Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение овариотоксических эффектов противоопухолевых препаратов растительного происхождения и пути их снижения

На правах рукописи

ПЕРОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

КСПЕРИМЕНТАЛЫЮЕ ИЗУЧЕНИЕ ОВАРИОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ПУТИ ИХ СНИЖЕНИЯ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология 03.00 13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2007

003060781

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

заслуженный деятель науки РФ Гольдберг Евгений Данилович

доктор биологических наук Боровская Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Зуева Елена Петровна

кандидат медицинских наук, доцент Кириенкова Елена Витальевна

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится "_" _2007г в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001 031.01 в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан "_" _2007г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Амосова Е Н

Актуальность проблемы В настоящее время существуют различные приоритеты при лечении больных со злокачественными новообразованиями [Урманичева А Ф, Кутушева Г Ф, 2002] Для пациентов с высокими показателями безрецидивной выживаемости первоначально главным является качество жизни после проведенного лечения Количество таких пациентов в последние годы неуклонно возрастает [Шилин Е Д, Игнашина Е В , 1999, Зенкова Е В , 2004] Состояние репродуктивной функции является важным фактором их жизни [Kanazawa К, Suzuki Т, Sakumoto К, 2000, Gaffan N, Holden L, Newlands ES et al, 2003, Gugg A , 2004]

Практически для каждого онкологического больного на определенном этапе его заболевания обсуждается вопрос об использовании химиотерапии [Переводчикова Н И, 2005] Повреждение женских половых желез ввиду постоянной смены морфологических структур, связанной как с развитием половых клеток, так и формированием эндокринной функции, является закономерным следствием любого вида цитостатического воздействия [Гершанович М JI, Филов В А , Акимов М А и др , 1999] В то же время, учитывая различные механизмы действия препаратов, их гонадотоксические эффекты могут значительно отличаться по степени выраженности и иметь ряд характерных особенностей [Гольдберг Е Д, Боровская Т Г, 2003] Изучение овариотоксических эффектов антибластомных средств разных групп позволяет прогнозировать сроки наступления ранней менопаузы, использование менее токсичных в этом плане препаратов могло бы сократить сроки ее наступления и значительно улучшить качество жизни пациенток

До недавнего времени изучению овариотоксических эффектов не уделялось достаточного внимания, первостепенной являлась оценка побочных эффектов антибластомных средств, лимитирующих их применение В последние годы изучение овариальной дисфункции становится приоритетным [Шилин Е Д, Игнашина Е В , 1999, Kanazawa К, Suzuki Т, Sakumoto К , 2000, Gaffan N , Holden L , Newlands ES et al, 2003, Gngg A, 2004, Davis AL, Klitus M, Mmtzer DM, 2005], что связано с обнадеживающими результатами лечения злокачественных заболеваний целого ряда локализаций, в том числе, и женской репродуктивной сферы Актуальным становится выяснение вопроса о возможности наступления беременности, а также появления полноценного потомства после завершенного лечения Обращает на себя внимание факт, что в клинике и эксперименте проводится активное изучение возможности снижения овариальной токсичности [Bokser L , Szende В , Schally А , 1990, Шилин Е Д, Игнашина

В настоящее время достаточно хорошо изучены овариотоксические эффекты апкилирующих соединений, платиносодержащих препаратов, антрациклиновых антибиотиков [Боровская Т Г , Пахомова А В , 2003, Боровская Т Г , Полуэктова М Е , 2004] Менее исследованными в этом плане являются антибластомные средства растительного происхождения этопозид и паклитаксел Последние относятся к средствами прямого действия на цитоплазматические и ядерные мишени [Гершанович М JI, Филов В А, Акимов М А и др, 1999] Этопозид является ингибитором топоизомеразной активности, паклитаксел индуцирует сборку дефектных микротрубочек Этопозид используется в клинической практике уже более 20 лет при лечении широкого спектра опухолей, в том числе, и органов женской репродуктивной системы [Махнова Е В, 2003, Мещерякова Н Г, 2004] Паклитаксел вошел в онкологическую практику в 90-е годы прошлого века Использование таксанов при раке молочной железы позволяет ежегодно сохранять жизнь десяткам тысяч женщин [Фисенко В П , 2000] В настоящее время показана высокая эффективность паклитаксела при лечении опухолей других локализаций [Бессмельцев С С , 2003, Блюменберг А Г ,

ЕВ, 1999]

2003, Ганьшина И П , Сельчук В Ю , 2004, Островская JIА , Корман Д Б , Фомина М М , 2007] Обнадеживающие результаты лечения, наблюдаемые на фоне использования этопозида, паклитаксела, обусловили появление ряда работ, как в клинике, так и в эксперименте, посвященных изучению их овариотоксичности [Takahashi N, Kai S , Kohmura H et al ,1986, Kai S , Kohmura H, Hiraiwa E et al, 1994, Yucebilgin M S , Terek M С , Ozsaran А , 2004], однако они носят, в основном, фрагментарный характер

Из числа быстро обновляющихся клеточных систем организма, к которым относятся гемопоэтическая ткань, кишечный эпителий, волосяные фолликулы, а также ткани половых желез, в том числе овариальных, последние являются системой, временная остановка которой вполне допустима Подавление ее активности может экранировать яичники от действия цитостатических препаратов С этой целью рекомендуется использование эстроген-гестогенных препаратов и гипоталамических регуляторов функции гипофиза [Chapman R М , 1989, Шилин Е Д , Игнашина Е В , 1999, Зенкова Е В, 2004] Однако вопрос о выборе препарата, наиболее подходящего для овариопротекции, является в настоящее время нерешенным [Шилин Е Д, Игнашина Б В , 1999, Grigg А, 2004]

Цель исследования: изучить характер, глубину и продолжительность нарушений репродуктивной системы крыс-самок после действия противоопухолевых препаратов этопозида и паклитаксела Провести поиск оптимальных способов снижения их овариотоксичности

Задачи исследования-

1 Изучить характер, глубину, продолжительность морфологических и функциональных изменений репродуктивной системы крыс-самок в ранние и в отдаленные сроки после введения этопозида и паклитаксела

2 Выявить индивидуальные особенности повреждающего действия этопозида и паклитаксела на репродуктивную систему крыс-самок

3 Изучить степень реализации овариотоксических эффектов препаратов в анте- и постнатальном развитии потомства, при скрещивании крыс-самок в отдаленные сроки после цитостатического воздействия Определить влияние на потомство таких факторов, как вид цитостатического воздействия и сроки скрещивания после введения препаратов

4 Провести сравнительную оценку защитных свойств на яичники гормональных овариопротекторов

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые с помощью современных методов исследования проведено экспериментальное изучение морфологического и функционального состояния женской репродуктивной системы в ранние и отдаленные сроки после однократного внутривенного введения в максимально переносимой дозе (МПД) этопозида и паклитаксела Принципиальную новизну представляют данные, касающиеся характера и глубины выявленных нарушений, влияния препаратов на потомство Результаты экспериментальных исследований позволяют прогнозировать возможность восстановления женской репродуктивной функции после использования этих препаратов Практическую значимость представляют данные о влиянии этопозида и паклитаксела на состояние потомства Показано, что при выборе оптимального срока скрещивания можно снизить токсическое действие на потомство В работе впервые проведена сравнительная количественная оценка овариопротекторов гормонального происхождения

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004), «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической

фармакологии» (Томск, 2006), «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва 2007) Материалы были представлены на II Всесоюзном съезде научного общества фармакологов (Москва, 2003), сессии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 2003)

Публикации- По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 8 — в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы Работа иллюстрирована 15 рисунками и 32 таблицами Библиографический указатель включает 227 литературных источников, из них 115 отечественных и 112 иностранных

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на белых беспородных крысах в количестве 470 самок массой 200-250 г в возрасте 2,5 мес Содержание крыс осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986)

