Автореферат и диссертация по медицине (14.01.26) на тему:ГЕННОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ИНДУКЦИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ

005534833

На правах рукописи

■(^пЛл-Сс^.

МЖАВАНАДЗЕ НИНА ДЖАНСУГОВНА

ГЕННОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ИНДУКЦИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ

14.01.26 - сердечно-сосудистая хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ОК'Г 2013

Рязань-2013

005534833

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Калинин Роман Евгеньевич Научный консультант:

Кандидат медицинских наук Деев Роман Вадимович Официальные оппоненты:

Батрашов Владимир Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор

- ФГБУ «Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И.Пирогова» Минздрава России, профессор кафедры грудной и сердечно-сосудистой хирургии;

Казаков Андрей Юрьевич, доктор медицинских наук, доцент

- ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава России, доцент кафедры сердечно-сосудистой хирургии

Ведущая организация:

ФГБУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского» Минздрава России

Защита диссертации состоится «01» ноября 2013 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.123.01 при ФГБУ «Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (105203, г. Москва, ул. Нижняя Первомайская, д.70).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института усовершенствования врачей ФГБУ «Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (105203, г. Москва, ул. Нижняя Первомайская, д.65).

Автореферат разослан «30» сентября 2013 г.

Ученый секретарь совета по защите Диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, ученой степени доктора наук доктор медицинских наук, профессор

Матвеев С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Хроническая ишемия нижних конечностей (ХИНК) является актуальной проблемой сердечно-сосудистой хирургии. Общая распространенность заболеваний периферических артерий (ЗПА), вызывающих ХИНК, составляет 12-14%, превышая 20% среди больных старше 70 лет [SAGE group, 2010; PANDORA, 2012]. Атеросклероз - причина ЗПА в 80-90% случаев [Оболенский В.Н. и соавт., 2010]. У приблизительно 40% пациентов, нуждающихся в оперативном лечении, артериальные реконструкции невыполнимы вследствие дистального, либо распространенного мультифокального поражения артериального русла. При декомпенсации артериального кровотока к концу первого года лишь 45% больных имеют шанс сохранения конечности, 30% продолжают жить после ампутации бедра или голени, 25% - умрут [Покровский В.А. и соавт., 2013].

Терапевтическое лечение показано всем пациентам с ХИНК и назначается пожизненно. Имеющийся арсенал средств не является исчерпывающим: препарат с самыми высокими классом и уровнем доказательности цилостазол на территории России не зарегистрирован и противопоказан пациентам с нарушением ритма сердца и хронической сердечной недостаточностью (ХСН) [European Medicines Agency, 2013].

Принципиально новым подходом к лечению ХИНК служит терапевтический ангиогенез (ТА) — тактика улучшения перфузии шемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации, развивающийся по трем магистральным направлениям: использование генных, клеточных и постгеномных технологий. Основоположниками ТА в России являются акад. РАМН ЮЛ.Шевченко и Л.А.Бокерия, член.-корр. РАМН Г.Г.Хубулава, профессор С.А.Матвеев, внесшие ценный вклад в становление и разработку технологий ТА в лечении ишемической болезни сердца, ХСН и ХИНК. В предыдущие годы д.б.н. М.В.Еремеевой и к.м.н. О.А.Демидовой проводились исследования эффективности и безопасности различных генных конструкций

в лечении ХИНК на ограниченном количестве пациентов. Методы клеточной терапии и постгеномных технологий в лечении ХИНК находятся на преимущественно экспериментальной стадии своего развития.

Проблема восстановления и поддержания кровообращения в дистальных сегментах при ХИНК сегодня рассматривается в том числе с точки зрения геннотерапевтической индукции неоангиогенеза, направленной на активацию эндотелиальных клеток, последующую их стабилизацию, «функциональное ремоделирование» сосудистой стенки и организацию в сложную сосудистую сеть.

Цель исследования: улучшение результатов лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий по классификации A.B. Покровского-Фонтейна при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Задачи исследования:

1. Оценить ангиогенные свойства геннотерапевтической конструкции р-vegfl 65 в эксперименте на животных.

2. Определить безопасность и эффективность применения геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну).

3. Оценить отсроченные (2 года) результаты применения геннотерапевтической конструкции p-veg/"165 в комплексной терапии у пациентов, вошедших в исследование.

4. Сформулировать и обосновать показания к применению геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии различных группах пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии.

Научная новизна. Впервые проведены экспериментальное исследование на модели хронической ишемии задних конечностей у

животных и клиническое исследование эффективности и безопасности применения геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии (Па-Шстадий по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Результатом стало получение государственной регистрации на территории Российской Федерации первого геннотерапевтического препарата на основе ДНК-плазмид с геном VEGF165 «Неоваскулген» в 2011 году.

Практическая значимость работы.

1. Результаты исследования позволяют расширить представление о патогенезе хронической ишемии нижних конечностей и процессах новообразования сосудов, что аргументирует разработку новых способов комплексного лечения заболевания, направленных на индукцию неоангиогенеза.

2. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых подходов к комплексному лечению хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств;

3. Экспериментальные и клинические данные могут дать предпосылку к применению геннотерапевтической индукции неоангиогенеза в комплексном лечении хронической ишемии нижних конечностей при диабетической ангиопатии и облитерирующем тромбангиите, а также лечении критической ишемии нижних конечностей.

Внедрение результатов в практику. Результаты исследования внедрены в клиническую практику в области ангиологии и сосудистой хирургии на территории России с 2011 года после государственной регистрации геннотерапевтической конструкции p-veg/165 под торговым названием «Неоваскулген», в лечебный процесс ГБУ Рязанской Области «Областной клинический кардиологический диспансер», а так же в учебный процесс кафедр сердечно-сосудистой хирургии ГБОУ ВПО Тверской ГМА

Минздрава России и ангиологии, сосудистой, оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на симпозиуме «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (г. Москва, 2012), 23-й (XXVIII) Международной конференции Российского Общества Ангиологов и сосудистых хирургов (г. Санкт-Петербург, 2012), Научно-практической конференции Рязанского Государственного Медицинского Университета имен. акад. И.П. Павлова, посвященной Дню аспиранта (г. Рязань, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Здравоохранение: образование, наука, инновации" (г. Рязань, 2013), Инаугуральной Конференции Европейского Общества Сосудистых Хирургов (Е8У8) "Сосудистая биология, материалы и инженерия" (г. Франкфурт-на-Майне, Германия, 2013), II Всероссийской Научно-практической конференциис международным участием «Угловские чтения: Инновации в хирургии» (г. Санкт-Петербург, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Стандартная комплексная терапия хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической этиологии не является исчерпывающей с позиции влияния на клиническую симптоматику, что требует дополнительных методов лечения.

2. Геннотерапевтическая индукция ангиогенезаплазмидной конструкцией р-уе,§/165 в комплексном лечении хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротической способствует значительному приросту дистанции безболевой ходьбы.

3. Геннотерапевтическая индукция ангиогенезаплазмидной конструкцией р-уе,§/165 не вызывает развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований.

4. Геннотерапевтическая индукция ангиогенезаплазмидной конструкцией р-

в составе комплексного лечения показана пациентам с хронической

ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Па-Ill стадий по классификации A.B. Покровского-Фонтейна при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, экспериментальной и клинической частей с изложением и оценкой результатов собственных исследований, глав, посвященных оценке эффективности и безопасности применения геннотерапевтической индукции неоангиогенеза в отдаленном периоде, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающего 84 отечественных и 250 зарубежных источников. Материал иллюстрирован 45 рисунками, 49 таблицами, 11 из которых - в разделе приложение, и 4 клиническими примерами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В диссертационной работе проведено исследование геннотерапевтической конструкции, представляющей собой сверхскрученную форму плазмиды p-veg/165, кодирующую эндотелиальный сосудистый фактор роста изоформы VEGF165. Диссертационное исследование разделено на экспериментальный и клинический этапы.

Экспериментальное исследование Экспериментальный раздел диссертационного исследования выполнен в два этапа: на белых беспородных крысах (в условиях вивария ГБОУ ВПО РязГМУ им. акад. И.П.Павлова Минздрава России) и на иммунодефицитных мышах линии CD-I (в условиях вивария и операционной Pharmaceed ltd, Израиль; обработка и оценка гистологического материала произведена в ходе настоящего исследования).

В рамках 1 этапа выполнено моделирование хронической ишемии тазовых конечностей у белых беспородных крыс массой около 400гр (п=35) возрастом 9-10 месяцев путем лигирования общей подвздошной артерии с последующим разделением животных на 3 группы: 1 группа - изолированное моделирование ишемии; 2 группа - контрольная (введение воды для инъекций); 3 группа - экспериментальная (введение геннотерапевтической конструкции p-veg/165). На 14-е сутки после операции животным контрольной группы в мышцы правой голени выполнялось внутримышечное введение воды для инъекций в объеме 1мл. Через тот же срок крысам экспериментальной серии выполнялось однократное внутримышечное введение конструкции p-veg/165 в дозе 0,2 мг. Тканевый материал, полученный после выведения животных из эксперимента, подвергали гистологической обработке: изготавливали срезы, окрашивали рутинными методами: гематоксилином и эозином, по Маллори.

