Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Церебральная ишемия новорожденных: факторы риска и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови

На правах рукописи

ДАВАА ЯНА ХУРАГАН-ООЛОВНА

ЦЕРЕБРАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ: ФАКТОРЫ РИСКА И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ

14.01.08 - педиатрия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 СЕН 2012

Красноярск - 2012

005052522

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Терещенко Сергей Юрьевич

Научный консультапг:

доктор медицинских наук

Зайцева Ольга Исаевна

Официальные оппоненты:

Прахин Ефим Исаакович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВГТО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздравсоцразвития России, профессор кафедры поликлинической педиатрии и пропедевтики детских болезней с курсом ПО

Савченко Андрей Анатольев1гч — доктор медицинских наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», профессор кафедры медицинской биологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «11» октября 2012 г. в «10°°» часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.01 на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздравсоцразвития России по адресу: 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « 'У"» сентября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 208.037.01

доктор медицинских наук, доцент

Штарик С.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема снижения перинатальной заболеваемости и смертности в настоящее время остается важной государственной задачей (Савичева А. М. с соавт., 2009; А.А. Баранов, 2010; Фролова О. Г. с соавт., 2010). При этом известно, что перинатальное гипоксически-ишемическое повреждение центральной нервной системы (ЦНС) остается главной причиной смертности новорожденных и представляет важнейшую проблему перинатологии (И.С. Сидорова, И.О. Макаров., 2000; R. Duran et al., 2008). Младенческая смертность в Республике Тыва за 2011 год по данным государственной и отраслевой статистической отчетности составил 13,7%о, перинатальная смертность 7%о. По причинам младенческой смертности в республике первое место занимают отдельные состояния, возникающие в перинатальном периоде 31,3%. Показатель заболеваемости отдельными состояниями, воз1шкающими в перинатальном периоде в 2011 году составил 5902,4 на 100 тысяч населения. Задача предупреждения антенатально обусловленных заболеваний новорожденных требует пристального изучения ее различных аспектов. В основу должна быть положена система раннего выявления нарушений здоровья и развития новорожденных групп высокого перинатального риска с использованием современных критериев оценки состояния ребенка, в том числе на уровне клеточных структур (Корнева М. Ю. с соавт., 2005; Иванова Н. А. с соавт., 2009).

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одним из ранних и чувствительных показателей нарушений гомеостаза является состояние клеточных мембран (Манчук В. Т. с соавт., 2003; Рязанцева Н. В. с соавт., 2004; Новицкий В. В. с соавт., 2006; Прахин Е. И. с соавт., 2007). У детей структурно-функциональное состояние биомембран многими исследователями используется в качестве маркера физической зрелости организма и показателя становления его систем (Herrera E.et al., 2003; Drouillet Р. et al., 2009; Kilari A. S. et al., 2009).

Исследователями предполагается, что в период новорожденности степень морфофункционального развития ребенка находит отражение в структуре и функции клеточных мембран (Стольникова М. В. с соавт., 2005; Новицкий В. В. с соавт., 2006; Колодяжная Т. А. с соавт., 2006). Это связано с фундаментальными свойствами биологических мембран, обеспечивающих во внутриутробном периоде клеточную рецепцию, транспорт веществ в клетки, клеточную регуляцию фосфолипидного и белкового обменов, ионного баланса клеток, то есть базовых факторов нормального роста и развития плода и новорожденного.

К настоящему времени установлена зависимость между состоянием клеточных мембран и уровнем заболеваемости плода и новорожденного. При этом отечественными и зарубежными исследователями изучаются различные факторы, оказывающие повреждающее действие на клеточные структуры организма новорожденного, среди которых видное место занимает хроническая гипоксия плода, гипоксически-ишемические поражение ЦНС,

соматические и инфекционные заболевания матери, имеющие единое патогенетическое звено - фето-плацентарную недостаточность и гипоксию (Мурашкин В. В. с соавт., 2004; Андриевская И. А. с соавт., 2007; Ишутина Н. А. с соавт., 2007; Никифорович И. И. с соавт., 2009). Именно гипоксическое поражение плода и новорожденного характеризует состояние напряженности и адекватности адаптационных процессов в раннем постнаталыюм периоде и создает предпосылки для высокой заболеваемости новорожденных, а в перспективе и у детей раннего возраста. Тем не менее, до сих пор открытым остается вопрос, существует ли патогенетическая связь между указанными процессами и структурно-функциональным состоянием мембран эритроцитов новорожденного. Это имеет принципиальное значение, так как именно эритроцит и его мембрана может считаться первичной мишенью для вызванного гипоксией и асфиксией повреждения клеток организма (Мусаев А. Т. с соавт., 2004; 5коита1оуа А. й а1„ 2009; Ша^игеп М. е1 а1„ 2010).

Таким образом, несмотря на то, что обсуждаемой проблеме в настоящее время уделяется пристальное внимание исследователей, не существует целостного представления о патогенезе нарушений структуры и функции эритроцитарных мембран у новорожденных с церебральной ишемией. Не освещен вопрос о влиянии на структуру и функцию мембраны эритроцитов особенностей течения перинатального периода. Из-за противоречивости и малочисленное™ исследований в данном направлении не представляется возможным получить комплексную оценку структурно-функционального состояния мембран эритроцитов новорожденных детей с перинатальными гипоксически-ишемическими повреждениями ЦНС. Изложенное определяет актуальность проведенного исследования и его научно-практическую значимость.

