Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Трансплантация клеток костного мозга для коррекции патогенетических нарушений при сахарном диабете 2 типа

На правах рукописи 003468987

Степанова Ольга Ивановна

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2ТИПА

(экспериментальное исследование)

14.00.41,- ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ И ИСКУССТВЕННЫЕ ОРГАНЫ 14.00.16,- ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 Г £ Л* '•"¿¡л ¿Л>3

МОСКВА 2009 г.

003468987

Работа выполнена в ФГУ "Федеральном Научном Цетре Трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова Минздравсоцразвития РФ" и в ГУ Научном центре биомедицинских технологий РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор

доктор билогических наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГУ Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава

Защита диссертации состоится «26» мая 2009 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.208.055.01. при ФГУ "ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова Минздравсоцразвития РФ" по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов им. В.И.Шумакова Минздравсоцразвития РФ"

Автореферат разослан «¿/> 0^' 2009 года

Нина Андреевна Оншценко

Владислав Николаевич Карюпценко

Николай Николаевич Скалецкий

Инна Иосифовна Дементьева

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.055.01.

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна Шевченко

Актуальность темы исследования.

Успехи клеточной биологии последних десятилетий создали научные и практические предпосылки для развития новой области медицины - клеточной трансплантации. С разработкой учения о стволовых клетках появилась надежда на возможность более эффективной регуляции процессов восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей [Pittenger et.al., 1999; Jaiswal et.al., 2000;B.A. Отеллин, 1999; И.В. Потапов и др., 2001; М.Ф. Расулов, 2004],а также восстановления липидного, углеводного и белкового обменов [A.B. Берсенев, 2003; Hess et al., 2003; Ende et al., 2002] в организме с помощью аутологичных или аллогенных стволовых клеток костного мозга (ККМ). Особенно значимой возможность осуществления восстановительной регенерации могла бы быть для повышения эффективности лечения сахарного диабета (СД), который является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний, приводящих к глубокой инвалидизации и гибели людей трудоспособного возраста во всех странах мира [King H. et al., 1998; Mainous et al., 2004; И.И. Дедов и др., 2005]. Полагают, что особенно выраженный рост заболеваемости СД в наступающем тысячелетии будет иметь СД 2 типа в связи с прогрессирующим эпидемическим распространением в человеческой популяции факторов, предрасполагающих к его развитию: атеросклероза, проатерогенных метаболических синдромов и эндокринных нарушений [М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова и др., 2000; A.A. Александров, 2001; И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2003; Я.А. Александровский, 2005; И.Н. Бокарев и др., 2006]. Продолжающийся рост заболеваемости СД, несмотря на определенные достижения последних лет, свидетельствует о том, что ни профилактические мероприятия, ни современная медикаментозная терапия не способны надежно препятствовать возникновению и прогрессировашяо клинических проявлений СД и его осложнений. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой современной медицины.

Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых и прогениторных клеток костного мозга может оказаться особенно перспективными для лечения СД 2 типа, при котором инсулинорезистентная гипергликемия является первично мембранной патологией клеток и обусловлена конформационным изменением структуры мембран клеток в условиях развития дислипидемии и эндокринных расстройств. [М.И. Балаболкин, 1994; А.Ш. Зайчик, Л.П. Гурилов, 2001; И.Н. Бокарев, Б.К. Беликов и др., 2006]. Мы полагали также, что для лечения СД 2 типа

наиболее перспективным может оказаться использование, как стромальной, так и мононуклеарной (гемопоэтической) фракций ККМ, которые содержат значительное количество стволовых и прогениторных клеток и поэтому способны индуцировать в паренхиме поврежденных органов процессы репаративной регенерации, выделяя в процессе своей жизнедеятельности регуляторные пептиды, которые восполняют дефицит адекватных информационных и адаптационных сигналов регенерации [H.A. Оншценко, 2004; Kinnaird et al., 2004].0днако исследований по коррекции ККМ нарушений при СД 2 типа ни в клинике, ни в эксперименте мы не обнаружили. Только в одной из работ [Ende et al.,2004] приводятся сведения об однократном введении ретроорбитально большой дозы ксеногенных ККМ мышам без изучения влияния различных доз и типов ККМ, а также стадии развития болезни на результаты клеточной терапии. Одной из причин отсутствия в России исследований терапии СД 2 типа с помощью клеточных технологий, является отсутствие в нашей стране охарактеризованной модели СД 2 типа, развивающейся у мутантных мышей линии C57BL/KsJYLepiiib/+. Отсутствие патофизиологической характеристики течения СД 2 типа у мутантных мышей этой линии и отсутствие данных об изменениях клинических проявлений СД 2 типа у таких мышей под влиянием аллогенных или изогенных ККМ позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Делью настоящего исследования явилось изучение целесообразности использования мутантных мышей линии C57BL/KsJYLepr'äb/+ в качестве модели при проведении экспериментальных работ по коррекции сахарного диабета 2 типа методом трансплантации клеток костного мозга.

Для достижения указанной цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику возникновения клинических и морфологических нарушений, присущих СД 2 типа у мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+ и обосновать пригодность использования их в качестве экспериментальной модели СД 2 типа для оценки терапевтической эффективности клеток костного мозга

2. Отработать методы выделения, культивирования или трансплантации гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга для выбора эффективного способа коррекции патогенетических нарушений при СД 2 типа.

3. Оценить эффективность и безопасность трансплантации аллогенного и изогенного костного мозга при коррекции метаболических нарушений у животных с СД 2 типа.

4. Установить сроки применения клеток костного мозга в зависимости от стадии развития болезни, а также дозу и кратность их введения для пролонгированной коррекции клинических и метаболических (биохимических) нарушений, развивающихся при СД 2 типа.

5. Установить значение фенотипа клеток костного мозга (гемопоэтической или стромальной фракций клеток), а также их гистосовместимости (изогенные и аллогенные клетки от здоровых животных) для индукции процессов репаративной регенерации внутренних органов (островковая ткань поджелудочной железы, печень, почки, лимфоидная ткань), участвующих в патогенезе СД 2 типа.

6. Выявить наличие функционально активных трансплантированных клеток костного мозга (маркер- йЕР) в органах животных с СД 2 типа на длительных сроках наблюдения (120 дней) и установить связь присутствия жизнеспособных клеток с восстановлением функции поврежденных органов.

Выполнение работы осуществлялась в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02»сентября 2005г. «Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы», по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0800280) и а также в рамках отраслевой программы «Новые клеточные технологии - медицине» (01.07.200201.07.2010гг.), утвержденной 29.05.02г. на заседании президиума РАМН.

Научная новизна работы.

Впервые была изучена и охарактеризована патофизиологическими методами генетическая модель СД 2 типа на мутантных мышах линии С57В17К&ГУЬергаь/+, пригодная для изучения терапевтических эффектов клеток костного мозга. Полученная модель СД 2 тала в настоящее время поддерживается в ГУ НЦБМТ РАМН.

Было установлено, что развитие патологического процесса у этих мышей проходит 3 стадии: 1-я стадия (1-2 месяц со дня рождения) характеризуется гипергликемией на фоне гипертрофии и гиперплазии островков Лангерганса в поджелудочной железе (инсулинрезистентная); 2-я стадия (3-4 месяца со дня рождения) - характеризуется нарушением липидного (ожирение) и углеводного (гипергликемия) обменов и протекает на фоне снижения количества функционирующих Р-клеток в островках Лангерганса. На этой стадии возникают выраженные метаболические нарушения, сопровождающиеся структурными изменения внутренних органов. 3-я стадия (5-6 месяцы после рождения) СД 2 типа сопровождается кахексией, функциональными

нарушениями во внутренних органах, которые прогрессируют и приводят к табели животного.

Доказано, что эффективность коррекции патофизиологических нарушений у животных с СД 2 типа при трансплантации клеток костного мозга, находится в прямой зависимости введенных клеток от суммарной дозы и стадии развития патологического процесса в организме, но не зависит от использованного фенотипа клеток и их гистосовместимости.

Показана целесообразность трансплантации клеток костного мозга на поздней стадии развития СД 2 для снижения темпов прогрессировали! патоморфологических изменений во внутренних органах и пролонгирования сроков жизни животных.

Более выраженная эффективность от трансплантации клеток костного мозга показана на ранней стадии развития СД 2 типа, когда лучше сохранены резервы адаптации островковых клеток поджелудочной железы, выраженность которых регулируется введенными клетками костного мозга от здоровых животных.

Показано, что нормализация углеводного обмена при использовании клеток костного мозга на ранних сроках СД происходит на фоне активации процессов адаптации я регенерации островковой ткани поджелудочной железы, что подтверждено иммунопггохимически по окраске хромогранином-А на присутствие нейроэндокринных клеток в островках и по окраске на антитела Ю-67 - маркер репликации ДНК (пролиферативной активности клеток), а также по результатам гистологических и морфологических исследованиям (гипертрофия, гиперплазия).

Доказано, что предварительное культивирование трансплантируемых клеток костного мозга достоверно повышает эффективность коррекции метаболических и структурных нарушений изменений во внутренних органах у животных с СД 2 типа.

Показано, что аллогенные донорские клетки костного мозга линии мышей ВКШБР, длительно сохраняют свою жизнеспособность в организме реципиента (линия С57В1Ж&галрЛ+) по крайне мере в течение 120 дней после трансплантации и могут участвовать в регуляции восстановительного морфогенеза внутренних органов (печень, почки, поджелудочная железа, лимфоидная ткань).

Практическая значимость работы.

Патофизиологические характеристики мышей мутантной линии С57В17К&Г¥1ер1Д'/+, полученной в ГУ НЦБМТ РАМН, пригодны для изучения патологических процессов, возникающих при развитии СД 2 типа

Было доказано, что данные животные (С57ВЬ/К51ЛгЪгргаь/+) могут быть использованы в качестве экспериментальной модели при проведении исследований с целью коррекции метаболических нарушений при СД 2 типа методами клеточной терапии.

Трансплантация аллогенных или изогенных клеток костного мозга при коррекции метаболических нарушений, сопровождающих развитие СД 2 типа, является безопасной процедурой, ослабляющей клинические и морфологические проявления СД 2 типа, выраженность которых зависит от дозы используемых клеток и стадии их применения.