Противоопухолевые препараты - вепезид (этопозид, Teva, Израиль) и паклитаксел (митотакс, Dr Reddy s, Индия) вводили животным однократно внутривенно в МПД Дозы препаратов были рассчитаны методом графического пробит-анализа при наблюдении за животными в течение 30 дней [Беленький М М, 1963] За величину МПД принимали дозу на пробитной сетке, вызывающую 5% гибель животных, которая оказалась равной для этопозида - 30 мг/кг и для паклитаксела - 4,6 мг/кг Контрольные животные получали эквиобъемное количество растворителя В качестве овариопротекторов были использованы препараты логест (Шеринг CA, Франция) и бусерелин (ЗАО «Фарм - синтез») Логест вводился внутрижелудочно в дозе 0,004 мг/кг за 1 сут до и в течение 5 сут после введения этопозида, бусерелин - однократно внутримышечно, за 5 суток до цитостатического воздействия, в дозе 5 мкг на 200 г массы животного При определении доз овариопротекторов ориентировались на терапевтические дозы, используемые в клинике Изучение морфологического и функционального состояния репродуктивной системы крыс проводили в ранние и отдаленные сроки после введения препаратов Сроки исследования состояния потомства плоды - на 20-й день беременности, крысята - в течение 2-х месяцев после рождения

Функциональное состояние репродуктивной системы самок изучали с 1-10, 30-40, 90-100, 100-180 сут (учитывая сроки созревания фолликулов, это соответствует воздействию на зрелые, двух- и многослойные, примордиальные фолликулы после введения противоопухолевых препаратов) путем оценки плодовитости животных и показателей эмбриональной гибели [Лепехин Н П, Палыга Г Ф, 1994] Для этого животных опытной и контрольной групп (по 15-20 самок на каждый срок эксперимента) ссаживали с интактными самцами в соотношении 2 самки 1 самец в течение 10 дней (продолжительность двух эстрапьных циклов) Спаривание регистрировали с помощью вагинальных мазков Для оценки плодовитости вычисляли

число оплодотворенных самок

индекс плодовитости = х 100%

число самок, ссаженных с самцами

число беременных самок

индекс беременности = - х100%

число оплодотворенных самок

Часть крыс-самок забивали на 20-й день беременности методом смещения шейных позвонков, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» Крыс-самок вскрывали, подсчитывали количество желтых тел в яичниках и мест имплантации в матке, число живых и мертвых плодов (из расчета на 1 самку) Показатели пре- и постимплантационной смертности вычисляли по формулам

кол-во желтых тел - кол-во мест имплантации

преимплантационная =- х100%

смертность количество желтых тел

кол-во мест имплантации - кол-во живых плодов

постимплантационная =-х 100%

смертность количество мест имплантации

Гормональную активность яичников оценивали путем исследования продолжительности каждой из фаз эстрального цикла, изучая вагинальные мазки [Смольникова H M и др, 2005] Работу с животными начинали после адаптации и установления у них регулярных астральных циклов

Для исследования морфологических изменений в яичниках цитостатические препараты вводили крысам-самкам, находящимся в стадии проэструс Самок забивали в стадии эструс на протяжении первого месяца после введения препаратов и на 30-35, 9095 и 180-185 дни эксперимента (по 5 животных на каждый срок опыта) Животных вскрывали, извлекали яичники, фиксировали их в жидкости Карнуа Серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином На срезах яичников подсчитывали количество фолликулов примордиальных, с двумя и более слоями гранулезных клеток, зрелых (граафовы пузырьки) и атретических, число желтых тел и общее число генеративных элементов Подсчет проводили по всей поверхности среза (фолликулы примордиальные учитывали в каждом 2-м срезе, результат умножали на 10, фолликулы зрелые и с двумя и более слоями гранулезных клеток, атретические фолликулы - в каждом 5-м срезе и умножали на 5, желтые тела - в срединном срезе) При количественной оценке микроструктуры яичника фиксировали только фолликулы, яйцеклетка которых содержала ядро и ядрышко [Смольникова H M и др, 2005]

Для цитогенетического анализа крысы-самца (потомство самок, получавших этопозид за 1 мес до скрещивания) использовались клетки костного мозга крыс Препараты готовились по методике Форда [Ford С , Hamerton J , 1956]

Оценка состояния потомства производилась у крыс-самок, получавших цитостатические препараты за 1, 3 и б мес до спаривания Для изучения состояния

потомства в антенатальном периоде развития плоды, извлеченные на 20-й день беременности, взвешивали, проводили внешний осмотр и определяли их кранио-каудальный размер После этого часть плодов помещали в раствор Боуэна для фиксации и последующего исследования состояния внутренних органов по методу Вильсона в модификации А П Дыбана Оставшуюся часть плодов фиксировали в 96 % спирте и окрашивали по методу Доусона в модификации А П Дыбана с целью оценки процессов оссификации [Дыбан А П , Баранов В С , Акимова И М , 1970]

Часть беременных самок (5-6 крыс) оставляли до родов для изучения состояния потомства в постнатальном периоде развития Фиксировали продолжительность беременности и день родов Индекс выживаемости вычисляли как отношение числа крысят, выживших на 4, 7, 14 и 21-е сут, к числу родившихся живыми х 100 % [Диннерман А А, 1980] Для оценки физического развития потомства исследовали динамику их массы, устанавливали сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезания резцов, открытия глаз, опускания семенников и открытия влагалища На 5-й и 15-й дни жизни изучали двигательную активность и формирование сенсорно-двигательных рефлексов по тестам «переворачивание на плоскости», «избегание края», способность удерживаться на горизонтальной веревочке [Смольникова Н М и др, 2005] В месячном возрасте наблюдали ориентировочно-исследовательское поведение в условиях "открытого поля" [Вихляева Ю И , 1982] На 60-й день жизни у крысят оценивали способность к обучению в тесте "условный рефлекс пассивного избегания" [Балынина Е С , Тимофеевская Л А , 1978] и способность к адаптивному поведению методом избегания стресс-ситуации по Хандерсону в модификации Н А Бондаренко [Бондаренко Н А, 1986]

Для проведения статистической обработки полученного экспериментального материала производили подсчет среднего значения параметра и стандартной ошибки отклонения Значимость различий определяли по непараметрическим критериям Вилкоксона - Манна - Уитни и угловому преобразованию Фишера Значимость различий считали достоверной при Р<0,05 [Лакин Г Ф , 1990]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении влияния этопозида на женскую репродуктивную систему было установлено, что в ранние сроки после его введения в яичниках крыс наблюдался интерстициальный отек, полнокровие сосудов Клетки фолликулярного эпителия, текальных оболочек, желтых тел набухали, границы между ними были видны неотчетливо В клетках гранулезы выявлялся кариорексис и кариопикноз В ряде случаев примордиальные фолликулы оказались представлены только яйцеклеткой Отмеченные изменения были наиболее выражены в течение первой недели после введения препарата В последующие сроки наблюдения они выявлялись в меньшей степени, но, в то же время, наблюдалось образование фолликулярных кист

Количественный подсчет структурно-функциональных элементов яичников показал, что в течение 30 сут после введения этопозида наблюдалось значительное сокращение пула примордиальных фолликулов (рис 1, А) Так, их число через 1 сут после начала эксперимента составило всего 20% от контроля Отмеченный эффект может быть следствием как гибели клеток фолликулярного эпителия, так и дегенеративных изменений яйцеклеток [Волкова О В , 1980] В последующие сроки наблюдения, вплоть до 30 сут опыта, количество примордиальных фолликулов несколько возрастало, но было снижено в 2 раза по сравнению с контролем Возрастание этого показателя, очевидно, связано с образованием новых примордиальных фолликулов, так как у крыс

процесс их формирования завершается к трехмесячному возрасту [Мопоуа-То<Зогоуа К, ВакоШа-НеБЬеуа М, ЗЬпбЮу , 1989] Количество двух- и многослойных фолликулов уменьшалось (в 1,8 раза) уже в первые сутки после введения этопозида (1-й эструс) и оставалось сниженным до конца опыта (рис 1, Б), что, очевидно, обусловлено сокращением пула примордиальных фолликулов, а не усилением атретических процессов, так как число последних не возрастало (Р<0,05)

