и объема реваскуляризации.

4. Уровень циркулирующих ЭКП у больных ХИНК значимо повышается на фоне терапевтического ангиогенеза с помощью генной и клеточной терапии и возвращается к исходному уровню в течение 6 мес. Стандартная консервативная терапия при ишемии нижних конечностей не вызывает прироста уровня циркулирующих ЭКП.

5. Использование генной терапии препаратом «Корвиан» (плазмидной конструкции, содержащей ген УЕОБ) у больных с ХИНК безопасно и приводит к значимому улучшению клинического статуса по шкале Рутерфорда, дистанции ходьбы и показателей перфузии конечностей, а также показателей коллатерального кровообращения. Применение генной терапии дает более выраженный лечебный эффект, чем стандартная консервативная терапия.

6. Наилучший эффект терапевтического ангиогенеза препаратом «Корвиан» наблюдается у пациентов с менее длительным анамнезом перемежающейся хромоты, с проходимым подвздошно-бедренным сегментом, имеющих более высокий исходный ЛПИ и меньший стаж курения. Больные с хорошим эффектом ангиогенной терапии имеют более высокий исходный уровень циркулирующих ЭКП по сравнению с больными, не ответившими на терапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение уровня циркулирующих ЭКП наряду с оценкой проходимости подвздошно-бедренного сегмента, ЛПИ и данных анамнеза (длительности перемежающейся хромоты и стажа курения) рекомендуется проводить при отборе больных ХИНК для участия в клинических испытаниях терапевтического ангиогенеза с помощью генной терапии и прогнозирования эффективности данного метода лечения.

2. Выявленные в работе взаимосвязи позволяют определять больных ХИНК, у которых ожидается низкая эффективность терапевтического ангиогенеза, что следует учитывать при разработке дизайна клинических испытаний новых препаратов и технологий, направленных на стимуляцию ангиогенеза.