Показано, что 1 стадия развития СД 2 типа является предпочтительной для применения клеток костного мозга, т.к. при этом имеет место максимально выраженный эффект коррекции клинических, биохимических и морфологических нарушений в организме животных с СД 2 типа. Предпочтительно также применять клетки костного мозга либо на 1-ой стадии СД 2 (на 3-4 неделе стабильной гликемии) однократно в максимально высокой дозе (ЮОмлн.) и/или многократно (до 7 раз, в суммарной дозе до 27,5 млн. клеток).

Показано, что и на 2 стадии развитиь СД 2 типа введение клеток костного мозга является целесообразным, т.к. ослабляет темпы развития необратимых нарушений в органах и пролонгирует сроки жизни животных.

Обнаружение трансплантируемых клеток костного мозга, содержащих ген вЕР, в тканях реципиента (С57ВЬ/К^УЬергаь/+) в течение длительного времени (до 120 суток) позволяет предложить метод трансплантации клеток мышей линии ВЮ.БРР для контролирования процессов восстановительного морфогенеза у животных с СД 2 типа.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Предложенная генетическая модель сахарного диабета мышей линии С57ВЬ/К&1УЬергл/+ является адекватной моделью СД 2 типа, так как она воспроизводит стадии нарушения углеводного обмена, развитие дисфункции островков Лангерганса в поджелудочной железе, а также патоморфологические нарушения во внутренних органах, клинический, биохимический и морфологический контроль которых может быть использован для поиска и оценки новых эффективных способов лечения этого заболевания, в том числе трансплантации клеток костного мозга.

2. Эффективность трансплантации стволовых и прогениторных клеток костного мозга при СД 2 типа зависит от стадии клинических проявлений заболевания (тяжести заболевания), количества используемых клеток и степени их биорегуляторной активности. Наиболее выраженный клинический эффект наступает при использовании высоких доз культивируемых клеток костного мозга от здоровых животных,

трансплантируемых или однократно (ЮОмлн. клеток), или дробно многократно (27,5 млн. клеток).

3. На стадии выраженных клинических и патоморфолошческих нарушений внутренних органов трансплантация клеток костного мозга не нормализует показатели углеводного обмена, но способствует замедлению темпов развития необратимого повреждения в органах и увеличивает сроки жизни животных с СД 2 типа (до 447 дней вместо 199 дней в контроле - СД 2 типа).

4. Введение клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа длительно нормализует показатели углеводного обмена и стабилизирует массу тела за счет индукции процессов адаптации и их восстановительной регенерации (гипертрофия, гиперплазия) в островках Лангерганса, что отодвигает развитие необратимых повреждений внутренних органов и существенно увеличивает сроки жизни животных (до 537±17,1 дней вместо 199 дней в контроле).

5. Клетки костного мозга после трансплантации сохраняются в организме реципиента в течение длительного времени (до 120 дней) и индуцируют процессы восстановительного морфогенеза внутренних органов.

АПРОБАЦИЯ Д ИССЕРТАЦИИ

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены на:

1. Научной конференции «Биомоделирование и биомедицина» Москва-Столбовая, 25 мая 2006г.

2. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 24-25 мая 2006г.

3. Научно-практической конференции «Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине» Ростов - на -Дону, 19-20 сентября 2006г.

4. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 30-31 мая 2007г.

5. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 29 мая 2008г.

6. IV Всероссийском съезде трасплантологов, посвященный памяти акад. В.И. Шумакова, Москва, 9-10 ноября 2008г.

Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехногий 13 марта 2009г.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 в центральном рецензируемом журнале.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Диссертация содержит 6 глав и состоит из введения, обзора литературы (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 3 глав собственных результатов (главы III, IV, V) с обсуждением их (глава VI), а также выводов, практических рекомендаций, и списка использованной литературы. Диссертация имеет библиографический указатель, который содержит 260 источников, включающих в себя 96 отечественных и 164 зарубежных источников. Работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 39 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика экспериментального материала и использованных методов

исследования

Для решения поставленных задач работа поводилась по трем основным направлениям -по пути изучения динамики патофизиологических изменений состояния животных в генетической модели СД 2 типа, по пути освоения техники применения клеточных технологий и по пути исследования возможностей коррекции СД 2 типа с помощью аллогенныхи изогенных ККМ.

Патофизиологические изменения в организме при СД 2 типа изучали на мутантных мышах C57BL/KsJYLepr^/+(B/Ks-Leprdb/+), которые несут рецессивный ген leptin receptoi-Lepiílb - (db) (8-я группа сцепления, 4-я хромосома). Ген db в гомозиготном состоянии вызывает диабет, сходный с diabetes mellitus, с дегрануляцией ß-клеток в островках ПЖ, но без дефицита инсулина. Мыши - диабетики B/Ks-Leprdb/Leprdb (db/db) обоих полов бесплодны [З.К. Бландова и др., 1983; H.H. Каркищенко, 2004; И.В. Сарвилина, В.Н. Каркищенко, Ю.В. Горшкова, 2007]. Для контроля динамики развития СД 2 типа использовали 2 группы здоровых мышей: фенотипически здоровые гетерозиготные мыши той же линии B/Ks-Lepí®7+ (db/+) и мыши линии C57BL/10 (BIO).

В таблице 1 в I разделе работы представлен общий расход мышей: в опытной ipynne(150 мышей) и контрольных группах в количестве (180 мышей), которые

использовались для изучения патофизиологических закономерностей развития СД 2 типа. Ставя своей целью, изучение возможности коррекции клинических проявлений СД 2 типа с помощью аллогенных и изогенных ККМ - П раздел работы был посвящен отработке технологий выделения клеток и приготовления клеточных культур. Для этого было использовано 15 мышей; для поиска адекватного способа трансплантации клеток использовали - 16 мышей, причем при определении способа

Таблица 1 Распределение животных по группам на этапе подготовки исследований к выполнению основных разделов работы.__

Раздел работы Группы опытов Количество животных (мыши)

самцы самхи

1Изучение экспериментальной модели СД 2 типа Патофизиологическая характеристика генетической модели СД2типа 1.1 .Динамическое изучение опытной группы с моделью СД 2типа у мышей ИЫдЬ 85 65

1.2.Динамическое наблюдение в 1. контрольной группе мышей ЙЬ/+-(норма) 90

1.3.Динамическое наблюдение в 2. контрольной группе мышей В10-(норма) 90

П. Отработка техники применения клеточных технологий в эксперименте Отработка технологии выделения различных фракций ККМ и их культивирования Л. 1 .ПолучениеГПККМ и ММСК КМ 15

Выбор оптимального способа трансплантации ККМ П.2.введение внутривенное (хвостовая вена) 5 3

ИЗ. введение внугрибрюшинное 5 3

Всего: 361 290 71

ГПККМ - гемопоэтические клетки костного мозга;

ММСК КМ - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (фибробластоподобные клетки); ККМ - клетки костного мозга.

трансплантации клеток, предпочтение было отдано преимущественно внутрибрюшинному способу, т. к. этот путь введения клеток у мышей оказался более простым и безопасным.

При изучении возможностей клеточной терапии при СД 2 типа были выполнены III и IV разделы исследования на мышах с генетической моделью СД 2 типа (таблица 2). Было израсходовано 310 мутантных мышей: с трансплантацией аллогенных ККМ - 105 мышей; с трансплантацией изогенных ККМ -120 мышей; контрольная серия опытов на мышах с СД 2 типа включала 85 животных без терапии ККМ (см. обозначения в таблице 2). В качестве доноров стволовых и прогекиторных клеток костного мозга мы использовали здоровых доноров - мышей 2-х линий: - трансгенных мышей линии B10.GFP с геном зеленого белка для маркировки введенных клеток в организм реципиента и осуществления аллогенной трансплантации (мыши B.10GFP были предоставлены нам для работы директором лаборатории Osb-Jackson - США A.B.

Червонским), а также фенотипически здоровых гетерозиготных мышей (йУ+, для осуществления изогенной трансплантации. Использование изогенных ККМ от здоровых доноров вместо аутологичных ККМ было связано с тем, что последние у животных с длительной хронической патологией в организме утрачивают свою биорегуляторную активность и становятся мало пригодными для клеточной терапии [Е.Д. Гольдберг и др., 2007].

Таблица 2 Распределение животных с моделью СД 2 типа по вариантам

Раздел работы Группы опытов Серии опытов Количество животных (мыши)

самцы самки

Ш. Исследование эффекта клеточной терапии СД 2 типа на стадии выраженных клинических и морфологических изменений в организме (введение ККМ на 3-4 месяце после рождения) 1. Использование аллогенных ККМ от мышей ВКШРР Ш. 1.1. СД+Использование 4,5- 5 млн. культивированных ГПККМ (однократное введение) 17 8

Ш.1.2. СД+Использование 4.5-5 млн. некультивированных ККМ (однократное введение) 15 10

Ш. 1.3. СД+Использование культивированных ГПККМ+ ММСК КМ (семикратное введение) (дозы указаны в тексте) 15 10

2. Использование изогенных ККМ от мышей <й>/+ Ш. 2.1. СД+Использование культивированных 24-39 мля.ГПККМ (трехкратное введение) 20 10

П1. 2.2. СД+Использование культивированных 24-30 млн. ММСК КМ (трехкратное введение) 20 10

Ш. 2.3. СД+Использование культивированных 100млн. ГПККМ (однократное введение) 20 10

IV. Исследование эффекта клеточной терапии СД 2 типа на ранней стадии гипергликемии (введение ККМ на 1 месяце после рождения) 1. Использование аллогенных ККМ от мышей ВЮ.ОТ IV, 1. СД+Использование культивированных ГПККМ+ММСК КМ (семикратное введение ККМ) 17 13

2. Использование изогенных ККМ от мышей с1Ь/+ IV.2. СД+ Использование культивированных ЮОмлк. ГПККМ (однократное введение ККМ) 17 13

Контроль - мыши с СД 2 типа*) без введения") ККМ (с введением физраствора) 54*) 31')

Всего: 310 195 115

*) - Контрольная серия опытов на мышах в III и IV разделах работы была общей.

**) - В контрольную серию были также включены мыши СД + убитые ККМ, т.к. результаты этих исследований достоверно не отличались от контроля (СД без ККМ); ГПККМ - гемопоэтические клетки костного мозга; ММСК КМ -мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (фибробластоподобные клетки); ККМ - клетки костного мозга.