Цель исследования: выявить факторы риска и оценить структурно-функциональную организацию плазматических мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных при церебральной ишемии.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту встречаемости церебральной ишемии у новорожденных тувинцев, рожденных в Республике Тыва.

2. Провести комплексный анализ клинико-анамнестических данных и выявить признаки, ассоциированные риском формирования церебральной ишемии новорожденных.

3. Изучить структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови методом флюоресцентного зондирования с учетом значимых факторов риска церебральной ишемии новорожденных.

4. Изучить структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови у новорожденных с церебральной ишемией.

5. Установить характерные особенности строения мембран эритроцитов пуповинной крови в зависимости от показателей физического развития новорожденных.

Научная новизна исследования

Впервые установлены основные факторы риска церебральной ишемии у новорожденных тувинцев, рожденных в г. Кызыл Республики Тыва.

Впервые показано, что у новорожденных, родившихся от матерей, беременность которых протекала на фоне анемии, наблюдаются признаки структурной дезорганизации мембран эритроцитов, затрагивающие главным образом их белковую составляющую. Это сопровождается нарушением пространственной конфигурации и топографии белков мембран со смещением расположения протеинов в липидном бислое.

Впервые показано, что хроническая внутриутробная гипоксия плода сопровождается преимущественным изменением липидной компоненты матрицы мембран эритроцитов, что проявляется повышением проницаемости липидного бислоя мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных.

Впервые показано, что наличие клинических признаков церебральной ишемии у новорожденных сопряжено с повышенным показателем дестабилизации мембран. Схожая направленность процессов дезорганизации мембран эритроцитов наблюдается у новорожденных с признаками асфиксии при рождении.

Практическая значимость работы

Выявленные особенности важнейших факторов риска развития церебральной ишемии новорожденных - анемии беременных и внутриутробной гипоксии плода рекомендовано использовать для профилактики и раннего скрининга риска церебральной ишемии.

Установлена взаимозависимость показателя погруженности белков в липидный бислой эритроцитарных мембран новорожденных и анемии беременной. Снижение степени погруженности мембранных белков предложено использовать для ранней диагностики железодефицитного состояния у детей первого года жизни.

Определена взаимосвязь интегрального показателя физического развития новорожденных (массо-ростового индекса Кетле I) с кальций-связывающей способностью мембран эритроцитов пуповинной крови, что рекомендовано использовать в качестве дополнительного доклинического диагностического параметра обеспеченности кальцием в периоде новорожденности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Важнейшими факторами риска церебральной ишемии новорожденных тувинцев, рожденных в г. Кызыл Республики Тыва, являются анемия беременных и хроническая внутриутробная гипоксия плода.

2. Для структурно-функционального состояния мембран эритроцитов новорожденных детей от матерей с патологией беременности, ассоциированной с высоким риском церебральной ишемии, характерны признаки дезорганизации белкового и липидного компонентов матрицы мембраны и конформации её функционально-активных молекулярных групп.

3. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповипной крови новорожденных, перинатальный период которых протекал с церебральной ишемией и асфиксией, характеризуется повышенными показателями дестабилизации мембран эритроцитов.

Внедрение результатов исследования в npaicriiKy

Результаты исследования внедрены в практическую работу второго детского отделения клиники Института медицинских проблем Севера СО РАМН (г. Красноярск), в практику работы акушерского стационара Перинатального центра Республики Тыва (г. Кызыл).

Апробация работы

Материалы работы были представлены на XII межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2009); на XIII конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии» (Томск, 2009); на симпозиуме с международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний» (Красноярск,

2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 20-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Красноярск, 2010); научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера» (Абакан, 2010); на итоговой научно-практической конференции НИИ МПС СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск,

2010); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва» (Кызыл, 2010); XXII Европейском Конгрессе по перинатальной медицине (Granada, Spain, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах и 1 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Диссертация содержит 152 страниц машинописного текста, 15 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы включает 239 источников, в том числе 123 отечественных и 116 зарубежных авторов.

Личный вклад

Лично автором проведены планирование работы, поиск и анализ литературы по проблеме диссертации, отбор беременных женщин для исследования, сбор клинико-анамнестических данных, забор пуповинной крови новорожденных при рождении, исследование физико-химических характеристик мембран эритроцитов, статистическая обработка и анализ материала, написание публикаций и диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и ¡методы исследования

Для решения поставленных в настоящем исследовании задач за период с 2006 года по 2008 год проведены клинические наблюдения и специальные биофизические исследования клеточных мембран эритроцитов пуповинной крови у 150 новорожденных на базе акушерского стационара Перинатального центра г. Кызыл Республики Тыва. Обследование включало в себя сбор анамнестических данных беременных с заполнением специально разработанной анкеты, включающей данные по течению беременности, родов, раннего неонатального периода. На проведение исследования получено разрешение этического комитета. Родителями подписано информированное согласие на обследование ребенка.

Критерии включения в исследование:

■ физиологические роды в головном предлежании плода;

■ доношенные новорожденные дети.

Критерии исключения:

■ недоношенность и перекошенность детей;

■ новорожденные с врожденными пороками центральной

нервной системы;

■ указание на гемолитическую анемию и желтуху

новорожденных.

