Автореферат и диссертация по медицине (14.01.26) на тему:Комплексное лечение больных с хронической ишемией нижних конечностей: сочетание реконструктивных операций с генно-инженерными технологиями (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ВОРОНОВ

Дмитрий Александрович

Комплексное лечение больных с хронической ишемией нижних конечностей: сочетание реконструктивных операций с генно-инженерными технологиями

(клинико-экспериментальное исследование)

14.01.26 — Сердечно-сосудистая хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 2013 00505ао«'

. "Ч

005059607

Работа выполнена в ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН, в отделении сосудистой хирургии

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ Гавриленко Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

Аракелян Валерий Сергеевич — доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела сосудистой хирургии и ангиологии ФГБУ «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева» РАМН

Зотиков Андрей Евгеньевич - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения сосудистой хирургии ФГБУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского» Минздрава России

Косенков Александр Николаевич- доктор медицинских наук, профессор кафедры сердечно-сосудистой хирургии и инвазивной кардиологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России

Ведущая организация:

ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава России

Защита состоится 28 мая 2013 г. в 15-00 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.027.01 ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В.Петровского» РАМН (119991, Москва, Абрикосовский переулок, д. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РНЦХ им. акад.Б.В.Петровского» РАМН

Автореферат разослан апреля 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

В.В.Никода

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Лечение хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей и обусловленной ими хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) , в т.ч. критической, представляют на сегодняшний день одну из нерешенных проблем ангиологии и сосудистой хирургии. Несмотря на имеющиеся в настоящее время достижения в сосудистой хирургии и фармакотерапии сосудистых заболеваний, существует целая группа пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, в отношении которых существующие лекарственные средства малоэффективны, а методы хирургического лечения (даже наиболее современные) не позволяют достичь клинически значимого результата, либо демонстрируют хорошие результаты лечения в ближайшем послеоперационном периоде, но отдаленные их результаты по-прежнему остаются неудовлетворительными (А.В.Покровский с соавт., 2010). Технически правильно и оптимально наложенный артериальный шунт, к сожалению, не способен функционировать долго при выраженном диффузном поражении артериального русла конечностей, в условиях высокого периферического артериального сопротивления, что в ряде случаев сводит эффективность такого хирургического вмешательства к минимуму (А.В.Покровский с соавт., 2008; И.И.Затевахин с соавт., 2009). Фармакотерапевтической же альтернативы для этой категории пациентов, т.е. средства, эффективность которого может быть сопоставима с эффективностью успешно выполненной хирургической реваскуляризации, в настоящее время нет.

В этой связи ведется поиск новых подходов к решению данной проблемы. В частности, активно обсуждается возможность использования методик стимуляции ангиогенеза в пораженных конечностях, основанных на возможностях генно-инженерных технологий (Л.А.Бокерия с соавт., 2006; В.С.Аракелян с соавт, 2011; К.А.Талицкий с соавт., 2011; У.Кияшпато е1 а1, 2006; Р.Ра\укеэ с1 а1, 2011; Т.Непп е1 а1, 2011). В 2004 г., выступая на встрече главных кардиохирургов регионов и руководителей сердечно-сосудистых центров страны в преддверии X Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, главный специалист по сердечно-сосудистой хирургии МЗ РФ академик РАМН Л.А.Бокерия сказал буквально следующее: « ... На современном этапе достичь дальнейшего прогресса в лечении сердечно-сосудистых заболеваний можно только с использованием новых методов и подходов, одними из которых являются генно-инженерные и клеточные технологии...». Таким образом были обозначены пути дальнейшего развития фундаментальных и прикладных исследований в области лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и в частности, новые подходы к лечению пациентов с хронической ишемией нижних

конечностей. Следует подчеркнуть, что геномные и постгеномные технологии создания лекарственных средств, клеточные технологии и нанотехнологии, т.е. сферы научных изысканий в компетенции которых находится рассматриваемая нами проблема, находятся в Перечне Критических технологий РФ и Приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ, утвержденным Президентом РФ 21.05.2006 г.

Соответственно, разработка новых инновационных методов лечения больных с ХИНК, основанных в частности на генно-инженерных методах стимуляции ангиогенеза, позволит вывести проблему лечения этой сложной категории пациентов на принципиально новый уровень (Н.П.Бочков с соавт., 2010). Наиболее интересным при этом представляется комплексное применение реконструктивных сосудистых операций, направленных на восстановление магистрального кровотока, с генно-инженерными методами стимуляции неоангиогенеза, направленных на развитие микроциркуляторного русла и улучшения перфузии дистальных отделов тканей и органов (А.В.Гавриленко с соавт, 2008).

Работы, всеобъемлюще систематизирующие клинические результаты применения генно-инженерных технологий индукции ангиогенеза у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, экспериментально обосновывающие особенности их использования в различных клинических ситуациях, и соответственно предлагающие конкретный протокол применения данных технологий в клинической практике, в настоящее время отсутствуют.

Цель исследования

Улучшение результатов лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей путем разработки и применения нового метода комплексного лечения на основе сочетания реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными методиками стимуляции ангиогенеза.

Задачи исследования

1. Определить потенциальную ангиогенную активность оригинальных генно-инженерных конструкций с генами фактора роста эндотелия сосудов (УЕО7) и ангиогенина (ЛМТ) на биологических моделях.

2. Экспериментально обосновать возможность индукции ангиогенеза при применении конструкций с генами УЕОР и ЛЫС на модели ишемии конечности млекопитающих.

3. Определить возможность использования генно-инженерных методов стимуляции ангиогенеза в клинической практике у пациентов с ХИНК.

4. Определить группы больных, в отношении которых применение данных технологий наиболее эффективно

5. Изучить сравнительную эффективность использования различных сочетаний хирургических реконструкций и методов индукции ангиогенеза в зависимости от характера поражения артериального русла нижних конечностей

6. Оценить ближайшие и отдаленные результаты комплексного лечения пациентов с ХИНК использованием генов-индукторов ангиогенеза

7. Оценить безопасность предлагаемых технологий индукции ангиогенеза

Научная новизна

Определена ангиогенная активность оригинальных генно-инженерных конструкций с генами-стимуляторами ангиогенеза и экспериментально доказана их способность стимулировать рост капилляров и развитие микроциркуляторного русла при введении в ишемизированные ткани.

Экспериментально обоснована возможность применения созданных генно-инженерных конструкций в клинической практике и определены механизмы, определяющие особенности клинического применения.

Впервые разработан клинический протокол применения генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей.

Впервые разработан и внедрен метод комплексного лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей, основанный на сочетании реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными технологиями стимуляции ангиогенеза.

Выделены группы больных, у которых использование методов стимуляции ангиогенеза наиболее эффективно.

Впервые проведена сравнительная комплексная оценка эффективности и безопасности метода в эксперименте и в клинической практике.

Практическая значимость

Применение предложенных технологий в комплексном лечении пациентов с ХИНК позволит улучшить его результаты, прежде всего в отношении больных с дистальными формами поражения, в отношении которых существующие на сегодняшний день методы фармакотерапии малоэффективны, а результаты хирургического лечения не являются удовлетворительными

Ранее отсутствующая возможность лечения определенных групп пациентов с ХИНК с помощью предлагаемого метода позволит снизить показатели инвалидизации больных и снизить число выполняемых ампутаций.

Предлагаемые критерии отбора пациентов и прогнозирования его эффективности позволяют использовать данный метод как в условиях стационарной, так и амбулаторной практики.

Предложенные экспериментальные модели и выявленные закономерности могут быть использованы в дальнейшем при испытании новых фармакологических агентов, воздействующих на микроциркуляторное русло у пациентов с ХИНК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Созданные оригинальные генно-инженерные конструкции с генами факторов ангиогенеза могут эффективно стимулировать ангиогенез в ишемизированных тканях в эксперименте и в реальных клинических условиях у больных с ХИНК.

2. У пациентов с ХИНК генно-инженерные технологии стимуляции ангиогенеза могут быть эффективно использованы как в качестве компонента комплексного консервативного лечения, так и в виде комбинированного лечения в сочетании с реконструктивными сосудистыми операциями.

3. Наиболее эффективно использование генно-инженерных конструкций с генами-стимуляторами ангиогенеза при лечении пациентов с ХИНК в случаях изолированного или сочетанного поражения дистального артериального русла нижних конечностей.

4. Комбинация реваскуляризирующих операций с технологиями стимуляции ангиогенеза позволяет достичь лучших результатов в отдаленном периоде наблюдения по сравнению с использованием этих методов по отдельности.

5. Эффективность применения генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза зависит от характера и распространенности поражения артериального русла нижних конечностей, степени ишемии и функционального резерва микроциркуляции нижних конечностей, что позволяет прогнозировать результат использования данных технологий у конкретного пациента.

6. Предложенные технологии лечения хорошо переносимы и безопасны в ближайшем и отдаленном периодах наблюдения.

Внедрение в практику

Разработанный метод комплексного лечения внедрен и используется в практике отделения хирургии сосудов ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В.Петровского» РАМН.

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены: на IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVII Всероссийских съездах сердечно сосудистых хирургов, 2003, 2004. 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2011 гг.;

на X, XI, XII Ежегодных сессиях Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, Москва, 2006, 2007, 2008 гг.;

на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004 г.;

на Научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирургии», Москва, 2004 г;

на V съезде Российского общества медицинских генетиков, Уфа, 2005 г.; на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005 г.;

на 56th International Congress of The European Society for Cardiovascular Surgery, Venice, Italy, 2007;

на VI съезде Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону,

2010;

на 23 (XXVII) Международной конференции «Актуальные вопросы сосудистой хирургии», Санкт-Петербург, 2012 г;

на научной конференции отделения хирургии сосудов ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» РАМН 21.12.2012 г.

Публикации

По теме диссертации опубликована 51 научная работа, в т.ч. 18 статей в журналах из перечня ВАК, получено 2 патента на изобретение.

Объем н структура работы

Диссертация изложена на 287 страницах и состоит из введения, 6 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель включает 182 источника, в т.ч. 35 отечественных и 147 зарубежных. Диссертация содержит 42 таблицы и 39 рисунков.

В 2006 - 2007 гг. работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) № 06-04-08311 офи по разделу «Ориентированные фундаментальные исследования»

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование носило клинико-экспериментальный характер. В этой связи работа была разделена на две основные части: экспериментальное исследование и клиническое исследование.

Экспериментальное исследование

Экспериментальные исследования проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1984) «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (2003). Проведение исследований было одобрено Этическим комитетом РНЦХ РАМН (10.04.2003).