Второй этап экспериментального исследования проведен на иммунодефицитных мышах линии CD-I (отсутствие Т-лимфоцитов) массой около 27гр в количестве 72 штуки, возрастом 9-10 недель (Harlan Laboratories, Израиль) с целью исключения возможного антигенного влияния человеческого белка, синтезирующегося в ответ на введение в ткани р-veg/165. Проведено моделирование хронической ишемии тазовых конечностей путем лигирования и резекции бедренной артерии целевой конечности. Распределение мышей между группами было следующим: 1 группа - интактные мыши; 2 группа - выполнена модель хронической ишемии тазовых конечностей; 3 группа - в мышечный массив голени целевой конечности вводилось плацебо (вода для инъекций, объем ЮОмкл); 4 группа - в мышечный массив голени целевой конечности вводилась конструкция p-veg/165 в дозировке 200мкг (в виде раствора в воде для инъекций, объем ЮОмкл) в виде двух инъекций, проксимальнее и дистальнее послеоперационной раны. Фиксированный тканевый материал подвергался стандартной гистологической обработке. Полученные препараты

исследовались на микроскопе Leica DM 1000. Морфометрически оценивали количество волокон с центрально-расположенными ядрами (признак репаративной регенерации скелетной мышечной ткани). Для оценки гистофизиологических процессов, развертывающихся в мышце при моделировании ишемии и под воздействием генной конструкции проводили иммуногистохимические исследования (ИГХ). Для оценки пролиферации использованы антитела Ki-67; ангиогенеза (маркеры эндотелиоцитов) -CD31, CD34, aSMA. Последние антитела так же для выявления миофибробластов грануляционной ткани. Все перечисленные реактивы были произведены фирмой «DAKO» (Дания). Для визуализации иммунных комплексов применен Universal LSAB2 «DAKO» (Дания).

Клиническое исследование Клиническое исследование проведено с целью установления эффективности и безопасности применения геннотерапевтической конструкции p-veg/165 у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадии по классификации А.В. Покровского-Фонтейнапри невозможности выполнения реконструктивного вмешательства, выбора режима дозирования и определения показаний к применению p-veg/165. Исследование проведено на кафедре ангиологии, сосудистой, оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России на базе отделения сосудистой хирургии ГБУ РО ОККД г. Рязани в 2009-2013 гг.Общее количество пациентов, включенных в клиническое исследование, составило 94 человека. Критерии включения в исследование: наличие клиники ишемии конечности Ila - III стадий; полная проходимость проксимального артериального русла (подвздошно-бедренный сегмент) исходно или после операции (более 3 месяцев); наличие дистального поражения или анатомо-функциональная недостаточность коллатеральных путей кровотока, препятствующих выполнению реконструктивного вмешательства, что по классификации путей оттока (по Rutherford et al., 1997) соответствовало 7-10

баллам при условии, что 1 балл означает хорошие пути оттока, 10 баллов -изолированный, «слепой» сегмент без магистральных артерий.

Критерии исключения из исследования: наличие язвенно-некротических изменений стопы и голени, декомпенсированного сахарного диабета; обусловленность клиники ХИНК иными, помимо атеросклероза, причинами (болезнь Бюргера и пр.). Все пациенты в рамках клинического исследования получали стандартную терапию (пентоксифиллин 1200мг/сутки, ацетилсалициловая кислота ЮОмг/сутки, внутривенное введение 6% гидроксиэтилированного крахмала №10, 10% депротеинизированного гемодеривата №10).

Клиническое исследование выполнено в два этапа: предварительный и основной. Задача предварительной оценки применения р-ус§/165 - на небольшой группе пациентов оценить безопасность и признаки эффективности при выбранном режиме дозирования. Исследование включало 24 пациента, рандомизированных в 2 группы: группа А - 12 пациентов, которым выполнялось двукратное внутримышечное введение р-ус£/165 в дозе 1,2 мг с интервалом 7 суток и группа В - 12 пациентов, введение р-уе^/165 в дозе 1,2 мг с интервалом 14 суток. Средний возраст пациентов составил 68,8±8,7 лет.

В рамках основного клинического исследования выполнена оценка краткосрочной (3, 6 месяцев) и отдаленной (1, 2 года) эффективности и безопасности применения р-уе,§Д65. 70 пациентов были рандомизированы в 2 группы по 35 человек: клиническую и контрольную.

Пациенты клинической группы помимо стандартной консервативной терапии получали р-уе§П 65 в ходе двукратного внутримышечного (максимально близко к зонам ишемии) введения в дозе 1,2 мг с интервалом между инъекциями 14 дней. Общая продолжительность участия пациентов в исследовании - 2 года, в ходе которых пациенты выполняли 5 визитов.

Распределение пациентов по стадии ишемии и уровню поражения в рамках основного исследования представлено на рисунке 1.

77%

□ III

■ IIa »116

в 14%

i _ вя

^Проксимальное поражение ™ Дистальная окклю зия ОМупьтифокальное поражение

77%

«IIa

11%

"116 6%

□ III

—> —

83%

Ш Прокситальное поражение Ш Дистальная окклюзия □ М ульзиф окальное поражение

Рис. 1. Распределение пациентов по стадии ишемии и уровню поражения в рамках основного исследования: а - по стадии ишемии в клинической группе; б - по стадии ишемии в контрольной группе; в - по уровню поражения в клинической группе; г — по уровню поражения в контрольной группе

Спектр лабораторных тестов в рамках клинического исследования, проводимых на всех визитах, включал общий анализ крови, биохимический анализ крови, коагулограмму и общий анализ мочи.