Общее количество мышей включенных в эксперимент (таблица 1 и 2) составило 671, из них 485 самцов и 186 самок. Всех экспериментальных животных содержали в условиях свободного доступа к воде и пище на рационном питании (без диет), соответствующем нормативам ГОСТа (зав. виварием В.Н.Рыбалкина). Все исследования проводились в

лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГУ ФНЦ ТиИО им. акад. В.ШИумакова и в.лаборатории клеточных нанотехнологий ГУ НЦБМТ РАМН Наблюдения за опытной и контрольными группами (раздел работы I) проводили с 4-8 недели после рождения в течение 12 месяцев. Исследовали массу тела, суточное количество принятой пищи и выпитой воды, продолжительность жизни животных. Изучались биохимические показатели крови и морфологические изменения внутренних органов на 2 - 4 - 6 месяцах жизни этих животных.

У животных в П1 разделе работы коррекция СД 2 типа проводилась на поздней стадии развития болезни (через 3-4 мес. после рождения - стадия выраженных клинических и морфологических изменений) путем трансплантации аллогенных или изогенных ККМ в разных дозах. У животных в IV разделе работы коррекция СД 2 проводилась на ранней стадии развития болезни (через 1 мес. после рождения) путем трансплантации аллогенных или изогенных ККМ в наиболее эффективных дозах, установленных в III разделе работы. Группа общего контроля включала животных с СД 2 типа без введения ККМ

В Ш разделе работы для клеточной терапии СД на поздней стадии развития болезни были использованы аллогенные ККМ (раздел работы П1.1.) от здоровых доноров мышей В1(ШРР, которые составили 3 серии опытов:

Ш.1.1. - мышам <ЗЬ/<ЗЬ в возрасте 3 месяцев, вводили однократно внутрибрюшинно гемопоэтические ККМ - (ГПККМ) в количестве 4,5-5млн.; клетки были культивированы 4 суток, срок наблюдения после трансплантации 60 дней; 1П.1.2. - мышам ёЬМЬ в возрасте 3 месяцев, вводили однократно внутрибрюшинно некультивированные ККМ в количестве 4,5-5млн., срок наблюдения после трансплантации 60 дней;

1П. 1.3. - мышам ёЬ/ёЬ в возрасте 4 месяцев, производили 7-кратное введение ККМ -сначала ГПККМ (мононуклеарная фракция), культивированных в течение 5 суток, и затем мультипотентных мензихимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ), культивированных в течение 14 суток. Реципиентам мононуклеарную фракцию ККМ вводили внутрибрюшнно по 4,5-5 млн. 4-х кратно (18-20 млн.) с интервалом в 7 дней; ММСК КМ вводили по 2-2,5 млн. 3-х кратно (6-7,5млн.) с интервалом в 14 дней, от первого введения мононуклеарной фракции; срок наблюдения составил 120 дней; В разделе работы III. 2. для коррекции СД 2 типа на поздней стадии развития болезни были использованы изогенные ККМ от здоровых гетерозиготных мышей <1Ь/+, которые также составили 3 серии опытов:

Ш.2.1. - мышам db/db в возрасте 3 месяцев, производили трехкратное внутрибрюшинное введение ГПККМ по 8-13 млн. (всего 24-39 млн. клеток) с интервалом в 3-4 дня; клетки были предварительно культивированы 4 суток; общий срок наблюдения составил 120 дней.

Щ.2.2. - мышам db/db в возрасте 3 месяцев, производили трехкратное внутрибрюшинное введение ММСК КМ, которые были культивированы в течение 14 суток и вводились с интервалом в 7-14 дней по 8-10 млн. (24-30 млн.) клеток; срок наблюдения составил 120 дней;

П1.2.3. - мышам db/db в возрасте 3 месяцев, производили однократное внутрибрюшинное введение ГПККМ в количестве 100 млн., клетки были культивированы в течение 5 суток; срок наблюдения составил 120 дней; В IV раздел работы для лечения СД 2 типа ККМ вводили на ранней стадии развития болезни, причем использовали либо алло- либо изогенные ККМ в высоких эффективных дозах и было выполнено 2 серии опытов:

IV. 1. - мышам db/db в возрасте 1 месяц, производили 7-кратное введение ККМ -сначала ГПККМ (мононуклеарная фракция), культивированных в течение 5 суток и затем ММСК КМ, культивированных в течение 14 суток. ГПККМ вводили внутрибрюшнно по 4,5-5 млн. 4-х кратно (18-20 млн.) с интервалом в 7 дней; ММСК КМ вводили по 2-2,5 млн. клеток 3-х кратно (6-7,5 млн.) с интервалом в 14 дней от первого введения мононуклеарной фракции; срок наблюдения составил 120 и180дней; IV.2. - мышам db/db в возрасте 1 месяц, производили однократное внутрибрюшинное введение ГПККМ в количестве 100 млн., клетки были культивированы в течение 5 суток; срок наблюдения составил 120 и180дней;

Для 1П и IV разделов работ были выполнены контрольные серии на мышах db/db, в которых изучали динамику развития СД 2 типа без введения ККМ (введение физиологического раствора в равных объемах с опытными сериями), возраст мышей соответствовал возрасту мышей в опытных сериях (в Ш и IV разделе). В работе была выполнена дополнительная контрольная серия, в которой животным с СД вводили мертвые ККМ (п=10). Однако, в связи с отсутствием достоверных различий в показаниях у этих животных по сравнению с контролем (СД без ККМ) эта серия опытов была включена в общий контроль для упрощения обсуждения полученных результатов.

Технология проведения культуральных исследований.

Все работы по выделению клеток и их культивированию проводились в соответствии с общими принципами культуральных исследований на живых и трупных донорах (срок

гибели животных 30-40 минут). Исследовали жизнеспособность ГПККМ и ММСК КМ по их окраске трипановым синим, а также исследовали пролиферативную активность в культуре ММСК КМ по скорости образования монослоя.

Получение и ведение культур гемопоэтических клеток костного мозга (ГПККМ).

Забор клеток костного мозга проводили у мышей-доноров под эфирным наркозом. Стерильно иссекали кости предплечья, плеча, голени и бедра вместе с суставами и отделяли их от мышц. Далее кости обрабатывали в 70% спирте, стерильно ножницами отсекали суставы и с помощью шприца (1мл. или 2мл.), вымывали ККМ раствором Хенкса (без Са+2 и Mg+2) из костномозгового канала. Полученную суспензию клеток центрифугировали вместе с Ficoll-P (удельная плотность 1,077г/см3) для градиентного разделения в течение 5 мин. при 1500 об/мин. и комнатной температуре t°=(220C). Затем надосадочную фазу удаляли путем отсасывания. Отмытую полученную интерфазу клеток мононуклеарной фракции ресуспендировали в питательной ростовой среде DMEM (ПанЭко) с добавками и высевали на культуральный пластик. Через 4-5 суток культура ККМ мышей содержала до 50% свободно плавающих неприкрепившихся гемопоэтических клеток на разных сроках дифференцировки (гемопоэтические клетки, лимфоциты, моноциты) и до 50% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных ММСК КМ. Неприкрепившиеся к пластику клетки отбирали и их затем использовали в опытах на животных для трансплантации как очищенную от стромалъных (пластикадгезивных) клеток мононуклеарнуто фракцию ГПККМ. Полученная культура ГПККМ содержала до 2,5% CD34+/CD45+ клеток (таблица 3) была готова для трансплантации, клетки отмывали от среды, подсчитывали в камере Горяева и вводили в объеме 500-1000 мкл. От одного донора получали в среднем 40-60 млн. ГПККМ для трансплантации. Значимые популяции гемопоэтических стволовых и прогениторных ККМ выявляли на проточном цитофлуориметре FC-500 (USA) с использованием комбинации крысиных моноклональных антител (МАТ) к дифференцировочным и активационным маркерам (CD34-Nab8158; CD45-Nab3088; фирма Abeam, США), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ). Использованный состав взвеси ГПККМ, указан в таблице 3.

Таблица 3 Состав взвеси ГПККМ после культивирования в течение 5 суток

Соотношение клеточных популяций в концетрате стволовых клеток, % После культивирования

1. Лимфоциты*) 80,2±9,6

2. Моноциты*) 18,7±1,3

3. Гранулоциты*) 1,1*1.4

4. CD34+/CD45+(no данным проточной цитометрии) 2,5±0,3

где *) - окраска по Романовскому-Гимза.

Получение и ведение культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ)

Аспират ККМ, полученный у животных под эфирным наркозом, обрабатывали в лизирующим раствором (114 mM NH4CI; 7,5 тМ КНСОз; 100 мкМ EDTA) из расчета 1:1 при комнатной температуре t°=(22°C) в течение 1 мин. с последующим центрифугированием в течение 3 мин. при 1500 об/мин, добиваясь полного лизиса эритроцитов. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий ГПККМ и ММСК КМ, ресуспендировали в ростовой среде DMEM (ПанЭко) с добавлением 25мМ HEPES, 0,58 г/л глютамина, 100мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), 5 мкг/л инсулина и высевали на культуральный пластик. Через 3-5 суток неприкрепившиеся клетки отбирали, а к оставшимся пластикадгезивным клеткам в ростовую среду добавляли основной фактор роста фибробластов (bFGF) (Sigma, USA) 20 нг/мл. Культивировали ММСК КМ для наращивания клеточной массы в течение 14 суток с заменой ростовой среды через каждые 3 дня. Через 2 недели клеточный материал, представлявший собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные ММСК КМ, был готов для трансплантации. Клетки снимали с пластика, производили подсчет в камере Горяева и ресуспендировали в 500-1000 мкл. раствора Хенкса. Для идентификации ММСК КМ в культуре использовали иммуногистохимический метод выявления коллагена I типа [Лейси А., 1992]. Методы биохимического исследования крови.

Все биохимические исследования проводили в 45 мкл цельной крови, полученной пункцией малой (латеральной) подкожной вены голени у мышей после 16-18 часов голодания, по разработанной нами методике, позволяющей многократно проводить забор цельной крови в объеме до 400 мкл и при этом сохранить жизнь и здоровье животного (без увечий хвоста) [О.И.Степанова, 2006].

Гликозилированный гемоглобин fflbAlc) определяли в 5 мкл крови на приборе NycoCard REDER П (Норвегия), который предназначен для быстрого определения in vitro HbAlc. Данный тест основан на методе боратного аффинного анализа Объем образца 5мкл крови. Диапазон измерения от 3 - до 18%.

Содержание глюкозы измеряли в капле крови (2-5мкл) на приборе Асси-СНЕК (Швейцария). Принцип работы прибора, основан на фотометрическом определении уровня глюкозы в свежей капиллярной (венозной) крови. Каплю крови наносили на тест- полоску. Диапазон измерения составлял от 0,6 - до 33,3 ммоль/л.

Показатели липидного обмена - общий холестерин (ОХ), триглицериды (ТрГ), а также липопротеиды высокой и низкой плотности (ЛПВП и ЛПНП) определяли на анализаторе Cholestech LxDxX (США).

Значения липопротеидов низкой плотности рассчитывали автоматически на приборе по формуле: ЛПНП = ОХ - ((Трг/2,19)+ ЛПВП). В этом приборе используется принцип фотометрии в отраженном свете, т. к. измеряется количество света, отраженного от реакционной поверхности. В анализаторе одновременно оценивается изменение окраски реакции на нескольких подложках. Объем пробы 35 мкл цельной крови (с добавлением 8 мкл гепарина). Диапазон измерения ОХ от 2,58 - до 12,92 ммоль/л; ТрГ от 0,51 - до 7,34 ммоль/л; ЛПВП от 0,39 - до 2,59 ммоль/л.

Стандартизацию и контроль качества лабораторных исследований проводили в соответствии с требованиями Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК).

В ходе экспериментальной работы изучение биохимических показателей крови и замеры массы тела были проведены у 310 животных, из которых: 225 животных - в опытных сериях и 85 в контрольных сериях (таблица 4).

Таблица 4 Количество животных использованных для биохимических исследований крови, определения массы тела и оставленных на дожитие после эксперимента.___

Опытные серии Кол-во животных для Кол-во животных для

биохимических определения срока жизни

исследований крови и после введения ККМ

массы тела

Ш.1.1. 25 5

III.1.2. 25 -

III.1.3. 25 5

Ш.2.1. 30 -

III.2.2. 30 -

1П.2.3. 30 5

IV. 1. 30 5

IV.2. 30 5

Контроль СД 2 типа без ККМ 85 5

Всего: 310 30

Из опытных серий с введением ККМ на ранней стадии развитии СД 2 типа были оставлены 10 животных для определения срока жизни; в сериях с введением ККМ на поздней стадии исследовали срок жизни животных с СД 2 типа на 15 животных, а в контрольных сериях (без введения ККМ) у 5. В группах животных продолжительность жизни у фенотипически здоровых гетерозиготных мышей линии ёЬ/+ составляет

65б±20 дней, а у здоровых мышей линии BIO продолжительность жизни составляет 785±13,9 дней.

Гистологические методы исследования были применены для исследования эндокринной и экзокринной части поджелудочной железы (ПЖ), печени, почек и селезенки на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Окраска препаратов ПЖ альдегид - фуксином по Гомори позволяла выявить ß-клетки островков Лангерганса (ОЛ). Гликоген в печени и углеводы в почках определяли PAS - реакцией. Жировую дистрофию гепатоцитов на криосрезах печени выявляли окраской Суданом Ш на жир. В ходе работы проведено 147 гистологических исследований в опытных сериях с введением ККМ на поздней стадии развития болезни (3-4 месяца после рождения) и 50 исследований в сериях с введением ККМ на ранней стадии развития СД 2 типа (1 месяц после рождения), а так же в контрольных сериях проведено 30 исследований; всего было выполнено 227 исследований (таблица 5).

Таблица 5 Гистологические исследования внутренних органов мышей ёЬ/(1Ь в опытных и контрольных сериях опытов. _

Гистологические Введение ККМ на ранних сроках Введение ККМ на поздних сроках развития

исследования развития СД 2 типа (через 1 мес. СД 2 типа (через 3-4 мес. после рождения)

внутренних после рождения)

органов Месяцы после рождения через 60-70 суток через 120 суток

после введения ККМ после введения

(5мес. п./р.) ККМ (7мес. пУр.)

серии Кол-во серии Кол-во серии Кол-во

5 мес 7мес.

ПЖ V.l. 13 8 Ш.1.1. 16 Ш.1.3. 5

Печень IV.2. 17 S Ш.1.2. 17 Ш.2.1. 17

Почки Ш.1.3. 13 Ш.2.2. 17

Селезенка Ш.2.1. 13 П1.2.3. 12

III.2.2, 13

1П.2.3. 13

Контроль 25

СД2типа

без ККМ

Выявление V.l. 4 П.1.1. 4 Ш.1.3. 2

донорских ККМ Ш.1.2. 5

в органах Контроль 2 Контроль 3

СД 2 типа СД 2 типа

без ККМ без ККМ

Всего: 227 36 16 122 53

МорФометрическое исследование ткани ПЖ и селезенки проводили под микроскопом фирмы "NIKON" (Япония) при увеличении х200 (усл.ед.) на персональном компьютере с использованием специальной программы т-Морфология (автоматизированные комплексные решения Телемедсистемы - Россия 2004 г).

Метод иммуногистохимического ШЛО исследования островковых клеток (ОЮ ПЖ применяли для выявления наличия нейроэндокринных (а- и Р-) клеток в ОЛ. Для этого использовали маркер специфических нейроэндокринных гранул хромогранин А

(моноклональные кроличьи антитела), который экспрессируется в цитоплазме клеток нейроэндокринной части TDK. Для выявления пролиферативной активности клеток островковой части ПЖ применяли иммуннопероксидазный метод с мышиными антителами Ki-67 (фирмы DACO, Дания), для выявления репликации ДНК. Результаты ИГХ оценивали на микроскопе фирмы "NIKON" (Япония). Для фотографирования использовали цифровой фотоаппарат фирмы "OLYMPUS" (Япония). Трансплантированные ККМ в культуре и в органах реципиента были идентифицированы по зеленому флуоресцирующему белку, т.к. в качестве доноров клеток были использованы трансгенные мыши линии B10.GFP, содержащие ген белка с зеленой флуоресценцией (GFP-green fluorescent protein). Флуоресцентную микроскопию срезов проводили на микроскопе фирмы "NIKON" (Япония) с использованием ультрафиолетового (УФ) излучения с длиной волны 490 нм. Для фотографирования использовали цифровой фотоаппарат фирмы "OLYMPUS" (Япония). Методы статистической обработки

Статистическую обработку результатов производили на персональном компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat; достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали по критерию t - Стьюдента с учетом поправки Бонферонни. Выживаемость и длительность жизни животных оценивали методом Каплан - Мейера. Различия считали достоверными при р <0,05 (Статистический пакет рекомендованный ВОЗ Epi Info 5.0).

Считаю необходимым отметить, что отработка отдельных этапов работы проводилась совместно и при непосредственном участии научных сотрудников лаборатории -клеточных нанотехнологий ГУ НЦБМТ (директор - чл,- корр. РАМН, д.м.н., проф., H.H. Каркищенко) - вед. н.сотр. О.В. Барановой, нач. отдела доклинических испытаний - д.м.н. В.Н. Каркищенко; зав. лаборатории - генетики Х.Х.Семенова, н.сотр. Т.В. Галаховой, н.сотр. Т.Б. Бесковой и зав. вивария этого центра В.Н. Рыбалкиной; а также сотрудников лаборатории - биотехнологий стволовых клеток ФГУ " ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов им.В.И.Шумакова Минздравсоцразвития РФ" (зав. лаб. - д.м.н., проф. RA. Оншценко) - ст.н.сотр. М.Е. Крашенинникова, ст.н.сотр. Л.В. Башкиной, аспиранта А.Р. Закирьянова. Интерпретация результатов исследования проводилось с участием проф. H.A. Ошпценко. Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мутантные мыши линии C57BL/KsJYLepr'"'/+ - отечественная генетическая модель сахарного диабета 2 типа

Приступая к работе нами было установлено, что в России предварительно охарактеризованной патофизиологическими методами модели СД 2 типа на мышах линии C57BL/KsIYLeptib/+ (B/Ks-Lepr db/+) не существует. Именно это обстоятельство потребовало от нас, прежде всего, дать объективную патофизиологическую характеристику динамики состояния мутантных мышей линии B/Ks-Lepr чтобы придти к заключению о возможности использования этих мутантных мышей в качестве генетической модели СД 2 типа для оценки корригирующих возможностей стволовых и прогениторных ККМ при этом заболевании.

Клиническая, биохимическая и морфологическая характеристика генетической модели СД 2 -шла у мутантных мышей линии B/Ks-Lepr'

При динамическом исследовании показателей углеводного обмена у гомозиготных мышей опытной группы - db/db с момента рождения было установлено, что уже на 3 -4 неделе после рождения уровень глюкозы и HbAlc в крови у db/db мышей повышается и уже на 1,2,4 и 6 месяцах после рождения нарушения углеводного обмена достоверно прогрессируют и достоверно отличаются от аналогичных показателей в контрольных здоровых группах гетерозиготных мышей db/+ и мышей В10 (таблица 6). Одновременно мы наблюдали прогрессирующее увеличение массы тела у мышей db/db по сравнению с контролями, что свидетельствует о появлении ожирения, типичного для СД 2 типа. Отмечено также, что у мышей db/db в период с 4 по 6 месяцы мят наступает быстрая потеря массы тела и животное принимает вид "заморыша" причем уровень глюкозы и HbAlc в крови продолжает оставаться высоким (таблица 6). Для мышей db/db были характерны и другие клинические признаки СД 2 типа, такие как полидипсия, полифагия и полиурия; которые становились отчетливо выраженными со 2 месяца после рождения. В среднем в сутки больные мыши выпивали до 25-30 мл (25,74±1,18) воды, тогда как животные контрольных групп в среднем 4-5 мл (4,69±0,35; р< 0.05), опытные мыши в 2,4 раза больше съедали кормов (в граммах) за сутки (8,9±0,29; р< 0.05), чем в контрольных группах (3,74±0,096; р<0.05) (контроль велся по брикетированному корму); у мышей db/db развивалась также мацерация кожных покровов, которая возникала в области холки у 20-25 % животных в возрасте 120-158 дней, которая в течение последующих 5-14 дней становилась обширной незаживающей раной и оставалась у животного вплоть до его гибели.

Морфологически у мышей db/db - ко 2-му месяцу жизни островковый аппарат ПЖ характеризовался отчетливо выраженными адаптационными перестройками. ОЛ в ПЖ

умеренно гипертрофировались, увеличивались по площади и количеству в них клеток по сравнению с группами контрольных здоровых животных, причем в ОЛ мышей <й>/<5Ь доминировали базофильные р-клепси (таблица 7), что позволяло предполагать достаточно высокий уровень выработки ими инсулина.

Таблица 6 Содержание глюкозы, НЬА1с и показатели массы тела у мышей

Показатели углеводного обмена и массы тела Линии мышей

<М1Ь(СД2) 1-я группа с!Ь/+(коктроль) 2-я группа ВЮ(контроль) 3-я группа

Возраст 1 месяц

Глюкоза, ммоль/л 10,3±2,4*(п=90) 5,4±0,5(в=30) 5,6±0,3(п=30)

НЬА1с, % 4,9±1,0* 3,5±0,07 3,0±0,08

Масса тела, г. 19±2,5* 13±1,2 15±1,8

Возраст 2 месяца

Глюкоза, моль/л 18,7±3,83*(п=90) 5,8±0,42(п=30) 5,9±0,03(п=30)

НЬА1с, % 7,9±1,11* 3,6±0,1 ЗД±0,1Э

Масса тела, г. 35±2,37* 15±2,69 18±2,49

Возраст 4 месяца

Глюкоза, моль/л 25,5±3,49*(п=78) 4,6±0,39(п=30) 4,9±0,69(п=30)

НЬА1с, % 8,6±1,16* 3,7±0,25 3,7±0,22

Масса тела, г. 40±2,68* 19±2,26 21±2,27

Возраст 6 месяцев

Глюкоза, моль/л 27,4±2,09*(п=23) 5,7±0,65(п=30) 5,4±0,38(п=30)

НЬА1с,% 8,9±1,25* 3,9±0,57 3,8±0,49

Масса тела, г. 17±2,35* 24±1,80 27±1,64

где *) р <0,05 по сравнению с контрольными группами.

Таблица 7 Морфометрическое исследование ПЖ и селезенки; масса селезенки

мышей разных линий и воз ластов.

Морфометрические показатели мес. Линии мышей

(М1Ь(СД 2) <1Ь/+(контроль) В10 (контроль)

площадьОЛ.усл.ед. 2 99269,5±1250 * 58954,7±1017 60838,7±1352

количество клеток ОЛ 294 ±27 *(п=20) 226±34(п=20) 234±22(п=20)

площадьОЛ,усл.ед. 4 29569,8±1017 * 58954,7±1051 60838,7±1250

количество клеток ОЛ 101±41 *(п=20) 226±38(п=20) 234±47(п=20)

площадьОЛ,усл.ед. 6 9910,6±634 ♦ 58954,7±690 60838,7±512

количество клеток ОЛ 75±19 *(п=20) 226±40(п=20) 234±57(п=20)

площадь фолликулов селезенки, усл.ед. 6 26123,9±320 * 83207,4±405 85769,6±398

масса селезенки, г. 0,036±0,02 * 0,089±0,016 0,099±0,013

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей контрольных групп.

Однако к 4 и особенно к 6 месяцу количество ОЛ и их размеры достоверно уменьшались, снижалась площадь ОЛ и количество в них клеток, в том числе базофильных (таблица 7). В ПЖ у 4-6-и месячных животных, страдающих СД 2 типа,

нами отмечались явления выраженного перидуктального и интралобулярного склероза с атрофией паренхимы железы, а так же явления интра- и перилобулярного липоматоза в результате чего, площадь ОЛ и количество в них клеток, в том числе базофильных резко снижалось. Результаты исследования позволили нам констатировать, что изученная генетическая модель СД воспроизводит характерные признаки стадийности развития СД 2 типа: на ранних сроках (1-2 мес.) развивается резистентность тканей к инсулину, которая компенсируется гипертрофией ОК; на сроках 3-4 месяца развивается стадия истиной инсулиновой недостаточности, как и при СД 1 типа; на 5-6 месяцах развивается терминальная стадия СД, которая приводит к глубокому нарушению метаболизма, кахексии и гибели животных. Морфологически выявлены поздние изменения в структуре ПЖ, которые сопровождаются прогрессирующей жировой дистрофией печени, белковой дистрофией канальцев и ангиопатиями клубочкового аппарата почек, прогрессирующей гипоплазией ткани селезенки и лимфатического узла, свидетельствуя, таким образом, о развитии дистрофии паренхимы внутренних органов, ангиопатии и иммунной дезрегуляции в организме.

Трансплантация ККМ при СД 2 типа на стадии ранних (1мес. после рождения) и выраженных (3-4мес. после рождения) патогенетических нарушений в организме

Из таблицы 8 видно, что при введении ККМ на стадии выраженных клинических проявлений СД 2 типа (3-4 мес.) во всех сериях опытов к 5 месяцу имеет место снижение глюкозы и НЬА1с - по сравнению с контролем. Более выраженное снижение было получено в серии III. 1.3. - при 7-кратном введении аллогенных ККМ разных фракций (ГПККМ и ММСК КМ) и в серии Ш.2.3. с однократным введением максимальной дозы 100 млн. изогенных ГПККМ.

Таблица 8 Значения показателей уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина у мышей с СД 2 типа после введения алло- и изогенных ККМ (в возрасте 5 мес. после рождения).___

Серии опытов глюкоза, ммоль/л HbAlc, %

Серия 111.1.1.(13=25) 17,5±5,42* 6,9±0,48*

Серия III 1.2.(п=25) 22,1±3,57* 7,7±0,56*

Серия Ш.1.3.(п=25) 17,2*4,18* 6,7±0,81*

Серия Ш.2.1.(п=30) 19,3±2,49* 7,2±0,67*

Серия Ш.2.2.(п=30) 19,4±4,18* 7,3±0,61*

Серия 1П.2.3.(п=30) 17,1±5,52* 6,6±0,46*

Серия IV. 1.(п=30) 6,9±2,82* 4,4±0,55*

Серия IV.2.(n=30) 6,7±2,18* 4,4±0,57*

Контроль с СД 2типа без ККМ(п=25) 26,3±3,61 8,7±0,80

Группа без СД (норма) (п=30) 5,7±0,65 3,9±0,57

где *) р <0,05 по сравнению с контролем СД 2 типа без терапии ККМ

В сериях Ш.2.1. и Ш.2.2. (где были введены разные фракции изогенных ККМ почти в одинаковых дозах), были получены равноценные результаты, что так же было подтверждено нами гистологически; менее выраженное снижение показателей углеводного обмена получено в серии Ш.1.2., где были введены некультивированные аллогенные ККМ.

Однако при введении алло и изогенных ККМ на раннем этапе развития СД 2 типа -через 1 мес. в исследуемых сериях ГУ.1.-1У.2. к 5 месяцу мы наблюдали нормальные значения показателей уровней глюкозы и НЬА1с, т.е. мы показали, что заблаговременное введение ККМ - предотвращало развитие основных клинических проявлений СД: к 5 месяцу уровень глюкозы и НЬА1с был достоверно ниже, не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с опытами, где клеточную терапию проводили на стадии развернутой клинической картины СД (по сравнению с III. 1.1. -Ш.2.З.).

Из рисунка 1 видно, что при введении ККМ на стадии выраженных клинических проявлений, т.е. на 3 мес.-отмечается лишь стабилизация массы тела и предотвращение

Дни наблюдений

Рис. 1. Динамика изменения массы тела у мышей с СД 2 типа после клеточной терапии на разных стадиях болезни

где *) - р <0,05 по сравнению с контрольной группой СД 2 типа без терапии ККМ.

её снижения на этапе декомпенсации метаболизма и развития терминальных нарушений в организме, которые возникают в контроле.

- при введении ККМ через 4 мес. - предотвратить снижение массы тела не удавалось, хотя степень снижения её была менее выраженной (масса тела стабилизировалась к 56 дню и достоверно удерживалась практически также до конца эксперимента).

- при раннем введении через 1 мес. - вес животных в течение 120 дней наблюдений достоверно не отличался от нормы.

Показатели объема выпитой воды и съеденного корма у мышей с СД 2 типа (таблица 9)

Таблица 9 Показатели объема выпитой воды и съеденного корма в течение 30 дней через после проведения клеточной терапии у мышей на разных стадиях развития СД 2 типа.___

Серии опытов Объем выпитой воды, миллилитры Объем съеденного корма, граммы

Серия Ш.1.1.(п=25) 13,7 ± 1,41* 5,9 ± 0,24*

Серия Ш. 1.2.(п=25) 17,6 ± 1,75* 6,7 ±0,15*

Серия Ш.1.3.(п=25) 9,44 ±0,92 4,97 ±0,34*

Серия Ш.2.1.(п=30) 12,5 ±0,69* 5,54 ±0,23*

Серия Ш.2.2.(п=30) 12,4 ±0,92* 5,62 ±0,32*

Серия Ш.2.3.(п=30) 8,0 ± 1,51* 4,48 ±0,34*

Серия IV. 1.(п=30) 5,04 ±0,37* 3,96 ±0,42*

Серия ГУ.2.(п=30) 5,11 ±0,61 4,02 ±0,83*

Контроль с СД 2 типа без ККМ(п=25) 25,7 ±1,18 8,9 ±0,29

Группа без СД (норма) (п=30) 4,69 ± 0,35 3,74 ±0,096

где *) р <0,05 по сравнению с контрольной группой СД 2 типа без терапии ККМ

менялись в соответствии с другими клиническими показателями. Было отмечено снижение полидипсии и полифагии после алло- и изогенной клеточной терапии во всех сериях, особенно в сериях при введении ККМ на ранних сроках развития болезни (сериях IV. 1. и ГУ.2.); хорошие результаты были получены на поздних сроках введения ККМ в сериях Ш. 1.3. и Ш.2.З., где нами вводились клетки многократно (7раз) и в максимально высокой дозе. Отмечен также регресс трофических изменений кожных покровов (серия Ш.1.З.). При введении ККМ на ранних сроках - мацерация кожных покровов не возникала в течение всего срока наблюдений.

