Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Структурная организация эритроцитарных мембран новорожденных в зависимости от патологии беременности и особенностей течения перинатального периода

На правах рукописи

Даваа Яна Хураган-ооловня

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭРИТРОЦИТ АРНЫХ МЕМБРАН НОВОРОЖДЕННЫХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПАТОЛОГИИ БЕРЕМЕННОСТИ И ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ПЕРИНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 НОЯ 2011

Иркутск-201 ]

4858788

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Терещенко Сергей Юрьевич Зайцева Ольга Исаев на

Власов Борис Яковлевич Павлова Татьяна Ивановна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится / (о • -7^7 2011 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.038.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН

Автореферат разослан «. » 7 и_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор /1 * , Шолохов Л. Ф.

Ш о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема снижения перинатальной заболеваемости и смертности в настоящее время остается важной государственной задачей [Савичева А. М. с соавт., 2009; Баранов А.А., 2010; Фролова О. Г. с со-авт., 2010]. Хроническая патология у детского населения неуклонно смещается в ранний возрастной период, а подавляющее большинство заболеваний новорожденных и многие болезни в грудном возрасте представляют собой пролонгированную патологию эмбриона и плода [Вельтищев Ю. Е., 1999]. В связи с этим, в основу должна быть положена система раннего выявления нарушений здоровья и развития новорожденных групп высокого перинатального риска с использованием современных критериев оценки состояния ребенка, в том числе на уровне надмолекулярных структур [Корнева М. Ю. с соавт., 2005; Иванова Н. А. с соавт., 2009].

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что одним из ранних и чувствительных показателей нарушений гомеостаза является состояние клеточных мембран [Рязанцева Н. В. с соавт., 2004; Новицкий В. В. с соавт., 2006; Прахин Е. И. с соавт., 2007]. У детей структурное состояние биомембран многими исследователями используется в качестве маркера физической зрелости организма и показателя становления его систем [БгоиШе! Р. е1 а1„ 2009; КПап А. 8. е1 а!., 2009].

Исследователями предполагается, что в период новорожденности степень морфофункционального развития ребенка находит отражение в структуре клеточных мембран [Стольникова М. В. с соавт., 2005; Новицкий В. В. с соавт., 2006; Колодяжная Т. А. с соавт., 2006]. К настоящему времени установлена зависимость между состоянием клеточных мембран и уровнем заболеваемости плода и новорожденного. При этом отечественными и зарубежными исследователями изучаются различные факторы, оказывающие повреждающее действие на клеточные структуры организма новорожденного, среди которых видное место занимает хроническая гипоксия плода, соматические и инфекционные заболевания матери, имеющие единое патогенетическое звено - фето-плацентарную недостаточность и гипоксию [Му-рашкин В. В. с соавт., 2004; Андриевская И. А. с соавт., 2007; Ишутина Н. А. с соавт., 2007; Никифорович И. И. с соавт., 2009]. Тем не менее, до сих пор открытым остается вопрос, существует ли патогенетическая связь между указанными процессами и структурным состоянием мембран эритроцитов новорожденного. Это имеет принципиальное значение, так как именно эритроцит и его мембрана может считаться первичной мишенью для вызванного гипоксией и асфиксией повреждения клеток организма [Мусаев А. Т. с соавт., 2004; 8коиша1оуа А. е1 а1., 2009; Ша^игеп М. е1 а1„ 2010].

Таким образом, несмотря на то, что обсуждаемой проблеме в настоящее время уделяется пристальное внимание исследователей, не существует целостного представления о патогенезе нарушений структуры эритро-цитарных мембран у новорожденных в зависимости от соматической и воспалительно-инфекционной патологии беременности. Не освещен вопрос о влиянии на структуру мембраны эритроцитов особенностей течения перинатального периода. Из-за противоречивости и малочисленности исследований в данном направлении не представляется возможным получить комплексную оценку структурного состояния мембран эритроцитов новорожденных детей, родившихся от матерей с осложненной беременностью, включая их физико-химические свойства на надмолекулярном уровне. Изложенное определяет актуальность проведенного исследования и его научно-практическую значимость.

Цель: Выявить клинико-патогенетическую роль структурной организации плазматических мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных при патологии беременности и особенностях течения перинатального периода для патогенетического обоснования новых методов диагностики и терапии заболеваний у детей.

Задачи исследования:

1. Провести комплексный анализ клинико-анамнестических данных беременных, проживающих в республике Тыва, и выявить кли-нико-анамнестические признаки, ассоциированные с церебральной ишемией новорожденных.

2. Изучить структурное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови методом флюоресцентного зондирования с учетом значимых факторов риска церебральной ишемии новорожденных.

3. Изучить влияние церебральной ишемии и асфиксии новорожденных на структурное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови.

4. Выявить особенности надмолекулярной организации мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных от матерей с мочеполовой инфекцией беременных и при внутриутробном инфицировании плода.

5. Установить характерные особенности строения мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных в зависимости от их физического развития.

Научная новизна исследования

Установлены важнейшие факторы риска церебральной ишемии у новорожденных и показана их прямая ассоциация с повышенной проницаемостью мембран эритроцитов пуповинной крови.

Впервые показано, что у новорожденных, родившихся от матерей, беременность которых протекала на фоне анемии или воспалительно-инфекционной патологии, наблюдаются признаки структурной дезорганизации мембран эритроцитов в виде нарушения пространственной конфигурации и топографии белков мембран со смещением расположения протеинов в липидном бислое.

Впервые установлена ассоциация физического развития новорожденных с состоянием текучести мембран эритроцитов пуповинной крови, их стабильностью и кальций-аккумулирующей способностью.