Совместно с Институтом молекулярной генетики РАН (проф. В.З.Тарантул, к.б.н. Н.В.Хайдарова) и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи МЗ РФ (проф. Б.С.Народицкий, к.б.н. С.В.Авдеева) были созданы и синтезированы в необходимом количестве самоэкспрессирующиеся (т.е. способные при введении в живой организм к временному самостоятельному функционированию и синтезу соответствующих белков) генно-инженерные конструкции. Каждая из таких конструкций представляет из себя участок ДНК, несущий основной ген, реализующий собственно синтез соответствующего ростового фактора, и ряд служебных генов, обеспечивающих стабильность и самостоятельное функционирование данных конструкций при введении в живой организм. В качестве основных генов (генов ангиогенеза) при создании данных конструкций были использованы ген ангиогенина (ANG) и ген фактора роста эндотелия эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Данные гены были включены как в состав нативных ДНК, так и в состав оригинальных рекомбинантных векторных конструкций на основе вирусных векторов аденовируса птиц (CELO) и аденовируса человека 5-го серотипа (Ad5). В структуре ни одной из созданных или использованных нами конструкций не содержалось участков, обеспечивающих способность встраивания чужеродного генетического материала в геном клетки-хозяина. Таким образом, данные конструкции не обладали способностью к проникновению в ядро клетки, мутагенезу, функционировали автономно в цитоплазме клетки-хозяина и через определенный промежуток времени полностью разрушались соответствующими клеточными системами и элиминировались из организма. Весь перечень созданных и испытанных на различных этапах настоящего исследования конструкций, представлен в табл. 1.

Таблица 1.

Генно-инженерные конструкции, использованные на различных этапах экспериментального и клинического исследования

Конструкция Характеристика и структура

Исследуемые генно-инженерные конструкции с генами факторов ангиогенеза pANG* Нативная плазмида с геном ангиогенина. Использовалась в трех вариантах (pANGl, pANG2, pANG3)

pVEGF* Нативная плазмида с фактором роста эндотелия сосудов

CELO-ANG* Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса CELO с геном ангиогенина

CELO-VEGF* Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса CELO с геном фактора роста эндотелия сосудов

Ad5-ANG* Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса аденовируса человека 5-го серотипа Ad5 с геном ангиогенина

Ad5-VEGF* Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса аденовируса человека 5-го серотипа Ad5 с геном фактора роста эндотелия сосудов

Конструкции, использованные в качестве контрольных pGEM Нативная плазмида, не содержащая генов ростовых факторов и вирусных компонентов

CELO-SEAP Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса CELO с геном термостабильной щелочной фосфатазы

Ad5-GFP Рекомбинантная вирусная конструкция на основе вируса аденовируса человека 5-го серотипа Ad5 с геном зеленого флуоресцирующего белка

PBS Буферный стабилизирующий раствор, не содержащий генных и вирусных компонентов

* - оригинальные генно-инженерные конструкции, созданные совместно с ИМГ РАН и НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Первоначально было проведено тестирование биологической активности полученных генно-инженерных конструкций. В качестве модели для тестирования биологической активности использовали развивающиеся куриные эмбрионы. Капилляры хорионаллантоисной мембраны куриных эмбрионов доступны непосредственной визуализации и при незначительном увеличении их площадь может быть оценена количественно, что делает данную модель удобной для оценки ангиогенного эффекта (рис. 1).

Статистический анализ результатов экспериментальных исследований проводился с применением статистической программы Мсс1Са1с с использованием критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Рис. 1. Визуализация и подсчет количества сосудов при испытании биологической активности плазмид на хорионаллантоисной мембране куриных эмбрионов: а - эмбрион основной группы после нанесения плазмиды с ангиогенными свойствами, б- эмбрион контрольной группы

Для испытания биологической активности раствор рекомбинантной плазмидной ДНК с соответствующим геном с концентрацией 1 мкг/мкл уколом вводили в хорионаллантоисную мембрану 9-ти дневных куриных эмбрионов. Далее эмбрионы инкубировали при 39°С во влажной камере. Через 30-60 часов после инъекции проводили прямой подсчет сосудов (1-го, 2-го и 3-го порядков) на различных участках хорионаллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Контролем служило равное количество ДНК, не содержащей соответствующего гена.

Все созданные генно-инженерные конструкции обладали значимым биологическим ангиогенным эффектом по сравнению с контролем, что выражалось в статистически значимом увеличении числа сосудов на хорионаллантоисной мембране. В частности, результаты испытания биологической активности плазмид pANG и \A5-ANG представлены на рис. 2.

Таким образом, в проведенных исследованиях на модели хорионаллантоисной мембраны развивающихся куриных эмбрионов была установлена выраженная биологическая ангиогенная активность как нативных сконструированных плазмид, так и рекомбинантных векторных конструкций, что позволило перейти к следующему этапу экспериментальных исследованиях на животных моделях.

В качестве экспериментальной животной модели для проверки ангиогенной активности созданных оригинальных генно-инженерных конструкций нами были выбраны крысы. В работе использовались взрослые крысы-самцы линии \Vistar массой 220 - 270 г. В качестве основной патологической модели использовали модель ишемии задней конечности крысы. В результате продолжительных поисков и многократных серий экспериментов нами была предложена модифицированная

модель хронической ишемии задней конечности крысы, приемлемая для целей проведения хронического эксперимента. Ключевыми моментами формирования нашей модели явились:

1. Трехуровневая перевязка артериальной магистрали задней конечности крысы нерассасывающимся шовным материалом. При этом первую лигатуру накладывали на наружную подвздошную артерию, вторую - на общую бедренную артерию тотчас ниже паховой связки, третью - на подколенную артерию;

2. Обязательное иссечение и удаление артерии между второй и третьей лигатурами;

3. Дополнительное наложение лигатуры на венозную магистраль задней конечности крысы (перевязка бедренной вены в средней трети).

-ЕЕ-

Р (рАМб-рбЕМ) <0,0001 Р (рА№ РВЯ <0,0001 Р (рОем-РВБ) =0,0679

рА№ рйЕМ

РВБ

2 § 30

Я 20

О с

Р (Ас15-АМС — А(35-йРР) <0,0001 Р (А1)5-АТО - РВБ) <0,0001 Р (даз-егр- рвб) <0,0001

А<15 М5 СРР

РВБ

Рис. 2. Средний абсолютный прирост количества сосудов всех порядков в течение 4 дней инкубации при испытании биологической активности нативной генной конструкции (слева) и рекомбинантной векторной аденовирусной конструкции (справа) с геном ангиогенина на модели хорионаллантоисной мембраны развивающихся куриных эмбрионов

Всего на различных этапах экспериментального исследования (помимо этапа поиска оптимальной модели ишемии конечности) было исследовано 236 животных. Основные этапы экспериментального исследования, а также количество животных, включенных в каждый этап, представлено в табл. 2.

Таблица 2.

Количество животных (крыс), включенное в этапы экспериментального

исследования

Этап Количество животных

Предварительное определение оптимального интервала введения генно-инженерных конструкций и длительности эксперимента 40

Предварительное определение оптимальной по профилю эффективность-безопасность дозы различных генно-инженерных конструкций 56

Основной этап контролируемого исследования по сравнительной оценки эффективности и безопасности созданных генно-инженерных конструкций 90

Контролируемое исследование по сравнительной оценке ангиогенного эффекта генно-инженерных конструкций в условиях модели ишемии конечности и при введении в интактные ткани 50

ИТОГО 236

В качестве непосредственного тканевого объекта для изучения и количественной оценки процессов неоангиогенеза была выбрана передняя (краниальная) тибиальная мышца (m. tibialis cranialis) задней конечности крысы. Данная мышца легко доступна для различных манипуляций и легко извлекается целиком при выведении животного из эксперимента. После формирования модели ишемии исследуемые генно-инженерные конструкции вводились путем 4-5 прямых внутримышечных инъекций в переднюю тибиальную мышцу крысы, преимущественно в ее среднюю часть. После выведения животных из эксперимента осуществляли забор передней тибиальной мышцы исследуемой конечности крысы. Для контроля возможного системного действия генных конструкций осуществляли забор тканей печени, почек и селезенки. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин. Из каждой исследуемой мышцы получали 3 парафиновых блока (при срезах на разных уровнях по длине мышцы). Из каждого блока делали три среза. Срезы окрашивали азокармином по Гейденгайну, что обеспечивало возможность непосредственной визуализации капилляров и их подсчета (рис. 3). В каждом из исследуемых срезов мышц при увеличении светового микроскопа в 280 раз производили подсчет числа капилляров в 100 (на ранних этапах исследования) либо в 30 (на последующих этапах исследования) полях зрения. Таким образом, в каждом из образцов мышцы подсчет количества капилляров осуществлялся либо в 900 либо в 270 полях зрения, что обеспечивало получение достоверной картины о степени васкуляризации мышцы.

Кроме того, качественно оценивалась морфологическая картина и клеточный состав препарата. При наличии в мышце зон продуктивного воспаления данные поля зрения из общего подсчета исключались. Полученные данные обрабатывались методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Исследование тканей паренхиматозных органов проводилось по стандартной методике после окраски гематоксилин-эозином.

Исходя из теоретических расчетов, данных литературы и пилотных экспериментальных исследований предположительная суммарная доза вводимых генных конструкций должна была составлять: для нативных плазмид - 150 - 450 мкг, для вирусных векторных конструкций 3x108 - 3x1010 БОЕ (бляшкообразующих единиц) при двух- или трехкратном введении в течение 1 - 3 недель. В этой связи перед проведением собственно контролируемых экспериментальных исследований по оценке эффективности и безопасности генно-инженерных конструкций были проведены предварительные испытания по экспериментальному подбору дозы, кратности введения препарата и длительности эксперимента.

Первоначально был осуществлен подбор кратности интервала введения препарата и продолжительности эксперимента, взяв априорно средне-вводимые дозы соответствующих конструкций. Исследование проводилось на одной нативной конструкции (pANG3) и на одной вирусной векторной конструкции (CELO-ANG). Суммарная вводимая доза для первой и второй конструкции составила 150 мкг и 3x10 БОЕ соответственно. Эксперимент для каждой конструкции проводился в двух вариантах. При первом варианте введение осуществлялось трехкратно с интервалом в 3 дня; животные выводились из эксперимента на 14-15-е сутки после его начала. При втором варианте введение осуществлялось также трехкратно, но с интервалом 1 неделю, а животные выводились из эксперимента через 28 - 30 дней после его начала. Результаты морфологической оценки результатов данного эксперимента представлены в табл. 3.

Рис. 3. Гистологическое исследование образца мышечной ткани конечности крысы. Стрелками обозначены микрососудистые структуры. Окраска азокармином по Гейденгайну, ув. х280

Таблица 3.

Среднее количество капилляров в одном поле зрения мышечной ткани при различных режимах введения генно-инженерных конструкций

Режим введения Среднее количество капилляров

pANG3 (Е=150 мкг) CELO-ANG (Е =3х109 БОЕ)

Вариант 1: трехкратно, с интервалом 3 дня; длительность эксперимента 14 — 15 дней 25,6±2,1 28,2±3,6

Вариант 2: трехкратно, с интервалом 1 неделю; длительность эксперимента 28 - 30 дней 34,1±2,9 33,9±2,2

Р= <0,0001 0,0005

Из таблицы следует, что второй режим введения (трехкратно, с интервалом 1 неделю, выведение животных из эксперимента через месяц) имел преимущества перед первым вариантом: среднее количество капилляров в мышечной ткани было статистически значимо больше, что, очевидно, объясняется необходимостью определенного периода времени для реализации процессов неоангиогенеза. В этой связи для всех дальнейших экспериментальных исследований был выбран второй вариант режима введения препарата.