Получение биологического материала для исследования: забор крови осуществлялся у новорожденных из вены пуповины при рождении - брали 5 мл крови в сухую чистую пробирку с антикоагулянтом (с гепарином в качестве антикоагулянта, из расчета 0,05 мл раствора с концентрацией 1000 ЕД/мл на 5 мл крови). Кровь центрифугировали при 500 g в течение 15 минут, по окончании отбирали сыворотку и в контейнер помещали 2 мл эритроцитарной массы. Полученный материал хранился при температуре минус 20°С. Выделенную эритроцитарную массу использовали для исследования физико-химических свойств мембран.

Методы исследования физико-химических свойств плазматической мембраны эритроцитов.

Структурно-функциональные характеристики плазматической мембраны эритроцитов исследованы методом флюоресцентной спектроскопии в

соответствии с рекомендациями Ю. А. Владимирова и Г. Е. Добрецова (1980). Все исследования биофизических характеристик мембран методом флюоресцентной спектроскопии (флюорометрии) проведены на спектрофлюориметре «Hitachi MPF-4» (Япония). Использованы зонды: пирен, 1-аланинонафталин-8-сульфонат (АНС), нистатин. Объемное соотношение зонд: суспензия мембран для всех зондов составляло 1:10. Исследование проводилось при комнатной температуре.

Выделение мембранного материала из эритроцитов: мембраны эритроцитов из полученной эритроцитарной массы выделены с помощью метода J. Т. Dodge (1963). Исследованы следующие биофизические характеристики мембран: собственная беззондовая флюоресценция NADH мембран эритроцитов (ЕФ); собственная безззондовая флюоресценция триптофановых остатков мембранных белков (триптофанилов) (ЕФ); степень погруженности мембранных протеинов в липиды по коэффициенту индуктивно-резонансного перехода в системе триптофанилы-пирен (ОЕ); микровязкость поверхностных мембранных структур (вращательной диффузии), определенная по параметрам поляризации (коэффициенту анизотропии) флюоресценции зонда АНС (ОЕ); текучесть глубоких областей липидного бислоя мембран, определенная по отношению флюоресценции эксимеры/мономеры пирена (ОЕ); молекулярная организация мембран и конформация белковых глобул в области белок-липидного взаимодействия, исследованная по параметру интенсивности флюоресценции зонда АНС после связывания с поверхностными структурами мембраны (ЕФ); отношение флюоресценция АНС/флюоресценция триптофанилов (ОЕ); проницаемость эритроцитарных мембран, определенная по интенсивности флюоресценции каналообразующего зонда нистатина (ОЕ); кальций-аккумулирующая способность мембран эритроцитов (ОЕ) исследована с помощью зонда ХТЦ.

Статистические методы анализа.

Статистическую значимость различий количественных признаков анализировали с помощью критерия Манна-Уитни (U). Анализ статистической значимости различий качественных признаков проведен с помощью критерия %2 с поправкой Йейтса, а для малых выборок - двусторонний точный критерий Фишера. Для оценки силы связи между признаками использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде медианы и интерквартильного интервала Me (LQ-UQ), где Me - медиана, LQ - 25% процентиль, UQ - 75% процентиль. Результаты исследования качественных параметров в группах сравнения представлены в виде Р (ДИ) %, где Р -процентная доля, ДИ - 95% доверительный интервал для доли. Для расчета риска был использован показатель отношения шансов (ОШ) с его 95% доверительным интервалом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Общая клиническая характеристика обследованных беременных и новорожденных

В исследование было включено 150 женщин и их новорожденных детей. Группа беременных женщин, включенных в исследование, была однородной по национальности (100 % - тувинки, проживающие в городе Кызыл республики Тыва). Средний возраст беременных составил 25±12,5 лет. Патологическое течение беременности было зарегистрировано у 87,3% женщин. Спектр осложнений текущей беременности отражен в таблице 1.

По особенностям родов исследуемая группа была однородна в связи с тем, что все роды были своевременными при сроках 37-41 недель беременности, физиологическими, то есть через естественные родовые пути в головном предлежании плода. Медиана срока гестации родов 39 недель.

Таблица 1

Течение беременности у обследованных женщин

Течение беременности Абсолютное количество % (ДИ)

Анемия беременной 61 40,7 (33,1-48,7)

Токсикозы беременной 58 38,7 (31,2-46,7)

Угроза прерывания беременности 47 31,3 (24,5-39,2)

Хроническая внутриутробная гипоксия 39 26,0(19,6-33,6)

Мочеполовая инфекция 35 23,3 (17,3-30,7)

Хроническая фетоплацентарная недостаточность 26 17,3 (12,1-24,2)

Внутриутробное инфицирование плода 26 17,3 (12,1-24,2)

Отеки беременной 21 14,0 (9,4-20,5)

Гестоз беременной 19 12,3 (8,3-19,0)

Многоводие, маловодие 18 12,0 (7,8-18,1)

Артериальная гипертензия 10 6,7 (3,7-11-8)

Гестационный пиелонефрит 10 6,7 (3,7-11-8)

Примечание: у некоторых беременных было диагностировано более одной нозологии.

Из 150 обследованных доношенных новорождённых было 46,7 % мальчиков и 53,3 % девочек. Все дети родились доношенными. Оценка состояния новорожденных по шкале Апгар в конце 1 и 5 минуты жизни составила у 76 % 7-9 баллов, у 20,7% - 4-7 баллов, у 3,3 % — до Зх баллов.

Масса тела ребенка при рождении составила минимум 2377 г., максимум 4150 г., в среднем — 3344±386 г. Средняя длшш тела ребенка составила 50,3±1,7 см., окружность головы — 35±1,2 см., окружность груди 33,4±1,4 см. В перинатальный период признаны здоровыми 57 новорожденных (38%). Спектр патологии перинатального периода, зарегистрированный у обследованных новорожденных представлен в таблице 2.