Практическая значимость работы

Выявленные особенности важнейших факторов риска развития церебральной ишемии новорожденного рекомендовано использовать для профилактики и раннего скрининга церебральной ишемии.

Впервые показана взаимосвязь мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных с дефицитным эритропоэзом и нарушением кальциевого обмена, что рекомендовано использовать для ранней диагностики указанных состояний.

Установленную взаимосвязь массы тела новорожденных с текучестью мембран эритроцитов пуповинной крови рекомендовано использовать в качестве маркера для выделения групп новорожденных, нуждающихся в нут-ритивном восполнении полиненасыщенных жирных кислот.

Выявленную взаимосвязь киндекса Кетле I новорожденных с каль-ций-связывающей способностью мембран эритроцитов пуповинной крови рекомендовано использовать в качестве дополнительного диагностического параметра обеспеченности кальцием в периоде новорожденности.

Личный вклад

Лично автором проведены планирование работы, поиск и анализ литературы по проблеме диссертации, отбор беременных женщин для исследования, сбор клинико-анамнестических данных, забор пуповинной крови во время родов, исследование специальных физико-химических характеристик мембран эритроцитов, статистическая обработка и анализ материала, написание публикаций и диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для структурного состояния мембран эритроцитов новорожденных детей при патологии беременности характерны признаки дезорганизации белкового и липидного компонентов матрицы мембраны и конформации её функционально-активных надмолекулярных групп.

2. Физическое развитие новорожденного обусловлено основными свойствами мембран эритроцитов пуповинной крови - их стабильностью, вязко-эластическими свойствами и кальций-аккумулирующей функцией.

3. Структурное состояние мембран эритроцитов новорожденных взаимосвязано с течением перинатального периода: у новорожденных, перенесших асфиксию и церебральную ишемию, мембраны эритроцитов характеризуются повышенными показателями дестабилизации молекулярных структур.

Апробация материалов диссертации

Материалы работы были представлены на XII межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2009); на ХШ конгрессе педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии» (Томск, 2009); на симпозиуме с международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний» (Красноярск, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 20-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Красноярск, 2010); научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера» (Абакан, 2010); на итоговой научно-практической конференции НИИ МПС СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва» (Кызыл, 2010); XXII Европейском Конгрессе по перинатальной медицине (Granada, Spain, 2010).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практическую работу детских отделений клиники Института медицинских проблем Севера СО РАМН, в учебный процесс кафедры поликлинической педиатрии и пропедевтики детских болезней, в практику работы ГУЗ «Перинатальный центр» (Республика Тыва, г. Кызыл).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы

Диссертация содержит 160 страниц машинописного текста, 17 таблиц, 22 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы включает 239 источников, в том числе 123 отечественных и 116 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных в настоящем исследовании задач за период с 2006 года по 2008 год было обследовано 150 женщин и их новорожденных детей. Нами проведены клинические наблюдения и специальные биофизические исследования клеточных мембран эритроцитов пуповинной крови у 150 новорожденных на базе акушерского стационара Перинатального центра г. Кызыл Республики Тыва. Клиническое обследование включало в себя сбор анамнестических данных при беседе с беременными методом интервью с заполнением специально разработанной анкеты, включающей данные по течению беременности, условиях проживания. Анализ родов и течения периода новорожденное™ проводились по медицинской документации.

Специальные методы исследования физико-химических свойств биологических мембран.

Физико-химические характеристики биологических мембран исследованы нами методами флуоресцентной спектроскопии в соответствии с рекомендациями Ю. А. Владимирова и Г. Е. Добрецова (1980). Все исследования биофизических характеристик мембран методом флюоресцентной спектроскопии (флюорометрии) проведены на спектрофлюориметре «Hitachi MPF-4» (Япония). Использованы зонды: пирен, 1-аланинонафталин-8-сульфонат (АНС), нистатин.

Выделение мембранного материала из эритроцитов: мембраны эритроцитов из полученной эритроцитарной массы выделены с помощью метода Dodge J. Т. (1963) с собственными модификациями. Исследованы следующие биофизические характеристики мембран: собственная беззондовая флюоресценция NADH мембран эритроцитов (ЕФ); собственная безззондовая флюоресценция триптофановых остатков мембранных белков (триптофанилов) (ЕФ); степень погруженности мембранных протеинов в липиды по коэффи-

диенту индуктивно-резонансного перехода в системе триптофанилы-пирен (ОЕ); микровязкость поверхностных мембранных структур (вращательной диффузии), определенная по параметрам поляризации (коэффициенту анизотропии) флюоресценции зонда АНС (ОЕ); текучесть глубоких областей ли-пидного бислоя мембран, определенная по отношению флюоресценции экси-меры/мономеры пирена (ОЕ); молекулярная организация мембран и конфор-мация белковых глобул в области белок-липидного взаимодействия, исследованная по параметру интенсивности флюоресценции зонда АНС после связывания с поверхностными структурами мембраны (ЕФ); отношение флюоресценция АНС/флюоресценция триптофанилов (ОЕ); проницаемость эритроци-тарных мембран, определенная по интенсивности флюоресценции каналооб-разующего зонда нистатина (ОЕ); кальций аккумулирующая способность мембран эритроцитов (ОЕ).