Рис 1 Количество примордиальных фолликулов (а), двух- и многослойных фолликулов (б) в яичниках крыс в ранние и отдаленные сроки после введения этопозида в МПД Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

При подсчете числа граафовых пузырьков, желтых тел не выявлялось статистически значимого уменьшения этих показателей Общее количество генеративных элементов на фоне цитостатического воздействия было снижено во все исследуемые сроки (рис 2) Через 3, 6 мес после введения этопозида отмечалось снижение количества примордиальных фолликулов (до 64-68% от контрольных значений), двух- и многослойных фолликулов (до 58-59%), общего количества генеративных элементов (до 73-69%, рис 1,2)

—о— контроль —■— этопозид

Рис 2 Общее количество генеративных элементов в яичниках крыс в ранние и отдаленные сроки после введения этопозида в МПД Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

Изучение клеточного состава вагинальных мазков показало, что введение этопозида приводило к более позднему, чем в контроле, наступлению фазы эструс у 25% животных Общая продолжительность эстрального цикла достоверно возрастала у всех

животных этой группы во втором цикле после начала опыта (до 135,8±13,45 ч, в контроле - 104,33+1,87 ч, при Р<0,05) При анализе длительности отдельных фаз эстрального цикла было выявлено, что стадия эструс сокращалась, метаэструс -возрастала (рис 3) Впоследствии происходила нормализация изучаемых показателей Полученные данные подтверждают результаты клинических исследований С Choo Yew et al (1985), свидетельствующие о достаточно быстром восстановлении овариального цикла у женщин молодого возраста при монотерапии этопозидом [Choo Yew С , Ma Но К, Wong Long С et al, 1985, Matsui H , Seki К, Sekija S et al, 1997]

20

15

10

а

^¡шт * 5ЯШШ

1 2 3

Контроль

Этопозид

Контроль

Этопозид

Рис 3 Продолжительность стадии эструс (а), метаэструс (б) у крыс в ранние сроки после однократного введения в МПД этопозида (1, 2, 3 — очередность циклов после введения препарата) * — при Р<0,05

В ряде экспериментальных работ [Боровская Т Г, Гольдберг В Е и др, 2005] показано, что введение цитостатических препаратов вызывает, как правило, увеличение стадии диэструс Известно, что самые низкие значения уровня эстрадиола наблюдаются в фазе метаэструс [Бабичев В Н , 1986] Выраженное токсическое действие этопозида на созревающие фолликулы, судя по данным морфологического анализа, по-видимому, привело к резкому снижению уровня половых гормонов, следовательно, и к удлинению стадии метаэструс Способность к спариванию, несмотря на угнетение гормональной активности, не снижалось, что очевидно связано с быстрой нормализацией эстрального цикла

Эффективность спаривания крыс опытной группы в сроки, соответствующие воздействию на все исследуемые стадии созревания фолликулов, оказалась сходной с таковой в контроле (Р<0,05) Показатели эмбриональной гибели не отличались от контрольных значений при скрещивании крыс-самок через 1 и 3 мес после введения этопозида (рис 4) Возрастание пре- и постимплантационной смертности было выявлено при спаривании с 1-10 сут опыта, что соответствует воздействию на зрелые фолликулы, причем наиболее высокие значения этого показателя наблюдались через сутки после введения препарата, когда в яйцеклетках происходит активация мейотического деления

Высокие показатели постимплантационной гибели (82,98±5,75%, в контроле -9,75±6,16%) отмечались также при скрещивании через 6 мес после начала эксперимента

1-10

30-40

90-100 180-190 сут

Преовуляторные Двух- и Примордиальные

фолликулы многослойные фолликулы фолликулы

1-10

30-40

90-100 180-190 сут

Преовуляторные Двух- и Примордиальные

фолликулы многослойные фолликулы

фолликулы

Рис 4 Преимплантационная смертность (А), постимплантационная смертность (Б) у крыс-самок, получавших этопозид при скрещивании в сроки, соответствующие различным стадиям созревания фолликулов * - достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

При изучении влияния паклитаксела на состояние репродуктивной системы крыс-самок было установлено, что в течение первых дней опыта в яичниках крыс отмечались морфологические изменения, сходные по характеру с таковыми на фоне введения этопозида (интерстициальный отек, расширение сосудов, дистрофические и деструктивные изменения) В последующие сроки наблюдения они были выражены в меньшей степени, но наблюдалось усиление атретических процессов

При подсчете структурно-функциональных элементов яичников было установлено, что в ранние сроки после введения паклитаксела наблюдалось сокращение (до 53% от контроля) пула примордиапьных фолликулов (рис 5, А) Полученные данные согласуются с таковыми М Yucebigm et al (2004), свидетельствующими о высокой чувствительности примордиальных фолликулов к действию паклитаксела [Yucebilgin М S , Terek М С , Ozsaran А , 2004] Число двух- и многослойных фолликулов через 1 сут после цитостатического воздействия составило 86% от контроля (рис 5, Б) Этот показатель оставался сниженным до 30 сут опыта, что может быть результатом как сокращения пула примордиальных фолликулов, так и усиления атретических процессов В пользу последнего свидетельствует факт возрастания (в 1,3 раза) числа атретических фолликулов по сравнению с контролем (15, 30 сут, рис 6, А) Количество граафовых пузырьков и желтых тел в яичниках крыс сравниваемых групп было сходно, однако в опытной группе выявлялась тенденция к возрастанию числа желтых тел Общее количество генеративных элементов оказалось сниженным во все исследуемые сроки после введения препарата (рис 6, Б)

Через 3, 6 мес после введения паклитаксела количество примордиальных фолликулов оказалось сниженным до 68-70% от соответствующего контроля (рис 5, А) Достоверное снижение двух- и многослойных фолликулов и общего количества

генеративных элементов (до 68-76% соответственно) наблюдалось только через 6 мес после введения препарата Через 3 мес после цитостатического воздействия выявлялось

-о—контроль -«—пакпитаксел

Рис 5 Количество примордиальных фолликулов (А), двух- и многослойных фолликулов (Б) в яичниках крыс в ранние и отдаленные сроки после введения паклитаксела в МПД Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

А Б

-о—контроль -■- пакпитаксел суг

Рис 6 Количество атретических фолликулов (А), содержание общего количества структурно-функциональных элементов (Б) в яичниках крыс в ранние и отдаленные сроки после введения паклитаксела в МПД Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

возрастание количества атретических фолликулов (до 65% от контрольных значений, рис 6, А) Количество граафовых пузырьков и желтых тел в отдаленные сроки наблюдения не отличались от контрольных значений

Исследование эстрального цикла крыс выявило, что у 20% крыс, получавших пакпитаксел, наступление стадии эструс задерживалось на 2 дня Дальнейшее изучение вагинальных мазков показало, что у всех животных, получавших препарат, продолжительность первого, второго и третьего циклов после введения препарата возрастала (в 1,6-2,3 раза, рис 7 А) за счет увеличения (в 2-3 раза) стадии диэструс (рис 7, Б) Следует отметить, что у некоторых самок состояние диэструса развивалось на протяжении более чем 13 суток Впоследствии происходило постепенное восстановление нормальной длительности эстрального цикла, но у 50% крыс-самок стадия диэструс была увеличена вплоть до 6-го цикла после введения препарата Индекс

Рис 7 Продолжительность астрального цикла (А) и стадии диэструс у крыс в ранние сроки после однократного введения в МПД паклитаксела (1, 2, 3 - очередность циклов после введения препарата) * - различия достоверны при Р<0,05

плодовитости крыс-самок при скрещивании с 1-10, 30-40 сут, а также через 3, 6 мес после начала опыта оставался на уровне контрольных значений Снижение этого показателя выявлялось с 10-20-й день опыта, что, очевидно, является следствием увеличения длительности эстрального цикла за счет стадии покоя

У крыс-самок, получавших паклитаксел, во все исследуемые сроки не выявлялось снижения эффективности спаривания Однако вероятность сохранения беременности, судя по показателям эмбриональной гибели, оказывалась сниженной Наиболее значительное ее возрастание было отмечено в сроки, соответствующие воздействию на зрелые и преовуляторные фолликулы (скрещивание с 1-10 сут опыта, рис 8) Повышение антенатальной гибели отмечается при длительном введении паклитаксела крысам в низких дозах [Kai S , Kohmura Н, Hiraiwa Е et al, 1994] Следует отметить, что для определения показателей эмбриональной смертности у крыс-самок производился подсчет числа желтых тел

А Б

1-10

30-40

Преовуляторные Двух- и Примордиальные

фолликулы многослойные фолликулы фолликулы

Преовуляторные Двух- и фолликулы многослойные фолликулы

90-100 180-190 сут

Примордиальные фолликулы

Рис 8 Преимплантационная смертность (А), постимплантационная смертность (Б) у крыс-самок, получавших паклитаксел при скрещивании в сроки, соответствующие различным стадиям созревания фолликулов * - достоверные различия по сравнению с контролем, при Р<0,05

Этот показатель через 1 мес после введения паклитаксела достоверно возрастал до 14,63±0,43% (в контроле — 10,69+0,51%, Р<0,05) Тенденция к его увеличению была выявлена и при морфологическом анализе Отмеченный эффект может быть, по-видимому, следствием стимуляции овуляторных процессов и свидетельствует о повышении гонадотропной функции гипофиза в ответ на угнетение гормональной активности овариальных желез, вызванное введением препарата

Анализ полученных данных показывает, что препараты растительного происхождения - этопозид, паклитаксел - несмотря на различный механизм их цитостатического действия, вызывали сходные по характеру овариотоксические эффекты, выявляемые при введении антибластомных средств других групп (алкилирующих соединений, антиметаболитов, платиноидов, антрациклиновых антибиотиков) [Арсеньева А М , Бакунина Э Д , 1967, Савицкий Г А, Иванова Р Д и др , 1977, Боровская Т Г, Смирнова М Е , Гольдберг Е Д , 1997, Гольдберг Е Д, Боровская Т Г , 2000, Боровская Т Г, Пахомова А В , 2002] Различия в повреждающем действии исследуемых цитостатических средств на морфологическое состояние яичников заключались в неодинаковой чувствительности их отдельных структурно-функциональных элементов к действию каждого из них Характерной чертой действия этопозида явилось значительное сокращение пула примордиальных фолликулов Введение паклитаксела, в отличие от этопозида, приводило к усилению атретических процессов Известно, что атретические процессы в яичнике значительно усиливаются при нарушении нервной регуляции их функции [Волкова О В , 1980] Нельзя исключить, что особенность действия паклитаксела на яичники связана с его выраженной нейротоксичностью, которая, очевидно, обусловлена способностью препарата оказывать токсическое действие на систему микротрубочек, что может привести к нарушению транспорта веществ в аксонах нервных клеток [Быков В Л, 1999]

Сокращение числа генеративных элементов является необратимым компонентом повреждения яичников и приводит к раннему истощению их резервных возможностей При этом индивидуальные особенности структурных повреждений яичников выходят, по-видимому, на второй план Данные клинических наблюдений свидетельствуют о том, что наступление ранней менопаузы у женщин, перенесших цитостатическую химиотерапию, происходит в среднем на 3 года раньше, чем в обычной популяции [Bower М , Rustm G J , Newlands ES et al, 1998] Судя по числу примордиальных, двух-и многослойных фолликулов, общему количеству генеративных элементов через 6 мес после введения препаратов, степень истощения овариальных желез была выражена в одинаковой степени при введении как этопозида, так и паклитаксела Сопоставляя полученные данные с таковыми у крыс, которым вводили эквивалентные дозы цитостатических препаратов других групп [Арсеньева А М, Бакунина Э Д, Головкина JIB и др, 1967, Гольдберг ЕД, Боровская ТГ, 2000], следует отметить, что сокращение репродуктивного периода при использовании этопозида и паклитаксела, очевидно, будет менее значительным, чем при введении антрациклиновых антибиотиков, антиметаболитов, алкилирующих соединений, и сопоставимо с таковым на фоне использования платиноидов

Данные клинических и экспериментальных наблюдений свидетельствуют о том, что структурные повреждения в яичниках сопровождаются угнетением их гормональной активности Клинический опыт показывает, что частота и длительность менопаузы после цитостатической химиотерапии у женщин зависит от типа проводимой химиотерапии [Montoya F, Menjon S , 1993, Зенкова Е В , 2004] Биологическим тестом для оценки гормонального состояния половых желез крыс является клеточный состав вагинального содержимого [Агаджанян НА, Радыш ИВ, 1998] По данным ГА Савицкого,

однократное введение антагониста фолиевой кислоты (метотрексата) в МПД индуцирует наступление длительной (продолжительностью до 35 дней) стадии покоя (диэструс) [Савицкий ГА, Иванова РД и др, 1977] Менее выраженное увеличение продолжительности диэструса наблюдалось при введении в МПД платиносодержащих препаратов и антрациклиновых антибиотиков [Смирнова М Е, 1997, Боровская Т Г, Гольдберг BE и др , 2004, Пахомова А В , 2004] Анализ изучения вагинальных мазков у крыс, получавших исследуемые препараты в МПД, показывает, что в первые дни эксперимента у 20-25% животных обеих опытных групп происходило нарушение фазовой структуры цикла Наступление фазы эструс задерживалось, что может быть связано с токсическим действием препаратов на гипоталамо-гипофизарную систему Изучение длительности астрального цикла показало, что у крыс, получавших препараты, наблюдалось его возрастание На фоне введения паклитаксела увеличивалась продолжительность стадии диэструс, этопозида — стадии метаэструс Последнее свидетельствует о том, что угнетение гормональной активности при введении этопозида было более выраженным В то же время, при изучении продолжительности проявления этого токсического эффекта оказалось, что на фоне введения этопозида нормализация гормональной активности происходит быстрее, чем при использовании паклитаксела Угнетение гормональной активности яичников крыс, получавших препараты, носило обратимый характер, снижения способности к спариванию, как правило, не наблюдалось Возможность наступления беременности также сохранялась как в ранние, так и отдаленные сроки после их введения Однако, судя по показателям эмбриональной смертности (рис 8), вероятность сохранения беременности оказалась сниженной как на фоне этопозида, так и паклитаксела Полученные в эксперименте результаты согласуются с данными клинических наблюдений о случаях самопроизвольного прерывания беременности у женщин, перенесших цитостатическую химиотерапию, включающую как этопозид, так и паклитаксел [Schilder J М , Thompson AM et al, 2002, Dobson 1S, Llorigan P S , Coleman RE et al, 2000] Повышение эмбриональной смертности может быть связано как с повреждающим действием (в том числе, и мутагенным) на созревающие яйцеклетки, а также на материнский организм Не исключено, что препараты, угнетая гормональную активность яичников, могут привести к нарушению функционального состояния эндометрия Особенно высокие показатели эмбриональной гибели отмечались в течение первых суток после введения препаратов, что соответствует воздействию на овулирующие фолликулы, в яйцеклетках которых происходит активация мейотического деления При введении паклитаксела этот токсический эффект наблюдался во все исследуемые сроки Однако отличительной особенностью состояния репродуктивной системы крыс-самок, получавших этопозид, явилось значительное увеличение эмбриональной смертности через 6 мес после введения препарата

В литературе, наряду с фактами о самопроизвольном прерывании беременности, описаны многочисленные случаи рождения детей у пациенток в отдаленные сроки после использования схем лечения, включающих этопозид и паклитаксел [Seiden М V , Spitzer TR, Fuller AT et al, 2001, Schilder JM, Thompson AM, De Priest PD et al, 2002, Gaffan N , Holden L , Newlands ES et al, 2003, Ramirez Torres N , Basavilvazo Rodriguez MA et al, 2004, Boran N , Tulunay G, Cahskan E, 2005] В то же время, известно, что все исследуемые препараты являются заведомо генотоксическими соединениями и оказывают мутагенное воздействие, в том числе, на половые клетки [Дурнев А Д, Середенин С Б, 1999] Безусловный интерес представляет собой выяснение вопроса о

реализации овариотоксических эффектов (мутагенного действия на созревающие яйцеклетки) исследуемых препаратов в анте- и постнатальном развитии у потомства

При изучении состояния потомства самок, которым вводили этопозид за 1,3,6 мес до скрещивания, внешних аномалий развития при рождении не выявлялось, но во всех опытных группах возрастало количество плодов с наружными кровоизлияниями (на 2266%, Р<0,05 по сравнению с контролем, таблица) Существенно увеличивалось также число плодов с патологическими изменениями внутренних органов Преимущественно выявлялись кровоизлияния в различные органы и ткани, гемоперикард, гидроцефалия, застойные явления в печени, нефроптоз Число плодов с этими формами патологических изменений возрастало на 26-63% (Р<0,05) по сравнению с контролем Задержка процессов оссификации была обнаружена также во всех опытных группах В значительной степени этот токсический эффект был отмечен у потомства самок, полученного через 6 мес после введения препарата Так, количество плодов с незавершенным формированием костей черепа в этой группе составило 100% (в контроле - 33%, Р<0,05) Динамика массы тела крысят опытных и контрольных групп оказалась сходной Исключение составила одна особь (самец), масса тела которой в двухмесячном возрасте была снижена до 38 г (более, чем в 4 раза по сравнению с контролем), что может быть результатом хромосомной мутации Для проверки этой гипотезы была приготовлена метафазная пластинка по методу Форда (окраска азур-эозином), проведено кариотипирование Оказалось, что хромосомный набор этой особи соответствует нормальному Следует отметить, что карликовость может быть следствием не только хромосомной мутации, но и проявлением гипофизарно-церебрального нанизма, т е результатом генной мутации, приводящей к недостаточной выработке гормона роста и гонадотропного гормона В пользу этого свидетельствует выявленное нами при гистологических исследованиях семенников этого животного их значительное недоразвитие В потомстве, полученном через 6 мес после начала опыта, наблюдалось снижение индекса выживаемости до 45% (в контроле - 96%), задержка открытия глаз, опускания семенников (на 2-3 дня) У животных этой группы отмечалось также существенное снижение мышечного тонуса, скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов Так, на 5-й день жизни процент подтягивающихся животных в этой группе составил 30% (в контроле - 100%, Р<0,05), рефлекс «избегания обрыва» сформировался у 20% крысят (в контроле - 76%, Р<0,05), рефлекс «переворачивания на плоскости» - у 77% крысят (в контроле - 100%, Р<0,05) В условиях «открытого поля» крысята всех опытных групп отличались от контрольных по большинству фиксируемых показателей Наиболее значительные изменения выявлялись в потомстве самок, получавших препарат за 3 мес до скрещивания У крысят этой группы была снижена (в 2 раза) горизонтальная, вертикальная двигательная активность, отмечалось угнетение «норкового» рефлекса, эмоциональной реакции В тесте УРПИ у всех крысят-самок опытных групп время нахождения в светлой камере во 2-й день опыта оказалось сниженным (Р<0,05) При изучении адаптивного поведения было показано, что 80-85% крысят в опыте (в контроле - 100%, Р<0,05) обладали способностью избегать стресс-ситуацию

Таблица

Патологические изменения жизнеспособного потомства крыс-самок, скрещенных через 1, 3 и 6 мес после введения цитостатических препаратов

Пт

+ (0,5)

+ 0)

+ (0,5)

+ 0) ++(6)

+ 0) + 0)

+ 0)

+ (0,5) + (0,5) ++(1)

14

Примечание

«-» - отсутствие токсического эффекта по тестируемому показателю, «+», «++» - различная степень выраженности токсического эффекта «Э» — этопозид, «Пт» - паклитаксел,

1, 3, 6 - срок после скрещивания препаратов, в круглых скобках - условные единицы оценки токсического эффекта

При изучении состояния потомства самок, которым вводили паклитаксел за 1, 3, 6 мес до скрещивания (таблица), внешних аномалий развития при рождении не выявлялось, но у самок, получавших паклитаксел за 3 мес до скрещивания, все исследуемые плоды характеризовались наличием наружных кровоизлияний, в то время как в контроле их число составляло 33% В других опытных группах этот показатель находился в пределах 66-82% (в контроле - 35-44% Р<0,05) В потомстве опытных групп возрастало (на 8-20%, Р<0,05) число плодов с патологическими изменениями внутренних органов (гидронефрозом, тимомегалией, нефроптозом) Наблюдалось также торможение

1 мес

3 мес

6 м

Показатель

Пт

Пт

Наружные кровоизлияния

(1)

+ (0,5)

+ (0,5)

(1)

(0,5)

Внешние аномалии

+ (1)

Патологические изменения внутренних органов_

(2)

+ 0)

(2)

(1)

(2)

Состояние процессов оссификации

+ (0,5)

(1)

+ (0,5)

(1)

++(1)

Динамика массы тела

+ (1)

+ (0,5)

Индекс выживаемости

(3)

+ (3)

Физическое развитие

+ 0)

+ (0,5)

(1)

Мышечный тонус

+ (1)

+ (1)

+ (0,5)

(2)

Рефлексы «переворачивания на плоскости» и «избегания обрыва»

+ 0)

(1)

(0,5)

(2)

Поведение в условиях «открытого поля»

(0,5)

О)

(1)

(0,5)

Способность к обучению

(0,5)

+ (0,5)

(0,5)

+ (0,5)

+ (0,5)

Адаптивное поведение

+ (0,5)

+ (0,5)

+ (0,5)

+ (0,5)

+ (0,5)

Суммарная оценка токсического эффекта_

10,5

13

процесса окостенения плодов, в значительной степени это касалось костей грудины и черепа Так, замедление оссификации последнего в опыте отмечалось у 54-83% (Р<0,05) плодов (в контроле - 13-27%) Этот токсический эффект был наиболее выражен в потомстве крыс, скрещенных через 1 и 3 мес после введения паклитаксела Масса тела крысят опытных групп на 4, 7, 14-й дни жизни оказалась достоверно ниже по сравнению с контролем В потомстве самок, полученном через 6 мес после начала опыта, отмечено значительное снижение индекса выживаемости (до 29%, в контроле - 90%, Р<0,05) Пониженная жизнеспособность наблюдалась также при введении препарата за 1 мес до зачатия Крысята всех опытных групп отставали от контрольных по скорости физического развития, формированию сенсорно-двигательных рефлексов, имели пониженный мышечный тонус Так, отлипание ушных раковин, прорезание резцов, происходило у них на 1-2 дня позднее, опускание семенников задерживалось на 3-4 дня, открытие влагалища - 4-12 дней Рефлекс «избегания обрыва» на 5-й день жизни был сформирован у 8-49% (Р<0,05) крысят (в контроле - 62-81%) Время выполнения рефлекса «переворачивания на плоскости» превышало таковое в контроле в 2-4 раза Время удерживания на горизонтальной веревочке было сокращено в 1,5-2 раза по сравнению с контролем В условиях «отрытого поля» у крысят опытных групп (препарат вводили за 3 и 6 мес до скрещивания) выявлялось достоверное угнетение горизонтальной и вертикальной двигательной активности, «норкового» рефлекса Этот токсический эффект был выражен в меньшей степени при скрещивании в наиболее отдаленные сроки после введения препарата У крысят экспериментальных групп отмечалось снижение времени пребывания в светлой камере во 2-й день опыта (тест УРПИ, Р<0,05), 20-50% из них не обладали способностью к избеганию стресс-ситуации (тест Хандерсона, Р<0,05), в то время как в контроле все животные подныривали под край внутреннего цилиндра У животных, способных к адаптивному поведению, время выполнения безусловного рефлекса было достоверно увеличено по сравнению с контролем Наиболее существенное его возрастание выявлялось в потомстве самок, скрещенных через 6 мес после цитостатического воздействия

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что патологические изменения у потомства крыс, перенесших воздействие как этопозида, так и паклитаксела, встречаются с достаточно высокой частотой, причем характер выявленных нарушений у плодов и крысят обеих опытных групп был, в основном, сходен Подобные патологические изменения выявляются также и в потомстве крыс-самок, скрещенных в отдаленные сроки после введения антрациклиновых и платиносодержащих препаратов [Боровская Т Г , 2000] Обнаруживаемые различия в повреждающем действии этопозида и паклитаксела на потомство заключались в степени их выраженности и сроках проявления (таблица) Потомство крыс-самок, получавших этопозид, характеризовалось наибольшим числом патологических изменений внутренних органов, выраженным замедлением формирования сенсорно-двигательных рефлексов, снижением мышечного тонуса Особенностью состояния потомства крыс-самок, получавших паклитаксел, явилась пониженная масса тела и очень низкая жизнеспособность крысят Суммарная оценка токсического эффекта на потомство (в уел ед) показывала, что паклитаксел обладает большим токсическим действием на потомство по сравнению с этопозидом (рис 9, А) Сопоставляя полученные данные с таковыми при введении цитостатических препаратов других групп (платиноиды, антрациклины) [Смирнова М Е, 1997, Пахомова А В , 2004], следует отметить, что самая низкая жизнеспособность потомства выявлялась в отдаленные сроки после введения платиносодержащего препарата карбоплатина

Угтт ел А Угп ел К

Рис 9 Суммарная количественная оценка патологических изменений у потомства (А - общая, Б — при скрещивании через 1, 3, 6 мес после введения этопозида и паклитаксела) По оси ординат - суммарная количественная оценка патологических изменений у жизнеспособного потомства крыс-самок, получавших противоопухолевые препараты в уел ед (Э - этопозид, Пт - паклитаксел) По оси абсцисс - срок скрещивания после введения препаратов

Анализ суммарной оценки патологических изменений у потомства крыс-самок, скрещенных через 1, 3, 6 мес после начала опыта (рис 9, Б), показывает, что через 6 мес после введения препаратов количество патологических изменений у потомства возрастает Наиболее оптимальными сроками скрещивания с точки зрения минимального выявления числа патологических изменений у потомства, являются для обоих препаратов - 3 мес после их введения При скрещивании в этот период у потомства не наблюдается снижения индекса выживаемости, отставание физического развития наименее выражено С учетом длительности репродуктивного периода у крыс [Ланга С М , Уилсон Р П, 1993], для человека этот срок соответствует 5 годам жизни Возможность учета этих данных позволила бы свести к минимуму риск появления неполноценного потомства

Выявленные патологические изменения у потомства являются, очевидно, следствием, прежде всего, мутагенных эффектов антибластомных средств на созревающие половые клетки в яичниках В пользу этого свидетельствует тот факт, что сходные по характеру патологические изменения наблюдаются в потомстве крыс-самцов, перенесших различные виды цитостатического воздействия [Пахомова А В, 2004, Щемерова Ю А, 2006], которые являются, как известно, результатом только генетических повреждений Учитывая, что сроки скрещивания соответствуют различным стадиям созревания фолликулов, то появление наибольшего числа патологических изменений у потомства при скрещивании через 6 мес после начала опыта может свидетельствовать о нарушении процессов репаративной регенерации в яйцеклетках примордиальных фолликулов В то же время, следует отметить, что токсическое действие на потомство может быть результатом не только овариотоксических эффектов, но и повреждающего действия на материнский организм

В пользу этого свидетельствует более значительная степень выраженности выявляемых изменений у потомства при введении препаратов крысам-самкам, чем крысам-самцам [Боровская Т Г, Гольдберг В Е , Полуэктова М Е и др , 2004] В экспериментальных исследованиях показано, что беременность у крыс-самок, получавших этопозид, сопровождается развитием гемолитической анемии [Тимина Е А, Карпова Г В , Чурин А А и др, 2007], что может быть одной из причин снижения жизнеспособности потомства Аналогичные данные были получены на фоне введения платиноидов [Карпова Г В , Боровская Т Г , Тимина Е А и др , 2004] Отдаленные последствия гематологической токсичности цитостатических препаратов могут приводить к гипоксии плода [Савченко Ю П , Шилов С Н, 2001] Последнее, согласно литературным данным [Трофимов С С,1993], отрицательно сказывается на состоянии центральной нервной системы и может способствовать усилению проявления таких патологических изменений у потомства, как снижение адаптивного поведения, формирования сенсорно-двигательных рефлексов, нарушение памяти

В настоящее время является актуальным поиск способов и средств снижения овариотоксичности противоопухолевых препаратов Одним из способов защиты яичников от цитостатического воздействия является временная остановка их функционирования с помощью гормонального воздействия В настоящее время в клинической практике используются эстроген-гестагенные препараты и гипоталамические регуляторы функции гипофиза [Вокэег Ь , 8гепс1е В , ЭсЬаПу А , 1990] При этом снижается пролиферативная активность в тканях яичника, что приводит к уменьшению числа потенциальных мишеней Однако в настоящее время нерешенным является вопрос о выборе препаратов, наиболее подходящих для овариопротекции [Шилин ДЕ, Игнашина ЕВ, 1999] В настоящей работе исследованы овариопротекторные свойства эстроген-гестагенного препарата третьего поколения -логеста и аналога гонадотропин-рилизинг гормона — бусерелина Первый наиболее прост в применении, но имеет достаточно большое число противопоказаний Бусерелин менее токсичен, но требует заблаговременного введения Повреждение яичников вызывали однократным внутривенным введением в МПД этопозида Животным контрольной группы вводили эквиобъемное количество растворителя Защитные свойства препаратов оценивали по результатам подсчета структурно-функциональных элементов половых желез через 6 мес после сочетанного введения цитостатика и каждого из корректоров Подсчет структурно-функциональных элементов яичников крыс, получавших этопозид, подтвердил полученные выше факты более раннего, чем в контроле, истощения резервных возможностей яичников (снижение числа примордиальных, двух- и многослойных фолликулов, числа желтых тел, общего числа генеративных элементов) У крыс обеих групп, получавших сочетанную терапию, также выявлялись отдаленные последствия овариотоксичности этопозида Об этом свидетельствовало более низкое, чем в контроле число примордиальных фолликулов (Р<0,05) На фоне использования бусерелина отмечалось снижение числа желтых тел и общего количества генеративных элементов В то же время, количество двух- и многослойных фолликулов не отличалось от контрольных значений На рисунке 10 представлены результаты подсчета структурно-

функциональных элементов в яичниках крыс, получавших корректоры, в сравнительном аспекте с таковыми на фоне использования одного этопозида

Примордиальные Двух- и Атретические Желтые Граафовы Общее

фолликулы многослойные фолликулы тела пузырьки количество

фолликулы генеративных

элементов

Рис 10 Количество структурно-функциональных элементов яичников крыс через 6 мес после сочетанного введения этопозида и логеста (1), этопозида и бусерелина (2)

Установлено, что при сочетанном введении этопозида как с логестом, так и с бусерелином количество многослойных фолликулов оказалось повышенным (в 1,8-1,7 раза соответственно), что позволяет сделать заключение о том, что оба препарата оказывали защитное действие Этот эффект, очевидно, обусловлен гибелью меньшего числа примордиальных фолликулов в ранние сроки после введения этопозида В то же время, следует отметить, что защитные свойства эстроген-гестагенного препарата выражены в значительной степени В пользу этого свидетельствует тот факт, что на фоне его введения выявлялось большее, чем при использовании одного этопозида, число желтых тел Этот показатель у крыс данной группы, как было отмечено выше, не отличался от такового у интактных животных

Клинические данные свидетельствуют о том, что одним из способов снижения овариогоксичносги может был. применение менее токсичных цшосишческих препаратов [Ноету В, Маша1 К, 1991] Эта проблема имеет особую значимость для мэлодых женщин. В связи с этим, представляет интерес сравнительная оценка овариогоксических эффектов цигосшшческих препаратов разных трупп Применение менее токсичных в этом плане препаратов в клинике может привести к более позднему наступлению менопаузы и значительно улучшит качество жюни пациенток, находящихся в длительной ремиссии после цигосташческого лечения Использование менее токсичных ангибласгомных средств позволило бы снизил, токсические эффекты цигосщшческой химиотерапии и на потомство Возможность учета данных о наиболее благоприятных сроках зачатия позволило бы также свести к минимуму риск появления неполноценного потомства

ВЫВОДЫ.

1 В ранние сроки после однократного введения в МПД этопозида и паклитаксела в яичниках крыс развиваются сходные по характеру деструктивные и дистрофические изменения, сокращается количество структурно-функциональных элементов Морфологические изменения сопровождаются временным угнетением гормональной активности яичников В отдаленные сроки после введения препаратов наблюдается истощение резервных возможностей яичников, одинаковое по степени выраженности

2 Основной мишенью токсического действия этопозида являются примордиальные фолликулы У крыс-самок, получавших паклитаксел, выявляется усиление атретических процессов в яичниках Продолжительность астрального цикла после введения этопозида увеличивается за счет удлинения стадии метаэструс, паклитаксела - диэструс На фоне введения этопозида происходит более быстрая нормализация эстрального цикла

3 Как в ранние, так и в отдаленные сроки после введения этопозида и паклитаксела индексы плодовитости и беременности крыс-самок, как правило, не снижаются, однако вероятность сохранения беременности, судя по показателям эмбриональной гибели, является сниженной У крыс, получавших паклитаксел, этот токсический эффект выявляется во все исследуемые сроки Отличительной особенностью состояния репродуктивной системы крыс-самок, получавших этопозид, является значительное возрастание эмбриональной гибели потомства, полученного при скрещивании в наиболее удаленные после его введения сроки

4 Патологические изменения в потомстве крыс-самок, скрещенных через 1, 3 и 6 мес после введения препаратов, выявляются с высокой частотой Характерной особенностью состояния потомства животных, получавших этопозид, является значительное возрастание числа плодов с патологическими изменениями внутренних органов (застойные явления в печени, гидронефроз, умеренное расширение желудочков головного мозга, нефроптоз), замедление скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, снижение мышечного тонуса Действие на потомство паклитаксела более выражено ввиду значительного снижения индекса выживаемости Особенностью потомства самок этой опытной группы является также сниженная масса тела

5 При скрещивании крыс-самок опытных групп в наиболее отдаленные сроки после введения препаратов количество патологических изменений у потомства максимально Наименьшее число патологических изменений у потомства выявляется при скрещивании самок через 3 мес после введения как этопозида, так и паклитаксела

6 Эстроген-гестагенный препарат логест и агонист гонадотропин-рилизинг гормона бусерелин защищают яичники от токсического действия этопозида Овариопротекторные свойства логеста выражены в большей степени, чем у бусерелина

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние вепезида на функциональное состояние репродуктивной системы крыс // Бюлл эксперим биол и мед - 2005 - Т 140 — №9 - С 301-304 (соавт Боровская Т Г , Гольдберг В Е, Полуэктова М Е, Тимина Е А, Щемерова Ю А)

2 Влияние противоопухолевых препаратов на астральный цикл крыс // Бюлл эксперим биол и мед —2005 —Приложение 1—С 31—35 (соавт Боровская ТГ, Гольдберг В Е, Полуэктова М Е, Пахомова А В , Тимина Е А )

3 Влияние ингибиторов топоизомеразной активности на морфологические и функциональные показатели сперматогенеза крыс // Бюлл эксперим биол и мед

- 2005 - Приложение 1 - С 26-30 (соавт Боровская Т Г, Гольдберг В Е, Щемерова Ю А, Полуэктова М Е , Тимина Е А )

4 Отдаленные эффекты действия вепезида на репродуктивную функцию крыс-самок // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии

- Томск, 2005 - С 39 (соавт Тимина Е А , Полуэктова М Е )

5 Постнатальное развитие потомства крыс, получавших вепезид // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии - Томск, 2005 - С 57-59 (соавт Щемерова Ю А )

6 Оценка состояние потомства крыс, получавших ингибитор топоизомеразы II вепезид//Бюлл эксперим биол имед —2006 -Т141 —№5-С 515-518 (соавт Боровская Т Г , Гольдберг В Е , Щемерова Ю А, Тимина Е А , Пахомова А В )

7 Морфологическое и функциональное состояние яичников крыс в ранние и отдаленные сроки после введения препарата вепезид // Бюлл эксперим биол и мед - 2006 - Т 141 - №5 - С 586-589 (соавт Боровская Т Г , Гольдберг В Е , Пахомова А В , Тимина Е А )

8 Состояние потомства крыс-самок, получавших паклитаксел // Бюлл эксперим биол и мед — 2007 - Приложение 1 - С 72-75 (соавт Боровская Т Г, Тимина Е А , Пахомова А В , Гольдберг В Е)

9 Влияние паклитаксела на морфологическое и функциональное состояние яичников крыс // Бюлл эксперим биол и мед — 2007 — Приложение 1 — С 23—27 (соавт Боровская Т Г, Пахомова А В , Тимина Е А, Гольдберг В Е )

10 Отдаленные эффекты паклитаксела в отношении женской репродуктивной системы // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии - Томск, 2007 - С 63 (соавт Пахомова А В )

11 Защита яичников от токсического действия этопозида // Вестник РТМУ - М, 2007 -№2(55) -С 302-303

12 Овариотоксические эффекты противоопухолевого препарата этопозида и их фармакологическая коррекция // Российский биотерапевтический журнал — 2007

- №1 — Т6 — С 31 (соавт Гольдберг ЕД, Боровская ТГ, Пахомова АВ, Тимина Е А , Щемерова Ю А , Гольдберг В Е )

отпечатано с готового орипшал-макета в типография издательства «Ветер» г Томск, Иркутский проезд I тел 659-336 подписано в печать 1805 2007 т Формат 62x84/16 Гарнитура «Тппез» Бумага офсетная Л!1) Печать офсетная Уел печ. л. 1,5

Тираж 100 эю

Актуальность проблемы. В настоящее время существуют различные приоритеты при лечении больных со злокачественными новообразованиями [Урманчеева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. Для пациентов с высокими показателями безрецидивной выживаемости первоначально главным является качество жизни после проведенного лечения. Количество таких пациентов в последние годы неуклонно возрастает [Шилин Е.Д., Игнашина Е.В., 1999; Зенкова Е.В., 2004]. Состояние репродуктивной функции является важным фактором их жюни [Kanazavva К., Suzuki Т., Sakumoto К., 2000; Gaffan N., Holden L., Newlands E.S. et al., 2003; Grigg A., 2004].

Практически для каждого оиколопгческого больного на определенном этапе его заболевания обсуждается вопрос об использовании химшяерапевтического лечения [Переводчикова Н.И., 2005]. Повреждение женских половых желез ввиду постоянной смены морфологических структур, связанной как с развитием половых клеток, так и формированием эндокринной функции, является закономерным следствием любого вида цитостагпгческого воздействия [Гершанович M.JI., Филов В.А., Акимов М.А. и др., 1999]. В то же время, учтывая различные механизмы действия препаратов, их гонадотоксичсские эффекты могут значительно отличаться по степени выраженности и иметь ряд характерных особенностей [Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., 2003]. Изучение овариотоксическнх эффектов антибластомных средств разных групп позволяет прогнозировать сроки наступления ранней менопаузы, использование менее токсичных в этом плане препаратов могло бы сократить ее продолжительность и значительно улучшить качество жизни namieirroK.

До недавнего времени изучению овариотоксическнх эффектов не уделялось достаточного внимания, первостепенной являлась оценка побочных эффектов антибластомных средств, лимитирующих их применение. В последние годы изучение овариальной дисфункции станошггся приоритетным [Bower М., Rustin G.J., Nevvlands E.S. et al., 1998; Шилин Е.Д., Ишашина Е.В., 1999; Dobson LS., Llorigan P.S., Coleman R.E. et al., 2000; Kanazavva K., Suzuki Т., Sakumoto K., 2000; GaiTan "N., Holden L., Newlands E.S. et al., 2003; Grigg A., 2004; Davis A.L., Klitus M., Mintzer D.M., 2005], что связано с обнадеживающими результатами лечения злокачественных заболеваний целого ряда локализаций, в том числе, и женской репродуктивной сферы. Клинические наблюдения показывают, что у женщин возникают проблемы, непосредственно не связанные со злокачественной опухолью, но требующие рассмотрения в свете предшествующего диагноза и проведенного цитостатического лечения. Актуальным станов1ггся выяснение вопроса о возможности наступления беременности, а также появления полноценного потомства после завершенного лечения. Обращает на себя внимание тот факт, что в клинике и эксперименте проводится активное изучение возможности снижения овариалыюй токсичности [Bokser L., Szende В., Schally А., 1990; Шилин Е.Д., Игнашина Е.В., 1999].

В настоящее время достаточно хорошо изучены овариотоксические эффекты алкилирующих соединений, платиносодержащих препаратов, антрациклиновых антибиотиков [Боровская Т.Г., Пахомова A.B., 2003; Боровская Т.Г., Полуэкгова М.Е., 2004]. Менее исследованными в этом плане являются антибластомные средства растительного происхождения этопозид и паклигаксел. Последние относятся к средствами прямого действия на цитоплазмагические и ядерные мишени [Гершановнч M.JI., Филов В.А., Акимов М.А. и др., 1999]. Этопозид ингибирует топоизомеразную активность, паклитаксел индуцирует сборку дефектных микротрубочек. Этопозид используется в клинической практике уже более 20 лег при лечении широкого спектра опухолей, в том числе, и органов женской репродуктивной -системы {Махновй Е.В., 2083; Мещерякова Н.Г., 2004]. Паклитаксел вошел в онкологическую практику в 90-е годы прошлого века. Использование таксанов при раке молочной железы позволяет ежегодно сохранять жюнь десяткам тысяч женщин [Фисенко В.П., 2000]. В настоящее время показана высокая эффективность пакпитаксела при лечении опухолей других локализаций [Бессмельцев С.С., 2003; Блюмснберг А.Г., 2003; Ганьшина И.П., Сельчук В.Ю., 2004; Островская J1.A. Корман Д.Б., Фомина М.М., 2007]. Обнадеживающие результаты лечения, наблюдаемые на фоне использования этопозида, паклитаксела, обусловили появление ряда работ как в клинике, так и в эксперименте, посвященных шученшо их овариотоксичности [Takaliashi N., Kai S., Kohmura H. et al., 1986; Kai S., Kohmura H., Hiraiwa E. et al., 1994; Yucebilgin M.S., Terek M.C., Ozsaran A., 2004], однако они носят, в основном, фрагментарный характер.

Из числа быстро обновляющихся клеточных систем организма, к которым относятся гемопоэтическая ткань, кишечный эпителий, волосяные фолликулы, а также ткани половых желез, в том числе овариальиых, последние являются системой, временная остановка которой вполне допустима. Подавление ее активности может защитить яичники от действия цитостатических препаратов. С этой целыо рекомендуется использование эстроген-гестогснных препаратов и гипоталамических регуляторов функции гипофиза [Chapman R.M., 1989; Шилин Е.Д., Игнашина Е.В., 1999; Зенкова Е.В., 2004]. Однако вопрос о выборе препарата, наиболее подходящего для овариопротекции, является в настоящее время нерешенным [Шилин Е.Д., Игнашина Е.В., 1999; Grigg А., 2004].

Цель исследования. Изучить характер, глубину и продолж1ггелыюсть нарушений репродуктивной системы крыс-самок после действия противоопухолевых препаратов этопозида и паклитаксела. Провести поиск оптимальных способов снижения их овариотоксичности. Задачи исследования: 1. Изучить характер, глубину, продолжительность морфологических и фушацюнальных изменений репродуктивной системы крыс-самок в ранние и в отдаленные сроки после введения этопозида и паклитаксела.

2. Выяшпъ индивидуальные особенности повреждающего действия этонозида и наюиггаксела на репродуктивную систему крыс-самок.

3. Изучить степень реализации овариотоксических эффектов препаратов в шгге- и постнагальном развитии потомства, при скрещивании крыс-самок с отдаленные сроки после цитостатического воздействия. Определшъ влияние на потомство таких факторов, как вид щггостатического воздействия и сроки скрещивания после введения препаратов.

4. Провести сравнительную оценку защитных свойств на яичники гормональных овариопротекторов.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые с помощью современных методов исследования проведено экспериментальное изучение морфологического и функционального состояния женской репродуктивной системы в ранние и отдалешше сроки после однократного внутривенного введения в МПД этопозида и паклитаксела. Принципиальную новизну представляют данные, касающиеся характера и глубины выявленных нарушений, влияния препаратов на потомство. Результаты экспериментальных исследований позволяют прогнозировать возможность восстановления женской репродуктивной функции после использования этих препаратов. Практическую значимость представляют данные о влиянии этоиозвда и наклигаксела на состояние потомства. Показано, что при выборе оптимального срока скрещивания можно стоить токсическое действие на потомство. В работе впервые проведена сравнительная количественная оценка овариипригекторив гормонального происхождения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медшцшы» (Новосиб1трск, 2004), «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологию) (Томск, 2006), «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва 2007). Материалы были представлены на II Всесоюзном съезде научного общества фармакологов (Москва, 2003), сессии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 8 - в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 227 литературных источников, из них 115 отечественных и 112 иностранных.

ВЫВОДЫ:

1. В ранние сроки после однократного введетш в МПД этопозида и паюнггаксела в яичниках крыс развиваются сходные по характеру деструктивные и дистрофические изменения, сокращается количество структурно-фу1пацюналыплх элементов. Морфологические шменения сопровождаются временным угнетением гормональной активности яичников. В отдаленные сроки после введения препаратов наблюдается истощение резервных возможностей яичников, одинаковое по степени выраженности.

2. Основной мишенью токсического действия этопозида являются примордиальные фолликулы. У крыс-самок, получавших паклитаксел, выявляется усиление атретических процессов в яичниках. Продолжительность эстрального цикла после введения этопозида увеличивается за счет удлинения стадии метаэструс, паклптаксела — дтструс. На фоне введения этопозида происходит более быстрая нормализация эстрального цикла.

3. Как в ранние, так и в отдаленные сроки после введения этопозида и паклптаксела индексы плодовшости и беременности крыс-самок, как правило, не снижаются, однако вероятность сохранешш беременности, судя по показателям эмбриональной гибели, является сниженной. У крыс, получавших паклитаксел, этот токсический эффект выявляется во все исследуемые сроки. Отличительной особенностью состояния репродуктивной системы крыс-самок, получавших этопозид, является значительное возрастание эмбриональной гибели потомства, полученного при скрещивании в наиболее удаленные после его введения сроки.

4. Патологические шменения в потомстве крыс-самок, скрещенных через 1, 3 и 6 мес после введения препаратов, выявляются с высокой частотой. Характерной особенностью состояния потомства животных, получавших этопозид, является значительное возрастание числа плодов с патологическими изменениями внутренних органов (застойные явления в печени, гидронефроз, умеренное расширение желудочков головного мозга, нефроптоз), замедление скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, снижение мышечного тонуса. Действие на потомство паклитаксела более выражено ввиду значительного снижения индекса выживаемости. Особенностью потомства самок этой опытной группы является также сниженная масса тела.

5. При скрещивании крыс-самок опытных групп в наиболее отдаленные сроки после введения препаратов количество патологических изменений у потомства максимально. Наименьшее число патологических изменений у потомства выявляется при скрещивании самок через 3 мес после введения как этопозида, так и паклитаксела.

6. Э стр о ге н-гестаге нны й препарат л о гест и агонист гонад отропин-рилизинг гормона бусерелин защищают яичники от токсического действия этопозида. Овариопротекторные свойства логеста выражены в большей степени, чем у бусерелина.

132