Таблица 2

Частота встречаемости отдельных видов перинатальной патологии у включенных в обследование новорожденных

Перинатальная патология Абсолютное количество % (ДИ)

Церебральная ишемия 91 60,7(52,7-68,1)

Асфиксии новорожденных (умеренная, средняя и тяжелая) 36 24,0(17,9-31,5)

Кровоизлияния в кожу лица 19 12,7 (8,3-19,0)

Внутриутробная инфекция 13 8,7(5,2-14,3)

Задержка внутриутробного развития 8 5,3 (2,8-10,2)

Морфо-функциональная незрелость 6 4,0(1,9-8,5)

Примечание: у некоторых новорожденных было диагностировано более одной нозологии.

2. Данные ретроспективного анализа факторов риска формирования церебральной ишемии новорожденных

Клиническая практика показывает что неонатологи, занимающиеся ведением проблемных новорожденных, имеющих клинические проявления церебральной ишемии (ЦИ), и акушеры, ведущие беременных на дородовом этапе, хотели бы знать риск появления и персистирования симптомов ишемии для своевременной терапевтической коррекции. Однако до настоящего времени основные маркеры риска формирования церебральной ишемии у новорожденных изучены недостаточно.

Мы оценили такой риск, сравнивая частоту встречаемости ЦИ с расчетом отношения шансов и его 95%-го доверительного интервала в 2-х группах. Первую (основную) группу составили дети, имевшие ЦИ и наличие

определенного клиннко-анамнестического фактора. Вторую группу (контроля) составили дети, имевшие клинические проявления ЦИ в период новорожденности, но не имеющие отдельных вероятных факторов риска согласно опросу матерей и индивидуальных карт беременной и родильницы. В градациях доказательной медицины данный подход относится к ретроспективным исследованиям факторов риска типа «случай-контроль». В то же время дизайн проведенного нами исследования подразумевает некоторые ограничения. В частности, не исключена вероятность наличия систематической ошибки вследствие влияния исхода на воспоминание о причинном факторе при использовании анкетных данных клинико-анамнестического анамнеза. Избежать подобной ошибки могло бы когортное проспективное исследования, которое, однако, должно в этом случае длиться многие годы (от 5 до 10 лет). Использованный нами подход позволил получить ответ на интересующий клиницистов вопрос в короткий срок с минимальными затратами.

Среди проанализированных факторов акушерского анамнеза нами был выявлен ряд управляемых факторов риска, способствующих развитию церебральной ишемии у новорожденных. Количественные данные проведенного анализа представлены в таблице 3.

Как следует из представленных данных, выявляемые в период беременности признаки хронической внутриутробной гипоксии практически в пять (4,85) раз увеличивают риск ишемии головного мозга в период новорожденности, что является статистически значимым, так как доверительный интервал показателя шансов не включает единицу (1,63-14,37).

Таблица 3

Значимые факторы риска церебральной ишемии у новорожденных

Фактор риска Показатель отношения шансов Доверительный интервал

Токсикоз беременной 1,01 0,43-2,80

Угроза выкидыша 2,26 0,83-6,15

Анемия беременных 2,16 1,36-27,17

Отеки беременных 0,56 0,20-1,60

Признаки внутриутробного инфицирования 0,88 0,32-2,42

Хроническая плацентарная недостаточность 0,89 0,81-2,81

Хроническая внутриутробная гипоксия 4,85 1,63-14,37

Мочеполовая инфекция 2,92 0,83-10,16

Примечание: доверительный интервал не включает 1,00; р — статистическая значимость различий между группами сравнения (основная-контроль).

Кроме того, риск ишемии новорожденного значительно (в 2,16 раза) увеличивает наличие у матери ребенка анемии во время беременности.

Таким образом, значимыми факторами риска церебральной ишемии у новорожденных являются анемия у беременных и хроническая внутриутробная гипоксия плода. Именно вышеперечисленные особенности течения беременности будут далее проанализированы в отношении их связи с молекулярной организацией мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных.

3. Сравнительная характеристика структурно-функциональной организации мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных при различных клинических вариантах течения беременности

3.1. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов новорожденных при анемии беременной.

Клинические исследования показывают, что выраженная анемия во время беременности может приводить к преждевременным родам, привычному невынашиванию, снижению массы тела новорожденного и даже к смерти плода при тяжелой форме анемии, особенно если она проявилась в первой половине беременности.

Нарушение структуры эритроцитарной мембраны при анемии у девочек-подростков и молодых женщин отчетливо показаны в исследованиях, проведенных О. А. Пахмутовой (2008). Автором показано наличие выраженных изменений в структуре плазматических мембран, характерных для железодефицитных состояний. Для дефицитного эритропоэза, как латентного, так и проявляющегося в виде ЖДА, характерно увеличенное содержание мембранных протеинов в мембране эритроцита, что, по-видимому, и является молекулярной основой морфологических изменений эритроцита (анизотропии, микроцитоза, пойкилоцитоза) при этом заболевании. При такой ситуации в материнском организме эритроцит плода несет колоссальную функциональную нагрузку и характеризуется увеличением мощности метаболизма и риском дестабилизации.