При раннем применении ККМ мы наблюдали в течение всего исследуемого срока (120 дней) не только сохранение нормальных показателей клинического состояния животных, но и достоверно более длительные сроки жизни таких животных (таблица 10), не только по сравнению с контролем, но и с животными, получавшими ККМ на поздних сроках жизни (болезни). При морфологических исследованиях оказалось, что у животных, получивших ККМ на ранней стадии развития СД, в ПЖ через 5 мес. сохраняется большая площадь ОЛ, большее количество клеток в ОЛ и более выраженная базофильность этих клеток (таблица 11), свидетельствующие об их боле высокой функциональной активности, чем в контроле (СД 2 типа без ККМ). С целью подтверждения присутствия нейроэндокринных (а и (5) клеток в составе ОЛ во всех сериях опытов, нами проводился ИГХ анализ ОЛ с маркером специфических нейроэндокринных гранул - хромогранином -А, который экспрессируется в цитоплазме

Таблица 10 Сроки жизни животных с СД 2 типа после алло и изогенной трансплантации ККМ на разных стадиях развития СД 2 типа._

Серии опытов Кол-во животных на дожитие Срок жизни, дни

Длительность жизни Средний срок

Серия Ш. 1.1. 5 324,330,337,345, 349 337±10,3*

Серия Ш. 1.3. 5 412,417,424,432,435 424±9,7*

Серия П1.2.3. 5 431,442,447,456,459 447±11,3*

Серия IV. 1. 5 486,505, 508,513, 520 506±12,7*

Серия IV. 2. 5 514,526, 539, 548, 557 537±17,1*

Контроль с СД 2 типа без ККМ 5 138,159,167,185,199 169±23,2

*) где, р <0,05 по сравнению с контрольной серией СД 2 типа без ККМ.

Таблица 11 Морфометрическое исследование островковой ткани ПЖ у мышей (1Ь/(1Ь в разных опытных сериях в возрасте 5 мес. после рождения._

Серия опытов Площадь ОЛ ПЖ Количество

в усл.ед. клеток в ОЛ

111.1.1.(п=16) 37858,73±1021* 131±21*

Ш.1.2.(п=17) 31565,25±1025* 112±17

Ш.1.3.(п=13) 96555,2±6578* 258±103*

П1.2.1.(п=13) 44284,01± 1756* 142±23*

Ш.2.2.(п=13) 41327,5±1437* 135±22*

Ш.2.3.(п=13) 63696,1±1922* 199±45*

ГУ.1.1.(п=13) 102143,1±2712* . 313±69*

ГУ.1.2.(п=17) 92299,5±2103* 306±84*

Контроль СД 2 типа без ККМ(п=25) 11318,8±783 81±27

Группа без СД (норма) (п=20) 58954,7±1134 226±40

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей контроля (СД 2 типа без ККМ).

клеток эндокринной части ПЖ при их восстановительной регенерации. Наши результаты показали, что положительное цитоплазматическое окрашивание было выявлено в значительном количестве клеток в ОЛ при позднем, но особенно при раннем введении алло или изогенных ККМ у мышей <ЗЬ/с£Ь в возрасте 5мес. и 7мес. В контроле (СД 2 типа без введения ККМ) положительное цитоплазматическое окрашивание было выявлено только в клетках периферических отделов ОЛ (в зонах нахождения а-клеток), тогда как в центральных участках, где расположены (3-клетки, клетки были хромогранин -А негативными.

С целью изучения изменений пролиферативной активности клеток островковой части ПЖ после введения ККМ, нами было выполнено ИГХ исследование с использованием маркера репликации ДНК - антитела Ш-61 (маркер пролиферативной активности). По результатам наших исследований установлено, что в возрасте 7 мес. Ю-67 положительно окрашенные клетки составляют приблизительно от 5 до 10% всех клеток

островка при позднем и 5-15% при раннем сроке введения ККМ В контроле (СД 2 типа без ККМ) пролиферативная активность клеток отсутствовала.

Позитивная динамика после введения ККМ на раннем сроке развитая СД 2 типа была отмечена в состоянии и других органов. В печени имело место, более выраженное накопление гликогена, лучшая сохранность балочной структуры печени, а так же отсутствие признаков жировой дистрофии, которые наблюдались в контроле к 120 дню наблюдения; мы также отмечали отсутствие жировой дистрофии гепатоцитов и накопление в них гликогена.

В почках к этому сроку после применения ККМ признаки выраженных дистрофических изменений канальцев, а так же скопление в их просвете эозинофильных белковых и PAS положительных масс - отсутствовали, тогда как в контроле - они были резко выраженными.

Установленная сохранность структур органов, участвующих в патогенезе СД 2 типа и его осложнений - свидетельствует, прежде всего, о более высоком регенерационном потенциале тканей этих органов и о более высоком их адаптационном и компенсаторном резерве. Так как ведущая роль в процессах адаптации и регенерации принадлежит иммунной системе, то мы исследовали также морфологическое состояние органов иммуногенеза.

Мы установили, что в возрасте 5 мес. под действием ККМ, введенных на ранних сроках развития СД, в ткани селезенки формируются крупные лимфоидные фолликулы, наблюдается интенсивная бласттрансформация лимфоидных клеток, что свидетельствует о восстановлении структуры селезенки, как иммуно-компетентного органа и о восстановлении её иммунорегуляторной активности, тогда как в контроле рисунок ткани стерт и имеются все признаки гипоплазии этого органа. Важно подчеркнуть, что нами впервые был установлен факт, что в ткани селезенки под влиянием как изогенных, так и аллогенных ККМ, возникают нетипичные для этого органа признаки активизации кроветворения (мегакариоцитоз).

Для выявления связи возникновения позитивных клинических, биохимических и морфологических изменений в организме мышей с СД 2 тшта при введении ККМ с их жизнеспособностью в течение длительного срока (120 дней) нами были проведены исследования по выявлению распределенных по органам жизнеспособных аллогенных донорских клеток от мышей B.10GFP. Мы установили, что донорские ККМ в криопрепаратах из разных органов, по крайней мери в течение 120 дней, не погибают, а сохраняют свою жизнеспособность. Сохраняющаяся люминесценция криосрезов разных органов позволила нам по флуоресцирующему зеленому белку ККМ выявить

донорские клетки в органах и связать возникающие в них позитивные изменения (морфологические и функциональные) со стимуляцией донорскими клетками в этих органах процессов адаптации, восстановительной регенерации и компенсации функции паренхиматозных клеток.

ВЫВОДЫ.

1. Корригирующий эффект терапии клетками костного мозга СД 2 типа впервые изучен на отечественной генетической модели СД 2 типа у мутантных мышей линии Мутангные мыши линии С57В1Ж&ГУЬерг<йУ+ отвечают всем требованиям экспериментальной генетической модели СД 2 типа, т.к. воспроизводят стадийность течения заболевания и соответствующие патогенетические, функциональные и структурные изменения в организме.

2. Развитие СД 2 типа у мышей ¿Ь/ёЬ проходит 3 стадии: 1-я стадия (на 1-2 месяце со дня рождения) - стадия инсулинорезестентности характеризуется гипергликемией, гипертрофией и гиперплазией островков Лангерганса в поджелудочной железе; 2-я стадия (на 3-4 месяце со дня рождения) - стадия выраженных изменений со стороны внутренних органов характеризуется снижением количества функционирующих р-клеток в островках Лангерганса, ожирением и недостаточностью иммунной системы (гипоплазия лимфоидной ткани); 3-я стадия (на 5-6 месяцах после рождения) - стадия необратимых изменений внутренних органов характеризуется развитием кахексии, которая заканчивается гибелью животного.

3. Отработанные методы выделения, культивирования и трансплантации гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга позволяют осуществлять эффективную коррекцию патогенетических нарушений в организме при СД 2 типа.

4. Трансплантация аллогенного или изогенного костного мозга животным с СД 2 типа является безопасной и эффективной процедурой, позволяющей корригировать клинические, метаболические и структурные нарушения в организме.

5. Выраженность терапевтического эффекта от применения клеток костного мозга у мышей с СД 2 типа находится в прямой зависимости от дозы и кратности введения культивированных клеток от здоровых доноров, а также от стадии развития болезни, но не зависит от фенотипа использованных клеток

(гемопоэтических или стромальных клеток костного мозга) и их гистосовместимости (изогенные или аллогенные).

6. Введение культивированных клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа (через 1 месяц после рождения), позволяет пролонгировано сохранять (в течение 5 мес.) нормальные уровни глюкозы и гликозшшрованного гемоглобина в крови, а так же сохранять значения массы тела в пределах нормы, за счет индукции пролонгированной гипертрофии и гиперплазии островков Лангерганса в поджелудочной железе и торможения развития патологических изменений во внутренних органах (печень, почки, органы иммуногенеза). Введение клеток костного мозга позволяет в 2,5-2,7 раза увеличить сроки жизни животных по сравнению с контролем (СД 2 типа без клеток костного мозга).

7. Введение культивированных клеток костного мозга на стадии выраженных клинических проявлений СД 2 типа (3-4 мес. после рождения) не сопровождается достоверным и стабильным снижением уровней гликемии и гликозилированного гемоглобина, однако снижает выраженность патоморфологических изменений во внутренних органах, что способствует сохранению их адекватной функции и пролонгирует сроки жизни животных (в 1,7-2,3 раза) по сравнению с контролем (СД 2 типа без применения клеток костного мозга).

8. Пролонгированное поддержание восстановительного морфогенеза в поврежденных органах при моделировании СД 2 типа и введении клеток костного мозга обусловлено длительным (120 дней) сохранением жизнеспособности введенных клеток, что подтверждается маркерной люминесценцией клеток костного мозга полученных от мышей ВЮ.ОРР с геном зеленого белка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученная линия мышей С57В1Ж.81УЬергд>/+ может быть использована в качестве адекватной модели СД 2 типа в эксперименте, в том числе для отработки новых способов лечения и профилактики СД 2 типа методами клеточной терапии.

2. Для достоверного повышения биорегуляторной активности клеток костного мозга от здоровых взрослых доноров в организме животных с хроническими заболеваниями (например, при СД 2 типа) для трансплантации необходимо использовать культивированные (в течение 5-14 суток) клетки костного мозга.

3. Для эффективной коррекции метаболических нарушений и профилактики повреждений внутренних органов, возникающих при СД 2 типа, трансплантацию клеток костного мозга необходимо проводить уже на ранних стадиях развития болезни, используя или возможно высокую дозу клеток или многократное применение малых доз.

4. Для изучения процессов восстановительного морфогенеза у животных с хроническими заболеваниями рекомендуется использовать в качестве донорского материала флуоресцирующие клетки костного мозга мышей линии В1СШЕР.

5. Для проведения терапии клетками костного мозга могут быть использованы методики выделения и культивирования клеток костного мозга отработанные при проведении настоящего исследования.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Степанова О.И., Каркищенко H.H., Онищенко H.A., Степанова Е.А. «Коррекция патогенетических нарушений при сахарном диабете второго типа методами клеточной трансплантации». М. Биомедицина 2005г. №1; с.35-51.

2. Степанова О.И. «Метод взятия крови у мышей из малой подкожной вены голени» М. Биомедицина 2006г. № 2; с.137-139.

3. Степанова О.И., Онищенко H.A., Абдрашитова Э.Х., Степанова Е.А., Галахова Т.В. , Бескова Т.Б. «Использование мононуклеарной фракции клеток аллогенного костного мозга мышей B10.GFP для терапии сахарного диабета типа 2 на мышах линии C57BL/KsJYdb/+». M. Биомедицина 2006г. № 4; с. 113-114.

4. Степанова О.И., Абдрашитова Э.Х., Конопленко Л.А., Галахова Т.В., Онищенко H.A.. «Коррекция СД -2 го типа у мышей линии C57Bl/KsJYdb//db при введении мононуаклеарной фракции клеток костного мозга от мышей B10GFP, содержащих ген-зеленого белка» Материал доклада ежегодной Всероссийской и междунородной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравохранении», Москва. 24-25мая 2006г. с.39-40.

5. Степанова О.И., Онищенко H.A., Баранова О.В., Галахова Т.В. «Использование клеток аллогенного костного мозга для коррекции сахарного диабета типа 2 в генетической модели» Материал доклада ежегодной Всероссийской и междунородной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравохранении», Москва 30-31 мая 2007г. с.47-49.

6. Степанова О.И., Онищенко RA., Абдрашитова Э.Х., Степанова Е.А, Галахова Т.В., Бескова Т.Б. «Мононуклеарная фракция клеток костного мозга мышей линии B10.GFP нормализирует углеводный обмен у мышей линии C57BL/KsJYdb/+ с моделью сахарного диабета 2 типа» М. Биомедицина 2008г. №1; с. 26-35.

7. Степанова О.И, Каркищенко НН., Галахова Т.В., Баранова О.В., Семенов Х.Х., Бескова Т.Б., Степанова Е.А., Закирьянов А.Р., Онищенко НА. «Мыши линии C57BL/KsLepr*ib/+ как генетическая модель сахарного диабета 2 типа» М. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007г. №12; с. 664-667.

8. Степанова О.И., Каркищенко H.H., Онищенко НА, Баранова О.В. «Динамика кинических и морфологических признаков сахарного диабета 2 типа при трансплантации клеток костного мозга в зависимости стадии заболевания, дозы и кратности введения клеток». Материал доклада ежегодной Всероссийской и междунородной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравохранении». Москва 29 мая 2008г. с. 50-53.

9. Степанова О.И., Оншценко H.A., Каркищенко H.H., Баранова О.В., Галахова Т.В. «Использование клеток разных фракций аллогенного костного мозга для терапии сахарного диабета типа 2 на генетической модели» М. Биомедицина 2008г. №2; с.78-81.

10. Степанова О.И., Каркищенко H.H., Онищенко НА., Баранова О.В. Трансплантация клеток костного мозга как способ коррекции патогенетических нарушений у животных с генетической моделью сахарного диабета 2 типа». Материал доклада IV Всероссийского съезда трансплантологов Москва 9-10 ноября 2008, с.272-274.

Заказ № 442. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность темы исследования.

Успехи клеточной биологии последних десятилетий создали научные и практические предпосылки для развития новой области медицины - клеточной трансплантации. С разработкой учения о стволовых клетках появилась надежда на возможность более эффективной регуляции процессов восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей [Pittenger et.al., 1999; Jaiswal et.al., 2000;B.A. Отеллин, 1999; И.В. Потапов и др., 2001; М.Ф. Расулов, 2004],а также восстановления липидного, углеводного и белкового обменов [А.В. Берсенев, 2003; Hess et al., 2003; Ende et al., 2002] в организме с помощью аутологичных или аллогенных стволовых клеток костного мозга (ККМ). Особенно значимой возможность осуществления восстановительной регенерации могла бы быть для повышения эффективности лечения сахарного диабета (СД), который является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний, приводящих к глубокой инвалидизации и гибели людей трудоспособного возраста во всех странах мира [King Н. et al., 1998; Mainous et al., 2004; И.И. Дедов и др., 2005]. Полагают, что особенно выраженный рост заболеваемости СД в наступающем тысячелетии будет иметь СД 2 типа в связи с прогрессирующим эпидемическим распространением в человеческой популяции факторов, предрасполагающих к его развитию: атеросклероза, проатерогенных метаболических синдромов и эндокринных нарушений [М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова и др., 2000; А.А. Александров, 2001; И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2003; Я.А. Александровский, 2005; И.Н. Бокарев и др., 2006]. Продолжающийся рост заболеваемости СД, несмотря на определенные достижения последних лет, свидетельствует о том, что ни профилактические мероприятия, ни современная медикаментозная терапия не способны надежно препятствовать возникновению и прогрессированию клинических проявлений СД и его осложнений. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой современной медицины.

Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых и прогениторных клеток костного мозга может оказаться особенно перспективными для лечения СД 2 типа, при котором инсулинорезистентная гипергликемия является первично мембранной патологией клеток и обусловлена конформационным изменением структуры мембран клеток в условиях развития' дислипидемии и эндокринных расстройств. [М.И. Балаболкин, 1994; А.Ш. Зайчик, Л.П. Гурилов, 2001; И.Н. Бокарев, Б.К. Беликов и др., 2006]. Мы полагали также, что для- лечения СД 2 типа наиболее перспективным может оказаться использование, как стромальной, так и мононуклеарной-(гемопоэтической) фракций ККМ, которые содержат значительное количество стволовых и прогениторных клеток и поэтому способны индуцировать в*паренхиме поврежденных органов* процессы репаративной регенерации, выделяя в процессе своей жизнедеятельности регуляторные пептиды, которые восполняют дефицит адекватных информационных и адаптационных сигналов регенерации [Н.А. Онищенко, 2004; Kinnaird et al., 2004].0днако исследований по коррекции ККМ нарушений при СД 2 типа ни в клинике, ни в эксперименте мы не обнаружили. Только в одной из работ [Ende et al.,2004] приводятся сведения об однократном введении ретроорбитально большой дозы ксеногенных КЗСМ' мышам без изучения влияния различных доз и типов ККМ, а также стадии развития болезни на результаты клеточной терапии. Одной из причин отсутствия в России исследований терапии СД 2 типа с помощью клеточных технологий, является отсутствие в. нашей стране охарактеризованной модели СД 2 типа, развивающейся у мутантных мышеи линии C57BL/KsJYLeprdb/+. Отсутствие патофизиологической характеристики течения СД 2 типа у мутантных мышей этой линии и отсутствие данных об изменениях клинических проявлений? СД 2 типа у таких мышей под влиянием аллогенных или изогенных ККМ позволило нам сформулировать цели; и задачи настоящего исследования: t '

Целью . настоящего исследования явилось изучение целесообразности использования: мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+ в качестве модели при проведении экспериментальных работ по коррекции сахарного: диабета 2 типа методом трансплантации: клеток костного мозга.

Для достижения указанной цели нами были поставлены, следующие задачи:

1. Изучить динамику возникновения клинических и морфологических нарушений; присущих СД 2 типа- у мутантных . мышеи линии С 5 7BL/Ks J Y Leprdb/+ июбосновать пригодность использования ?их в качестве экспериментальной^ модели СД 2 типа для оценки терапевтической эффективности клеток костного мозга

2. Отработать методы выделения; • культивирования- или трансплантации гемопоэтическойри стромальной фракций клеток костного мозга- для. выбора эффективного' способа коррекции: патогенетических нарушений при СД 2 типа.

3. Оценить эффективность и безопасность трансплантации аллогенного и изогенного костного мозга при коррекции: метаболических нарушений у животных с СД 2 типа.

4. Установить сроки применения клеток костного мозга в зависимости от стадии развития болезни, а также дозу и кратность их введения для пролонгированной коррекции клинических: и метаболических (биохимических) нарушений, развивающихся при СД 2 типа.

5. Установить значение фенотипа клеток костного мозга, (гемопоэтической или стромальной фракций клеток), а также их гистосовместимости (изогенные и аллогенные клетки от здоровых животных) дляиндукции;процессов,репаративной регенерации внутренних органов^ (островковая ткань поджелудочной железы, печень, почки, лимфоидная ткань), участвующих в .патогенезе СД 2 типа.

6. Выявить наличие функционально, активных трансплантированных клеток костного мозга (маркер- GFP)> в органах: животных, с СД 2 типа на длительньгх сроках наблюдения (120 дней) и установить, связь присутствия-жизнеспособных клеток с восстановлением функции; поврежденных органов; ,

Выполнение работы, осуществлялась в рамках государственного контракта № 021435.11.3019 от «02»сентября 2005г. «Использование, стволовых: клеток костного мозга: для? поддержания; функции сердца и поджелудочной? железы», по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный; номер- 0120.0800280), а также в- рамках отраслевой; программы «Новые клеточные технологии - медицине» (01.07.200201.07.2010гг.), утвержденной-29!05102г. на заседании?президиума^М^1Н1

Научная- новизна работы;

Впервые была изучена и охарактеризована патофизиологическими методами генетическая; модель, СД 2 типа на'мутантных мышах линии C57Bt/KsJYLeprdb/+, пригодная для изучения терапевтических эффектов клеток костного мозга. Полученная модель СД 2 типа в настоящее время поддерживается в ГУ НЦБМТ РАМН.

Было установлено, что развитие патологического процесса у этих мышей проходит 3; стадии: 1-я стадия (1-2 месяц со дня рождения) характеризуется гипергликемией на фоне: гипертрофии и: гиперплазии островков Лангерганса в поджелудочной железе (инсулинрезистентная); 2г я стадия. (3-4 месяца со дня- рождения) — характеризуется нарушением липидного? (ожирение) и углеводного (гипергликемия) обменов и протекает на фоне снижения количества функционирующих р-клеток в 10 островках Лангерганса. На этой стадии возникают выраженные метаболические нарушения, сопровождающиеся структурными изменения внутренних органов. 3-я стадия (5-6 месяцы после рождения) СД 2 типа сопровождается кахексией, функциональными нарушениями во внутренних органах, которые прогрессируют и приводят к гибели животного.