Выполнялись инструментальные методы обследования:

1. тредмил-тест - определение дистанции безболевой ходьбы (первичный критерий эффективности лечения) по ровной дорожке (угол 0 град.) со скоростью движения дорожки 1 км/час; замерялось время от начала ходьбы до наступления болевых ощущений в мышцах конечностей;

2. ультразвуковая допплеросфигмоманометрия (УЗДСММ) артерий нижних конечностей с определением лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ) - отношения систолического артериального давления (АД) на большеберцовых артериях к АД на плечевой артерии, измеряется в мм. рт. ст.;

3. транскутанное напряжение кислорода (ТКНК) - оценка ТКНК в тканях осуществлялась с помощью прибора ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания); во

время исследования пациент находился в горизонтальном положении на спине с выпрямленными конечностями; показатели регистрировались через 20 мин. после помещения откалиброванного датчика в первом межпальцевом промежутке на тыле стопы;

4. ультразвуковое дуплексное сканирование (УЗДС) артерий нижних конечностей с определением линейной скорости кровотока (J1CK) - исследования выполнялись на аппарате GE Vivid Five, датчик Angiodin-PC;

5. ангиография с контрастированием дистального сосудистого русла (артерии голени и стопы) - проводилась пациентам со Нб и выше стадией заболевания с целью оценки состояния магистрального и периферического русла, а также определения уровня развития коллатералей; ангиография выполнялась на ангиографических установках Philips «Integris V-300», Siemens «Axtom Artis» (Германия) под местной анестезией по методу М. Jadkins с введением катетера в бедренную артерию по S. Seldinger; применялся контраст «Омнипак»;

6. электрокардиография в стандартных и грудных отведениях;

7. ультразвуковое исследование органов брюшной полости, флюорографическое либо рентгенологическое исследование органов грудной полости - выполнялись пациентам через 1 и 2 года после включения в исследования в рамках онкоскрининга.

При статистическом анализе полученных данных учитывались объемы выборок, количество групп, соответствие вида распределения признака в каждой группе закону нормального распределения. Последовательно были выполнены: анализ соответствия вида распределения признака в каждой группе закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка; описание количественных данных в зависимости от вида их распределения (среднее квадратическое отклонение, стандартная ошибка среднего, доверительный интервал, нижний (25%) и верхний (75%) квартили); сравнение групп по количественным признакам с использованием параметрических или непараметрических критериев в зависимости от вида

распределения признаков (метод сравнения парных случаев Вилкоксона-U-критерия Манна-Уитни). Для проведения статистического анализа и моделирования использовался IBM-совместимый компьютер класса Pentium-IV с объемом ОЗУ 512 Мб и тактовой частотой 2400 МГц в стандартной конфигурации. В исследовании использовались пакеты прикладных программ: Statistica for Windows 6.0 (ANOVA/MANOVA) - для статистического анализа, MS Office 2003 - для организации и формирования матрицы данных, подготовки графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты экспериментального исследования В рамках первого раздела экспериментального исследования через 7 суток после введения (21 сутки после перевязки) в очагах некроза отмечалось развитие регенерата. Отмечается повышенная клеточность участков регенерации, помимо разнообразных лейкоцитов в таких участках присутствуют клетки, которые можно идентифицировать как клетки-предшественницы, предположительно как механоцитов (фибробластов), так и эндотелиоцитов (рис. 2 а). На больших увеличениях отчетливо обнаруживаются волокна с 1 - 3 центрально расположенными светлыми ядрами (рис. 2 б).

* ,, "УЯт ' > : Р L ' *5' ' '

П

. 'И

* -v •-:« Ч'" 4 . ■ JmjS

. - f 4 /.«"-'л. . >

• г

Рис. 2. Участок мышц голени крысы экспериментальной группы (p-veg/165): 7 сутки после в/м введения p-veg/165, 21 сутки после перевязки. Волокна с центрально расположенными ядрами (*). Окраска: гематоксилиниэозин. Ув.: ах 100, 6*200

■4 - - Г» дй» / ■ * •j pi i - ! MW * Щ # - V\'

\ щ Ш1 к . /4'» * ! " * /

V f -

АЛ f ftrf IP" J

На последующих сроках эксперимента ярких гистогенетических процессов не наблюдалось. Через 14 и 21 сутки после введения р-уе^65

состояние мышечной ткани фактически не отличимое без специальных морфометрических методов от интактного. В некоторых участках, преимущественно граничащих с перимизием или фасциями, отмечается богатое развитие кровеносных сосудов различного калибра (рис. 3).