Статистические методы анализа

Статистическую значимость различий количественных признаков анализировали с помощью критерия Манна-Уитни (II). Анализ статистической значимости различий качественных признаков проведен с помощью

г

критерия % с поправкой Иейтса, а для малых выборок - двусторонний точный критерий Фишера. Для оценки силы связи между признаками использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде медианы и интерквартильного интервала Ме (1X2-11(2), где Ме - медиана, Ь<3

- 25% процентиль, 11(2 - 75% процентиль. Результаты исследования качественных параметров в группах сравнения представлены в виде Р (ДИ) %, где Р

- процентная доля, ДИ - 95% доверительный интервал для доли. Для расчета риска был использован показатель отношения шансов (ОШ) с его 95% доверительным интервалом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В исследование было включено 150 женщин и их новорожденных детей. Группа беременных женщин, включенных в исследование, была однородной по национальности (100 % - тувинки, проживающие в республике Тыва). Средний возраст беременных составил 25 лет. Патологическое течение беременности было зарегистрировано у 87,3% женщин. Спектр осложнений текущей беременности отражен в таблице 1.

По особенностям родов исследуемая группа была однородна в связи с тем, что все роды были своевременными при сроках 37-41 недель беременности и все роды физиологическими, то есть через естественные родовые пути и в головном предлежании. Медиана срока гестации родов 39 недель.

Из 150 обследованных нами новорождённых было 46,7% мальчиков и 53,3% девочек. Все дети родились доношенными. Оценка состояния новорожденных по шкале Апгар в конце 1 минуты жизни составила у 76 % 7-9 баллов, у 20,7% - 4-7 баллов, у 3,3 % - до 3 баллов.

Масса тела ребенка при рождении составила минимум 2377 г., максимум 4150 г., в среднем - 3344±386 г. Средняя длина тела ребенка составила 50,3±1,7 см., окружность головы - 35±1,2 см.

Таблица 1

Спектр патологии беременности

Патология беременности % абс

Анемия беременной 16,6% 61

Токсикозы беременной 15,9% 58

Угрозы прерывания беременности 12,7% 47

Хроническая внутриутробная гипоксия 10,4% 39

Мочеполовая инфекция 9,1% 35

Хроническая фетоплацентарная недостаточность 1% 26

Внутриутробное инфицирование плода 1% 26

Отеки беременной 5,7% 21

Гестоз беременной 5,1% 19

Многоводие, маловодие 4,9% 18

Артериальная гипертензия 2,8% 10

Гестационный пиелонефрит 2,8% 10

Всего патологии беременности 87,3% 131

Беременность без осложнений 12,7% 19

Всего исследованых беременных 100% 150

Всего заболеваний беременности 280% 370

В перинатальный период признаны здоровыми 57 новорожденных (38 %). Спектр патологии перинатального периода, зарегистрированный у остальных новорожденных представлен в таблице 2.

До настоящего времени основные маркеры риска формирования церебральной ишемии у новорожденных изучены недостаточно. Мы оценили такой риск, сравнивая частоту встречаемости ЦИ с расчетом отношения шансов и его 95%-го доверительного интервала в 2-х группах.

Таблица 2

Спектр перинатальной патологии у обследованных новорожденных

Перинатальная патология Количество %

Церебральная ишемия 91 51,4%

Асфиксии новорожденных 36 20,3%

Кровоизлияния в кожу лица 19 10,7%

Внутриутробная инфекция 13 7,4%

Задержка внутриутробного развития 8 4,5%

Морфо-функциональная незрелость 6 3,4%

Натальная травма шейного отдела позвоночника 4 2,3%

Первую (основную) группу составили дети, имевшие ЦИ и наличие определенного клинико-анамнестического фактора. Вторую группу (контроля) составили дети, имевшие клинические проявления ЦИ в период новорожденное™, но не имеющие отдельных вероятных факторов риска согласно опросу матерей и индивидуальных карт беременной и родильницы.

Среди проанализированных факторов акушерского анамнеза нами был выявлен целый ряд управляемых факторов риска, способствующих развитию церебральной ишемии у новорожденных (табл. 3).

Как следует из представленных данных, выявляемые в период беременности признаки хронической внутриутробной гипоксии практически в пять (4,85) раз увеличивают риск ишемии головного мозга в период новорожденное™. Кроме того, риск ишемии новорожденного значительно (в 2,16 раза) увеличивает наличие у матери ребенка анемии. Одновременно нами выявлена тенденция к увеличению риска ишемии у новорожденного при наличии таких факторов, как наличие у беременной угрозы выкидыша и мочеполовой инфекции.

Таким образом, значимыми факторами риска церебральной ишемии у новорожденных являются хроническая внутриутробная гипоксия плода, анемия беременной. Тенденция к увеличению риска церебральной ишемии у новорожденных имеется при наличии таких факторов, как угроза прерывания беременности и мочеполовая инфекция. Вышеперечисленные особенности течения беременности будут далее проанализированы в отношении их связи с молекулярной организацией мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных.

Таблица 3

Значимые факторы риска церебральной ишемии у новорожденных

Факторы риска Показатель отношения шансов Доверительный интервал Р

Токсикоз беременной 1,01 0,43-2,80 0,522

Угроза выкидыша 2,26 0,83-6,15 0,088

Анемия беременных 2,16 1,36-27,17 0,089

Отеки беременных 0,56 0,20-1,60 0,211

Признаки внутриутробного инфицирования 0,88 0,32-2,42 0,510

Хроническая плацентарная недостаточность 0,89 0,81-2,81 0,508

Хроническая внутриутробная гипоксия 4,85 1,63-14,37 0,004

Мочеполовая инфекция 2,92 0,83-10,16 0,092

Примечание: серым цветом выделены факторы, достоверно повышающие риск (доверительный интервал не включает 1,00). р - статистическая значимость различий между группами сравнения (основная-контроль).

Инфекции мочеполовых путей у беременных женщин вызывают изменения в органах и системах, типичные для хронического воспалительного процесса, и напрямую связаны с высоким риском внутриутробного инфицирования [Никонов А. П. с соавт., 2007]. Вовлечение эритрона в воспалительный процесс создает дополнительный фактор для усугубления развивающейся при воспалении тканевой гипоксии [Рязанцева Н. В. с соавт., 2003; Степовая Е. А. с соавт., 2004]. У плода эти процессы вызывают недостаточность ряда гомеостатических параметров, необходимых для нормального развития, в том числе дисбаланс в системе эритрона, что может проявляться в период новорожденности.