Для выяснения характера структурных изменений в мембранах эритроцитов новорожденных изучены показатели структурного состояния мембран эритроцитов пуповинной крови у детей, рожденных от матерей с анемией, которая встречалась среди обследованных беременных у 37 женщин (52 %). Установлено, что в группе новорожденных при анемии беременной отмечается более поверхностное расположение белковых молекул по отношению к липидному бислою 0,167 (0,057-0,333) ОЕ против 0,275 (0,1540,428) ОЕ в контроле (р=0,024). Мы полагаем, что найденное изменение топографии белков в эритроцитарных мембранах в виде их всплывания к поверхности мембраны является характерным для железодефицитного состояния и базируется на сравнении результатов наших исследований с данными других авторов. Так О. А. Пахмутовой (2008) было показано, что у

молодых женщин погруженность белков в мембране эритроцита снижается уже при латентном дефиците железа. Аналогичные изменения выявляются у девочек-подростков при железодефищгтных состояниях и нарастают при постепенном развитии дефицита железа.

Структура поверхностно расположенных областей мембран оценивалась также по флюоресценции отрицательно заряженного зонда АНС, располагающегося в зоне белок-липидных взаимодействий поверхности мембраны. Показатель флюоресценции зонда АНС в расчете на уровень флюоресценции белковых групп в мембранах эритроцитов в группе новорожденных от матерей с анемией имеет тенденцию к увеличению 0,78

(0,69-0,95) ОЕ против 0,69 (0,57-0,89) ОЕ в контроле (р=0,060), что отражает вероятные преобразования поверхностного заряда мембраны в период стабилизации метаболических и биофизических свойств мембран, наступающих в ходе адаптации к гипоксии. Это согласуется с данными литературы о повышении флюоресценции АНС в мембранах эритроцитов детей с анемией и свидетельствует об изменениях в области белок-липидного взаимодействия. Такие результаты флюоресценции АНС дополняют вышеизложенные данные о развитии деструктивных процессов в мембране эритроцита у детей, матери которых страдали анемией беременных.

Учитывая важность кальций-фосфорного гомеостаза растущего ребенка, весьма существенным моментом является исследование кальций-связывающей способности мембран. Обеспеченность растущего организма ребенка кальцием зависит в первую очередь от уровня его поступления в клетку, и в этом процессе клеточные мембраны играют регулирующую роль. Кальций-связывающая способность мембран эритроцитов у новорожденных при анемии беременной имеет ярко выраженную тенденцию к снижению: 2,08 (1,38-3,17) ОЕ против 1,50 (0,96-2,40) ОЕ в контроле (р=0,050). Полученные нами результаты согласуется с данными других авторов, обнаруживших подобную тенденцию к снижению кальций-связывающей способности мембран эритроцитов у взрослых женщин с железодефицитной анемией.

Таким образом, характерным для состояния мембран эритроцитов у новорожденных при железодефицитной анемии беременной является преобразование главным образом, белковой составляющей мембран эритроцитов. Это выразилось в нарушении пространственной конфигурации и топографии белков мембраны со смещением расположения белков в наружные слои мембраны. Конформация белковой компоненты мембраны эритроцита может быть связана с преобразованиями, вызванными дефицитом железосодержащих ферментов, что затрагивает важнейшие функции клеточной мембраны и эритроцита в целом. Можно полагать, что дефицит железа у матери и недостаточное депонирование его в антенатальном периоде у плода способствуют развитию у новорожденных детей дефицитного эритропоэза, затруднений гемоглобинообразования, появлению хронической гипоксии и дисбалансу в системе эритрона, что проявляется вышеуказанными

нарушениями физико-химических параметров эритроцитарных мембран и метаболизма клеточных структур.

3.2. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов новорожденных от матерей, беременность которых протекала с признаками внутриутробной гипоксии.

Известно, что воздействие большого количества неблагоприятных факторов на плод не является специфическим и связано главным образом с перинатальной гипоксией, сопровождающейся гемодинамическими и метаболическими нарушениями. Кислородная недостаточность приводит к нарушению функций организма, изменению обменных процессов. В разные сроки беременности кислородная недостаточность имеет разные последствия для плода. В ранние сроки она приводит к появлению аномалий развития, замедлению развития эмбриона. В поздние сроки беременности кислородное голодание приводит к задержке роста плода, поражению ЦНС, снижает адаптационные возможности новорожденного, что может отражаться на клеточных структурах.

В наших исследованиях основным параметром, отражающим состояние мембран эритроцитов новорожденных при внутриутробной гипоксии, оказался показатель проницаемости, определяемый по встраиванию в мембраны каналообразующего зонда — нистатина. Согласно этим данным, проницаемость мембран при наличии внутриутробной гипоксии достоверно повышалась (рис.1).

0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10

Ш МесКап I I 25%-75% ~Т~ Мт-Мах

0 1

Примечание: 0 — новорожденные от беременных без признаков внутриутробной гипоксии плода: 1 — новорожденные от беременных с признаками внутриутробной гипоксии плоди; ро-1 =0,022.

Рис. 1. Проницаемость мембран эритроцитов у новорожденных при наличии признаков внутриутробной гипоксии плода во время беременности.

Обнаруженное повышение проницаемости мембран эритроцитов при гипоксии плода - вполне прогнозируемое явление. Перинатальная гипоксия сопровождается гемодинамическими и метаболическими нарушениями. Гомеостаз клеток при гипоксии нарушается, а важным условием поддержания гомеостаза является нормальная проницаемость цитомембраны. Это обусловлено тем, что мембрана построена одновременно н как барьер, и как проход для всех субстанций, которые проникают в клетку или ее покидают. Она поддерживает внутренний химический состав клетки посредством избирательной проницаемости и транспортировки. Процесс мембранного транспорта предполагает перенос ионов и других субстратов по градиенту и против градиента концентрации.