• а ' с 8 4 1

V. . |

' Л •,V Т , -

• - V»/« > ■■'•" ' ** £2 ~ - 1© л ' *

• •' ' »► • - V • • ♦

• - ' - •

Рис. 3. Кровеносные сосуды различного диаметра в участках мышцы, прилегающей к иеримизию у животных экспериментальной группы: 14 сут. После введения р-уе£/165, 21 сут. После перевязки. Окраска: а, в - гематоксилиниэозин; б - по Маллори. Ув.: ах 100, 6*200, в*400

Оценка показателя соотношения среднего количества волокон с центрально расположенными ядрами у животных всех групп свидетельствует о том, что его пик приходится на 21 сутки, к 35-м, вне зависимости от наличия или отсутствия лечебного воздействия интенсивность репарации снижается (рис. 4). Сама операция и резекция приносящего сосуда является мощным индуктором для пролиферативного процесса. Уже на 7 сутки число делящихся клеток увеличивается более чем в 10 раз (рис. 5). На раннем сроке наблюдений, количество делящихся митозом клеток в группе животных, получивших р-уе£/165, существенно выше (рис. 6), чем в контроле, однако эта разница не достигает статистической значимости.

Идентификация клеток, экспрессирующих гладкомышечный актин (аГМА) на поздних сроках (35 сутки) показывает, что помимо диссеминированных миофибробластических элементов ткани содержат кровеносные сосуды с соединительнотканным компонентом в стенке. Визуально количество таких сосудов выше в группе животных, получавших внутримышечные инъекции р-уе,§/165 (рис. 7).

30 25 20 15 10 5 0

Рис. 4.

7 сутки а 1

21 сутки ■ 2 я 3

Соотношения среднего количества волокон с центрально расположенными ядрами (%) в поле зрения (хЮО): 1 - интактные; 2 -резекция; 3 - плацебо-контроль; 4- введение р-уец/\65. * - р£0,05

а • -- ■ • к

,, • ' ...

Л „'-. " „ • V

к. '.г, . , . . : ■ .

, * » , »-«V»

Д - ~ > -

$

' > ; ' ,

>

и

Ч 1

■МУ-

ш 1 а 2

Рис. 5. Соотношения

21 сутки 35 сутки

шз

7 сутки

11 «7 Ш

группах среднего количества Ю67+ клеток в поле зрения (шт./п.з.) (хЮО, 350-460 волокон): I -

интактные; 2 - резекция; 3 - плацебо-контроль; 4 - введение р-уе§/165

а Г ' . . б ^

М ¿Г-.у '

> 4 4

Рис. 6. Скелетная мышечная ткань экспериментальных животных, ИГХ-реакция с антителами к Ю67+, 7 сутки:

а - контроль (только резекция бедренной артерии); б - в/м введение \t-vegj\b5. До краска гематоксилином. Ув. х200

Рис. 7. Скелетная мышечная ткань экспериментальных животных, ИГХ-реакция с антителами к аГМА, 35 сутки: а - контроль (только резекция бедренной артерии); б - в/м введение р-уе^65. * - кровеносные сосуды. Докраска гематоксилином. У в. х250

При постановке ИГХ-реакции с антителами к С034, эндотелиоциты (СЭ34+ клетки) выявлялись как клетки, на поверхности которых имеются окрашенные участки (рис. 8 а, б. в, г). В ряде случаев они находились между мышечных волокон в виде дискретных клеток, иногда - в виде ленточных образований в соединительнотканных структурах мышцы.

При проведении морфометрического анализа установлено, что в результате повреждающего и лечебного воздействий соотношение подвержено изменениям. В частности, активация восстановительного процесса приводит к увеличению числа капилляров по сравнению с

контролем во всех группах. На 21 и 35 сутки разница в количестве капилляров свидетельствует о влиянии р-у<?^/165 на ангиогенез, а именно на увеличение сосудов в мышечной ткани (рис. 9). Однако вследствие ограниченного числа животных в каждой группе различия не достигают статистической значимости.

Рис.

"Г

Скелетная

экспериментальных животных. ИГХ-реакция с антителами к ( Ш4. 35 сутки: а - интактный контроль; б - контроль с резекция бедренной артерии; в - в/м введение воды для инъекций; г - в/м введение р-уе^65.

Рис. 9. Соотношения в группах числа ( П.М' клеток и количества мышечных волокон: 1 - интактные; 2 - резекция; 3 - плацебо-контроль; 4 -введение р-уе^ 65

Функциональные тесты, выполненные с данными животными (лазерная флоуметрия), напрямую коррелируют с патоморфологической картиной.

Таким образом, в ходе выполнения экспериментального этапа работы удалось установить, что в результате перевязки или резекции питающего сосуда в ишемизированных тканях развивается патогистологическая динамика гипоксического повреждения, включающая как обратимые (некроз), так и необратимые (баллонная дистрофия) изменения. Параллельно с этим развертываются компенсаторно-адаптационные преобразования, а именно: репаративный рабдомиогистогенез (мышечные волокна с центрально расположенными ядрами), активация соединительнотканного и эндотелиального компонентов органа.

Введение генного индуктора р-уе,§/165 влияет на данные процессы, а именно активируют процессы ангиогенеза, что выражается в существенно большем количестве эндотелиоцитов в регенерирующей мышце у экспериментальных животных.

Еще одной важной особенностью, выявленной в ходе работы, является фактическое отсутствие значимого влияния на процессы митотического деления на отсроченных от момента введения сроках - 21 и 35 сутки, что свидетельствует в пользу безопасности изучаемого вещества.