На следующем этапе был осуществлен предварительный подбор дозы водимого препарата. Тестировалась нативная плазмида pANG и два варианта векторных конструкций - CELO-ANG и Ad5-ANG. Вариант введения во всех случаях был идентичным (определен в предыдущем исследовании). Нативная плазмида тестировалась в суммарных дозах 150 мкг и 450 мкг. Вирусные конструкции тестировались в суммарных дозах ЗхЮ8, ЗхЮ9 и ЗхЮ10 БОЕ. Результат данного эксперимента представлен в табл. 4 и 5.

Из приведенных в табл. 4 и 5 данных следует, что в отношении нативной плазмиды pANG3 суммарной дозы 150 мкг достаточно для достижения ангиогенного эффекта: увеличение суммарной дозы ее введения со 150 до 450 мкг (в 3 раза) не вызывает появления каких-либо значимых патологических морфологических изменений в мышечной ткани, но в то же время и не приводит к статистически значимому увеличению плотности капиллярной сети (по сравнению с дозой 150 мкг).

Таблица 4.

Среднее количество капилляров в одном поле зрения мышечной ткани и особенности морфологической картины при введении различных доз нативной плазмиды с геном ангиогенина

Суммарная доза рА№3 Среднее количество капилляров Особенности морфологической картины

150 мкг 33,9±2,1 Без существенных особенностей

450 мкг 34,4±2,5 Без существенных особенностей. Небольшие участки лимфоцитарной инфильтрации по ходу введения иглы

Р= 0,6925

Таблица 5.

Среднее количество капилляров в одном поле зрения мышечной ткани и особенности морфологической картины при введении различных доз рекомбинантных аденовирусных конструкций с геном ангиогенина

Суммарная доза СЕШ-АКС А(15-ЛГ\'С

рекомбинантной Среднее Особенности Среднее Особенности

конструкции коли- морфологической коли- морфологической

чество картины чество картины

капил- капил-

ляров ляров

3 х 10" БОЕ 30,1±2,1 Участки лимфоцитарной инфильтрации, плазматические клетки 42,4±2,8 Участки лимфоцитарной инфильтрации

3 х 10у БОЕ 34,3±2,6 Участки лимфоцитарной инфильтрации, плазматические клетки 51,1±3,6 Участки лимфоцитарной инфильтрации, плазматические клетки, «островки» скопления лейкоцитов

3 х10ш БОЕ 37,9±2,7 Участки Подсчет Выраженная

лимфоцитарной невозмо- лимфоцитарно-

инфильтрации, жен из-за лейкоцитарная

«островки» скопления выражен- инфильтрация,

леикоцитов, гигантские ного вос- локальные участки

клетки инородных тел паления некроза

Р1-2 = 0,0061 0,003

Р1-3 = 0,0001 -

Р2-3 = 0,0259 -

При использовании рекомбннантных векторных конструкций оптимальными по профилю эффективность-безопасность являются суммарные дозы 3x109 БОЕ для CELO-ANG и ЗхЮ8 БОЕ для Ad5-ANG. Увеличение дозы этих конструкций, несмотря на статистически значимое увеличение плотности капиллярной сети, приводит к выраженным изменениям морфологической картины (значительная лимфоцитарная инфильтрация, появление скоплений лейкоцитов), а при дальнейшем увеличении дозы наблюдаются явления повреждения мышечной ткани (вплоть до формирования некротических участков), а степень продуктивного воспаления становится столь высока, что даже не позволяет произвести подсчет количества капилляров.

Таким образом, в результате проведенного предварительного исследования нами были экспериментально определены: оптимальная кратность введения генно-инженерных конструкций (три раза с интервалом 1 неделю) и оптимальная по профилю эффективность-безопасность суммарная доза их использования (150 мкг для pANG3, ЗхЮ9 БОЕ для CELO-ANG и ЗхЮ8 БОЕ для Ad5-ANG). Определенные нами схемы были использованы на последующем этапе проведения контролируемого экспериментального исследования.

Целью следующего этапа экспериментального исследования была сравнительная оценка ангиогенной активности созданных генно-инженерных конструкций и определение безопасности их применения. В соответствии со схемой, определенной на предыдущих этапах эксперимента, после формирования модели хронической ишемии, конструкции вводили в переднюю тибиальную мышцу задней конечности крысы трехкратно с интервалом 1 неделю. Суммарная доза введенных одному животному нативных плазмид составляла 150 мкг, конструкций на основе вируса CELO — ЗхЮ9 БОЕ, конструкций на основе аденовируса человека 5-го типа Ad5 - ЗхЮ8 БОЕ. Животные выводились из эксперимента на 28 - 30-е сутки.

Кроме того, для целей углубленного анализа отдельные генные конструкции были дополнительно испытаны в аналогичных условиях эксперимента на интактной конечности крыс (т.е. без моделирования условий ишемии конечности). Результаты исследований представлены в табл. 6 и 7.

Анализируя приведенные таблицы, следует отметить, что все испытанные рекомбинантные генно-инженерные конструкции с ангиогенными генами (как нативная плазмида - pANG3, так и рекомбинантные векторные вирусные конструкции - CELO-ANG, CELO-VEGF, Ad5-ANG, Ad5-VEGF) демонстрируют выраженную ангиогенную активность, что выражается в увеличении плотности капиллярного русла мышечной ткани, что было статистически значимо как по сравнению с внутригрупповым контролем, так и с общим референсным контролем. Таким

образом, все варианты данных конструкций могут быть потенциально использованы для целей терапевтического ангиогенеза при ишемии конечности.

При анализе морфологической картины препаратов выявлено, что во всех препаратах, где применялись вирусные конструкции (как основных, так и контрольных подгрупп) обнаруживались участки лимфоцитарной, а иногда и лейкоцитарной инфильтрации, плазматические клетки, отек мышечных волокон, т.е. типичные морфологические признаки воспалительной реакции ткани. Данные признаки не выявлялись в препаратах при использовании конструкций, не содержащих вирусных векторов. Можно предположить, что при введении вирусного вектора в ткани развивается различной степени выраженности иммуновоспалительная реакция как вариант естественного иммунного ответа организма. В свете данных фактов становится понятным описанный статистически значимый прирост плотности капилляров в контрольных подгруппах: в ответ на введение вирусной конструкции развивается иммунно-воспалительная реакция, которая даже в отсутствии проангиогенного гена способна сама по себе стимулировать ангиогенез.

Таблица 6.

Сравнительный анализ ангиогенной активности генно-инженерных конструкций в условиях экспериментальной ишемии и в интактной ткани

Используемая конструкция Среднее количество капилляров в одном поле зрения мышечной ткани Р1

При испытании на модели ишемии конечности При испытании на интактной мышце

Группа!

рАШЗ 35,3±2,9 27,4±3,0 0,0029

рвЕМ (внутригрупповой контроль) 20,5±2,5 21,6±2,4 0,4980

р2<0,001 р2=0,0097

Группа 2

СЕЮ-АЫС 34,1±2,8 31,3±2,7 0,1416

СЕШ-УЕСЕ 37,2±2,2 33,4±2,6 0,0372

СЕЬО-СЕАР (внутригрупповой контроль) 27,1 ±2,7 28,2±2,3 0,5076

р2<0,001 (для обоих сравнений) />2=0,0864 (для СЕЮ-АЫв) />2=0,0101 (для СЕЮ-УЕСР)

Примечание: р\ - статистическая значимость различий показателей в строках таблицы; р2 -статистическая значимость различий с соответствующим внутригрупповым контролем

Таблица 7.

Результаты морфологического анализа при использовании генно-инженерных конструкций в условиях модели хронической ишемии конечности

Используемая генная конструкция Среднее количество капилляров в одном поле зрения Р1 р2 рЗ Морфологические особенности препаратов

Группа 1

рЛЛ'СЗ 35,3±2,9 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Без существенных особенностей

рвЕМ (внутригруппо-вой контроль) 20,5±2,5 0,0939 Без существенных особенностей. Признаки дистрофических изменений мышечной ткани

Группа 2

СЕШ-ЛМ7 34,1 ±2,8 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Участки лимфоцитарной инфильтрации. Плазматические клетки. «Островки» скопления лейкоцитов. Гигантские клетки инородных тел.

СЕЬО-га^ 37,2±2,2 <0,0001 <0,0001 <0,0001 Участки выраженной лимфо-, лейкоцитарной инфильтрации. Плазмацитоз. Выраженный отек мышечных волокон. Локальные участки некроза и некробиоза

СЕЬО-СЕАР (внутригруппо-вой контроль) 27,1±2,7 0,0005 Участки лимфоцитарной инфильтрации. Отек мышечных волокон

Группа 3

Ас15-ЛА'С 43,7±2,9 <0,0001 <0,0001 Участки лимфоцитарной инфильтрации

М5-УЕвЕ 52,9±3,1 <0,0001 <0,0001 Участки лимфоцитарной инфильтрации

(внутригруппо-вой контроль) 31,4±2,5 <0,0001 Участки лимфоцитарной инфильтрации. Очаги дистрофических изменений мышечной ткани

Группа 4

РВ8 (общий референсный контроль) 22,4±2,3 Без существенных особенностей. Признаки дистрофических изменений мышечной ткани

Примечание: р1 - статистическая значимость различий по отношению к внутригрупповому контролю; р2 - статистическая значимость различий по отношению к общему референсному контролю; рЗ - статистическая значимость различий по отношению к аденовирусной конструкции с соответствующим геном в группе 3

Особое внимание следует акцентировать на том, что при гистологическом анализе паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки), полученных от экспериментальных животных каких-либо патологических изменений, свидетельствующих о возможном системном действии вводимых конструкций, ни в одном случае выявлено не было. Морфологическая картина исследуемых препаратов мышц также свидетельствовала о возможности безопасного использования созданных генно-инженерных конструкций.

Интересными с точки зрения предположений о возможных звеньях механизмов неоангиогенеза являются сравнительные результаты использования рекомбинантных конструкций с ангиогенными генами в условиях ишемизированной и интактной мышечной ткани. При использовании нативной плазмиды (рАА'йЗ) в интактной мышечной ткани получен прирост плотности капилляров, значение которой статистически значимо больше, чем аналогичное значение в контрольной подгруппе (р=0,0097), но в то же время статистически значимо меньше, чем аналогичный показатель, полученный в условиях экспериментальной ишемии конечности (р=0,0029). При использовании СЕЬО-УЕСЕ получена аналогичная картина, хотя и с меньшим уровнем статистической значимости (р=0,0101 и р=0,0372 соответственно). Однако при использовании СЕЬО-АЫв получена принципиально иная картина: не достигнут уровень статистической значимости ни при сравнении с контрольной подгруппой (р=0,0864), ни при сравнении с показателями при экспериментальной ишемии (р=0,1416). В группе СЕЬО-СЕАР также не получено статистически значимых различий в показателях в интактной и ишемизированной мышце (р=0,5076), при этом оба значения статистически значимо отличались от значения в группе общего референсного контроля.