У обследованного нами контингента беременных женщин инфекция мочеполовых путей установлена в 12 случаях (16 %) и подтвержден лабора-торно. У 21 (29,5 %) беременной был установлен диагноз внутриутробного инфицирования плода.

Анализ белковой компоненты эритроцитарных мембран у обследуемых новорожденных выявил повышение флуоресценции триптофановых групп белков в мембранах эритроцитов, как в группе новорожденных от матерей с инфекцией мочеполовых путей, так и у новорожденных с признаками внутриутробного инфицирования (рис. 1, 2).

40 35 30 25

ш О

20 15 10 5

Рис. I. Флуоресценция триптофановых групп белков в мембранах эритроцитов у новорожденных от матерей с признаками мочеполовой инфекции. Примечание: 0 - новорожденные от матерей без признаков инфекции мочеполовых путей; 1 - новорожденные от матерей с признаками инфекции мочеполовых путей; р 0-1< 0,001.

Эти изменения являются значимым признаком активации транспортных функций в условиях возможной недостаточности трофического обеспечения клеток крови и отражают процесс компенсаторной активации обмена веществ.

Следующим этапом явилось исследование молекулярной структуры поверхностно расположенных ассоциатов «белок-липид» по параметрам зонда АНС. Нами установлено, что абсолютные значения флуоресценции АНС увеличивались в группе новорожденных от матерей с мочеполовой инфекцией и составили 16,50 (13,00-17,50) ЕФ против 11,00 (7,50-14,50) ЕФ в контроле, р< 0,0001. При наличии признаков внутриутробной инфекции флуоресценция зонда АНС статистически значимых различий с контролем не имела.

О 1

МесНап Ш 25%-75% Т~ М1п-Мах

35

30

25

I

Ш1

ш

О

20

1

15

*

¿11

10

5

0 1

Ш МесНап О 25%-75% Щ 1№п-Мах

Рис. 2. Флуоресценция триптофановых групп белков в мембранах эритроцитов у новорожденных при наличии признаков внутриутробного инфицирования.

Примечание: 0 - новорожденные без признаков внутриутробного инфицирования; 1 - новорожденные с признаками внутриутробного инфицирования; р 0-1=0,018.

Фазовое состояние мембраны (более или менее жидкое) зависит также от гидратированности липидного бислоя, определяемого нами по интегральной флуоресценции зонда ДМХ, интенсивность которой обратно пропорциональна количеству мембраносвязанной воды. Выявлено статистически значимое повышение интенсивности флуоресценции ДМХ как у новорожденных, родившихся от матерей с мочеполовой инфекцией 50 (39-65) ЕФ против 30 (27-38) ЕФ у новорожденных от матерей с признаками инфекции мочеполовых путей (р < 0,0001); так и у новорожденных с внутриутробным инфицированием 39(30-50) ЕФ против 30 (26-36) у новорожденных без признаков внутриутробного инфицирования (р=0,017). Эти изменения является неблагоприятным прогностическим признаком, так как снижает чувствительность клеток к гормонам (например, к инсулину). Кроме того, связанная вода повышает полярность поверхности мембраны и увеличивает поверхностный потенциал, то есть заряженность мембраны. Изменение этих параметров может лежать в основе развития ряда патологических процессов, связанных с нарушением гемодинамики.

Неспецифическим параметром, отражающим функциональные свойства мембраны, является показатель дестабилизации, рассчитанный по поляризационным свойствам мембраны. Показатель дестабилизации у новорожденных с внутриутробным инфицированием был статистически значимо выше (рис. 3).

48

42

36

ш о

30

24

18

Рис. 3. Показатель дестабилизации эритроцитарных мембран у новорожденных при наличии признаков внутриутробного инфицирования. Примечание: 0 - новорожденные без признаков внутриутробного инфицирования; 1 - новорожденные от матерей с признаками внутриутробного инфицирования; р 0-1=0,017.

Исследование показателя проницаемости мембран эритроцитов проводилось по отношению к каналообразующему зонду нистатину (рис.4), что позволяло судить о степени подверженности мембранных структур к проникновению в клетки токсинов и других повреждающих субстратов. Было установлено, что проницаемость мембран эритроцитов у детей при мочеполовой инфекции беременной существенно возрастала.

О 1

Я МесНап [: ] 25%-75%

О 1

МесИап П 25%-75% Щ Мт-Мах

Рис. 4. Проницаемость мембран эритроцитов у новорожденных от матерей с признаками мочеполовой инфекции.

Примечание: 0 - новорожденные от матерей без признаков инфекции мочеполовых путей; 1 - новорожденные от матерей с признаками инфекции мочеполовых путей; рО-1=0,007.

Таким образом, системная воспалительная реакция при наличии признаков мочеполовой инфекции беременной и внутриутробного инфицирования плода на клеточном уровне проявляется снижением содержания мембра-носвязанной воды и увеличением флюоресценции триптофановых групп в мембранах эритроцитов пуповинной крови новорожденных. Дополнительно, при наличии мочеполовой инфекции беременных в мембранах эритроцитов их новорожденных отмечается глубокая погруженность белковых молекул в липидный бислой и увеличение проницаемости, а при внутриутробном инфицировании плода - увеличение показателя дестабилизации структуры мембраны.

Клинические исследования показывают, что выраженная анемия во время беременности может приводить к преждевременным родам, привычному невынашиванию, снижению массы тела новорожденного и даже к смерти плода при тяжелой форме анемии, особенно если она проявилась в первой половине беременности.