В конечном счете, последствием метаболических нарушений обмена в эритроцитах матерей при гипоксии плода различного генеза будет угнетение функции клеток красной крови новорожденных, повреждение мембраносвязанных и растворимых ферментных систем продуктами окислительной дегидратации липидов и появление дефицита энергопродукции за счет подавления скорости утилизации глюкозы, то есть возникают условия для мембранодестабилизирующих процессов в организме плода и новорожденного.

Таким образом, наличие признаков внутриутробной гипоксии и угрозы прерывания беременности сопровождаются однонаправленным повышением проницаемости мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных, что может приводить к высокой подверженности гемолизу и формированию сосудистых осложнений, в том числе, и к церебральной ишемии. С нашей точки зрения, нарушенная структура и функция мембран эритроцита может являться важнейшим дополнительным патогенетическим фактором формирования церебральной ишемии новорожденных.

4. Мембраны эритроцитов пуповинной крови новорожденных, перинатальный период которых протекал с церебральной ишемией и асфиксией.

При исследовании групп новорожденных с явлениями церебральной ишемии и асфиксии мы принимали во внимание, что перинатальное гипоксическн-ишемическое повреждение ЦНС остается главной причиной смертности новорожденных и представляет важнейшую проблему перинатологии. Нами установлено, что состояние церебральной ишемии и асфиксии в наибольшей степени отразилось на интегральном показателе, характеризующем стабильность клеточной оболочки и клетки в целом — коэффициенте дестабилизации плазматической мембраны (рис. 2, 3).

80

70

60

50

ш О

40

Ж

30

20

^ Median

ю

о

I i 25%-75% ~Т~ Min-Max

О

1

Примечание: 0 — новорожденные без церебральной ишемии; I — новорожденные с церебральной ишемией; р0.1=0,004.

Рис. 2. Показатель дестабилизации мембранных структур эритроцитов новорожденных с церебральной ишемией.

Известно, что независимо от причин кислородной недостаточности в организме новорожденного, одним из ярких клинических проявлений которой является церебральная ишемия, происходит перестройка обменных процессов, гемодинамики и микроциркуляции. Степень выраженности их зависит от интенсивности и длительности гипоксии. Однако при всех видах церебральной ишемии развивается метаболический или респираторно-метаболический ацидоз, сопровождающийся гипогликемией, относительной азотемией и гиперкалиемией, сменяющейся дефицитом калия. Дисбаланс электролитов и метаболический ацидоз неизбежно приводят к клеточной гипергидратации и усилению процессов перекисного окисления липидов. Указанные патофизиологические процессы нарушают стабильность мембран многих клеток, в том числе циркулирующих эритроцитов.

Аналогичная картина наблюдалась в группе детей с признаками асфиксии при рожденга (р=0,006). Наши исследования согласуются с данными М. гуПшка ег а1., показавшими, что структуры мембраны эритроцита могут считаться первичной мишенью для вызванного асфиксией повреждения клеток организма. При этом считается, что увеличение высвобождения железа эритроцитов в плазму крови может быть маркером окислительного повреждения эритроцитов, а положительная корреляция между плазменным свободным железом и числом ядерных эритроцитов в крови является надежным индексом длительной внутриматочной асфиксии, обладающим высокой прогнозирующей ценностью для дальнейших нарушений нервно-психического развития. Ряд авторов полагает, что для оценки глубины

гипоксии, перенесенной плодом, и прогнозирования неблагоприятных последствий для новорожденного можно использовать определение интенсивности процессов пероксидации и деструкции клеточных мембран (Мусаев А.Т. , 1993; Камилов Ф. X. с соавт, 1999).

§ МесНап □ 25%-75% I Мш-Мах

Примечание: 0 -асфиксией; ро-!~0,006.

О 1

новорожденные без асфиксии; 1 — новорожденные с

Рис. 3. Показатель дестабилизации мембранных структур эритроцитов новорожденных с асфиксией.

Таким образом, многофакторно обусловленные явления церебральной ишемии нарушают структурно-функциональную пластичность мембран новорожденных, что выражается в повышении интегрального показателя дестабилизации мембран эритроцитов. Эти изменения могут проявляться формированием гемореологических нарушений и способствовать усугублению гипоксических повреждений жизненно важных органов ребенка в период новорожденное™. Однотипный характер направленности дестабилизационных процессов выявлен в группе детей с признаками асфиксии при рождении.

5. Структурно-функциональная организация мембран пуповинной крови новорожденных, перинатальный период которых протекал с физиологической желтухой

Среди включенных в настоящее исследование новорожденных детей физиологическая желтуха была зарегистрирована у 17 детей.

Мы проанализировали показатели текучести липидного бислоя мембран эритроцитов у новорожденных с наличием физиологической желтухи. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4

Показатели текучести липидного бислоя мембран эритроцитов у новорожденных с наличием физиологической желтухи

Анализируемые показатели Новорожденные без желтухи п=54 Новорожденные с желтухой п=17 Статистическая значимость (Р)

Текучесть в глубоких слоях мембраны, ОЕ 0,623 (0,532-0,711) 0,529 (0,493-0,595) 0,012

Текучесть в зоне белок-липидных контактов, ОЕ 0,414 (0,333-0,488) 0,344 (0,32-0,385) 0,01

Текучесть поверхностных слоев мембран, ОЕ 2,0 (1,71-2,23) 2,123 (1,88-2,43) 0,1

У новорожденных детей с физиологической желтухой нами выявлено статистически значимое снижение текучести как в глубоких слоях липидного бислоя (р=0,012), так и в области белок-липидных контактов (р=0,01). Снижение текучести мембран эритроцитов при физиологической желтухе новорожденных может указывать на активизацию процессов преобразования жирнокислотного спектра, а именно на преобладание насыщенных жирных кислот над ненасыщенными. Сохранение достаточной текучести поверхностных слоёв мембраны, где происходит метаболизм фосфолппидов и функционирование белков, является важным для поддержания жизнедеятельности клетки.

Таким образом, у детей с наличием физиологической желтухи выявлена дезорганизация преимущественно в глубоких слоях липидного бислоя эритроцнтарных мембран, предрасполагающая к относительно меньшей устойчивости клеточных мембран и, как следствие, более низкой продолжительности жизни эритроцитов, что вносит свой вклад в развитие желтухи новорожденных.

4. Связь структурпо-фупкциональпого состояния мембран эритроцитов новорожденных с параметрами физического развития

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что состояние клеточных мембран является одним из ранних и чувствительных показателей состояния организма ребенка и его физического развития. Это связано с

фундаментальными свойствами биологических мембран, обеспечивающих клеточную рецепцию, транспорт веществ в клетки, клеточную регуляцию фосфолипидного и белкового обменов, ионного баланса клеток, то есть базовых факторов нормального роста и развития плода и новорожденного. Состояние структуры и функции мембран клеток коррелирует с физиологической зрелостью организма ребенка и с уровнем заболеваемости плода и новорожденного, поэтому может служить одним из критериев его здоровья и физического развития.

В нашей выборке медиана значения массо-ростового индекса Кетле I составила 66,0 (61,0-70,8). У 17 новорожденных значения индекса Кетле I не. превышали 61, что было расценено нами, как некоторая тенденция к задержке внутриутробного развития.

При сопоставлении массо-ростового индекса Кетле I с показателями структурно-функциональной организации мембран эритроцитов новорожденных детей (рис. 4), нами установлено, что капьций-связывающая способность эригроцитарных мембран пуповинной крови статистически значимо повышается у детей с индексом Кетле I <61 (р=0,036).

Индекс Кетле! <61 Индекс Кетле! >61 Мт-Мах

р=0,036

Рис. 4. Показатель Са-связывающей способности мембран эритроцитов у новорожденных в зависимости от значений индекса Кетле I.

Таким образом, у новорожденных детей с массо-ростовым индексом Кетле I на нижней границе нормы показатель кальций-связывающей способности мембраны оказался информативным, свидетельствуя, что у таких

19

детей способность связывать двухвалентные катионы возрастает, и, вероятно, насыщение кальцием клетки увеличивается. Можно полагать, что этот показатель является иллюстрацией компенсаторно-приспособительных проявлений деятельности регуляторных систем детей, родившихся от матерей с патологией беременности.

Характерно, что кальций-связывающая способность повышалась также и у новорожденных с показателями окружности головы <34 см (рис. 5).

1 МесНап □ 25%-75% ~Т~ Мт-Мах

в

Примечание: А - новорожденные с окружностью головы < 34 см; В -новорожденные с окружностью головы = 35 см; С - новорожденные с окружностью головы > 36 см; р =0,01.

Рис. 5. Показатель Са-связывающей способности мембран эритроцитов у новорожденных в зависимости от значений окружности головы.

Таким образом, физическое развитие новорожденного ассоциировано в основном с кальций-аккумулируюгцей функцией мембран. Выявленное повышение кальций-связывающей способности плазматической мембраны у детей со значениями индекса Кетле I < 61 и с низкой окружностью головы, на наш взгляд, свидетельствует о низкой обеспеченности кальцием организма новорожденных с относительно невысокими показателями физического развития, что компенсаторно приводит к большей способности мембран к его мобилизации из сосудистого русла. Обнаруженные нами взаимосвязи вполне могут быть использованы в качестве диагностических маркеров обеспеченности кальцием в периоде новорожденное™.

выводы

1. Церебральная ишемия является наиболее частым видом перинатальной патологии среди новорожденных коренного населения Республики Тыва, и встречается в 60,7 % случаев.

2. Основными факторами риска церебральной ишемии новорожденных тувинской национальности являются анемия беременных (ОШ=2,16) и хроническая внутриутробная гипоксия плода (ОШ=4,85).

3. У новорожденных, рожденных от матерей с анемией береме1шых, выявлено нарушение пространственной конфигурации и топографии белков эритроцитарной мембраны со смешением расположения протеинов в наружные слои липидного бислоя (р=0,024).

4. Хроническая внутриутробная гипоксия плода сопровождается повышением проницаемости мембран эритроцитов пуповинной крови, что может приводить к высокой подверженности гемолизу, тромбообразованию и формированию сосудистых осложнений.

5. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных, перинатальный период которых протекал с церебральной ишемией, характеризуется повышением показателя дестабилизации мембран эритроцитов, что патогенетически связано с высоким риском формироваш1я гемореологическнх осложнений. Однотипные явления установлены при асфиксии новорожденных.

6. Показатель физического развития новорожденных — индекс Кетле I ассоциирован с кальций-связываюшей способностью плазматических мембран.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для своевременной профилактики церебральной ишемии новорожденных особое внимание следует обращать на наличие таких признаков, как анемия у беременных и хроническая внутриутробная гипоксия плода.

2. У детей, рожденных от матерей с анемией, рекомендуется определение мембранологического показателя погруженности белков в липидный бислой мембран эритроцитов. Этот мембранологический показатель является информативным в плане диагностики доклинической стадии анемии в период новорожденностн.

3. Повышение кальций-связывающей способности мембран эритроцитов новорожденных со значениями индекса Кетле I < 61 свидетельствует о низкой обеспеченности кальцием организма новорожденных с компенсаторно увеличенной способностью мембран к его мобилизации из сосудистого русла и может быть использовано в качестве дополнительного параметра оценки кальциевого обмена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние возраста матери тувинской национальности на структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран новорожденных / Т. А. Колодяжная, Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С.Ю. Терещенко, В. Т. Манчук // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера: матер. XII межрегиональной науч.-практ. конф. — Абакан, 2009. — Вып. 8. — С. 151-153.

2. Даваа, Я. X. Влияние железодефицитной анемии беременной на молекулярную организацию мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Питание в профилактике социально-значимых заболеваний: матер, симпозиума с международным участием. — Красноярск, 2009. — С. 50-52.

3. Даваа, Я. X. Связь кальцийсвязывающей способности мембран эритроцитов пуповинной крови с параметрами физического развития новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Фармакотерапия и диетология в педиатрии: сб. матер. XIII конгресса педиатров России. — Томск, 2009.-С. 33.

4. Даваа, Я. X. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных, рожденных от матерей с анемией беременных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Фармакотерапия и диетология в педиатрии: сб. матер. XIII конгресса педиатров России. — Томск, 2009.-С. 32.

5. Структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран у новорожденных, родившихся от матерей с различным характером патологии беременных Республики Тыва / Т. А. Колодяжная, Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С.Ю. Терещенко, В.Т. Манчук // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера: матер. XII межрегиональной науч.-практ. конф. -Абакан, 2009. - Вып. 8. - С. 153-154.

6. Структурно- функциональное состояние мембран эритроцитов новороиеденных при анемии беременных / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Якутский медицинский журнал. - 2010. - №2. — С.9-11.

7. Даваа, Я. X. Данные ретроспективного анализа факторов риска формирования синдрома церебральной ишемии новорожденных / Я. X. Даваа, Л. В. Васильева, С. Ю. Терещенко // Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва: матер, юбилейной науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ГУЗ «Республиканская больница №1» МЗ РТыва. - Кызыл, 2010. - С. 95-97.

8. Даваа, Я. X. Связь кальцийсвязывающей способности мембран эритроцитов пуповинной крови с параметрами физического развития новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва: матер.

юбилейной науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ГУЗ «Республиканская больница №1» МЗ РТыва. - Кызыл, 2010. - С. 164-16

9. Davaa, Y. Cord blood erythrocyte membrane fluidity and birth weight in full-term Tuvinian newborns / Y. Davaa, M. Shubina, S. Tereshcenko // The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. - 2010. - Vol. 23 (Suppl. 1). - P. 118.

10. Особенности структурно-функционального состояния эритроцитарных мембран новорожденных, родившихся от матерей, страдающих аллергией / Т. А. Колодяжная, О. И. Зайцева, Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, посвящ. 30-летнему юбилею Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. - Красноярск, 2010. — С. 297-299.

11. Ретроспективный анализ факторов риска формирования синдрома церебральной ишемии новорожденных / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: матер, итоговой науч.-практ. конф. НИИМПС СО РАМН - Красноярск, 2010. - Вып. 9. - С. 92-93.

12. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов новорожденных при мочеполовой инфекции беременной / Я. X. Даваа, Т. А. Колодяжная, М. В. Шубина, С. Ю. Терещенко П Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, посвящ. 30-летнему юбилею Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. - Красноярск, 2010. - С. 109-111.

13. Даваа, Я. X. Связь структурно-функционального состояния мембран эритроцитов новорожденных с параметрами их физического развития / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, С. Ю. Терещенко // Сибирское медицинское обозрение. -2011.- Л®1.- С. 25-28.

14. Даваа, Я. X. Факторы риска формирования церебральной ишемии у новорожденных республики Тыва / Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Якутский медицинский журнал. - 2011. — №2. - С. 3336.

15. Церебральная ишемия у новорожденных детей: метод, рекомендации / Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко. - Красноярск, 2011. - 20 с.

Зарегистрирована заявка на изобретение «Способ прогнозирования риска развития церебральной ишемии у новорожденных» от 06.02.2012 года, входящий №006206, регистрационный №2012104168.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АНС

ВУИ

ДИ

ДМХ

ЕФ

1 -анилинонафталин-8-сульфонат внутриутробное инфицирование доверительный интервал диметиламинохалкон единицы флуоресценции

ЖДА железодефицитная анемия

ЗВУР задержка внутриутробного развития

мпи мочеполовая инфекция

ОЕ относительные единицы

ОШ отношение шансов

хвг хроническая внутриутробная гипоксия

ХФПН хроническая фетоплацентарная недостаточность

ци церебральная ишемия

ИАОН 2 восстановленная форма никопшамидзависимой

дегидрогеназы

Отпечатано ООО ТПК "Старатель" г. Красноярск, ул.Марковского 43, т. 227-50-92 Заказ 12323, тираж 80 экз.

бумага офсетная 80 гр./м2 гарнитура Times New Roman подписано в печать 06.09.2012 г.