Доказано, что эффективность коррекции патофизиологических нарушений у животных с СД 2 типа при трансплантации клеток костного мозга, находится в прямой зависимости введенных клеток от суммарной дозы и стадии развития патологического процесса в организме, но не зависит от использованного фенотипа клеток и их гистосовместимости.

Показана целесообразность трансплантации клеток костного мозга Haf поздней стадии развития СД 2 для снижения темпов прогрессирования патоморфологических изменений во внутренних органах и пролонгирования сроков жизни животных.

Более выраженная эффективность от трансплантации клеток i костного мозга показана на ранней стадии развития СД 2 типа, когда лучше сохранены, резервы адаптации островковых клеток поджелудочной железы, выраженность которых регулируется введенными клетками костного мозга от здоровых животных.

Показано, что нормализация углеводного обмена при использовании клеток костного мозга на ранних сроках СД происходит на фоне активации процессов адаптации и регенерации островковой ткани поджелудочной железы, что подтверждено иммуногитохимически по окраске хромогранином-А на присутствие нейроэндокринных клеток в островках и по окраске на антитела Ki-67 - маркер репликации ДНК (пролиферативной активности клеток), а также по результатам гистологических и морфологических исследованиям (гипертрофия, гиперплазия).

Доказано, что предварительное культивирование трансплантируемых клеток костного мозга достоверно повышает эффективность коррекции метаболических и структурных нарушений изменений во внутренних органах у.животных с СД 2 типа.

Показано, что аллогенные донорские клетки костного мозга линии мышей B10.GFP, длительно сохраняют свою жизнеспособность в организме реципиента (линия C57BL/KsJYLeprdb/+) по . крайне мере в течение 120 дней после трансплантации: и могут участвовать! в регуляции: восстановительного морфогенеза внутренних органов (печень, почки, поджелудочная железа, лимфоидная^ткань).

Практическая значимость работы.

Патофизиологические характеристики мышей мутантной линии C57BL/KsJYLeprdb/-r, полученной, в ГУ МЦЬМ Г РАМН; пригодны; для. изучения патологических процессов; возникающих при развитии СД 2 типа.

Было доказано, что данные животные (C57BE/KsJ¥Leprdb/+) могут быть, использованы в > качестве экспериментальной модели- ири проведении исследований с целью коррекции метаболических нарушений при СД 2 типа методами-клеточной терапии.

Трансплантация аллогенных или изогенных клеток костного мозга при коррекции • метаболических нарушений; сопровождающих развитие СД 2 типа, является безопасной процедурой, ослабляющей клинические и морфологические проявления СД 2 типа, выраженность которых зависит от дозы используемых клеток и стадии их применения;

Показано, что 1 стадия развития СД 2 типа является предпочтительной для применения клеток костного мозга, т.к. при этом имеет место максимально выраженный эффект коррекцию клинических, биохимических и морфологических нарушений в организме животных с СД 2 типа. Предпочтительно также применять, клетки? костного мозга либо на 1-ой стадии СД 2 (на 3-4 неделе стабильной гликемии) однократно .в максимально: высокой дозе (ЮОмлн.) и/или, многократно: (до 7 раз;, в< суммарной дозе до 27,5 млн. клеток). 12 '

Показано, что и на 2 стадии развития СД. 2 типа введение клеток костного мозга является целесообразным, т.к. ослабляет темпы развития необратимых нарушений в органах и пролонгирует сроки, жизни животных.

Обнаружение трансплантируемых клеток костногомозга, содержащих ген- GFP, в тканях реципиента (С57ВL/KsJYLeprdb/+) в; течение длительного времени: (до 120 суток) позволяет предложить метод трансплантации клеток мышей линии ВЮ.СРР'для? контролирования процессов восстановительного морфогенеза ,у животных с СД 2 типа.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Предложенная генетическая модель сахарного диабета,мышей линии- C57BL/KsJYLeprdb/+ является; адекватной' моделью СД 2 типа;: так как она воспроизводит стадии нарушения; углеводного обмена, развитие дисфункции, островков Лангерганса в поджелудочной железе, а также патоморфологические нарушения во внутренних органах, клинический, биохимический и морфологический контроль которых может быть использован для; поиска и оценки новых эффективных способов лечения этого заболевания; в том числе трансплантации клеток костного мозга.

2. Эффективность трансплантации: стволовых и прогениторных клеток костного мозга при СД 2 типа зависит от стадии клинических проявлений заболевания (тяжести заболевания), количества используемых клеток и, степени их биорегуляторной активности. Наиболее выраженный клинический эффект наступает при использовании высоких доз культивируемых клеток костного мозга от здоровых животных, трансплантируемых или однократно (ЮОмлн. клеток), или дробно многократно (27,5 млн. клеток).

3. На стадии выраженных клинических и патоморфологических нарушений внутренних органов трансплантация клеток костного мозга не нормализует: показатели углеводного обмена, но способствует замедлению> темпов развития: необратимого* повреждения в органах и увеличивает сроки жизни животных с СД 2 типа (до 447 дней вместо 199 дней в контроле - СД 2 типа).

4. Введение клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа длительно нормализует показатели углеводного обмена и стабилизирует массу тела за счет индукции процессов адаптации и их восстановительной регенерации (гипертрофия, гиперплазия) в островках Лангерганса, что отодвигает развитие необратимых повреждений внутренних органов и существенно, увеличивает сроки жизни животных (до 53 7± 17,1 дней вместо 199 дней в контроле).

5. Клетки костного мозга после трансплантации сохраняются в организме реципиента в течение длительного времени (до 120 дней) и индуцируют процессы восстановительного морфогенеза внутренних органов.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены на:

1. Научной конференции «Биомоделирование и биомедицина» Москва-Столбовая, 25 мая 2006г. j

2. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 24-25 мая 2006г.

3. Научно-практической конференции «Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине» Ростов - на - Дону, 19-20 сентября 2006г.

4. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 30-31 мая 2007г.

5. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 29 мая 2008г.

6. IV Всероссийском съезде трасплантологов, посвященный памяти акад. В.И. Шумакова, Москва, 9-10 ноября 2008г.

Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехногий 13 марта 2009г.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 в центральном рецензируемом журнале.

i выводы.

1. Корригирующий эффект терапии клетками костного мозга СД 2 типа впервые изучен на отечественной' генетической модели СД 2 типа у ; мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+. Мутантные мыши линии I

C57BL/KsJYLeprdb/+ отвечают всем требованиям экспериментальной генетической модели СД 2 типа, т.к. воспроизводят стадийность, течения? ! заболевания и соответствующие патогенетические, функциональные и структурные изменения в организме. ' 2. Развитие СД 2 типа у мышей db/db проходит 3 стадии: 1-я* стадия (на 1-2 месяце со дня рождения) — стадия инсулинорезестентности характеризуется гипергликемией, гипертрофией* и гиперплазией' островков? Лангерганса в поджелудочной железе; 2-я стадия (на 3-4 месяце со дня рождения) — стадия?

А t выраженных изменений со, стороны» внутренних органов характеризуется снижением количества функционирующих р-клеток в островках Лангерганса, ожирением и недостаточностью- иммунной системы 1 гипоплазия лимфоидной ткани); 3-я стадия (на 5-6 месяцах после рождения) - стадия необратимых изменений внутренних органов- характеризуется развитием кахексии, которая заканчивается гибелью животного.

3. Отработанные методы выделения, культивирования и трансплантации гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга позволяют осуществлять эффективную коррекцию патогенетических нарушений в организме при СД'2 типа.

4. Трансплантация аллогенного или изогенного костного мозга животным с СД 2 типа является безопасной и эффективной процедурой, позволяющей корригировать клинические, метаболические и структурные нарушения в организме.

5. Выраженность терапевтического,эффекта от применения клеток костного мозга у мышей с СД 2 типа* находится в прямой» зависимости от дозы и кратности введения культивированных клеток от здоровых доноров, а также от стадии развития болезни, но не зависит от фенотипа использованных клеток (гемопоэтических или стромальных клеток костного мозга)1 и их гистосовместимости (изогенные или аллогенные).

6. Введение культивированных клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа (через 1 месяц после рождения), позволяет пролонгировано сохранять,(в течение 5 мес.) нормальные уровни глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови, а так же сохранять значения массы тела в пределах нормы, за* счет индукции пролонгированной гипертрофии и гиперплазии островков Лангерганса в поджелудочной железе и торможения развития патологических изменений во внутренних органах (печень, почки, органы иммуногенеза). Введение клеток^ костного1 мозга позволяет в> 2,5-2,7 раза увеличить сроки жизни, животных по сравнению с контролем (СД2 типа без клеток костного мозга).1

7. Введение культивированных клеток костного мозга на стадии выраженных клинических, проявлений СД' 2 типа (3-4 мес. после рождения) не сопровождается достоверным нестабильным снижением уровней гликемии и гликозилированного гемоглобина, однако снижает выраженность, патоморфологических изменений во внутренних органах, что способствует сохранению их адекватной функции и пролонгирует сроки жизни животных (в 1,7-2,3 раза) по сравнению с контролем (СД 2 типа без применения клеток костного мозга).

8. Пролонгированное поддержание восстановительного морфогенеза в поврежденных органах при моделировании СД 2 типа и введении клеток костного мозга обусловлено длительным (120 дней) сохранением жизнеспособности введенных клеток, что подтверждается маркерной люминесценцией клеток костного мозга полученных от мышей B10.GFP с геном зеленого белка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученная линия мышей C57BL/KsJYLeprdb/+ может быть использована в качестве адекватной модели СД 2 типа в эксперименте, в том числе для отработки новых способов лечения и профилактики СД 2 типа методами клеточной терапии.

2. Для достоверного повышения биорегуляторной активности клеток костного мозга от здоровых взрослых доноров в организме животных с хроническими заболеваниями (например, при СД 2 типа) для трансплантации необходимо использовать культивированные (в течение 514 суток) клетки костного мозга.

3. Для эффективной коррекции метаболических нарушений и профилактики повреждений внутренних органов, возникающих при СД 2 типа, трансплантацию клеток костного мозга необходимо проводить уже на ранних стадиях развития болезни, используя или возможно высокую дозу клеток или многократное применение малых доз.

4. Для изучения процессов восстановительного морфогенеза у животных с хроническими заболеваниями рекомендуется использовать в качестве 1 донорского материала флуоресцирующие клетки костного мозга мышей линии B10.GFP.

5. Для проведения терапии клетками костного мозга могут быть использованы методики выделения и культивирования клеток костного мозга отработанные при проведении настоящего исследования.