Для выяснения уровня стабильности и характера структурных изменений в мембранах эритроцитов новорожденных нами были изучены показа-

тели структурного состояния мембран эритроцитов пуповинной крови с наличием анемии у беременных, которая встречалась среди обследованных нами беременных у 37 женщин (52 %). Структурное состояния мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных от матерей с анемией беременных характеризовалось более поверхностным расположением белковых молекул по отношению к липидному бислою и составляло 0,167 (0,057-0,333) ОЕ против 0,275 (0,154-0,428) ОЕ в контроле, р=0,024. Мы полагаем, что найденное изменение топографии белков в эритроцитарных мембранах в виде их всплывания к поверхности мембраны является характерным для железоде-фицитного состояния и согласуется с данными других авторов [Пахмутова О. А., 2008].

Структура поверхностно расположенных областей мембран, оцениваемая нами также по флуоресценции зонда АНС характеризовалась выраженной тенденцией к увеличению содержания триптофановых групп белков 0,78 (0,69-0,95) ОЕ против 0,69 (0,57-0,89) ОЕ в контроле, р=0,069, что отражает возможные преобразования поверхностного заряда мембраны в период стабилизации метаболических и биофизических свойств мембран, наступающих в ходе адаптации к гипоксии. Такие результаты флуоресценции АНС дополняют вышеизложенные данные о развитии деструктивных процессов в мембране эритроцита у детей, матери которых страдали анемией беременных.

Анализ показателей флуоресценции зонда ХТЦ в группе новорожденных, матери которых страдали анемией беременных, свидетельствует о выраженной тенденции к снижению кальций-связывающей способности эритроцитарных мембран у них 1,50 (0,96-2,40) ОЕ против 2,08 (1,38-3,17) ОЕ в контроле, р=0,050.

Таким образом, характерным для состояния мембран эритроцитов у новорожденных при железодефицитной анемии беременной является преобразование белковой составляющей мембран эритроцитов. Это выразилось в нарушении пространственной конфигурации и топографии белков мембраны со смещением расположения белков в наружные слои мембраны, выраженной тенденцией к увеличению содержания триптофановых групп белков, снижением кальций-связывающей способности мембран, а, следовательно, активности кальций-транспортных белков мембран. Можно полагать, что дефицит железа у матери и недостаточное депонирование его в антенатальном периоде у плода способствуют развитию у новорожденных детей дефицитного эритропоэза, затруднений гемоглобинообразования, появлению хронической гипоксии и дисбалансу в системе эритрона, что проявляется вышеуказанными нарушениями физико-химических параметров эритроцитарных мембран и метаболизма клеточных структур.

Известно, что воздействие большого количества неблагоприятных факторов на плод не является специфическим и связано главным образом с перинатальной гипоксией, сопровождающейся гемодинамическими и метабо-

лическими нарушениями, что снижает адаптационные возможности новорожденного и может отражаться на клеточных структурах.

В наших исследованиях основным параметром, характеризующим состояние мембран эритроцитов новорожденных при внутриутробной гипоксии, оказался показатель проницаемости, определяемый по встраиванию в мембраны каналообразующего зонда - нистатина. Согласно этим данным, проницаемость мембран при наличии внутриутробной гипоксии достоверно повышалась (рис. 5).

Обнаруженное повышение проницаемости мембран эритроцитов при гипоксии плода - вполне прогнозируемое явление. Перинатальная гипоксия сопровождается гемодинамическими и метаболическими нарушениями. Гомеостаз клеток при гипоксии нарушается, а важным условием его поддержания является нормальная проницаемость цитомембраны.

0,55 0,50 .0,45 0,40 0,35

ш О

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10

■ МесКап О 25%-75% "Т" Мт-Мах

Рис. 5. Проницаемость мембран эритроцитов у новорожденных при наличии признаков внутриутробной гипоксии плода во время беременности. Примечание: 0 - новорожденные от беременных без признаков внутриутробной гипоксии плода; 1 - новорожденные от беременных с признаками внутриутробной гипоксии плода; р 0-1=0,022.

При гипоксии плода значительно возрастает угроза выкидыша, так как структурно-морфологические изменения мембран ведут к нарушениям реологических свойств крови (снижению деформируемости, увеличению скорости агрегации эритроцитов, уменьшению их количества) и изменению метаболических процессов - интенсификации перекисного окисления липи-

дов, снижению антиоксидантной активности крови, уменьшению энергетического обеспечения и недостаточности пластических процессов. Следовательно, прослеживается клиническая и патогенетическая связь гипоксии детей с угрозой выкидыша.

На уровне клеточных мембран при сравнении групп новорожденных от матерей с угрожаемым выкидышем и с гипоксией наблюдались однотипные явления, что подчеркивает их патогенетическую связь: у детей, имевших угрозу выкидыша мы выявили выраженную тенденцию к повышению проницаемости мембран 0,26 (0,23-0,33) ОЕ против 0,21 (0,19-0,27) ОЕ у новорожденные от беременных без угрозы выкидыша, р=0,081.

Таким образом, оба важнейших фактора риска церебральной ишемии у новорожденных - наличие признаков внутриутробной гипоксии и угрозы выкидыша сопровождаются однонаправленным повышением проницаемости мембран эритроцитов пуповинной крови, что может приводить к их большей деформируемости, способности к гемолизу и формированию сосудистых осложнений, в том числе, и к церебральной ишемии. С нашей точки зрения, нарушенная структура мембран эритроцита может являться важнейшим дополнительным патогенетическим фактором формирования церебральной ишемии новорожденных.