Результаты клинического исследования

При проведении клинического исследования выявлено, что во время введения р-уе^/165 и при последующем наблюдении не отмечено развития нежелательных негативных явлений или осложнений, местного либо системного характера. Введение препарата было безболезненным, не требовало местной анестезии. Значимых изменений общего анализа крови, биохимического анализа крови, коагулограммы и общего анализа мочи в динамике лечения не выявлено. Развития новообразований в рамках онкоскрининга не зафиксировано.

В рамках предварительного исследования в обеих группах отмечен достоверный прирост безболевого расстояния к 90 суткам от начала лечения: в группе А - до 37,7% (р=0,012), в группе В - 20,4% (р=0,025) по сравнению с исходными показателями. Прирост ЛПИ в течение 90 суток составил более 10%, причем в фуппе В отмечен больший прирост ЛПИ по сравнению с группой А: 0,12 (23,1%) против 0,10 (16,9%) (р<0,05). Увеличение напряжения кислорода в тканях отмечалось в течение всего периода наблюдения, в обеих группах, достигая максимального значения 90 суткам наблюдения. Максимальный положительный сдвиг зафиксирован в группе В, где прирост показателя составил в среднем 7,3% против 3,7% в группе А (р<0,05). В группе В ЛСК к 90 суткам в среднем возросла на 7.1 см/с (50%) (р<0,05).

Учитывая то, что статистически достоверных различий в отношении критериев ДБХ, ЛПИ, ТКНК и ЛСК при межгрупповом сравнении по и-критерию Манна-Уитни для исследуемых групп А и В получено не было, и, таким образом, на эффективность лечения режим введения геннотерапевтической конструкции р-уе,§/165 не влиял, с учетом результатов экспериментального исследования, в качестве последующего режима введения был выбран интервал в 14 суток между инъекциями препарата.

В рамках основного исследования выявлено, что применение геннотерапевтической конструкции <p-vegf\65 позволило улучшить состояние больных с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза за счет перехода значительного числа пациентов из более тяжелой стадии ишемии в более легкую (рис. 10).

п-35 суток. <1-35 С/ГШ, еунж, п (1=35 (1=35 суток. Р=25 сутах

■ и »«и «ш >амлут»и«и .,в >№ »»иугадаа

-сохранность конечности 'сохранность конеиности

Рнс. 10. Динамика стадии ишемии и сохранность конечностей в рамках основного клинического исследования: а — клиническая группа; б — контрольная группа

Сохранность конечностей у пациентов клинической группы в отдаленном периоде (1 год - 85.7%, 2 года - 84.2%) превышала сохранность конечности у пациентов группы контроля (1 год - 84%, 2 года— 73,3%).

2 пациента клинической группы и 1 пациент контрольной группы со Пб стадией заболевания умерли в течение 1 года после включения в исследования в связи с развитием летального инфаркта миокарда.

Первые положительные изменения в виде увеличения дистанции безболевой ходьбы были субъективно отмечены пациентами клинической группы через 2 недели от начала лечения. Достоверный прирост ДБХ в

клинической группе в процессе наблюдения составил в среднем 48,5% к 6 месяцам (р=0,001) и 207,2% к 2 годам от начала лечения (р=0,021), в то время как в контрольной группе отмечено достоверное снижение показателя ДБХ 18,9 - 30% в динамике лечения (р<0,05) (рис. 11 а).

"р<0,05, критерии Вилтксона **р<0,05, и-кригерт Манна Уитни

Рис. 11. Динамика исследуемых показателей в рамках основного клинического исследования

Прирост ЛПИ в клинической группе составил 13,7% к 6 месяцам от начала лечения (р=0,001), и сохранялся при последующих наблюдениях, в то время как в группе контроля отмечалась отрицательная динамика (рис. 11 б). В клинической группе выявлена положительная динамика показателя ТКНК в течение всего срока наблюдения: через 2 года от начала лечения показатель ТКНК в клинической группе превышал исходные показатели на 14,8% (р<0,05) (рис. 11 в). Схожая динамика определялась в отношении показателя ЛСК среди пациентов клинической группы: статистически достоверное увеличение ЛСК составило более 60% через 6 месяцев от начала лечении, с сохранением положительной динамики в течение всего срока наблюдения (р<0,05) (рис. 11 г). В группе контроля отмечалась отрицательная динамика в отношении вышеуказанных показателей.

казтвдн ТКНК в к(зинич»ш)й фупяв а ТКНК к кошолпьыей -сугия-

0 сукок 93 ¡±2} сую*

•Д,„«««,.,

я ЛПИ в «ж я ЛПИ в хэдтрдо*

90 (12) суток 180(*2) суток 365 (±14) суток

730 {$28} сутоя

* Динамика «<ж*4*шя* ИСК а кжмшиеско» групзэе ® Дшштя ¡-.смаятпя ЛСК а к(ытй!!ь>«;й группе-

Не смотря на малую выборку пациентов по стадии ишемии и уровню поражения внутри групп, основные тенденции изменения первичного критерия эффективности (дистанции безболевой ходьбы) были отчетливы: максимальная эффективность в отношении прироста ДБХ, была зарегистрирована у пациентов с III стадией заболевания (прирост ДБХ составил более 1000% к 1 и 2 годам наблюдения) и с мультифокальным поражения (прирост ДБХ достиг 843.7% к 1 году и 752.6% ко 2 году наблюдения) (рис. 12 а. б, в, г).

365 (±14) 730 (¿28) суток. суток.

О суток. SO {¿21 сутс

«НА стадия В сгздкя * Ш стад«» ДБХ в клинической группе в зависимости от стадии ишемии, м

180 {42} 365!'* 14) 730 (±28?

с.у'ок. суток. -яугок,

п»Я27Я П-4/1Т/1 г.-2!ВИ И А стадия * !1 Б стадия * !?1 стадия ДБХ в контрольной группе в зависимости от стадии

О су to«, 90{±2}СУТ»«. 18« (±2) 365 ixWi 7?»0{i28J г=4?Ж2 п=<1-29.'2 суток, суток. суток, г =437/2 n-imi2 0=6/5*2 *Дистзяьноб поражение * Проксимальное ¥ Му^атифокалояое ДБХ в клинической группе в зависимости от уровня пораженип, м

365 (±14} 730 ;428! сутох. суток.

«Детальное поражение * Проксимальное 55 Мультифс^апьиое ДБХ в контрольной группе в зависимости от уровня поражения, м

Рис. 12. Динамика ДБХ в зависимости от стадии ишемии и уровня поражения в рамках основного клинического исследования

Установлено, что у 75% пациентов клинической группы, кому выполнялось ангиографическое исследование периферического артериального русла, на контрольных ангиограммах, выполненных через 3 месяца от начала лечения, определяется усиление контрастирования сосудистого русла за счет новообразованных коллатеральных сосудов и, вероятно, раскрытия ранее не функционировавших сосудов.

21

ВЫВОДЫ

1. Геннотерапевтическая конструкция p-vegfl65 обладает ангиогенными и гистопротекторными свойствами в отношении скелетной мускулатуры в условиях ишемии.

2. Геннотерапевтическая конструкция p-veg/165 эффективна в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Па-Ш стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) преимущественно за счет достоверного прироста дистанции безболевой ходьбы и безопасна в отношении развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований в течение не менее 2 лет от начала лечения.

3. Клиническая эффективность геннотерапевтической конструкции р-vegß65 в отношении показателей дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса, транскутанного напряжения кислорода и линейной скорости кровотока сохраняется в течение не менее 2 лет от начала лечения: постепенное увеличение дистанции безболевой ходьбы в течение 2 лет до 207,2% от изначального значения (р<0,05), увеличение лодыжечно-плечевого индекса на 13,7% к 6 месяцам от начала лечения с последующей стабилизацией в течение 2 лет (р<0,05), увеличение транскутанного напряжения кислорода в течение 1 года наблюдения до 16,2% с последующей стабилизацией в течение 2 года наблюдения (р<0,05), постепенное увеличение линейной скорости кровотока до 103,4% от изначального значения в течение 2 лет (р<0,05).

4. Применение геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в составе комплексной терапии показано пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств и является максимально эффективным у пациентов с III стадией заболевания и мультифокальным типом поражения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты показали, что геннотерапевтическая конструкция p-veg/165 обладает ангиогенными и гистопротекторными свойствами в условиях ишемии. Поэтому пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств целесообразным является применение в составе комплексного лечения p-veg/165 с целью индукции ангиогенеза и восстановления перфузии ишемизированных тканей.

2. Полученные результаты показали, что применение геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) вызывает стабильное достоверное увеличение дистанции безболевой ходьбы, лодыжечно-плечевого индекса, транскутанного напряжения кислорода и линейной скорости кровотока в течение не менее 2 лет от начала лечения. Поэтому пациентам с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств целесообразной является индукция неоангиогенеза при помощи геннотерапевтической конструкции p-veg/165.

3. Полученные результаты показали, что применение геннотерапевтической конструкции p-veg/165 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) не вызывает развития местных, системных воспалительных реакций и новообразований в течение не менее 2 лет от начала лечения. Поэтому применение геннотерапевтической индукции неоангиогенеза конструкцией p-vegfl65 следует считать безопасным.

4. Оптимальным режимом введения геннотерапевтической конструкции p-veg/165 с целью индукции неоангиогенеза в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии Ila-III стадий (по A.B. Покровскому-Фонтейну) при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств является двукратные инъекции по 1,2мг с интервалом в 14 суток внутримышечно, максимально близко к зоне ишемии.