Таким образом, экспериментальная часть нашего исследования показала, что созданные рекомбинантные генно-инженерные конструкции (как нативные, так и на основе векторных вирусных систем) могут эффективно стимулировать ангиогенез в мышечной ткани, эффективно повышать плотность капиллярного русла и, следовательно, могут быть эффективно и потенциально приемлемо безопасно использованы в клинической практике в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. В условиях ишемии данный ангиогенный эффект более выражен и в меньшей степени проявляется в интактной ткани. Конструкции на основе вирусных векторных систем продемонстрировали значительно больший ангиогенный эффект, однако часть этого эффекта может быть обусловлена иммуновоспалительной реакцией, развивающейся в ответ на введение собственно вирусных компонентов (что было более значительно при использовании

конструкций на основе вектора CELO по сравнению с вектором Ad5), что также должно учитываться при внедрении данных технологий в клиническую практику.

Клиническое исследование

Материал и методы

Проведено открытое проспективное контролируемое клиническое исследование. Исследование проведено в соответствии с этическими принципами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964, с изм. 2000, 2002, 2004, 2008 гг). На проведение данного исследования было получено разрешение Этического комитета РНЦХ РАМН (10.04.2003). Все пациенты, включенные в исследование, были ознакомлены со всеми аспектами его проведения и перед включением в него подписывали соответствующее информированное согласие.

Всего на различных этапах исследования в него было включено 160 больных с хронической ишемией нижних конечностей, вызванной окклюзионно-стенотическими поражениями артериального русла. В соответствии с теоретически и экспериментально обоснованными механизмами, заложенными в основу действия генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза, обязательным условием включения в исследование являлось наличие у больного признаков поражения артериального русла голени.

В исследование не включались пациенты с острой артериальной ишемией, а также с хронической артериальной ишемией, вызванной травмой сосудов, врожденными аномалиями развития сосудистой системы или инфекционными поражениями. Из исследования исключались пациенты с обширными некротическими поражениями тканей конечности, нуждающиеся в выполнении первичной ампутации. Кроме того, из исследования исключались пациенты с доказанным наличием или подозрением на наличие доброкачественных или злокачественных новообразований, а также при указаниях на наличие семейного анамнеза злокачественных новообразований.

Среди 160 больных, включенных в исследование, было 130 (81,3%) мужчин и 30 (28,7%) женщин. Возраст больных варьировал от 43 до 75 лет, средний возраст составил 56,1±5,5 лет. У большинства больных, включенных в исследование (120 (75,0%) пациентов), этиологией поражения сосудов был атеросклероз. Кроме того, у 30 (18,8%) больных имелось сочетание атеросклеротического и диабетического поражения сосудов, а у 10 (6,2%) пациентов этиологией поражения сосудов был артериит (эндартериит или тромбангиит).

По классификации Fontaine-Покровского IIB ст. ХИНК была диагностирована у 88 (55,0%) пациентов, III ст. ХИНК - у 72 (45,0%) больных. Соответственно, 72 (45,0%) больных в нашем исследовании имели признаки критической ишемии нижних конечностей. У 8 пациентов имелись небольшие трофические поражения мягких тканей стопы и голени. Тем не менее, мы не сочли необходимым относить этих пациентов к IV ст. ХИНК по классификации Fontaine-Покровского в связи с тем, что трофические поражения у них были обусловлены прежде всего микроангиопатией (преимущественно диабетической этиологии), и по другим объективным признакам и результатам инструментальных методов исследования тяжесть ишемии конечности не соответствовала IV ст. ХИНК.

Из 160 пациентов, включенных в исследование, 80 (50%) в рамках данного исследования получали только комплексное консервативное лечение (группа 1), а 80 (50%) пациентов подверглись хирургическому лечению с выполнением прямых и непрямых реваскуляризирующих операций (группа 2). Внутри каждой группы в свою очередь были выделены основная и контрольная группа. Соответственно, у пациентов основной подгруппы группы 1 (группа 1А) в дополнение к стандартному медикаментозному лечению применялись генно-инженерные методики стимуляции ангиогенеза (п=40); пациенты контрольной подгруппы группы 1 (группа 1Б) получали только стандартное консервативное лечение (п=40). Внутри группы 2 также было сформированы две подгруппы: основная (группа 2А), в которой в дополнение к сосудистым операциям и последующему стандартному консервативному лечению использовались генно-инженерные технологии стимуляции ангиогенеза (п=40); и контрольная (группа 2Б), пациентам которой выполнялась операция с последующим использованием стандартной консервативной терапии (п=40). Таким образом, всего в основные группы, где использовались генно-инженерные методы индукции ангиогенеза, было включено 80 больных, в контрольные группы - 80 больных.

Во всех случаях генно-инженерные конструкции вводились в виде раствора, приготовленного в асептических условиях, путем внутримышечных инъекций. Инъекции осуществлялись в мышцы голени ишемизированной конечности по ее задней, медиальной и латеральной поверхностям, преимущественно в средней трети (т.е. в зоне максимального развития мышечного массива голени). В зависимости от росто-весовых показателей больного и степени развития мышц голени количество единовременно выполняемых инъекций составляло от 4 до 6, а объем вводимого в каждую точку голени раствора - от 0,5 до 1,0 мл. Введение всех генно-инженерных конструкций осуществлялось трижды с интервалом 7 дней (в единичных случаях допускалось уменьшение одного из интервалов между введениями до 5 — 6 дней или

увеличение до 8 - 9 дней). Разовые и суммарные (курсовые) дозы в пересчете на основную генно-инженерную конструкцию приведены в табл. 8.

Таблица 8.

Разовые и суммарные дозы вводимых генно-инженерных конструкций

Вариант Разовая доза Суммарная

конструкции (курсовая)доза

рАЫО 450 мкг 1350 мкг

рУЕвЕ 1000 мкг 3000 мкг

сеьо-лм; 1,0x10" бое 3,0x10" бое

Ас15-ЛМ? 1,0x10" бое 3,0x10" бое

Ай5-(ААгС+УЕОЕ) 1,0x10" бое 3,0x10" бое

Пациенты группы 1А помимо стандартной терапии получали лечение генно-инженерными комплексами с генами факторов-стимуляторов ангиогенеза. В группе 1А генно-инженерная конструкция рАЫв была использована у 5 больных, конструкция рУЕвЕ - у 25 больных, конструкция СЕЬО-ЛЖг - у 5 больных и конструкция Ас15-(/4МЗ+ УЕОЕ)- у 5 больных. Конструкция Ас15-ЛМ? в этой группе больных не использовалась. Пациенты контрольной (1Б) группы получали только лечение в объеме описанной выше стандартной комплексной консервативной терапии без введения генно-инженерных стимуляторов ангиогенеза.

Объем хирургического лечения и характеристика условий выполнения операций во 2-й группе представлены в табл. 9. Принципиальной особенностью комплексного лечения пациентов основной (2А) группы по сравнению с пациентами контрольной (2Б) группы явилось использование в комбинации с хирургическим лечением генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза. Рекомбинантные генно-инженерные комплексы с генами факторов ангиогенеза вводились внутримышечно в мышечный массив голени со стороны операции в соответствующих дозах по описанной выше схеме. Первое введение осуществлялось на следующий день после операции. В группе 2А генно-инженерная конструкция СЕЬО-ЛМ/ была использована у 5 больных, конструкция М5-АЫС - у 10 больных и конструкция Ас15-(ЛМЗ+ УЕСЕ) - у 25 больных. Конструкции с нативными плазмидами (рЛМ7 рУЕйЕ) в этой группе больных не использовались. Пациенты контрольной (1Б) группы получали только лечение в объеме стандартной консервативной терапии без введения генно-инженерных стимуляторов ангиогенеза.

Таблица 9.

Объем операций и характеристика условий их выполнения

Операция Группа 2А (основная) N=40 Группа 2Б (контрольная) N=40 Р

Прямые реваскуляризации

Балл состояния путей оттока по Rutherford 4,6±0,7 4,2±1,1 >0,05

Бедренно-подколенное шунтирование: выше щели коленного сустава ниже щели коленного сустава 12 (30,0%) 9 (22,5%) 14(35,0%) 7 (17,5%) >0,05

Аорто(подвздошно)- глубокобедренное шунтирование 4(10,0%) 6(15,0%) >0,05

Профундопластика 5 (12,5%) 3 (7,5%) >0,05

Неп рямые реваскуляризации

Балл состояния путей оттока по Rutherford 8,3±0,5 8,6±0,4 >0,05

Артериализация поверхностного венозного кровотока голени и стопы 6(15,0%) 7 (17,5%) >0,05

Поясничная симпатэктомия 2 (5,0%) 2 (5,0%) >0,05

Реваскуляризирующая остеотрепанация 2 (5,0%) 1 (2,5%) >0,05

Для оценки клинического состояния больных, его динамики и эффективности лечения использовали субъективные (физикальные) и объективные (лабораторные и инструментальные) методы исследований.

Физикальное исследование проводилось в объеме, принятом в отношении пациентов с заболеваниями периферических артерий. Всем больным выполняли стандартные лабораторные исследования, включающие общий анализ крови с определением лейкоцитарной формулы, общий анализ мочи, биохимический анализ крови (включая определение у части больных липидного спектра), коагулограмму. В рамках стандартной схемы исследования госпитализированных пациентов, а также с целью оценки соматического статуса и онкологического скрининга пациентам проводилась рентгеноскопия органов грудной клетки, электрокардиография, эхокардиография и ультразвуковое исследование органов брюшной полости в стандартном общепринятом объеме. Показатели дистанции безболевой ходьбы объективизировались во время проведения тредмил-теста, выполняемом на дорожке

Burdik, расположенной горизонтально (0° наклона) и движущейся со скоростью 2,4 км/ч (для пациентов с исходной IIB ст. ХИНК) или 1,5 км/ч (для пациентов с исходной III ст. ХИНК). Всем пациентам выполнялось ультразвуковое дуплексное сканирование артерий нижних конечностей. С целью уточнения диагноза, распространенности поражения и определения возможности выполнения реконструктивной сосудистой операции у части больных выполнялась рентгенокотрастная ангиография в стандартном объеме или мультиспиральная компьютерная томография с внутривенным контрастированием и последующей 3D-реконструкций изображений. Для оценки субъективного восприятия больными собственного здоровья мы использовали показатели качества жизни. В качестве опросника, оценивающего качество жизни, применялся сокращенный опросник SF-36 («Medical Outcomes Study: 36-Item Short Form Health Survey»), русскоязычная версия. Интегральную оценку результатов и эффективности комплексного лечения оценивали в соответствии со шкалой, предложенной Rutherford.

Статистический анализ результатов проводился с использованием программ

MedCalc и Statistica 10. При сравнении параметрических показателей использовали t-

„2 .,

критерий Стьюдента, непараметрических показателей - критерии %, точный критерий Фишера и U-критерий Манна-Уитни. При сравнении малых групп использовалась поправка Йейтса. При расчете корреляции использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Построение прогностических моделей осуществлялось с использованием регрессионного анализа. Различия между показателями считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

Результаты использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза в качестве самостоятельного метода лечения

В группе 1 ближайшие и отдаленные результаты лечения в сроки до 1 года изучены у 80 (100%) пациентов; отдаленные результаты в сроки до 2 лет - у 69 (86%) больных, в сроки до 3 лет - у 54 (68%), в сроки до 4 - 5 лет и более - у 31 (39%) пациентов.