При исследовании групп новорожденных с явлениями асфиксии и церебральной ишемией мы принимали во внимание, что независимо от причин кислородной недостаточности в организме новорожденного происходит перестройка обменных процессов, гемодинамики и микроциркуляции. В результате микроциркуляторных расстройств в головном мозге, сердце, почках, надпочечниках и печени новорожденных в возникают отек, кровоизлияния и участки ишемии, развивается тканевая гипоксия. Такое катастрофическое состояние органов и систем новорожденного не может не отразиться на важнейших параметрах структуры и функции клеточных мембран, в том числе мембран эритроцитов. В наших исследованиях мы нашли подтверждение данному положению (рис.6,7).

Состояние церебральной ишемии и асфиксии отразилось на интегральном показателе, характеризующем стабильность клеточной оболочки и клетки в целом - коэффициенте дестабилизации. Как следует из рис. 7, в группе детей с церебральной ишемией, имеющих какую-либо из изучаемых нами перинатальную патологию, уровень дестабилизации мембраны значимо возрастал, что сопровождалось резким увеличением разброса индивидуальных вариант с наличием крайне высоких значений, не наблюдавшихся в группе детей с отсутствием патологии. Обращает на себя внимание, что такое патологическое «расширение» обычной амплитуды показателей (например, осмотической резистентности эритроцитов до 0,2-0,8%) по данным Васильевой О. А. с соавт. (2007), обязательным патохимическим признаком

фетоплацентарной недостаточности, то есть одного из вариантов детерминации церебральной ишемии.

1

■ МесКап □ 25%-75% ~Г Мт-Мах

Рис.6. Показатель дестабилизации мембранных структур эритроцитов новорожденных с асфиксией.

Примечание: 0 - новорожденные без асфиксии; 1 - новорожденные с асфиксией; р=0,006.

Аналогичная картина наблюдалась и в группе детей с наличием асфиксии новорожденного (рис. 6). Наши исследования согласуются с данными гуНпвка М. е[ а1. (1999), показавшими, что структуры мембраны эритроцита могут считаться первичной мишенью для вызванного асфиксией повреждения клеток организма. Отсутствие изменений всех других показателей, в том числе отмечаемых нами как показатели компенсаторных реакций, свидетельствует о снижении эффективности механизмов реактивности в критической регуляторно-метаболической ситуации при асфиксии новорожденного и может расцениваться как неблагоприятный фактор.

Таким образом, многофакторно обусловленные явления асфиксии и церебральной ишемии нарушают структурную и функциональную пластичность мембран новорожденных с возможной утратой реактивности и приобретением предродовой уязвимости организма новорожденного. Это может проявляться (с высокой вероятностью) формированием гемореологических нарушений, гипоксических повреждений жизненно важных органов и трав-матизацией ребенка в родах.

I МесКап □ 25%-75% ~Г М'т-Мах

Рис. 7. Показатель дестабилизации мембранных структур эритроцитов новорожденных с церебральной ишемией.

Примечание: 0 - новорожденные без церебральной ишемии; 1 - новорожденные с церебральной ишемией; р=0,004.

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что состояние клеточных мембран является одним из ранних и чувствительных показателей состояния организма ребенка и его физического развития. Состояние структуры мембран клеток коррелирует с физиологической зрелостью организма ребенка, с уровнем заболеваемости плода и новорожденного, поэтому может служить одним из критериев его здоровья и физического развития [Зайцева О. И.., 2003; Стольникова М. В. с соавт., 2006].

Важнейшим морфометрическим показателем, отражающим зрелость организма новорожденного, является его масса. В исследованной нами когорте новорожденных медиана массы тела составила 3350 (3034-3610) г. При этом 17 новорожденных составили группу с массой тела ниже 25 перцентиля (масса <3034 г. при сроке родов 39 недель). При оценке физического развития масса <3034 оценена как на нижней границе нормы.

Нами было установлено, что мембраны детей с массой тела <3034г характеризовались тенденцией к более низкой текучести, как глубоких слоев липидной матрицы 0,55 (0,49-0,64) ОБ против 0,62 (0,52-0,71) ОБ у новорожденных с массой тела > 3034г, р=0,088, так и в прибелковых областях мембраны 0,34 (0,31-0,39) ОБ против 0,40 (0,35-0,46) ОЕ у новорожденных с мас-

сой тела > 3034г, р=0,1, то есть отмечалась тотальная ригидность липидного матрикса мембраны.

На наш взгляд, более высокая текучесть у детей с большей массой тела при рождении напрямую связана с подвижностью окружающих зонд липид-ных молекул. Известно, что структурная организация липидной фазы плазматической мембраны отражает степень соотношения насыщенных и ненасыщенных форм жирнокислотных цепей молекул фосфолипидов в мембранах, которые изменяют текучесть их сердцевины и полярной области мембран. Многочисленными исследованиями установлена прямая связь дефицита жирных кислот во время беременности с низкими показателями физического развития новорожденных [1пп15 Б. М., 2007; ОгоиШе! Р. е! а1., 2009].

Для оценки состояния зрелости и упитанности новорожденного в педиатрической практике широко применяют массо-ростовой индекс (Кетле I). В нашей выборке медиана значения индекса составила 66,0 (61,0-70,8). У 17 новорожденных значения индекса не превышали 61, что было расценено нами, как некоторая тенденция к задержке внутриутробного развития.

При сопоставлении массо-ростового индекса с показателями структурной организации мембран эритроцитов новорожденных детей, нами установлено, что кальций-связывающая способность эритроцитарных мембран пуповин-ной крови статистически значимо повышается у детей с индексом Кетле I 61 (рис. 8).

Изменения содержания мембраносвязанного кальция в клетках связано с флуктуацией кальциевого тока через Са-каналы. Блокирование Са-активируемого канала приводит к деполяризации плазматической мембраны клетки, и, следовательно, к увеличению ее возбудимости, что, в свою очередь, должно активировать компенсаторные механизмы и увеличивать общую активность примембранной области цитоплазмы [Макаров О. В. с соавт, 2007].

Найденные особенности структурных свойств мембран эритроцитов у детей с индексом Кетле I на нижней границе нормы можно расценить как компенсаторную реакцию в виде повышения абсорбции ионизированного кальция сыворотки клеткой для построения структуры костей.

Следовательно, у детей с массой тела на нижней границе нормы показатель кальций-связывающей способности мембраны оказался информативным, свидетельствуя, что у таких детей способность связывать двухвалентные катионы возрастает, и, вероятно, насыщение кальцием клетки увеличивается. Можно полагать, что этот показатель является иллюстрацией компенсаторно-приспособительных проявлений деятельности регуляторных систем детей, родившихся от матерей с патологией беременности.

Ш Median

I i 25%-75%

Индекс Кетле I <61 Индекс Кетле I > 61 | Min-Max

p=0,036

Рис. 8. Ca - связывающая способность мембран эритроцитов у новорожденных в зависимости от значений индекса Кетле I.

Анализ связи показателей длины тела с особенностями надмолекулярной организации мембран эритроцитов показал, что у детей с тенденцией снижения длины тела выявляются флуориметрические маркеры дестабилизации мембранных структур (рис. 9). Так, у детей с длиной тела <52 см (граница 25 перцентиля) показатель дестабилизации составил 28,4 (23,4-29,2) ОЕ, а у новорожденных с длиной тела >52 см - 19,8 (15,4-27,2) ОЕ, р=0,051. Следовательно, показатели длины тела у новорожденных с тенденцией к снижению сопряжены с общей нестабильностью мембранных структур, что может являться предрасполагающим фактором развития, как специфической мембра-ноассоциированной патологии, так и неспецифических патогенетических процессов.

Таким образом, физическое развитие новорожденного ассоциировано с основными свойствами мембран - их стабильностью, вязко-эластическими свойствами и кальций-аккумулирующей функцией. Наиболее важным результатом анализа связи параметров физического развития обследованных нами новорожденных с показателями надмолекулярной организации эритро-цитарных мембран пуповинной крови мы считаем выявленное нами повышение кальций-связывающей способности плазматической мембраны у детей со значениями индекса Кетле I < 61.

■ МесИап I I 25%~75% ~Г Мт-Мах

Рис. 9. Показатель дестабилизации мембранных структур эритроцитов новорожденных с различной длиной тела.

Примечание: 1 - новорожденные с длиной тела < 52 см; 2 - новорожденные с длиной тела > 52 см; р=0,051.

Подобный характер изменений, на наш взгляд, свидетельствует о низкой обеспеченности кальцием организма новорожденных с относительно невысокими показателями физического развития, что компенсаторно приводит к большей способности мембран к его мобилизации из сосудистого русла. Выявленные нами взаимосвязи вполне могут быть использованы в качестве диагностических маркеров обеспеченности кальцием в периоде новорожден-ности.

выводы

1. Церебральная ишемия новорожденных ассоциирована с такими неблагоприятными признаками течения беременности, как анемия беременных и хроническая внутриутробная гипоксия плода.

2. У новорожденных, рожденных от матерей с анемией беременных, выявлено нарушение пространственной конфигурации и топографии белков эритроцитарной мембраны со смещением расположения протеинов в наружные слои липидного бислоя и выраженной тенденцией к увеличению содержания их триптофановых групп, снижением кальций-связывающей способности мембран. Данные изменения могут рассматриваться, как ранние маркеры железодефицитного эритропоэза, сформированные до клинически значимого снижения уровня гемоглобина.

3. Внутриутробная гипоксия новорожденных сопровождается повышением проницаемости мембран эритроцитов пуповинной крови, что может приводить к их большей деформируемости, высокой подверженности гемолизу, тромбообразованию и формированию сосудистых осложнений.

4. Структурное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных, перинатальный период которых протекал с асфиксией и церебральной ишемией, характеризуется повышенным показателем дестабилизации мембран эритроцитов с высокой вероятностью формирования ге-мореологических нарушений.

5. У новорожденных, рожденных от матерей с мочеполовой инфекцией и с внутриутробным инфицированием, мембранопатологическое действие воспалительной реакции проявляется снижением содержания мембра-носвязанной воды, увеличением проницаемости мембран эритроцитов у новорожденных первой группы, повышением показателя дестабилизации эритроцитарных мембран у вторых. Эти изменения делают уязвимыми мембранные структуры к проникновению в клетки повреждающих субстратов.

6. Отличительной особенностью структурной организации мембран эритроцитов у новорожденных, рожденных от матерей с мочеполовой инфекцией и с внутриутробным инфицированием, служит повышение флуоресценции триптофановых групп, которое носит компенсаторный характер и способствует активации транспортных функций эритроцитарных мембран. Выявлен дополнительный стабилизирующий компонент мембраны у новорожденных от матерей с мочеполовой инфекцией: реорганизация в области белок-липидного взаимодействия, определяемая по высоким параметрам флуоресценции зонда АНС.

7. Организация мембранных структур эритроцитов пуповинной крови новорожденных с невысокими показателями физического развития сопряже-

на с их общей нестабильностью: повышенным показателем дестабилизации мембран, тенденцией к снижению текучести внутренних областей липидного бислоя. Увеличение кальций-связывающей способности плазматических мембран свидетельствует о низкой обеспеченности кальцием организма новорожденных этой группы и является компенсаторной реакцией, направленной на повышение способности мембран к мобилизации ионизированного кальция из сосудистого русла.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для своевременной профилактики церебральной ишемии новорожденных особое внимание следует обращать на наличие таких признаков, как анемия и мочеполовая инфекция беременной, эпизоды угрозы выкидыша и, особенно, наличие признаков хронической внутриутробной гипоксии плода.

2. У новорожденных, рожденных от матерей с анемией беременных, рекомендуется определение содержания триптофанилов и степени их погруженности в липидный бислой в эритроцитах пу-повинной крови в качестве раннего маркера высокого риска формирования анемии грудного возраста с проведением соответствующих превентивных мероприятий.

3. У новорожденных с массой тела на нижней границе нормы целесообразным является определение текучести мембран эритроцитов пуповинной крови, как косвенного маркера дефицита полиненасыщенных жирных кислот, с его своевременной коррекцией соответствующими лекарственными препаратами и обогащенными питательными смесями.

4. Определение кальций-связывающей способности мембран эритроцитов у детей со значениями индекса Кетле I < 61 может быть использовано в качестве дополнительного параметра оценки кальциевого обмена у новорожденных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние возраста матери тувинской национальности на структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран новорожденных / Т.

A. Колодяжная, Я. X. Даваа, О. И. Зайцева и др. // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера: матер. XII межрегиональной науч.-практ. конф. - Абакан, 2009. - Вып. 8. - С. 151-153.

2. Даваа, Я. X. Влияние железодефицитной анемии беременной на молекулярную организацию мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Питание в профилактике социально-значимых заболеваний: матер, симпозиума с международным участием. - Красноярск, 2009. - С. 50-52.

3. Даваа, Я. X. Связь кальцийсвязывающей способности мембран эритроцитов пуповинной крови с параметрами физического развития новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Фармакотерапия и диетология в педиатрии: сб. матер. XIII конгресса педиатров России. - Томск, 2009. -С. 33.

4. Даваа, Я. X. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных, рожденных от матерей с анемией беременных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Фармакотерапия и диетология в педиатрии: сб. матер. XIII конгресса педиатров России. - Томск, 2009. - С. 32.

5. Структурно-функциональное состояние эритроцитарных мембран у новорожденных, родившихся от матерей с различным характером патологии беременных Республики Тыва / Т. А. Колодяжная, Я. X. Даваа, О. И. Зайцева и др. // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Сибири и Севера: матер. XII межрегиональной науч.-практ. конф. - Абакан, 2009.-Вып. 8.-С. 153-154.

6. Даваа, Я. X. Данные ретроспективного анализа факторов риска формирования синдрома церебральной ишемии новорожденных / Я. X. Даваа, Л.

B. Васильева, С. Ю. Терещенко // Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва: матер, юбилейной науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ГУЗ «Республиканская больница №1» МЗ РТыва. - Кызыл, 2010. - С. 95-97.

7. Даваа, Я. X. Связь кальцийсвязывающей способности мембран эритроцитов пуповинной крови с параметрами физического развития новорожденных / Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Актуальные вопросы развития специализированной медицинской помощи в Республике Тыва: матер, юбилейной науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ГУЗ «Республиканская больница № 1» МЗ РТыва. - Кызыл, 2010. - С. 164-16

8. Davaa, Y. Cord blood erythrocyte membrane fluidity and birth weight in full-term Tuvinian newborns / Y. Davaa, M. Shubina, S. Tereshcenko // The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. - 2010. - Vol. 23 (Suppl. 1). -P. 118.

9. Особенности структурно-функционального состояния эритроцитарных мембран новорожденных, родившихся от матерей, страдающих аллергией / Т. А. Колодяжная, О. И. Зайцева, Я. X. Даваа, С. Ю. Терещенко // Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, посвящ. 30-летнему юбилею Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. - Красноярск, 2010. - С. 297-299.

10. Ретроспективный анализ факторов риска формирования синдрома церебральной ишемии новорожденных / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: матер, итоговой науч.-практ. конф. НИИМПС СО РАМН - Красноярск, 2010. - Вып. 9. - С. 92-93.

11. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов новорожденных при анемии беременных / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Якутский медицинский журнал. - 2010. - №2. -С. 9-11.

12. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов новорожденных при мочеполовой инфекции беременной / Я. X. Даваа, Т. А. Колодяжная, М. В. Шубина, С. Ю. Терещенко // Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, посвящ. 30-летнему юбилею Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. - Красноярск, 2010.

-С. 109-111.

13. Даваа, Я. X. Связь структурно-функционального состояния мембран эритроцитов новорожденных с параметрами их физического развития / Я. X. Даваа, М. В. Шубина, С. Ю. Терещенко // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - № 1. - С. 25-28.

14. Даваа, Я. X. Факторы риска формирования церебральной ишемии у новорожденных республики Тыва / Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко // Якутский медицинский журнал. - 2011. - №2. - С. 33-36.

15. Церебральная ишемия у новорожденных детей: метод, рекомендации / Я. X. Даваа, О. И. Зайцева, С. Ю. Терещенко,- Красноярск, 2011. - 20 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АНС - 1-аланинонафталин-8-сульфонат

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ДИ - доверительный интервал

ДМХ - диметиламинохалкон

ЕФ - единицы флуоресценции

ЖДА - железодефицитная анемия

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

МПИ - мочеполовая инфекция

ОЕ - относительные единицы

ОШ - отношение шансов

ХВГ - хроническая внутриутробная гипоксия

ХТЦ - хлортетрациклин

ХФПН - хроническая фетоплацентарная недостаточность ЦИ - церебральная ишемия

ЫАОН - восстановленная форма никотинамидзависимой дегидроге-назы

Утверждено в печать 30 сентября 2011 г. Отпечатано в тип. ООО «Эксклюзив-Поли» г. Красноряк, пр. Свободный 66 «А» зак. 402, тир. 100 экз 28