Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Токсические эффекты паклитаксела на репродуктивную систему крыс-самцов и пути их снижения

00461673У

РУМПЕЛЬ ОЛЕСЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПАКЛИТАКСЕЛА НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ КРЫС-САМЦОВ И ПУТИ ИХ СНИЖЕНИЯ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2010

~ 3 ЛЕК 2010

004616739

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Научные руководители:

доктор биологических паук, профессор

БОРОВСКАЯ Татьяна Геннадьевна

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

ГОЛЬДБЕРГ Виктор Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

УРАЗОВА Ольга Ивановна

доктор медицинских наук

ХРИЧКОВА Татьяна Юрьевна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита состоится "_^ _2010 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан _" И'ОХйрЬ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук — Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследовательская активность в области мужского гаметогенеза продолжает оставаться высокой, что не только связано с познавательным интересом к этой ключевой проблеме биологии и медицины, но и диктуется постоянно расширяющимся кругом актуальных задач, имеющих большое медико-биологическое и социальное значение [Захцдов С.Т. и др., 2009]. К числу последних относится проблема мужского бесплодия, вызванного цитостатической химиотерапией [Адамян JT.B. и др., 2003; Jeruss J.S. et al., 2009; Meirow D. et al., 2010], вопрос об использовании которой обсуждается сегодня практически для каждого онкологического больного. Актуальность данной проблемы обусловлена обнадеживающими результатами химиотерапевтического лечения целого ряда онкологических заболеваний, возросшим числом пациентов, находящихся в длительной ремиссии [Быстрова О.В. и др., 2009; Пароконная А.А., 2009]. Так, 5-летняя выживаемость пациентов мужского пола в возрасте 15-54 лет составляет 61% [Резниченко А.Г., 2007]. Особенно впечатляют успехи детской онкологии [Кравченко Н.Е. и др., 2009]. В России около 2,6 млн. человек наблюдаются у врачей после излечения онкологических заболеваний по прошествии пяти и более лет [Чиссов В.И., 2009]. Опрос мужчин показывает, что 75% из них надеются на сохранение фертильности [Пароконная А.А., 2009; Jeruss J.S. et al., 2009]. Между тем клинические данные свидетельствуют о том, что нормальные показатели спермограммы выявляются лишь у половины из них [Адамян J1.B. и др., 2003]. С точки зрения представлений о низкой избирательности действия цитостатических препаратов их побочные эффекты на сперматогенную ткань не являются неожиданными, т. к. последняя относится к тканям с высокой фракцией клеточного роста. Однако степень выраженности гонадотоксичности при применении различных препаратов может значительно варьировать [Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., 2000]. Поиск путей и способов коррекции требует подробного изучения особенностей действия антибластомных средств разных групп на сперматогенез. В этом плане достаточно хорошо исследованы платиноиды, антрациклины, ИТА. Менее изучены препараты, принадлежащие к группе таксанов, которые сравнительно недавно вошли в онкологическую практику. К их числу относится препарат паклитаксел, являющийся одним из самых эффективных антибластомных средств [Фисенко В.П. и др., 2000; Хричкова Т.Ю., Гольдберг В.Е. и др., 2010; Pectasides D. et al., 2009]. Он успешно используется также в лечении злокачественных новообразований у детей и подростков [Woo М.Н. et al., 1999]. Данные литературы о действии иаклитаксела на сперматогенез немногочисленны и ограничиваются сведениями о цитогенетических изменениях в гоноцигах половозрелых мышей. Показано также, что мишенью его действия являются стволовые сперматогонии [Сухачева 'Г.В., 2001], повреждение которых может приводить к снижению фертильности в отдаленные сроки после введения препарата.

ч.

Известно, что паклитаксел способен вызывать в мужских половых клетках цитогенетические изменения. Такие гаметы не проходят селекционный отбор ни в спермиогенезе, ни при фертилизации, ни в первом цикле развития зиготы, что может приводить к появлению неполноценного потомства [Marchetti F. et al., 1999]. Вопрос о реализации мутагенных эффектов паклитаксела в анте- и постнатальном развитии остается открытым. Мевду тем для пациентов, имеющих нормальные показатели спермограммы, принципиально важным является вопрос о риске появления неполноценного потомства, ввиду генотоксичности цитостатического лечения [Пароконная А.Л., 2009; Steliarova-Foucher Е. et al., 2004; Fossa S.D. et al., 2005].

Поиск путей и средств защиты мужских половых желез от цитостатического воздействия в последние годы проводится в эксперименте по разным направлениям. В настоящее время обосновано использование антиоксидантов для защиты клеток нормальных тканей (не поврежденных опухолью) от цитостатического воздействия [Давыдов М.И., Барышников А.Ю., 2003]. К числу лекарственных средств такого плана принадлежит синтетический антноксидант тиофан, биологические эффекты которого обусловлены синергическим сочетанием антирадикальной активности его фенольных фрагментов с противопероксидным действием сульфидной группы [Гуреева Н.В. и др., 2006]. Показана его протективная активность в отношении кроветворной ткани, печени при цитостатическом воздействии [Ермолаева Л.А., 2008; Колотова О.В. и др., 2008]. В связи с этим безусловный интерес представляет изучение возможности использования тиофана в качестве средства коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных введением паклитаксела.

Другим перспективным способом защиты нормальных тканей от повреждений, вызванных цитостатическим воздействием, является использование средств регенеративной медицины, обладающих способностью мобилизировать собственные механизмы «глубокого резерва» - стволовые клетки костного мозга с их последующим хомингом в поврежденные ткани и активацией региональных стволовых клеток. К числу таких средств относится Г-КСФ [Дыгай A.M., Жданов В.В. и др., 2006; Дыгай A.M. и др., 2010]. Стволовые сперматогонии, как было отмечено выше, являются мишенью токсического действия паклитаксела. С указанных позиций несомненный практический и теоретический интерес представляет изучение эффективности Г-КСФ для защиты источников пролиферативного пула сперматогенеза при использовании данного препарата.

Цель исследования. Изучить характер, глубину и продолжительность нарушений репродуктивной системы крыс-самцов на фоне введения паклитаксела; провести поиск патогенетически обоснованных путей снижения его гонад отоксичности.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние репродуктивной системы крыс-самцов в ранние и в отдаленные сроки после введения паклитаксела половозрелым животным.

2 Оценить состояние репродуктивной системы крыс-самцов при введении паклигаксела в период их полового созревания.

3. Провести анализ состояния потомства интактных крыс-самок и самцов, спаренных в отдаленные сроки после введения паклитакссла. Определить влияние на потомство такого фактора, как срок спаривания после цитостатического воздействия.