При анализе жалоб и результатов физикального осмотра (в т.ч. оценке кожной температуры конечности, гипотрофичности мышц голени, цвета кожи конечности) отмечены явные преимущества по субъективным показателям в основной группе по сравнению с контрольной как при ПБ, так и при III ст. ХИНК. Различия у пациентов с III ст. ХИНК обнаруживались раньше и на ранних сроках являлись более выраженными, чем различия между основной и контрольной группой у больных с ПБ

ст. ХИНК. С другой стороны, в основной группе пациентов с исходной ИБ ст. ХИНК динамика субъективных показателей дольше имела положительный характер и в целом дольше сохранялась в отдаленном периоде наблюдения.

Результат оценки динамики дистанции безболевой ходьбы и максимально проходимой дистанции (по результатам тредмил-теста) представлен на рис. 4. На этом и последующих рисунках, демонстрирующих динамику результатов инструментальных тестов, представлена интегральная сравнительная оценка, отражающая средние максимально достигнутые значения соответствующих параметров в течение всего периода лечения и наблюдения.

При анализе рис. 4 можно видеть, что в основной группе показатели дистанций ходьбы статистически значимо увеличиваются не только при сравнении с исходными показателями до лечения, но они таюке статистически значимо превышают аналогичные результаты на фоне стандартных методов лечения в контрольной группе больных. Причем это относится как к больным с исходной ПБ ст. ХИНК, так и к пациентам с исходной III ст. ХИНК. Однако, степень этого прироста больше у пациентов с исходной ПБ ст. ХИНК, чем у больных с исходной III ст. ХИНК. Наблюдаемая динамика свидетельствует об эффективности методов стимуляции ангиогенеза в отношении улучшения показателей ходьбы, а также косвенно свидетельствуют об улучшении функционального резерва кровообращения конечности и ее устойчивости к ишемии.

□ Исход

и Результат (основная группа)

□ Результат (контрольная группа)

IIB ст. ХИНК III ст. ХИНК

МБ ст. ХИНК III ст. ХИНК

Рис. 4. Результаты тредмил-теста в группе 1 в сроки наблюдения до трех лет

р! - статистическая значимость различий исходного показателя и показателя после лечения в основной (1 А) группе; р2 - статистическая значимость различий показателя в основной (1 А) и контрольной (1Б) группах после лечения

На рис. 5 представлена интегральная оценка динамики ультразвуковых показателей (линейной скорости кровотока, лодыжечно-плечевого индекса давления) в основной и контрольной подгруппах группы 1. Видно, что при IIB ст. ХИНК прирост в основной группе как лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ), так и линейной скорости кровотока (ЛСК) является статистически значимым. Несмотря на то, что по показателю ЛПИ между основной и контрольной группой статистически значимых различий не выявлено, тем не менее при сравнении основной и контрольной групп по показателю ЛСК эти различия сохраняются, что косвенно может свидетельствовать об уменьшении периферического сопротивления и «разгрузке» микроциркуляторного русла за счет неоангиогенеза в основной группе. Что касается III ст. ХИНК, то здесь показатели регионарной гемодинамики меняются в меньшей степени. Обнаружен только статистически значимый прирост ЛСК в основной группе по сравнению с исходом. Ни по показателю ЛПИ, ни по показателю ЛСК статистически значимых различий между группами выявлено не было, несмотря на то, что по абсолютному значению в основной группе оба показателя были больше, чем в контрольной.

□ Исход

я Результат (основная группа)

□ Результат (контрольная группа)

ЦБ ст. ХИНК

ст. ХИНК

ПБст. ХИНК III ст. ХИНК

Рис. 5. Динамика показателей лодыжечно-плечевого индекса давления и линейной скорости кровотока по артериям голени в группе 1 в сроки наблюдения до трех лет

р1 — статистическая значимость различий исходного показателя и показателя после лечения в основной (1 А) группе; р2 - статистическая значимость различий показателя в основной (I А) и контрольной (1Б) группах после лечения

Для более объективной оценки степени улучшения микроциркуляции и функционального резерва кровообращения конечности нами изучены показатели прироста мышечной перфузии (по данным радиоизотопной сцинтиграфии) и времени восстановления исходных параметров кровотока при проведении нагрузочного теста. У пациентов с исходной II ст. ХИНК прирост мышечной перфузии по данным сцинтиграфии составил в основной (1А) подгруппе 160% от исходного, а в контрольной (1Б) подгруппе - 70% от исходного (р=0,012). Среди пациентов с исходной III ст. ХИНК прирост мышечной перфузии в основной и контрольной группах составил 105% и 20% от исходного (р<0,001). Динамика показателей времени восстановления исходных параметров кровотока представлена на рис. 6.

Анализ представленных данных показывает, что применение генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза очевидно демонстрирует объективно подтвержденный прирост мышечной перфузии. Статистически значимое уменьшение времени восстановления исходных параметров кровотока при проведении нагрузочного теста, указывает на улучшение функционального резерва микроциркуляции при применении данных методов, причиной которого в данном случае может быть только развитие микроциркуляторного русла за счет активации неоангиогенеза. Полученные результаты демонстрируют статистическую значимость различий обоих показателей между основной и контрольной группой, что свидетельствует о том, что, несмотря на некоторые положительные результаты, которые позволяет достичь современная стандартная фармакотерапия, степень выраженности этих результатов существенно уступает методикам стимуляции ангиогенеза. Несмотря на то, что как при IIB, так и при III ст. ХИНК удалось получить клинически и статистически значимые результаты в изменении параметров перфузии и функционального резерва кровообращения, демонстрирующие эффективность применения генно-инженерных методов стимуляции ангиогенеза, тем не менее выраженность этого эффекта максимальна при IIB ст. ХИНК по сравнению с III ст. ХИНК.

При проведении время-зависимого анализа регистрации отрицательных исходов заболевания по методу Каплан-Мейера в качестве основного оцениваемого исхода нами был взят комплексный показатель: ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечно-сосудистых причин. Результаты данного анализа представлены на рис. 7. Как видно из рисунка и приведенных числовых данных, статистической значимости различий по этому показателю мы не получили ни у больных с исходной IIB ст. ХИНК, ни у больных с исходной III ст. ХИНК, несмотря на то, что у пациентов основной группы в течение

приведенного срока наблюдения было зарегистрировано меньше отрицательных исходов, чем у пациентов контрольной группы.

□ Исход

I Результат (основная группа)

□ Результат (контрольная группа)

МБ ст. ХИНК

ст. ХИНК

Рис. 6. Динамика показателя времени восстановления

исходных параметров

кровотока при проведении нагрузочного теста в группе 1 р1 - статистическая значимость различий исходного показателя и показателя после лечения в основной (1А) группе; р2 -статистическая значимость различий показателя в основной (1А) и контрольной (1Б) группах после лечения

Время наблюдения, мес. Время наблюдения, мес.

Рис. 7. Анализ Каплан-Мейера комплексного показателя (ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечнососудистых причин) в основной и контрольной подгруппах группы 1: А - при исходной ПБ ст. ХИНК, Б - при исходной III ст. ХИНК

Результаты использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза в составе комплексного (в сочетании с хирургическими реваскуляризациями) лечения

В группе 2 ближайшие и отдаленные результаты лечения в сроки до 1 года изучены у 80 (100%) пациентов; отдаленные результаты в сроки до 2 лет - у 71 (88,8%) больных, в сроки до 3 лет - у 68 (85%), в сроки до 4 - 5 лет и более - у 50 (62,5%) пациентов.

При изучении отдаленных результатов комплексного лечения нами проводился раздельный анализ результатов прямых и непрямых реваскуляризаций отдельно для больных с исходной IIB и III ст. ХИНК

Сравнительный анализ результатов выполнения прямых реваскуляризирующих операций представлен в табл. 10. Из таблицы видно, что по всем анализируемым параметрам (дистанция безболевой ходьбы, максимально проходимая дистанция, прирост ЛПИ, линейная скорость кровотока по тибиальным артериям, прирост мышечной перфузии, время восстановления исходных параметров кровотока), в т.ч. отражающим не только клиническую эффективность проведенного лечения, но и косвенно отражающим микроциркуляцию тканей конечности и функциональный резерв кровотока, результаты в основной группе значительно превосходят результаты в контрольной группе, причем как при исходной IIB, так и III ст. ХИНК.

Таблица 10.

Сравнительный анализ клинических результатов выполнения прямых реваскуляризирующих операций у больных основной и контрольной групп

Оцениваемый параметр Исходная IIB ст. ХИНК Исходная III ст. ХИНК

Основная группа Контрольная группа Основная группа Контрольная группа

Дистанция безболевой ходьбы, м 560±110 410±165 480±130 320±180

р=0,021 /7=0,029

Максимально проходимая дистанция, м 1090±225 | 790±115 870±175 | 630±235

р<(),01 р=0,018

Прирост лодыжечно плечевого индекса, абс. от исходного 0,47±0,11 | 0,36±0,09 0,55±0,12 | 0,41 ±0,11

¿>=0,046 />=0,039

Линейная скорость кровотока по артериям голени, см/с 44±9 35±7 41±7 34±11

р=0,032 /7=0,040

Прирост перфузии мышц голени, % от исходного 420±160 | 310±170 510±125 350±180

р=0,025 р=0,011

Время восстановления исходных параметров кровотока, мин 5±2 | 8±2 6±2 | 11±4

р=0,041 /7=0,027

Нами был проведен интегральный анализ результатов лечения в основной и контрольной группе пациентов после выполнения прямых реваскуляризирующих операций в соответствии со стандартами оценки результатов хирургического лечения по шкале Rutherford. Результаты этой оценки представлены на рис. 8. Наибольшее количество пациентов в основной группе имели балл по Rutherford +3, тогда как в контрольной группе - балл +2. Кроме того, в основной группе при оценке результатов в подавляющем большинстве регистрировались только положительные баллы (+3, +2, +1) и лишь в единичных случаях балл 0. В контрольной же группе, наряду с положительными регистрировались и результаты с отрицательными баллами (-1), а также большее (по сравнению с основной группой) количество пациентов с результатом 0 баллов. Соответственно медиана результата в основной группе составляет +2,5, а в контрольной группе +1,5, что демонстрирует лучшие результаты лечения в основной группе по сравнению с контрольной.

+3 +2 +1 0 -1 -2 -3 ¡Основная группа □ Контрольная группа

Рис. 8. Оценка результатов прямых реваскуляризирующих операций в основной и контрольной группах пациентов в отдаленном периоде наблюдения по шкале Rutherford

Дополнительно был проведен время-зависимый анализ регистрации отрицательных исходов заболевания по методу Каплан-Мейера. Анализ проводился для двух показателей: проходимости шунтов (рис. 9) и вероятности наступления отрицательного исхода, за который был аналогично взят тот же комплексный показатель: ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечно-сосудистых причин (рис. 10). Выявлено, что в целом основная группа пациентов демонстрирует лучшие результаты по сравнению с

контрольной, однако ни в одном случае различия не достигли уровня статистической значимости. Тем не менее, если принимать во внимание абсолютные показатели и вид представленных кривых, то помимо констатации преимуществ лечения в основной группе можно отметить, что различия эти более выражены при III ст. ХИНК, чем при II ст. ХИНК. Именно при III ст. ХИНК при расчете комплексного показателя отрицательного исхода и построении соответствующих кривых получено значение статистической значимости, находящееся хоть и выше порогового значения, но тем не менее весьма близкое к этому порогу. Кроме того, несмотря на то, что при анализе кривых вероятности регистрации комплексного отрицательного исхода, статистически значимых различий не было, тем не менее в основной группе, как при исходной IIB, так и при III ст. ХИНК в течение 3 лет наблюдения не было зарегистрировано ни одного отрицательного исхода, в то время как в контрольной группе такие исходы регистрировались (при IIB ст. ХИНК - 2 случая, при III ст. ХИНК-4 случая).