5. Геннотерапевтическая индукция неоангиогенеза при помощи конструкции p-veg/165 в составе комплексного лечения у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей атеросклеротической этиологии при невозможности выполнения реконструктивных вмешательств может применяться у пациентов со Ila-III стадиями заболеваниями (по A.B. Покровскому-Фонтейну) и различными типами поражением артериального русла, с максимальным клиническим эффектом у пациентов с III стадией заболевания и мультифокальным типом поражения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ А. В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Мжаванадзе, И.Д. Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскулген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (26-3 фаза клинических испытаний) / П.Г.Швальб, А.В.Гавриленко, Р.Е.Калинин и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - Т. 6, № 3. - С. 76-83.

2. Мжаванадзе, Н.Д. Генная фармакотерапия неоперабельных пациентов с хронической ишемией нижних конечностей / П.Г.Швальб, Р.Е.Калинин, Р.В.Деев и др. // Рос.медико - биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2011. -№4. - С. 28-37.

3. Мжаванадзе, Н.Д. Результаты применения гентерапевтического препарата "Неоваскулген" у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей; 1 год наблюдений / Р.В.Деев, Р.Е.Калинин, Ю.В.Червяков и др. // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова.- 2011. -Т.6, №4. - С. 20-26.

4. Мжаванадзе, Н.Д. Реалии и перспективы применения генной терапии в сердечно-сосудистой хирургии / Н.Д.Мжаванадзе, И.Я.Бозо, Р.Е.Калинин, Р.В.Деев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2012. -T.VII, №2. - С. 58-62.

5. Мжаванадзе, Н.Д. Перемежающаяся хромота: лечебная тактика практикующего врача / Р.Е.Калинин, Н.Д.Мжаванадзе, Р.В.Деев // Лечащий врач, - 2013. - № 7. - С.65-70.

Б. В прочих изданиях:

6. Мжаванадзе, Н.Д. Результаты клинических испытаний первого генного препарата для лечения хронической ишемии нижних конечностей / Р.В.Деев, СЛ.Киселев, А.А.Исаев и др. // Материалы Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток»,-Звенигород,2011.- С. 62-63.

7. Мжаванадзе, Н.Д. Первый в Европе геннотерапевтический препарат Неоваскулген: от фундаментальных исследований к рутинной клинической практике / Р.В.Деев, И.Я.Бозо, Н.Д. Мжаванадзе и др. // Тезисы докладов V ежегодного международного симпозиума «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий». - Москва, 2012. - С 14-15.

8. Mzhavanadze, N.D. [Мжаванадзе, Н.Д.] The results of gene drug "neovaskulgen" in the complex treatment of chronic lower limb ischemia / R.V.Deev, N.D.Mzhavanadze, A.A.Filin et al. [Р.В.Деев, Н.Д.Мжаванадзе, А.А.Филин и др.] // International conference on postgenomic technology for biomedicine. PTB, 12. -Novosibirsk, 2012. - P. 170.

9. Мжаванадзе, Н.Д. Отдаленные результаты оценки безопасности и эффективности применения генной терапии в лечении хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза / Р.Е.Калинин, П.Г.Швальб, Р.В.Деев и др. // Ангиология и сосудистая хирургия. — 2012. - Т. 18, №2. (Прил.). - С. 163-164. Приложение. Материалы 23-й (XXVII) Международной конференции Российского Общества Ангиологов и сосудистых хирургов.

10. Мжаванадзе, Н.Д. Фаза 26-3 клшчного достижения геноопосередкованого терапевтичного анпогенезу (vegfl65) та вщстрочене спостереження за патентами з хрошчною ппемкго нижшх кшщвок Ila—III стад!!' / Р.В.Деев, 1.Я.Бозо, М.Д.Мжаванадзе и др. [Р.В.Деев, ИЛ.Бозо, Н.Д.Мжаванадзе и др.] // Серце i судини (Украина).— 2013.— № 3.— С.90-99.

11. Mzhavanadze, N.D. [Мжаванадзе, Н.Д.] Clinical trial of naked plasmid DNA encoding vascular endothelial growth factor isoform VEGF165 transfer in patients with stage Ila-III Fontaine lower limb ischemia due to atherosclerotic peripheral arterial disease: the results of the multicentered, randomized, controlled study / N.D.Mzhavanadze, R.E.Kalinin, R.V.Deev et al. [Н.Д.Мжаванадзе, Р.Е.Калинин, Р.В.Деев и др.] // Book of abstracts. ESVS Spring Meeting «Vascular biology, Materials and Engineering». - Frankfurt am Main, 2013 - P. 63.

12. Мжаванадзе, Н.Д. Инновации XXI века в сосудистой хирургии: генная терапия в лечении хронической ишемии нижних конечностей / Н.Д.Мжаванадзе, Р.Е.Калинин, Р.В.Деев // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 70-летию Ряз. гос. мед. ун-та им. акад. И.П. Павлова «Здравоохранение: образование, наука, инновации». - Рязань, 2013.-С. 297-301.

Научное издание

Мжаванадзе Нина Джансуговна

ГЕННОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ИНДУКЦИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЕЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ № 698.

Отпечатано в РИО УМУ ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России 390026, г. Рязань, ул. Шевченко, д. 34/2