4. Изучить возможность фармакологической коррекции гонадотоксических эффектов паклитаксела.

Научная новнзна работы. Впервые с помощью современных методов исследования проведено всестороннее изучение морфологического и функционального состояния репродуктивной системы крыс-самцов в ранние и отдаленные сроки после однократного введения паклитаксела в МПД. Принципиальную новизну имеют данные о влиянии препарата на семенники неполовозрелых животных. Впервые выявлено апоптозицдуцирующее действие препарата на клетки семенников и его способность повышать уровень ДЛМ на стадии сперматозоидов и сперматогоний. Изучено состояние потомства интактных крыс-самок и самцов, которым вводили паклитаксел в отдаленные сроки до спаривания. Установлены гонадопротекторные свойства антиоксиданта тиофана и Г-КСФ.

Практическая значимость работы. Результаты экспериментальных исследований позволяют прогнозировать восстановление фертилыюсти у пациентов после применения таксансодержащих схем лечения. Тиофан может быть использован для улучшения фертилизующих свойств эякулята, Г-КСФ для восстановления популяции сперматогоний. С учетом срока спаривания после введения паклитаксела можно снизить генотоксичность препарата на потомство. Данные о токсических эффектах паклитаксела на семенники неполовозрелых животных могуг служить основой для поиска патогенетически обоснованных путей коррекции. Очевидную научно-практическую перспективу имеет использование метода «ДНК-комет» для поиска патогенетически обоснованных корректоров, позволяющих снизить токсичность препарата на гонады и потомство. Определение степени выраженности ДНК-повреждений этим методом может быть использовано для сравнительной оценки генотоксического и канцерогенного действия цитостатических препаратов. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение (RU) по заявке № 2009136150 от 10.06.2010 г. «Способ коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2008, 2009, 2010), Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Гула, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2009, 2010), III съезде токсикологов России (Москва, 2008), V конгрессе Всемирной ассоциации репродуктивной медицины (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 - в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 22 таблицами. Библиографический указатель включает 292 литературных источника, из них 137 отечественных и 155 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на крысах популяции Wistar в количестве: 133 самца (120 половозрелых - возраст 2,5 мес, 13 неполовозрелых - возраст 45 дней) массой 150-300 г, для скрещивания было использовано 228 самок. Животные получены из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Противоопухолевый препарат паклитаксел (митотакс, Dr.Reddy's, Индия) вводили животным однократно внутривенно в МПД (7,6 мг/кг), рассчитанной методом графического пробит-анализа. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме. Изучение состояния репродуктивной системы крыс-самцов проводили в сроки, соответствующие различным стадиям созревания половых клеток: 1-7 сут - сперматозоидам, 16-22 сут - сперматидам, 36-42 сут -сперматоцитам, 60-66, 90-96 и 180-186 сут - сперматогониям [Лепехин Н.П. и др., 1994]. Учитывая, что вопрос об отцовстве возникает в отдаленные сроки после химиотерапевтического лечения, подробное изучение состояния плодов и крысят проводили при эффективном скрещивании через 1, 3 и 6 мес после введения паклитаксела. Сроки исследования потомства: плоды на 20-й день беременности, крысята в течение 2-х месяцев после рождения.

В качестве возможных корректоров гонадотоксических эффектов паклитаксела были изучены препараты: тиофан (НИИ химии антиоксидантов НГГ1У) и Г-КСФ (нейтростим, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск совместно с НИИ фармакологии СО РАМН, г. Томск). Тиофан вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг за 5 дней до и 5 дней после цитостатического воздействия. Состояние сперматогенеза при этом оценивали на 5, 16, 30 и 90-е сут после начала эксперимента. Препарат Г-КСФ вводили подкожно в дозе 100 мкг/кг один раз в день в течение 5 дней через I мес после воздействия паклитакселом. Корректорные свойства препарата оценивали на 60 и 90-е сут опыта.

Для изучения морфологических показателей семенников крыс контрольных и опытных групп умерщвляли (методом цервикальной дислокации) на 1, 5, 16, 30, 60, 90 и 180-е сут после введения паклитаксела. Животных вскрывали, извлекали семенник и эпидидимис, взвешивали и определяли их весовые коэффициенты. Семенники фиксировали в жидкости Карнуа, готовили парафиновые срезы (толщиной 5 мкм), окрашивали их гематоксилин-эозином. На срезе семенника в каждом просмотренном канальце определяли количество слоев сперматогенного

эпителия, вычисляли индекс сперматогенеза. Подсчитывали количество сперматогоний, число канальцез с 12-й стадией мейоза и со спущенным эпителием [Саноцкий И.В. и др., 1919], относительное количество клеток Лейдига, определяли соотношение больших, средних и малых форм эндокриноцитов [Ухов Ю.И. и др., 1983]. Для оценки механизма действия Г-КСФ на 60 и 90-е сут подсчитывали также количество клеток Серголи, вычисляли показатель степени зрелости сперматогенного пласта [Сухоруков B.C. и др., 1989].

Для определения О КС, приходящегося на придаток, использовали гомогенизированную клеточную взвесь эпидидимиса в дозированном количестве физиологического раствора с применением лейкоцитарного меланжера и камеры Горяева [Саноцкий И.В. и др., 1979]. Второй придаток разрезали, делали мазок, фиксировали его в метиловом спирте и окрашивали азур Н-эозином, подсчитывали процент дегенеративных форм зрелых сперматозоидов [Пашутин Г.В. и др., 1976], определяли морфологические типы аномальных спермиев. Функциональное состояние зрелых мужских половых клеток также оценивали на 1, 5, 16, 36, 60, 90 и 180-е сут после введения паклитаксела. Для этого придаток семенника гомогенизировали в физиологическом растворе. В полученной взвеси из половых клеток эпидидимиса определяли процент подвижных форм сперматозоидов и максимальную продолжительность их движения.

Интегральную оценку функционального состояния семенников крыс проводили путем определения индексов плодовитости, беременности, показателей эмбриональной смертности. Для этого самцов опытной и контрольной групп ссаживали с интакшыми самками в сроки: 1-7, 16-22, 36-42, 90-96 и 180-186 сут, в соотношении 1 самец : 2 самки в течение 6 дней. Спаривание регистрировали с помощью вагинальных мазков. Самок умерщвляли на 20-й день беременности, вскрывали, подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, количество живых и мертвых плодов (из расчета на 1 самку), определяли пре-и постимплантационную смертность, характеризующую вероятность сохранения беременности [Саноцкий И.В. и др., 1979].