р=0,2382

Основная группа Контрольная группа

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

10 15 20 25 30 35 40 Время наблюдения, мес.

р=0,5842

Основная группа Контрольная группа

15 20 25 30 35 40 Время наблюдения, мес.

Рис. 9. Анализ кумулятивной проходимости шунтов в основной и контрольной подгруппах после выполнения прямых реконструктивных операций: А — при исходной ПБ ст. ХИНК, Б - при исходпой III ст. ХИНК

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

р=0,2864

Основная группа Контрольная группа

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

/?=0,0752

Основная группа Контрольная группа

10 15 20 25 30 35 40 Время наблюдения, мес.

10 15 20 25 30 35 40 Время наблюдения, мес.

Рис. 10. Анализ комплексного показателя (ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечно-сосудистых причин) после выполнения прямых реконструктивных операций: А - при исходной IIB ст. ХИНК, Б - при исходной III ст. ХИНК

При анализе результатов комплексного лечения при выполнении непрямых реваскуляризирующих операций основные изучаемые параметры у пациентов с исходной ИБ и III ст. ХИНК оценивались совместно. Сравнительный анализ результатов выполнения непрямых реваскуляризирующих операций представлен в табл. 11.

Таблица 11.

Сравнительный анализ клинических результатов выполнения непрямых реваскуляризирующих операций у больных основной и контрольной групп в сроки до 3 лет после операции

Оцениваемый параметр Основная группа Контрольная группа Р

Дистанция безболевой ходьбы, м 320±105 220±125 0,033

Максимально проходимая дистанция, м 550±165 360±190 0,029

Прирост лодыжечно плечевого индекса, абс. от исходного 0,17±0,05 0,12±0,07 0,055

Линейная скорость кровотока по артериям голени, см/с 41±9 29±8 0,039

Прирост перфузии мышц голени, % от исходного 290±85 130±70 0,038

Время восстановления исходных параметров кровотока, мин 9±2 13±4 0,042

Из таблицы видно, что по показателям дистанции безболевой ходьбы и максимально проходимой дистанции результат в основной группе лечения статистически значимо превосходит соответствующий результат в контрольной группе лечения. Эти различия в абсолютных значениях начинают прослеживаться уже спустя 3 месяца наблюдения в отдаленном периоде, однако статистическую значимость они приобретают к 6-12-му месяцам наблюдения. По показателю ЛПИ статистически значимые различия в отдаленные сроки после операции между основной и контрольной группами выявлены не были, хотя при сравнении прироста ЛПИ различия находятся на самой границе статистической значимости (р=0,055). При этом и в основной и в контрольной группах удалось добиться клинически значимого прироста ЛПИ (>0,1). Что же касается показателя ЛСК, то здесь были выявлены статистически значимые различия между основной и контрольной группами, причем различия эти начинали обнаруживаться уже с 6-го месяца наблюдения. Результаты радиоизотопного метода исследования наглядно демонстрируют значительный прирост мышечной перфузии в основной группе по сравнению с контрольной. Соответственно, при оценке времени восстановления исходных параметров кровотока во время проведения нагрузочного теста также обнаруживаются статистически значимые различия, указывающие на улучшение функционального резерва в обеих группах, но статистически значимо более выраженное улучшение в основной группе по сравнению с контрольной.

Интегральный анализ результатов лечения после выполнения непрямых реваскуляризирующих операций был проведен в соответствии со стандартами оценки результатов хирургического лечения по шкале Rutherford (рис. 11).

ю 30

о 20

5 10

+3 +2 +1 в Основная группа

О -1 -2 -3 □ Контрольная группа

Рис. 11. Оценка результатов непрямых реваскуляризирующих операций в основной и контрольной группах пациентов в отдаленном периоде наблюдения по шкале Rutherford

Из рисунка видно, что в основной группе разброс баллов результата лечения составлял от 0 до +2 баллов, отрицательных значений шкалы в этой группе не зарегистрировано. При этом более 80% пациентов имели баллы +1 и +2, а половина пациентов данной группы имели балл оценки результата +2. Соответственно, значение медианы балла оценки результата по данной шкале составило +2. В контрольной группе разброс баллов оценки составил от -2 до +2, таким образом в контрольной группе были отмечены отрицательные баллы оценки; более того, баллы -1 и -2 имели около четверти больных. Лишь у 15% пациентов удалось достичь балла +2 в отдаленном периоде наблюдение. Большинство же пациентов в этой группе имели баллы оценки 0 и +1. Медиана балла оценки для контрольной группы составила +1. Таким образом, результаты оценки по данной шкале наглядно демонстрируют преимущества лечения в основной группе по сравнению с контрольной.

Результаты анализа частоты возникновения отрицательных исходов заболевания (ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечно-сосудистых причин) по методу Каплан-Мейера представлен на рис. 12. Достигнутая при этом статистическая значимость различий указывает на преимущество предлагаемого варианта комплексного лечения в отдаленном периоде наблюдения после непрямых реваскуляризирующих операций.

1,0 г 0,9 г 0,8" 0,7 г 0,6: 0,5: 0,4 : 0,3: 0.2: 0,1 : О.ОЬ

ч

/>=0,0479

Основная группа Контрольная группа

10 15 20 25 30 35 40

Время наблюдения, мес.

Рис. 12. Анализ комплексного показателя (ампутация конечности + развитие необратимых некротических изменений тканей + смерть от сердечно-сосудистых причин) после выполнения непрямых

реконструктивных операций

Особое внимание в работе уделялось вопросам безопасности применения предлагаемых технологий. Оценку безопасности проводили по принципу «¡ЩеШюп-1о-1геаЬ>: пациент включался в анализ безопасности, если генно-инженерная конструкция была введена ему хотя бы один раз, и хотя бы однажды у него было проведено повторное обследование. Любые нежелательные явления, возникающие у

34

данных пациентов, рассматривались как потенциально связанные с применяемым лечением.

В непосредственном и ближайшем периодах оценивали возникновение реакций гиперчувствительности, гипертермии, усиление или возникновение болевого синдрома, отека конечности, выраженность местной и системной воспалительной реакции. В отдаленном периоде оценивали смертность, возникновение новообразований. В связи с тем, что изучение безопасности методики в группе пациентов комплексным лечением (группа 2) связано с потенциальным воздействием множественных факторов, обусловленных влиянием и рисками самого хирургического вмешательства, оценка отдельных нежелательных реакций и безопасности прежде всего была проведена в группе 1, т.е. среди пациентов, у которых стимуляция ангиогенеза применялась в рамках консервативной терапии.

Установлено, что основные показатели клинического, биохимического анализа крови, общего анализа мочи и коагулограммы на фоне введения стимуляторов ангиогенеза существенно не изменяются. Исключение составляют показатели количества лимфоцитов, моноцитов, СОЭ, АЛТ и фибриногена, уровни которых незначительно повышаются на фоне введения индукторов ангиогенеза с вирусными векторами (что может свидетельствовать о наличии соответствующей системной воспалительной реакции организма), однако значения данных параметров возвращались к исходным у 100% пациентов в течение 1 месяца наблюдения.

При оценке динамики температуры тела в основной группе в целом, наблюдается статистически значимое повышение показателя температуры тела пациентом через сутки после введения индукторов ангиогенеза (исходно диапазон значений составляет 36,0 - 37,0 °С, а через сутки после введения - уже 36,0 - 39,0 °С). При этом к 7-му дню наблюдения температура тела вновь нормализуется (диапазон значений - 36,1 - 37,0 °С).

Нами зарегистрированы 4 летальных исхода через 10, 19, 22 и 26 мес после проведенного лечения. Таким образом, общая смертность составила 5,0%. В 3 случаях причиной смерти был острый инфаркт миокарда, в одном случае — точная причина смерти осталась неизвестной. У 3 из этих больных стимуляция ангиогенеза использовалась в качестве самостоятельного метода лечения в дополнение к стандартному курсу консервативной терапии, у одного — в дополнение к операции бедренно-подколенного шунтирования.

Не было зарегистрировано ни одного случая формирования сосудистых мальформаций или новообразований на фоне лечения как с использованием нативных плазмид, так и вирусных рекомбинантных конструкций.

Выраженная гиперчувствительная реакция на введение конструкций была определена у 2 (2,5%) больных. В обоих случаях были использованы вирусные конструкции. У обоих пациентов в анамнезе имелись аллергические реакции, а у одной пациентки — признаки неверифицированного системного заболевания (вероятно) соединительной ткани и нарушения показателей иммунограммы. Болевой синдром и/или отек тканей в месте введения в нашем исследовании наблюдались у 9 (11,3%) пациентов. Во всех случаях данные явления наблюдались при использовании вирусных конструкций и во всех же случаях они были транзиторными и полностью исчезали в течение 3—7 дней. Местные и системные воспалительные реакции в нашем исследовании наблюдались преимущественно при использовании вирусных векторов и практически отсутствовали при использовании нативных плазмид.

Суммарно оценка нежелательных реакций представлена в табл. 12.

Таблица 12.

Основные нежелательные реакции в ближайшем и отдаленном периодах наблюдения после введения генно-инженерных конструкций

Нежелательная реакция Нативные плазмиды, рАМС и pVF.Gr Векторные вирусные конструкции

СЕ Ш-ЛМ7 А(15-АМС Ас15-(АЫС+УЕСЕ)

Случаи гиперергических реакций - 1 - 1

Максимальная/средняя температура тела после введения конструкции, °С 37,4 / 37,2 39,4/38,1 38,0/37,5 37,7 / 37,4

Максимальная длительность температурной реакции, сут. 3 6 3 4

Выраженность болевых ощущений в конечности* + ++ + +

Выраженность отека конечности** + ++ + ++

Выраженность системной воспалительной реакции*** + +++ ++ ++

Смертность в отдаленном периоде наблюдения 2 1 0 1

* - + -незначительная боль, не требующая дополнительного назначения аналгетиков; ++ -боль средней интенсивности, требующая назначения ненаркотических аналгетиков; +++ -выраженная боль, требующая назначения наркотических аналгетиков;

** - + -отек менее 1 см в объеме по сравнению с контрлатеральной конечностью; ++ -отек 1-2 см; +++ -отек более 2 см;

*** - + -признаки незначительной СВО, не требующей дополнительного назначения препаратов; ++ -умеренная СВО, требуются назначения нестероидных противовоспалительных препаратов; +++ -выраженная СВО, требующая назначения стероидных препаратов.

Нами были также определены факторы, влияющие на результаты лечения с использованием технологий стимуляции ангиогенеза. В данный раздел исследования мы включили только пациентов группы 1А, у которых технологии индукции ангиогенеза использовались в качестве самостоятельного метода лечения. В качестве основного первичного критерия оценки результата лечения в данной прогностической модели мы рассматривали дистанцию безболевой ходьбы. При наличии клинически значимой степени прироста этого показателя относительно исходного значения, стойкости максимально достигнутого эффекта и субъективной оценки клинического статуса как «улучшение» результат оценивался нами как «хороший». Для выявления связи между каждым из анализируемых факторов и «хорошим» результатом использовался регрессионный анализ с определением коэффициента корреляции (г) и статистической значимости выявленных закономерностей. Результаты проведенного математического анализа представлены в табл.13.

Таблица 13.

Факторы, влияющие на результат лечения с применением генно-инженерных методик индукции ангиогенеза (регрессионный анализ)

Анализируемый фактор Коэффициент корреляции (г) Р

Пол 0,036 0,879

Возраст -0,214 0,068

Длительность анамнеза 0,113 0,231

Сопутствующий сахарный диабет -0,421 0,041

Дистанция безболевой ходьбы 0,389 0,039

Степень ишемии конечности -0,571 0,026

Время восстановления исходных параметров кровотока по результатам тредмил-теста -0,728 0,013

Наличие гемодинамически значимого поражения поверхностной бедренной артерии -0,392 0,038

Наличие гемодинамически значимого -0,601 0,029

поражения глубокой артерии бедра

Отсутствие гемодинамически значимых

поражений до уровня подколенной артерии 0,799 0,031

(«дистальные» формы)

Наличие артерий голени без гемодинамически значимых поражений 0,523 0,027

Приведенные результаты математического моделирования указывают на отсутствие значимого влияния на результат лечения таких факторов, как пол, возраст и длительность заболевания. Обращает на себя внимание выявленная статистически незначимая тенденция в отношении возраста. В отношении дистанции безболевой ходьбы выявляется лишь средняя положительная корреляция, тогда как в отношении степени ишемии — сильная отрицательная. Наличие сопутствующего сахарного диабета демонстрирует среднее отрицательное влияние на результат лечение. Отмечена сильная корреляционная связь между наличием непораженных артерий голени и результатом лечения. Сильную положительную корреляционную связь демонстрируют «дистальные» варианты поражения артериального русла (по сравнению с «проксимальными»). Следует обратить внимание на более сильное отрицательное влияние поражения глубокой артерии бедра, чем поражения собственно поверхностной бедренной артерии.

Выводы

1. Созданные оригинальные генно-инженерные конструкции обладают выраженной ангиогенной активностью: при испытании на биологических моделях они увеличивают абсолютное количество сосудов 1-го, 2-го и 3-го порядков в 2 - 4 раза по сравнению с контролем (р<0,0001)

2. При испытании на модели хронической ишемии конечности млекопитающих созданные генно-инженерные конструкции с генами УЕСЕ и ЛЛ'О стимулируют ангиогенез и статистически значимо увеличивают плотность капиллярного русла мышечной ткани. В условиях ишемизированной мышечной ткани действие данных конструкций более выражено (прирост плотности капилляров на 55 - 175%) по сравнению с интактной мышечной тканью (прирост плотности на 17 - 28%). Наибольший прирост плотности капилляров (120-175%) наблюдается при использовании рекомбинантных конструкций на основе аденовирусных векторов. Наименьшая неспецифическая реакция тканей на введение конструкции отмечается при использовании нативных плазмид.

3. Генно-инженерные конструкции с генами-стимуляторами ангиогенеза могут быть эффективно использованы в лечении пациентов с ХИНК, преимущественно в случаях поражения дистального артериального русла конечностей. Применение указанных технологий при изолированных дистальных формах поражения демонстрирует максимальную эффективность. Достигнутые эффекты сохраняются в течение трех лет и более.

4. При сочетании проксимальных и дистальных поражений использование стимуляции ангиогенеза в комплексе с реконструктивными сосудистыми операциями улучшает отдаленные результаты хирургического лечения: интегральный балл по шкале Rutherford при выполнении прямых реваскуляризаций в основной группе от 0 до +3, медиана +2,5, в контрольной группе - от -1 до +3, медиана +1,5; при выполнении непрямых реваскуляризаций в основной группе от 0 до +2, медиана +2, в контрольной группе - от -2 до +2, медиана +1.

5. Комбинация хирургических реваскуляризаций с генно-инженерными методами стимуляции ангиогенеза демонстрирует лучшие результаты по сравнению с их использованием по отдельности, позволяя при наличии оптимальных условий достичь 100% сохранности конечности при выполнении прямых реваскуляризаций и 90% сохранности конечности при выполнении непрямых реваскуляризаций в сроки до 36 месяцев после операции.

6. Наибольшую эффективность показывают генно-инженерные конструкции, имеющие в своем составе несколько проангиогенных генов (комбинация генов ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов). Использование генно-инженерных методов индукции ангиогенеза наиболее эффективно при наличии остаточного функционального резерва кровообращения конечностей. При наличии необратимых изменений, выраженной ишемии, сопровождающейся декомпенсацией системы микроциркуляции, применение данных технологий нецелесообразно.

7. При использовании в качестве самостоятельного консервативного лечения метод демонстрирует максимальную эффективность в ближайшем и отдаленном периоде наблюдения у пациентов с ПБ ст. ХИНК (в среднем по группе увеличение дистанции безболевой ходьбы на 271%, увеличение перфузии на 160%, уменьшение времени восстановления исходных параметров кровотока на 50%). У пациентов с III ст. ХИНК степень выраженности эффекта и его продолжительность меньше (увеличение дистанции безболевой ходьбы на 250%, увеличение перфузии на 105%, уменьшение времени восстановления исходных параметров кровотока на 28%).

8. При использовании в качестве комплексного метода лечения в сочетании с реконструктивными операциями генно-инженерные технологии индукции ангиогенеза не влияют на ближайшие результаты лечения, однако улучшают отдаленные результаты лечения как у пациентов с НБ так и с III ст. ХИНК

9. Не установлено влияние на эффективность применения метода пола, возраста больного, длительности анамнеза. Наличие сахарного диабета (г=-0,421),

диффузное поражение бедренных артерий (г=-0,392 для поверхностной бедренной артерии и г=-0,601 для глубокой артерии бедра), выраженное снижение функционального резерва кровообращения конечности (увеличение времени восстановления исходных параметров кровотока при тредмил-тесте, г=-0,728) ухудшает прогноз лечения больных с использованием технологий стимуляции ангиогенеза. Напротив, Отсутствие гемодинамически значимых поражений до уровня подколенной артерии (г=0,799), наличие непораженных тибиальных артерий (г=0,523), достаточный функциональный резерв кровообращения позволяют прогнозировать хороший эффект лечения с применением технологий стимуляции ангиогенеза.

10. Предложенные технологии лечения хорошо переносимы, все нежелательные явления в ближайшем периоде наблюдения являются транзиторными. В отдаленном периоде наблюдения предлагаемые технологии лечения безопасны.

Практические рекомендации

1. У пациентов с ХИНК при наличии поражений артерий голени необходимо использовать предложенные генно-инженерные методы стимуляции ангиогенеза для повышения эффективности лечения. Методика может быть использована у пациентов любого возраста, пола и вне зависимости от длительности анамнеза ХИНК

2. В качестве самостоятельного метода лечения технологии стимуляции ангиогенеза следует применять в первую очередь у пациентов с НБ ст. ХИНК, а также при наличии трофических язвенных поражений, обусловленных микроангиопатией.

3. В составе комплексного лечения в сочетании с хирургической реваскуляризацией генно-инженерные методы стимуляции ангиогенеза необходимо использовать у пациентов с любой степенью ишемии как при выполнении прямых так и при выполнении непрямых реваскуляризаций.

4. Рекомендовано использовать методы стимуляции ангиогенеза у пациентов с преимущественно дистальными поражениями артериального русла конечностей. В случае сочетания дистальных поражений с проксимальными методы индукции ангиогенеза должны быть использованы совместно с хирургическими методами восстановления кровотока.

5. Предлагаемые методы должны использоваться при отсутствии признаков декомпенсации кровообращения конечности и наличии у пациентов остаточного функционального резерва кровообращения конечности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК (варианты), способ индукции ангиогенеза, способ лечения ишемической болезни и композиция для лечения ишемической болезни// Патент РФ на изобретение № 2209245, 27.07.2003, приоритет от 01.08.2001 (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, Н.О.Миланов, А.В.Гавриленко и др).

2. Неинфекционный для человека аденовирус как вектор для заместительной генной терапии нарушений ангиогенеза, обеспечивающий эффективный синтез ангиогенина человека в трансфецированных клетках млекопитающих, способ индукции ангиогенеза, способ лечения ишемической болезни, композиция для индукции ангиогенеза и лечения ишемической болезни// Патент РФ на изобретение № 2321631, 10.04.2008, приоритет от 27.12.2006 (соавт. Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков, Б.С.Народицкий и др).

3. Новый подход к лечению критических ишемических состояний с использованием генно-инженерных методов стимуляции неоангиогенеза// Материалы конференции Новые биокибернетические и телемедицинские технологии XXI века для диагностики и лечения заболеваний человека («НБИТТ-21»). - Петрозаводск. - 23 - 25 июня 2003 г. - С. 25. (соавт. Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко)

4. Использование генно-инженерных технологий в лечении критических ишемических состояний при поражении сосудов нижних конечностей// Тезисы докладов и сообщений Девятого Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. - Москва. - 18 —21 ноября 2003 г. - С.115. (соавт. Б.А.Константинов,

A.В.Гавриленко, Г.Ф.Шереметьева)

5. Возможности и перспективы лечения критической ишемии с использованием генно-инженерных технологий// Ангиология и сосудистая хирургия. - 2003 -т.9. - №3. С. 14 - 18. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко,

B.З.Тарантул и др).

6. Новые технологии в комплексном лечении ишемических состояний при поражении сосудов нижних конечностей с использованием генно-инженерных методик стимуляции неоангиогенеза// Материалы III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 20 - 24 января 2004 г. - С.421 -422.

7. Генно-инженерные технологии в комплексном лечении критической ишемии нижних конечностей// Материалы научной конференции молодых ученых «Новое в реконструктивной хирургии». - Москва. - 19 марта 2004 г. - С. 129.

8. Перспективы использования генной инженерии в лечении критических ишемических состояний// Анналы РНЦХ РАМН. - 2004. - выпуск №13. - С. 71 - 76. (соавт. Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко, Г.Ф.Шереметьева).

9. Современные возможности хирургического лечения критической ишемии нижних конечностей// Медицинская помощь. 2004 - №4. - С. 3 - 6. (соавт. Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко, С.И.Скрылев).

10. Использование генно-инженерных конструкций с геном ангиогенина в комплексном лечении хронической критической ишемии нижних конечностей// Тезисы докладов и сообщений X Всероссийского съезда сердечно-сосудистых

хирургов. - Москва. - 10-13 ноября 2004 г. - С. 327. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко).