В специальном эксперименте изучались отдаленные эффекты паклитаксела на репродуктивную систему крыс-самцов, перенесших цитостатическое воздействие в неполовозрелом возрасте (45 дней). Для этого через 3 мес после введения крысам-самцам паклитаксела оценивали морфофункциональное состояние гамет, эндокринную активность семенников (по количеству клеток Лейдига) [Ухов Ю.И. и др., 1983], индексы плодовитости и беременности, уровень эмбриональной гибели у спаренных с ними самок.

Методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток («ДНК-комет») на 10 мышах линии С57В1/6 (животные получены из питомника «Столбовая» РАМН) в системе in vitro была проведена оценка апоптозиндуцирующего и ДНК-повреждающего действия паклитаксела на клетки семенников.

Для изучения состояния потомства в антенатальном периоде развития плоды, извлеченные на 20-е сут беременности, взвешивали, проводили макроскопический осмотр, определяли их кранио-каудальный размер. После этого часть плодов помещали в раствор Боуэна для фиксации и последующего исследования состояния внутренних органов по методу Вильсона. Оставшуюся часть плодов фиксировали в 96% этиловом спирте и окрашивали по методу Доусона с целью оценки процессов оссификации [Дыбан А.П. и др., 1970]. Часть беременных самок оставляли до родов для изучения состояния потомства в постнаталыюм периоде развития. Фиксировали продолжительность беременности и день родов, вычисляли индекс выживаемости [Диннерман A.A., 1980]. Для оценки физического развития крысят исследовали динамику массы на 4, 7, 14 и 21-е сут жизни, устанавливали сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезания резцов, открытия глаз, опускания семенников и открытия влагалища. На 5 и 15-е сут жизни изучали двигательную активность и формирование сенсорно-двигательных рефлексов по тестам: «переворачивание на плоскости», «избегание края», «способность удерживаться на горизонтальной веревочке». В месячном возрасте наблюдали ориентировочно-исследовательское поведение в условиях «открытого поля» [Вихляева Ю.И., 1983]. На 60-е сут жизни у крысят оценивали способность к обучению в тесте «условный рефлекс пассивного избегания» [Буреш Я.И др., 1991] и способность к адаптивному поведению методом избегания стресс-ситуации по Хапдерсону в модификации H.A. Бовдаренко [Бондаренко H.A., 1980]. В специальном эксперименте были изучены показатели эмбриональной смертности у потомства (F,) интактных крыс-самок и самцов, получавших паклитаксел за 3 мес до спаривания.

Для определения достоверности различий полученных данных в группах применяли непараметрические критерии Вилкоксона-Манна-Уитни и многофункциональный критерий f - угловое преобразование Фишера. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологический анализ показал, что в ранние сроки после однократного внутривенного введения паклитаксела в МПД в половых железах крыс-самцов на фоне отека интерстиция и гиперемии сосудов, в ряде случаев наблюдался пикноз ядер сперматогоний, границы между клетками были видны неотчетливо, сперматогенный эпителий выглядел истонченным. В последующие дни опыта большинство выявленных изменений исчезало, но истончение сперматогенной ткани в ряде канальцев наблюдалось даже спустя 3 мес после введения препарата.

Количественный анализ морфологических изменений семенников выявил степень повреждения, уровень внутриканальцевой репаративной регенерации и индивидуальные особенности действия паклитаксела. Антипролиферативные свойства препарата, судя по числу канальцев с 12-й стадией мейоза, проявлялись на 5-

е сут опыта (рис. 1, а). Мейотическая активность угнеталась в 2 раза. Через 3 мес после введения паклитаксела мейотическая активность возрастала, что свидетельствовало об активации процессов внутриканальцевой регенерации (рис. 1, а).

6

5 -4 -3 -2 -1 -

о-о-

16 30 90 180 СУ

-1-1--I

5 16 30 90 180 "У

усл.ед. 25 т

усл.ед.

4 -1 3,8 -3,6 ■ 3,4 • 3,2

16 30 90 180 Ч™

1

16 30 90 180 суг

Рис. 1. Морфологические показатели сперматогенеза крыс в ранние и отдаленные сроки

после однократного введения паклитаксела в МПД. а - количество канальцев с 12-й стадией мейоза, б - количество канальцев со слущенным эпителием, в - количество сперматогоний, г - индекс сперматогенеза. Здесь и далее: по оси абсцисс - сроки после введения препарата; о - контроль (физиологический раствор), ■ -опыт (паклитаксел); * - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Введение препарата индуцировало не только угнетение пролиферативной активности, но и гибель части клеток. Так, через 2 недели после начала эксперимента в семенниках животных опытной группы появлялись канальцы со слущенным эпителием (рис. 1, б), в то время как в контроле такие изменения обнаружены не были. Тот факт, что увеличенное слущивание наблюдалось не в первые дни исследования, свидетельствует о том, что паклитаксел вызывает появление патологически измененных клеток, впоследствии подвергающихся элиминации. Сходный эффект выявлялся при введении паклитаксела в эквивалентных дозах мышам [Сухачевой Т.В. и др., 2001]. Доказательства частичной гибели клеток были выявлены также при подсчете количества сперматогоний. Их число оказалось сниженным уже через сутки после начала эксперимента (рис. 1, в). Отсутствие положительной динамики этого показателя в последующие дни опыта может свидетельствовать о токсическом действии препарата на все типы сперматогоний, в том числе и на А0, являющиеся стволовыми (резервными) клетками, делящимися

только при повреждении. Повреждающее действие паклитаксела на стволовые клетки описано в литературе [Сухачева T.R. и др., 2001]. Следует отметить, что гибель стволовых клеток выявляется при введении не всех цитостатических препаратов [Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., 2003]. В связи с этим паклитаксел, очевидно, можно использовать в качестве экспериментальной модели недостаточности пролиферативного пула сперматогенеза. Известно, что снижение количества резервных половых клеток может приводить к необратимому бесплодию [Липатова H.A., 1983].

Закономерным следствием угнетения мейотической активности, усиленного слущивания клеток, сокращения пролиферативного пула сперматогенеза (популяции сперматогоний) является истончение сперматогенной ткани, для количественной оценки которого вычисляли индекс сперматогенеза. При подсчете было выявлено его снижение на протяжении первых 30-и сут опыта (рис. 1, г), впоследствии этот показатель восстанавливался до контрольных значений. В то же время на гистологических срезах семенников, как уже отмечалось ранее, наблюдалась изреженность сперматогенной ткани, что, очевидно, связано не с сокращением числа слоев, а с уменьшением численности эпителиоцитов.

Количественный анализ структурных изменений семенников показал также, что введение препарата приводит к патологическим изменениям в интерстициальной ткани. Определение относительного количества эндокриноцитов выявило статистически значимое снижение (в 1,2-1,3 раза) их числа с 5 по 30-е сут опыта (р<0,05). При этом происходило возрастание (на 8-15%; р<0,05) больших форм клеток Лейдига, за счет сокращения числа клеток средних размеров (на 10-19%; р<0,05). Известно, что большие эндокриноциты являются в функциональном плане наиболее активными [Ухов Ю.И. и др., 1983]. В связи с этим, отмеченное возрастание их числа может быть ответной компенсаторной реакцией на гибель части клеток. Сокращение количества клеток Лейдига в первые дни опыта является, вероятно, следствием прямого повреждающего действия паклитаксела. Поскольку интерстициальные эндокриноциты не относятся к активно пролиферирующим клеткам, их гибель может быть связана с апоптозиндуцирующими свойствами препарата. Учитывая, что апоптоз гландулоцитов происходит за счет активации каспазы 3 [Gautam D.K. et al., 2006], нельзя исключить, что паклитаксел воздействует на эту ферментативную систему. Снижение количества клеток Лейдига в последующие дни опыта может быть следствием нарушения их паракринных взаимоотношений с гоноцитами, поскольку известно, что морфология гландулоцитов меняется в зависимости от того, контактируют ли они с поврежденным или неповрежденным эпителием канальцев [Ухов Ю.А. и др., 1983]. Изучение дальнейшей динамики численности клеточной популяции эндокриноцитов показало, что к концу эксперимента (6 мес) их количество, напротив, возрастало (в 1,7 раз), по сравнению с контролем (р<0,05). Известно, что пролиферация клеток Лейдига находится под контролем ФСГ [Зилов A.B. и др., 2007]. Учитывая данный факт, можно предположить, что увеличение их

и

численности является следствием повышения гипофизарной активности в ответ на тестикулярную недостаточность по механизму обратной связи. Клинические данные свидетельствуют о том, что у пациентов в отдаленные сроки после цитостатической химиотерапии (в том числе с использованием таксансодержащих схем) наблюдается возрастание уровня ФСГ в сыворотке крови [Hansen S.W., 1990; Pectasides D. et al., 2009; Chatzidarellis E. et al., 2009].

Закономерным следствием отмеченных выше структурных изменений семенников является снижение продуктивности сперматогенеза. При подсчете ОКС выявлялось его снижение на 41-53% от контроля (до 90 сут), что соответствовало воздействию на делящиеся и неделящиеся гоноциты (рис. 2, а). Угнетение продуктивности сперматогенеза в отдаленные сроки является, очевидно, следствием токсического действия препарата на популяцию сперматогоний. Снижение этого показателя наблюдалось и на 180-е сут опыта, но из-за большого разброса данных различия с контролем оказались статистически не значимы.

млн. 50 л 40 -30 -20 10 0

16 30 90 180 "У1

16 30 90 180 Ф

%

100 -I 80 -60 -40 -20 -0

мин. 500 400 -300 -200 ■ 100 0

16 30 90 180 СУ*

16 30 90 180 суг

Рис. 2. Морфологические и функциональные показатели зрелых мужских половых клеток

крыс после однократного введения паклитаксела в МПД. а - общее количество сперматозоидов, б - количество патологических форм сперматозоидов, в - количество подвижных форм сперматозоидов, г - максимальная продолжительность движения сперматозоидов.

При подсчете количества патологических форм спермиев было установлено значительное увеличение их числа почти во все исследуемые сроки. Наибольшее возрастание данного показателя (в 4-5 раз) отмечалось при прямом воздействии препарата на зрелые половые клетки (первые 5 дней опыта; рис 2, б). Через 6 мес

количество патологических форм спермиев не отличалось от контроля. При более детальном цитологическом исследовании выявлялись сперматозоиды с патологией хвоста, формы распада, наибольшее число которых (24,5%) наблюдалось через 1 сут после начала опыта (р<0,05). Отмеченные выше патологические изменения свидетельствуют о разрушении зрелых половых клеток в канале придатков на фоне нормально протекающего сперматогенеза [Пашутин Г.В. и др., ¡976]. Кроме того, были обнаружены спермин с вакуолями, существенное возрастание числа которых (в 9 раз) наблюдалось на 5-е сут эксперимента (р<0,05). Появление таких клеток является одной из причин бесплодия [Bartoov В. et al, 2010].

К числу наиболее значимых критериев оценки фергильности эякулята принадлежат, как известно, процент подвижных форм и максимальная продолжительность движения спермиев [Липатова H.A., ¡998}. Анализ полученных данных показал, что снижение функциональной активности половых клеток выявлялось уже на 5-е сут опыта и носило длительный характер (до 3-х мес после начала эксперимента). Через 6 мес происходило восстановление исследуемых i показателей (рис. 2, в, г).

На следующем этапе работы важным было выяснение вопроса о том, сопровождаются ли отмеченные выше структурные изменения семенников, морфологические и функциональные изменения спермиев угнетением интегрального показателя генеративной функции половых желез - способности к зачатию (индекса 1 беременности). Правомочность вопроса является вполне обоснованной, т. к. известно, что система репродукции обладает высокой степенью надежности благодаря дублированию большого числа половых клеток. Результаты определения эффективности спаривания представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Эффективность спаривания крыс-самцов после введения паклитаксела в сроки, соответствующие различным стадиям сперматогенеза. Здесь и далее: 1-7 - сперматозоиды; 16-22 - сперматиды: 36-42 - сперматоциты; 90-96, 180-186 - сперматогонии; о - контроль (физиологический раствор), я - опыт (паклитаксел); * - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Установлено, что введение паклитаксела приводило к снижению исследуемого показателя уже в первые дни опыта. Этот токсический эффект носил длительный характер и сохранялся а отдаленные сроки (до 3 мес). Плодовитость животных

сокращалась на 16-30% (р<0,05). Наиболее вероятной причиной снижения фертильности является сокращение числа подвижных форм, наблюдаемое в этот I период, т. к. уменьшение только этого показателя на 50% может приводить к стерильности [Липатова H.A., 1998]. К концу эксперимента, как было отмечено ранее, процент подвижных форм возрастал, и индекс беременности уже не отличался от контрольного уровня (рис. 3). Следует отметить, что сохранение способности к зачатию, ввиду генотоксичности цитостатических воздействий, не может гарантировать наступление беременности.

К числу показателей, характеризующих вероятность наступления беременности, относится уровень эмбриональной гибели (пре- и постимплантационная смертность) у интактных самок, спаренных с самцами экспериментальных групп. Результаты исследования показали, что пре- и постимплантационная смертность возрастала (в 1,5-3,4 раза; рис. 4) на стадии сперматозоидов и спермагогоний, что может быть следствием индукции ДЛМ.

Преимплантационная Постимплантационная

смертность, % смертность, %

Рис. 4. Эмбриональная смертность потомства интактных крыс-самок, спаренных с самцами., получавшими паклитаксел в сроки, соответствующие различным стадиям

сперматогенеза.

Способность повышать уровень ДЛМ в мужских половых клетках экспериментальных животных (мышей) выявлена также у доксорубицина [Meistrich M.L. et al., 1985], тио-тэфа, хлорамбуцила, мелфалана, циклофосфамида, прокарбазина, 5-фторурацила, меркаптопурина [Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998], этопозида [Russell L.B. et al., 2000] и других препаратов. Следует отметить, что повышенная смертность до имплантации может быть не только результатом индукции ДЛМ, но и следствием снижения оплодотворяющей способности спермиев. Такой механизм угнетения генеративной функции у крыс-самцов, получавших паклитаксел, также возможен, поскольку препарат, как было показано выше, приводит к увеличению патологических форм спермиев, которые характеризуются сниженной функциональной активностью.

Одним из интегральных показателей состояния репродуктивной системы в целом является способность к спариванию, которая, как известно, определяется состоянием ЦНС и гормональной обеспеченностью. Экспериментальные исследования выявили ее снижение на 23% по сравнению с контролем у крыс-самцов в первые 6 сут после введения паклитаксела (р<0,05). Учитывая, что препарат является нейротоксичным [Шакирова И.Н., 2002], выявленный эффект может быть обусловлен его угнетающим действием на ЦНС.

Как известно, основным механизмом антипролиферативного действия паклитаксела является нарушение веретена деления за счет сборки дефектных микротрубочек. Проведенные исследования показали, что он является не единственным при повреждении клеток семенников. Об этом свидетельствуют отмеченные выше факты повреждения и гибели неделящихся клеток. К числу повреждающих факторов можно отнести активацию ПОЛ, которая вносит значительный вклад в токсичность антибластомных средств [Богуш Т.А. и др., 2001]. К механизмам противоопухолевого действия паклитаксела, судя по данным литературы, относится индукция апоптоза в опухолевых клетках [Корман Д.Б., 2006; Lanni S. et al., 1997; Kan R. et al., 2001; Tan Guolin et al., 2002]. Апоптозиндуцирующие свойства препарата в отношении клеток семенников ранее не исследовались. В настоящей работе методом «ДНК-комет» установлено, что при инкубации клеточной взвеси семенников мышей с паклитакселом в дозах 0,6 и 1,2 |iM наблюдается увеличение в 1,2-1,4 раза числа апоптотических комет (р<0,05). Анализ полученных данных показал, что выявленный эффект имеет дозозависимый характер.

Данные литературы [Сухачева Т.В., 2001] и представленные выше результаты свидетельствуют о том, что паклитаксел, как заведомо генотоксичное средство, вызывает нарушение синаптотемных комплексов, анеуплоидию сперматоцитов, повышение уровня ДЛМ в половых клетках. К числу индуцируемых цитостатическими препаратами генетических повреждений сперматозоидов могут принадлежать реципрокные транслокации, одним из признаков которых является повышение эмбриональной гибели зигот во втором поколении потомков [Малашенко A.M., 1967; Bajpayee М. et al., 2005]. В специальном эксперименте нами было произведено спаривание крысят-самцов F, опытных групп с интакгными самками. Результаты исследования показали, что введение паклитаксела не приводит к сокращению численности пометов во втором поколении потомков, следовательно, препарат не индуцирует появление реципрокных транслокаций.

Для количественной оценки частоты ДНК-повреждений в семенниках в настоящем исследовании изучен уровень разрывов ДНК методом «ДНК-комет». Установлено, что в системе in vitro наблюдается увеличение в 1,5 раза (р<0,05) числа ДНК-комет в клетках семенников мышей при их 3-х часовой инкубации с паклитакселом, что свидетельствует о выраженном ДНК-повреждающем действии препарата.

Дальнейшим этапом исследования явилась оценка репродуктивного статуса крыс-самцов, получавших паклитаксел в период полового созревания (возраст 45 дней, соответствующий началу становления сперматогенеза). Состояние воспроизводящей функции оценивалось через 3 мес после цитостатического воздействия, что соответствует, с учетом длительности сперматогенеза у крыс, проявлению воздействия на сперматогонии. Результаты исследования показали, что продуктивность сперматогенеза, судя по ОКС (р>0,05), соответствовала контрольным значениям. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение препарата в препубертатном периоде развития животных не вызывает гибели источников пролиферативного пула сперматогенеза, как это наблюдалось у половозрелых животных. Это может быть связан с тем, что продуктивность деления сперматогоний у крыс репродуктивного возраста выше, чем в период полового созревания [Сухоруков B.C., 1988]. В то же время морфологический анализ выявил возрастание числа патологических форм спермиев (в 6 раз) по сравнению с контролем (р<0,05), чего не наблюдалось у половозрелых крыс. Кроме того, выявлялось снижение функциональной активности спермиев. Так, число подвижных форм снижалось в 2 раза по сравнению с контролем и составляло 34% (р£0,05). Столь значительное снижение этого показателя могло стать одной из причин бесплодия. Последнее выявлялось у 13% самцов этой группы. Оставшиеся животные сохраняли способность к зачатию. Эмбриональная смертность у спаренных с ними самок была сопоставима с контролем. Как было отмечено выше при введении паклитаксела половозрелым самцам эмбриональная смертность, напротив, возрастала. Полученные данные свидетельствуют о меньшей чувствительности сперматогоний неполовозрелых животных к генотоксическому действию препарата. При определении способности к спариванию выявлялось ее угнетение (на 19%; р<0,05). Одной из причин этого эффекта может быть снижение уровня гормональной обеспеченности системы репродукции. В пользу чего свидетельствует выявленный факт сокращения на 26% по сравнению с контролем числа тестостеронсинтезирующих клеток (р<(),05).

Данные литературы свидетельствуют о далеко не единичных фактах появления детей у пациентов, перенесших лечение таксансодержащими схемами [Seiden M.V. et al., 2001; Ferrandina G. et al., 2005; Pectasides D. et al., 2009]. В то же время в ряде экспериментальных работ обоснована вероятность появления неполноценного потомства при воздействии таксанов на мужские половые клетки [MarcheUi F. et al., 1999]. Клинические данные в этом плане фрагментарны. Одним из способов оценки последствий генотоксичности в токсикологии является подробное изучение состояния потомства [Саноцкий И.В. и др., 1979]. В связи с этим следующим этапом работы явилось исследование потомства в анте- и постнаталыюм периоде развития, полученного от интактных самок и самцов, которым вводили препарат за 1, 3 и 6 мес до спаривания.

В эксперименте было обследовано 998 плодов и крысят (из них 537 контрольной группы). Результаты интегральной оценки состояния потомства крыс-

самцов опытных и контрольных групп представлены в таблице 1. Установлено, что введение паклитаксела самцам до спаривания с интактными самками не оказывало отрицательного влияния на кранио-каудальный размер, массу тела, количество наружных кровоизлияний плодов, индекс выживаемости крысят. Однако в опытной группе обнаружена одна особь - самка с аплазией хвостового отдела позвоночника (препарат вводили за 3 мес до спаривания). Отклонения в состоянии потомства были выявлены во всех опытных группах при изучении внутренних органов, процессов оссификации плодов, скорости физического развития, формирования сенсорно-двигательных рефлексов и обучаемости крысят. Так, во всех экспериментальных группах наблюдалось увеличение по сравнению с контролем количества плодов с гемоперикардом в 1,8-3 раза, с застойными явлениями в печени - в 1,4-2,2 раза, с гидронефрозом - в 2-4,5 раза (р<0,05). Число плодов с задержкой процессов оссификации костей (черепа) возрастало на 26-55% по сравнению с контролем (в зависимости от срока спаривания; р<0,05). У крысят (самцов) опытных групп наблюдалась задержка полового созревания, прорезания резцов. В группах опыта были обнаружены крысята с пониженным мышечным тонусом, о чем свидетельствовало сокращение (в 1,5-1,7 раз) времени их удерживания на горизонтальной веревочке (р<0,05).

Таблица 1

Патологические изменения у потомства интактных крыс-самок и самцов, получавших паклитаксел за 1, 3 и 6 мес до спаривания

Показатель Сроки спаривания после введения паклитаксела, мес

1 3 6

Индекс выживаемости крысят - - -

Внешние аномалии потомства (плодов и крысят) - + (3) -

Средняя масса тела и кранио-каудальный размер плодов, крысят - - -

Наружные кровоизлияния плодов - - -

Патологические изменения внутренних органов плодов + (3) ++(4) + 0)

Состояние процессов оссификации плодов + 0) ++(4) + (1)

Физическое развитие крысят + (1) + (1) + 0)

Мышечный тонус крысят + (1) + 0) + 0)

Выработка рефлекса «избегания края» - - +(1)

Поведение в условиях «открытого поля» - - -

Способность к выработке УРПИ + (0,5) - -

Адаптивное поведение - - -

Примечание: «-» — отсутствие токсического эффекта, «+», «++» - различная степень выраженности токсического эффекта. В круглых скобках - условные единицы оценки токсического эффекта.

При оценке состояния ЦНС в тестах «открытое поле», УРПИ, Хацдерсона не обнаруживалось существенных изменений у крысят экспериментальных групп. Следует отметить, что выявленные нарушения в потомстве крыс-самцов, получавших паклитаксел, наблюдаются и при использовании препаратов других групп [Пахомова А.В., 2004; Щемерова Ю.А., 2006; Боровская Т.Г., Гольдберг В.Е., 2007], однако выраженность патологических изменений, связанных с токсическим действием препарата на ЦНС, оказалась не столь значительной.

На рисунке 5 представлена суммарная количественная оценка состояния потомства крыс-самцов в условных единицах. Полученные данные свидетельствуют о том, что паклитаксел оказывает максимальное повреждающее действие на потомство при введении его за 3 мес до зачатия, что соответствует проявлению токсического воздействия препарата на стволовые сперматогонии. Наиболее оптимальным сроком, с точки зрения наименьшего токсического действия паклитаксела на потомство, является спаривание через 6 мес. Снижение токсичности с течением времени свидетельствует об обратимости генетических нарушений и об отсутствии нарушений в функционировании системы репаративной регенерации клетки. Учитывая данные об оптимальных сроках зачатия, очевидно, можно свести к минимуму риск появления неполноценного потомства.

Обнадеживающие результаты лекарственного лечения ряда онкологических заболеваний, наблюдаемые в последние годы, обусловили актуальность поиска путей и средств для снижения гонадотоксического эффекта цитостатической химиотерапии [Резниченко А.Г., 2007; Трещалин И.Д. и др., 2009; Carmely A. et al., 2009]. Однако, несмотря на предпринимаемые усилия, единственным способом защиты пациентов от бесплодия в клинической практике остается криоконсервация семенной жидкости [Быстрова О.В. и др., 2009; Пароконная А.А., 2009; Lee S.J. et al., 2006], возможность использования которой для многих онкологических больных ограничена.

В настоящее время обоснована целесообразность применения антиоксидантов для снижения повреждающего действия цитостатической химиотерапии, поскольку усиление образования активных форм кислорода и процессов липидной пероксидации являются одними из биологических эффектов цитостатического воздействия, которые вносят свой вклад в ее токсичность [Давыдов М.И., Барышников А.Ю., 2003]. Показана эффективность использования антиоксидантов в качестве гемато- и гепатопротекторов [Богуш Т.А. и др., 2001; Ермолаева JI. А., 2008].

Известно, что активация ПОЛ в мужских половых клетках ведет к повреждению мембраны и ДНК гоноцитов [Aitken R.J. et а!., 2006; Venkatesh S. et al.,

Рис. 5. Суммарная количественная оценка

(в условных единицах) токсического эффекта паклитаксела на потомство крыс-самцов.

2009], следствием чего является снижение функциональной активности сперматозоидов, появление генетических повреждений и гибель клеток [Zorn В. et al., 2003; Као S.H. et al., 2008; Tremellen К., 2008]. Все отмеченные изменения выявлялись при введении паклитаксела. Попытки коррекции нарушений сперматогенеза на фоне введения цитостатиков с помощью антиокеидантов описаны в литературе. Использование тиоловых соединений [Богуш Т.А. и др., 2001] не увенчалось успехом. Применение растительного препарата с антиоксидантными свойствами (экстракта левзеи) оказало защитный эффект, но только в ранние сроки после цитостатического воздействия [Щемерова Ю.А., 2006]. Между тем, наиболее актуальна коррекция отдаленных последствий. В связи с этим существует необходимость поиска более эффективных в этом плане антиоксидантных соединений. В настоящей работе сделана попытка коррекции гонадотоксических эффектов паклитаксела с помощью синтетического препарата тиофана. Безопасность использования тиофана с паклитакселом доказана на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис. Установлено, что его введение животным, леченным цитостатиком, не снижает противоопухолевый эффект последнего [Лопатина К.А. и др., 2009]. Для оценки защитных свойств корректора использовали наиболее дискриминационные показатели спермограммы: процент подвижных форм спермиев, максимальная продолжительность их движения, количество патологических форм, ОКС. Учитывая, что паклитаксел относится к числу препаратов, повреждающих сперматогонни, был произведен подсчет их числа. Корректорные свойства тиофана оценивали в ранние и отдаленные сроки, соответствующие воздействию на делящиеся и неделящиеся клетки сперматогенной ткани. При подсчете количества сперматогоний и ОКС не было выявлено статистически значимых различий в группе сочетанной терапии по сравнению с животными, получавшими один паклитаксел (р>0,05). Следовательно, тиофан не защищал сперматогонни от гибели, что и отразилось на продуктивности сперматогенеза. Однако функциональная активность выживших клеток оказалась повышенной. Так, количество подвижных форм, максимальная продолжительность их движения во все исследуемые сроки (рис. 6, а, б) практически не отличались от фона, в то время как при введении одного паклитаксела эти показатели были снижены. Количество патологических форм сперматозоидов (рис. 6, в) сокращалось по сравнению с контролем на 30-90-е сут опыта, что свидетельствует об антимутагеном эффекте антиоксидапта на делящиеся гоноциты. Свойства тиофана снижать генотоксичность антибластомных средств, описаны в литературе [Колотова О.В. и др., 2008].

Таким образом, использование тиофана защищает выжившие клетки от повреждения паклитакселом, что может повысить фертилыгость животных. Между тем его применение не приводит к увеличению количества сперматогоний, то есть не решает проблему недостаточности пролиферативного пула.

Для решения этой проблемы в настоящей работе был использован Г-КСФ, обладающий способностью активизировать региональные стволовые клетки

[Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др., 2008; Di Campli С. et al„ 2004]. Его регенеративные способности в отношении семенников ранее не исследовались. В настоящей работе проведено изучение влияния Г-КСФ на процессы репаративной регенерации тестикулярной ткани крыс репродуктивного возраста через 2 и 3 мес после введения паклитаксела. Сроки исследования соответствуют воздействию на полу- и стволовые сперматогонии. Правомочность использования Г-КСФ на фоне введения паклитаксела основана на результатах экспериментов, проведенных на мышах с перевиваемой метастазирующей опухолью Лыоиса, в которых показано, что лечебный эффект цитостатика при этом не снижается [Румпель О.А., Сафонова Е.А., 2009]. Кроме того, Г-КСФ рекомендован для использования при цитостатической химиотерапии [ХричковаТ.Ю., 2009J.

5 16 30 90 суг

Рис. 6. Состояние репродуктивной системы крыс-самцов после сочетанного введения

паклитаксела и тиофана. а - количество подвижных форм сперматозоидов, б - максимальная продолжительность движения сперматозоидов, в - количество дегенеративных форм сперматозоидов; о -фон; в - контроль (паклитаксел); ♦ - опыт (сочетанное введение паклитаксела и тиофана); * - различия достоверны по сравнению с фоном при р<0,05; # - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Известно, что для образования новых стволовых сиерматогоний необходимо наличие клеток микроокружения [Meachem S. et al., 2001], последние утрачивают способность к делению в зрелом извитом семенном канальце. В связи с этим репаративная регенерация тестикулярной ткани идет только путем образования новых канальцев из регенераторной зоны rete testis [Курносова Т.Р. и др., 1994],

которая содержит клетки Сертоли и первичные половые детерминанты, являющиеся источниками стволовых клеток. Во вновь образующихся канальцах отмечается повышенное число клеток микроокружения, что не ограничивает размножение популяции сиерматогоний. Критерием эффективности регенерации тестикулярной ткани является снижение степени зрелости сперматогенного пласта, которое определяется на основании подсчета клеток Сертоли [Сухорукое B.C. и др., 1989].

Результаты подсчета степени зрелости сперматогенного пласта выявили ее снижение у крыс всех экспериментальных групп по сравнению с фоном, что свидетельствует о процессах репарагивной регенерации ткани (рис. 7, а).

усл.ед. " усл.ед.

2 з мес 2 3 мес

Рис. 7. Состояние сперматогенеза крыс-самцов после сочетанного введения паклитаксела

и Г-КСФ.

а - степень зрелости сперматогенного пласта, б - количество сиерматогоний, в - общее количество сперматозоидов, г - количество подвижных форм сперматозоидов, д -максимальная продолжительность движения сперматозоидов; □ - фон; ж — контроль (паклитаксел); п - опыт (сочетанное введение паклитаксела и Г-КСФ); * - различия достоверны по сравнению с фоном при р<0,05; # - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Однако через 2 мес после начала эксперимента в группе сочетанной терапии этот показатель оказался ниже, чем при введении одного цитостатика. Полученные данные указывают на то, что Г-КСФ способствовал более ранней активации регенерации семенникоз. Закономерным следствием более интенсивного течения репаративных процессов должно быть увеличение количества сперматогоний и продуктивности сперматогенеза. Морфологический анализ показал (рис. 7, б), что численность клеточной популяции сперматогоний при сочетанном введении паклитаксела и Г-КСФ в исследуемые сроки увеличивалась в 1,4 и 1,7 раза соответственно по сравнению с контролем, а через 3 мес она возрастала даже по сравнению с фоном. Возрастание источников пролиферативного пула должно привести к увеличению ОКС. Результаты исследования показали, что этот показатель статистически значимо возрастал через 3 мес после начала опыта на 59% от контроля (рис. 7, в). Учитывая важность функционального состояния спермиев в фертильности эякулята, определяли количество подвижных форм и максимальную продолжительность их движения. Эти показатели на фоне введения Г-КСФ возрастали на 46 и 20% соответственно (рис. 7, г, д). В совокупности представленные данные свидетельствуют о том, что Г-КСФ является эффективным средством восстановления источников пролиферативного пула сперматогенеза при цитостатическом воздействии.

Анализ представленных выше результатов исследования свидетельствует о том, что бесплодие, вызываемое паклитакселом, может быть обратимо, хотя восстановление сперматогенеза имеет длительный характер. С учетом длительности репродуктивного периода крыс [Ланга С.М. и др., 1993], для человека этот срок соответствует 10 годам жизни. Применение корректоров может привести к сокращению времени восстановления фертильности, в значительной степени это относится к Г-КСФ.

ВЫВОДЫ

1. В ранние сроки после однократного введения паклитаксела в МПД в семенниках половозрелых крыс развиваются дистрофические и деструктивные изменения сперматогенной и интерстициальной ткани, сопровождающиеся угнетением сперматогенеза, снижением функциональной активности спермиев, способности к зачатию. В первые 6 дней после введения препарата у крыс-самцов отмечается снижение индекса плодовитости, у спаренных с ними интактных самок возрастает эмбриональная смертность.

2. В отдаленные сроки после введения препарата (3 мес) сохраняется истонченность сперматогенной ткани. Продуктивность сперматогенеза, функциональная активность спермиев, эффективность зачатия не достигают контрольного уровня. Снижение продуктивности сперматогенеза сопровождается недостаточностью пролиферативного пула. Через 6 мес после введения паклитаксела численность клеточной популяции сперматогоний остается сниженной, количество

интерстициальных эндокриноцитов превышает контрольный уровень. У интактных самок, спаренных с самцами через 3 и 6 мес после введения паклитаксела, отмечается возрастание эмбриональной смертности.

3. Мишенью токсического действия паклитаксела на семенники являются как делящиеся (сперматогонии, сперматоциты), так и неделящиеся (сперматиды, сперматозоиды, эндокриноциты) клетки. Препарат обладает апоптозиндуцирующим действием на клетки семенников, увеличивает в них количество клеток с однонитевыми разрывами ДНК.

4. Семенники неполовозрелых крыс-самцов обладают высокой чувствительностью к действию паклитаксела. Через 3 мес после его введения в МПД в препубертатном периоде развития выявляется функциональная неполноценность гамет, снижение способности к зачатию, индекса плодовитости. Сперматогонии семенников неполовозрелых животных менее подвержены токсическому воздействию препарата по сравнению с таковыми у крыс репродуктивного возраста.

5. Потомство интактных самок и самцов, получавших паклитаксел за I, 3 и 6 мес до спаривания, характеризуется повышенной частотой встречаемости патологических нарушений у плодов и крысят, которая зависит от срока спаривания после цитостатического воздействия. Наибольшее их число выявляется в потомстве интактных самок и самцов, получавших препарат за 3 мес до зачатия.

6. Введение антиоксиданта тиофана крысам-самцам, получавшим паклитаксел, улучшает фертилизующие свойства эякулята в ранние и отдаленные сроки после цитостатического воздействия, но не оказывает влияния на источник пролиферативного пула сперматогенеза и его продуктивность.

7. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является эффективным средством восстановления источников пролиферативного пула сперматогенеза при введении паклитаксела. Через 2 и 3 мес в группе животных, получавших комбинированное лечение, продуктивность сперматогенеза, функциональная активность сперматозоидов превышают таковые при введении одного цитостатика.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Румпель, O.A. Морфологическое и функциональное состояние зрелых мужских половых клеток после введения паклитаксела / O.A. Румпель, A.B. Пахомова, A.B. Перова // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - Приложение Xsl.-С. 112-113.

2. Гольдберг, Е.Д. Отдаленные последствия репродуктивной токсичности цитостатических препаратов и пути их снижения / Е.Д. Гольдберг, Т.Г. Боровская, A.B. Пахомова, A.B. Перова, М.Е. Полуэктова, O.A. Румпель, В.Е. Гольдберг // 3-й съезд токсикологов России (Тезисы докладов). - Москва, 2008. - С. 84-86.

3. Румпель, O.A. Отдаленные последствия цитостатических воздействий на репродуктивную систему крыс-самцов и механизмы их развития / O.A. Румпель,

В. Пахомова, А.В. Иег ова // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. -риложение Ш2. - С. 142-143.

4. Боровская, Т.Г. Влияние паклитаксела на репродуктивную систему крыс-мцов / Т.Г. Боровская, О.А. Румпель, А.В. Пахом она, А.В. Перова, В.Е. Гольдберг// )ссийский биотерапевтический журнал. - 2009. - №2. - С. 8.

5. Румпель, О.А. Отдаленные эффекты паклитаксела на мужскую продуктивную систему / О.А. Румпель //' Сибирский онкологический журнал. -109. - Приложение .N»1. - С. 165-167.

6. Боровская, Т.Г. Состояние сперматогенеза крыс после введения ютивоопухолевого препарата паклитаксела / Т.Г. Коровская, В.Е. Гольдберг,

A. Румпель, А.В. Пахомова, А.В. Перова, Е,Д. Гольдберг // Бюллетень спериментальной биологии и медицины - 2009. - Т. 147, №6. — С. 655-658.

7. Боровская, Т.Г. Влияние таксаисодержащнх цитоетатичсских препаратов на itomctbo / Т.Г. Боровская, В.Е. Гольдберг, О.Л. Румпель, А.В. Перова, А.В. 1хомова, М.Е. Полуэкгоиа // Вестник РАМН. - 2009. - ■ № 11. - С. 26-30.

8. Румпель, О.А. Коррекция нарушений генеративной функции семенников ыс, вызванных цитостатическим воздействием / О.А. Румпель, А.В. Пахомова,

B. Вычужанина // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - Приложение №1. -86.

9. Боровская, Т.Г. Отдаленные последствия цитостатических препаратов зных групп на репродуктивную функцию и пути их снижения / Т.Г. Боровская, В.Е.

ольдберг, М.Е. Полуэктова, А.В. Пахомова, Ю.А. Щемерова, А.В. Перова, О.А. мпель // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9,№2. - С. 64-65.

10. Borovskaya, T.G. The remote consequences of cytostatic preparations of different )ups on spermatogenesis and ways of their decrease / T.G. Borovskaya, V.E. Goldberg, E. Poluektova, A.V. Pahomova, Y.A. Chemerova, A.V. Vychuzhanina, O.A. Rumpel // istracts of the 5th Congress of the World Association of Reproductive Medicine. -jscow, 2010. -P. 592.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ДЛМ - доминантные летальные мутации

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИТА - ингибиторы топоизомеразной активности

МПД - максимально переносимая доза

ОКС - общее количество сперматозоидов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания

ФСГ — фолликулостимулирующий гормон

ЦНС - центральная нервная система

Подписано к печати 16.11.2010. Тираж 100 экз. Кол-во стр. 24. Заказ №43-10 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO Отпечатано в типографии ООО «РауШмбх» Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54