11. Рекомбинантный аденовирус птиц СЕЬО-АЫО, несущий ген ангиогенина человека, индуцирует неоваскуляризацию в передней большеберцовой мышце крысы// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2004. - №4. -С. 38 - 40. (соавт. С.В.Авдеева, Н.В.Хайдарова, М.М.Шмаров, Д.Ю.Логунов и

др)-

12. Отдаленные результаты применения генно-инженерных технологий для лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков. — Уфа. — 24 — 27 мая 2005 г. (соавт. Н.П.Бочков, Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко)

13. Экспериментальные и клинические результаты использования генно-инженерных конструкций с геном ангиогенина в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Медицинская генетика. - 2005. - т.4. - № 7. - С. 327 -331. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко, В.З.Тарантул и ДР)-

14. Генно-инженерные и клеточные технологии в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Материалы II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва. - 20 - 21 октября 2005 г. - С. 104 - 105. (соавт. А.В.Гавриленко, В.З.Тарантул, Д.В.Гольдштейн, Б.С.Народицкий и др).

15.Тредмил-тест в оценке эффективности консервативного лечения больных с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей// Материалы XI Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2005. - т. 6. - №5. - С. 115. (соавт. Е.Ф.Дутикова, В.А.Сандриков, А.В.Гавриленко)

16. Результаты применения мезенхимальных стволовых клеток и генно-инженерных конструкций с генами ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Материалы XI Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2005. - т. 6. - №5. - С. 294. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко).

17. Применение генно-инженерных конструкций с генами ангиогенина и фактора роста эндотелия сосудов в комплексном лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы 16-й (XX) Международной конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов. -Москва. - 21 - 23 ноября 2005 г. - С. 172 - 173. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко).

18. Отдаленные результаты лечения хронической ишемии нижних конечностей с использованием генно-инженерных конструкций с геном ангиогенина// Анналы хирургии. - 2005. - № 3. - С. 23 - 27. (соавт. Б.А.Константинов, Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко, В.З.Тарантул и др).

19. Генно-инженерные технологии стимуляции ангиогенеза в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Анналы хирургии. - 2005. - № 4. -С. 5 - 8. (соавт. А.В.Гавриленко, И.И.Фомичева).

20. Results of treatment of chronic lower limb ischemia by gene transfer of vascular endothelial growth factor and angiogenin// Abstracts of 55th International Congress of The European Society for Cardiovascular Surgery. - St. Petersburg, Russian Federation. - 2006. - May 11 - 14. - P. s85. (соавт. A.V.Gavrilenko, N.P.Bochkov, B.A.Konstantinov).

21. Возможности улучшения результатов хирургического лечения хронической ишемии нижних конечностей у пациентов с дистальными формами поражения путем использования генно-инженерных методик стимуляции ангиогенеза// Тезисы докладов и сообщений Десятой ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. - Москва. - 14 - 16 мая 2006 г. - С. 72. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков, Б.А.Константинов).

22. Результаты применения клеточных и генно-инженерных технологий в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Тезисы Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и их использование в здравоохранении». - Москва. - 24 - 25 мая 2006 г. - С. 89. (Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко, Т.А.Фатхудинов, Н.П.Бочков).

23. Комплексное лечение хронической ишемии нижних конечностей с использованием генно-инженерных и клеточных стимуляторов ангиогенеза// Материалы XII Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2006. - т. 7. - №5. - С. 266 (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

24. Экспериментальное изучение возможности использования генно-инженерных конструкций с проангиогенными генами для индукции ангиогенеза в ишемизированных тканях конечностей// Материалы XII Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2006. - т. 7. - №5. - С. 269 (соавт. А.В.Гавриленко, Н.В.Хайдарова, Е.З.Кочарян, Б.С.Народицкий и др).

25. Генно-инженерные технологии в лечении хронической ишемии нижних конечностей// Вестник РАМН. - 2006. - № 9-10. - С. 6 - 11. (соавт. Н.П.Бочков, Б.А.Константинов, А.В.Гавриленко, С.В.Авдеева и др).

26. Ближайшие и отдаленные результаты использования генно-инженерных конструкций с проангиогенными генами в лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы 11 Ежегодной сессии НЦССХ им.

A.Н.Бакулева РАМН. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2007. - т. 8. - №3 (приложение). - С. 71. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков)

27. Angiogenesis stimulation using gene transfer for complex treatment of chronic lower limb ischemia: preliminary results of controlled clinical study// Abstracts of 56th International Congress of The European Society for Cardiovascular Surgery. -Venice, Italy. - May 17 - 20, 2007. - P. s94 - 95. (соавт. A.V.Gavrilenko,

B.A.Konstantinov, N.P.Bochkov).

28. Результаты клинического использования генно-инженерных конструкций с генами факторов-стимуляторов ангиогенеза в комплексном лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы 18-й (XXII) международной конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов «Внедрение высоких технологий в сосудистую хирургию и

флебологию». Ангиология и сосудистая хирургия. - 2007. - № 2 (приложение). -С. 41 -42. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

29. Современная стратегия комплексного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: сочетание реконструктивных сосудистых операций с генными технологиями стимуляции ангиогенеза// Сборник научных трудов «Традиционные и новые направления сосудистой хирургии и ангиологии». - Челябинск. - 2007. - вып. четвертый. - С. 19-20. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов. Н.П.Бочков).

30. Комплексное хирургическое лечение пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генных технологий стимуляция ангиогенеза: пилотные результаты контролируемого исследования// Материалы XIII Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2007. - т. 8. - № 6. - С. 297. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

31. Ближайшие и отдаленные результаты использования генных стимуляторов ангиогенеза в комбинации с реконструктивными сосудистыми операциями при лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы 12 Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2008. - т. 9. - № 3 (приложение). - С. 90. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

32. Сочетание реконструктивных сосудистых операций с генно-инженерными технологиями стимуляции ангиогенеза: современная стратегия улучшения отдаленных результатов лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей// Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008. - т. 14. - № 4. - С. 49 - 53. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

33. Эффективность и безопасность комплексного метода лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генных индукторов ангиогенеза// Материалы XIV Всероссийского съезда сердечнососудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2008. -т. 9. - №6. - С. 291. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

34. Комбинация реконструктивных сосудистых реконструкций с генно-инженерными стимуляторами ангиогенеза в лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей// Сборник научных трудов «Традиционные и новые направления сосудистой хирургии и ангиологии». - Челябинск. - 2009. -вып. пятый. - С. 24 - 27. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов. Н.П.Бочков).

35. Улучшение результатов хирургического лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей путем использования генно-инженерных стимуляторов ангиогенеза// Материалы 21-й международной конференции Российского общества ангиологов и сосудистых хирургов. Ангиология и сосудистая хирургия. - 2009. - т. 15. - № 2 (приложение) - С. 82 - 83. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.А.Константинов, Н.П.Бочков).

36. Стимуляция ангиогенеза в улучшении результатов хирургического лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: экспериментальное обоснование и эффективность клинического применения// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2009. - т. 2. - № 3. С. 45 - 49. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

37. Использование генных индукторов неоангиогенеза в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: фундаментальные аспекты и клинические результаты// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2009. - т. 2. - №5. - С. 44 - 48.

38. Возможности улучшения отдаленных результатов реконструктивных сосудистых операций при хронической ишемии нижних конечностей с использованием индукторов ангиогенеза// Материалы XV Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2009. - т. 10. - № 6. - С. 312. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

39.Генотерапия в лечении сердечно-сосудистых заболеваний: фундаментальные основы, терапевтический потенциал, современное состояние и перспективы// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2010. - т. 3. - № 3. - С. 4 - 11. (соавт. Н.П.Бочков).

40. Результаты применения генных технологий в комплексном хирургическом и консервативном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2010. - т. 3. - № 3. - С. 47 - 51. (соавт. А.В.Гавриленко, Б.С.Народицкий, В.З.Тарантул, Н.П.Бочков).

41. Безопасность применения генно-инженерных методов индукции ангиогенеза у пациентов с хронической ишемией: клинический опыт и проблемы оценки// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. -2010. - т. 3. -№5. - С. 58 -61.

42. Генотерапия хронической ишемии нижних конечностей// Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону. Медицинская генетика (приложение). - 2010. - С. 27 - 28. (соавт. Н.П.Бочков, А.В.Гавриленко, Б.С.Народицкий, В.З.Тарантул).

43. Отдаленные результаты комплексного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием реконструктивных операций и генно-инженерных технологий индукции ангиогенеза// Материалы 22 (XXVI) Международной конференции «Нерешенные вопросы сосудистой хирургии». Ангиология и сосудистая хирургия. - 2010. - т. 16. - № 4 (приложение). - С. 74 -75. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

44. Экспериментальное исследование индукции ангиогенеза в мышечной ткани при использовании генно-инженерных конструкций с генами факторов роста: потенциальная возможность и вероятные механизмы// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2011. - т. 4. - №1. С. 46 - 50.

45. Результаты использования генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза в комплексном лечении больных с хронической ишемией нижних конечностей: экспериментально-клинические параллели// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2011. - т. 4. - № 1. - С. 57 - 60. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

46. Прогнозирование результатов методик комплексного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, основанного на технологиях стимуляции ангиогенеза// Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. -2011. - т. 4. - № 2. - С. 37 - 39. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

47. Эффективность и безопасность применения препарата «Неоваскулген» в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей

(ПЬ - III фаза клинических испытаний)// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - т. VI. - № 3. - С. 76 - 83. (соавт. П.Г.Швальб, А.В.Гавриленко, Р.Е.Калинин, Ю.В.Червяков и др).

48. Комплексное лечение пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генных индукторов ангиогенеза: ближайшие и отдаленные результаты// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011. - т. VI. -№ 3. - С. 84 - 88. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

49. Сравнительный анализ различных методов комплексного лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генно-инженерных стимуляторов ангиогенеза// Материалы сателлитного симпозиума «Терапевтический ангиогенез: мировой и Российский опыт лечения ишемии нижних конечностей» в рамках XVII Всероссийского съезда сердечнососудистых хирургов. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. - т. VI. - № 4. - С. 124 - 125. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

50. Клинические результаты применения генно-инженерных технологий индукции ангиогенеза в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей// Материалы 23 (XXVII) Международной конференции «Актуальные вопросы сосудистой хирургии». Ангиология и сосудистая хирургия. - 2012. - т. 16. - № 2 (приложение). - С. 64 - 65. (соавт. А.В.Гавриленко).

51. Комплексное хирургическое лечение пациентов с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генных индукторов ангиогенеза// Хирургия. - 2013. - № 2. - С. 25 - 29. (соавт. А.В.Гавриленко, Н.П.Бочков).

Список сокращений

БОЕ - бляшкообразующая единица

ЛПИ - лодыжечно-плечевой индекс

ЛСК - линейная скорость кровотока

СВО - системная воспалительная реакция

ХИНК - хроническая ишемия нижних конечностей

Ad5 - вектор на основе аденовируса человека 5-го типа

ANG - ангиогенин

CELO - вектор на основе вируса CELO GFP - зеленый флуоресцентный белок PBS - натрий-фосфатный буфер pGEM - векторная система для клонирования VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Заказ № 86-П/04/2013 Подписано в печать 19.04.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,9

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru