Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние производных бензимидазола на репродуктивную систему крыс-самцов

На правах рукописи

БУКАТИН МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

Влияние производных бензимидазола на репродуктивную систему крыс-самцов

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 СЕН 2013

005533оо«

ВОЛГОГРАД-2013

005533666

Работа выполнена в ГЪОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: Спасов Александр Алексеевич

Академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант: Бугаева Любовь Ивановна доктор биологических наук,

заведующая лабораторией лекарственной безопасности НИИ фармакологии ГБОУ ВПО «ВолгГМУ» Минздрава России

Официальные оппоненты:

Черников Максим Валентинович доктор медицинских наук, доцент

заведующий кафедрой биологии и физиологии «Пятигорского медико-фармацевтического института — филиала ГБОУ ВПО «ВолгГМУ» Минздрава России»

Яворский Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор,

Ученый секретарь ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «18» октября 2013 г. в на заседании Диссертационного Совета Д

208.008.02 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан «_» сентября 2013 г.

Ученый секретарь совета /у

доктор биологических наук ЛИ Бугаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. При разработке и внедрении новых препаратов в клиническую практику, является важным установление порогов вредности и (или) их безвредности и обоснование безопасных уровней воздействия на организм, а так же знание основных принципов и механизмов их общетоксического и токсического органоспецифического действий [Арзамасцев Е.В., 2005; Березовская И.В. и др., 2011; Миронов А Н., 2012; Петров В.И. и др., 2012; Addis A. et al., 2000] и, в частности, - их репродуктивной токсичности [Немова Е.П. и др., 2007; Смольникова Н.М. и др., 2007; Дурнев А.Д., 2012; Maisa N. Feghali and Donald R. Mattison, 2011].

Несмотря на серьезные разработки проблемы доклинической оценки репродуктивной токсичности лекарственных средств, многие из них, как уже используемые в клинической практике, так и проходящие доклинические испытания, требуют детального изучения на предмет их безопасности в отношении репродуктивной функции мужчин [Фарбирович В.Я. и др., 2011; Курило Л.Ф., 2011], что особенно актуально на фоне резко снижающегося уровня фертильности современной мужской популяции [Тер-Аванесов Г.В., 2004; Гамидов С.И., 2009; Клещев М.А. и др., 2011; Crosignani P.G., et al., 1998; WHO, 2010].

По мнению ряда авторов [Быков B.JI, 2000; Верткин A.B., 2006; Галимова Э.Ф., 2011; Сюбаев Р.Д., 2012] «вклад современных ксенобиотиков и лекарственных препаратов в частности» в процесс снижения репродуктивности населения развитых стран весьма существенен. Для многих групп лекарственных препаратов показана возможность прямого, либо опосредованного воздействия как на «предтестикулярные», «тестикулярные» и «посттестикулярные» уровни, так и механизмы нейрональной регуляции мужской репроду ктивной системы [Луцкий Д.Л., 2009; Курляндский Б.А., 2010; Brinkworth M.N. et al, 1997]. При этом, чем шире диапазон биологической активности лекарственных средств, тем выше риск вмешательства в процессы воспроизводства потомства [Гуськова Т.А., 2001; Березовская И.В., 2006; Журавлева М.В. и др., 2010]. С другой стороны, расширение спектра показаний препаратов, вплоть, до использования здоровыми лицами, также может отразиться на их «репродуктивном здоровье» [Румянцева Г.Н., 2001; Сивочалова О.В. и др., 2008, 2013; Тюзиков H.A., 2013].

К группе веществ с широким спектром биологической активности могут быть отнесены производные бензимидазола, для которых показаны: дозозависимое взаимодействие с центральными серотонин- , дофамин- и холинергическими системами [Спасов A.A., и др., 1999, 2000, 2006; Черников М.В., 2008; Lopez-Rodriguez M.L. et al., 2006] и целый ряд других фармакологических эффектов - прямо или косвенно опосредующих возможность влияния соединений данной химической группы на «предтестикулярные» (ЦНС, ПНС, гипофиз), «тестикулярные» (гонады) и «посттестикулярные» (эпидидимисы и др. органы мочеполовой системы, участвующие в спермогенезе) уровни репродуктивной системы. При этом для представителей данной группы веществ показана возможность влияния на процессы репродукции [Хамидова Т.В. и др., 2005; Кузубова Е.А. и др., 2010; Бутаева Л.И. и др., 2007, 2012]. В тоже время, у широко использующихся в клинической практике производных бензимидазола - препаратов дибазол и бемитил - указанные свойства не в полной мере представлены в доступной литерату ре. Наличие же у данных препаратов актопротекторного и иммуномодулирующего действия [Оковитый C.B. и др., 2005; Болехан A.B. и др., 2006; Шаршов Ф.Г., 2002; Шабанов П.Д. и др., 2006; Зарубина И.В. и др., 2006; Смирнов B.C., 2008] расширяет спектр их показаний у пациентов репродуктивного возраста, вплоть до назначения здоровым лицам, и, соответственно, обуславливает актуальность дальнейшего комплексного изучения их репродуктивной токсичности. Новое потенциальное лекарственное средство с антиоксидантной и мембранотропной активностью, находящееся на стадии доклинических исследований, вещество эноксифол [Спасов A.A. и др., 2003; Косолапов В.А., 2005; Гутенев С.М. и др., 2007], так же планируется к использованию в клинической практике лицам репродуктивного возраста. Вместе с тем, вопросы его

«предтестикулярного», «тестикулярного» и «постгестикулярного» действия исследованы недостаточно.

В связи с вышеизложенным, исследование у биологически активных производных бензимидазола - дибазола, эноксифола и бемитила репродуктивной токсичности, а так же изучение возможных механизмов их влияния на различные уровни регуляции мужской системы фертильности - представляется актуальной задачей.

Работа выполнялась в рамках научно-исследовательской темы «Изучение общетоксических, гонадотропных и эмбриотоксических свойств новых веществ с целью определения безопасности их применения», которая является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы была утверждена на заседании Ученого Совета ВолгГМУ (протокол №9 от 29 мая 2013 года).

Цель исследования. Изучение влияния на процессы репродукции крыс-самцов биологически активных производных бензимидазола - дибазола, эноксифола и бемитила.

Задачи исследования.

1. Исследовать общетоксические и нейротоксикологические свойства, установить диапазоны безопасней и токсической активностей и определить «эффективные дозы» в пределах этих диапазонов активности у производных бензимидазола - дибазола, эноксифола и бемитила.

2. Исследовать влияние дибазола, эноксифола и бемитила на «предтестикулярный» уровень репродуктивной системы крыс-самцов при 5-ти дневном и 2-х месячном курсах введения - в дозах безопасного и токсического диапазонов их активности.

3. Исследовать влияние дибазола, эноксифола и бемитила на «тестикулярный» уровень репродуктивной системы крыс-самцов при 5-ти дневном и 2-х месячном курсах введения - в дозах безопасного и токсического диапазонов их активности.

4. Определить влияние производных бензимидазола на «постгестикулярный» уровень репродуктивной системы крыс-самцов при 5-ти дневном и 2-х месячном курсах введения - в дозах безопасного и токсического диапазонов их активности.

5. Провести сравнительный анализ безопасного и токсического действия указанных биологически активных производных бензимидазола на репродуктивную функцию крыс-самцов.

Научная новизна. Впервые для производных бензимидазола - дибазола, эноксифола и бемитила проведено комплексное изучение их влияния на «предтестикулярные», «тестикулярные» и «посттестикулярныс» уровни репродуктивной системы крыс-самцов. Впервые на «предтестикулярном» \ровне выявлено дозозависимое взаимодействие исследуемых производных бензимидазола с центральными холинергическими и моноаминергическими структурами, а также влияние на половое поведение крыс-самцов. Впервые показано на «тестикулярном» уровне влияние дибазола, эноксифола и бемитила на сперматогенез, а на «посттестикулярном» уровне установлено их влияние на процессы фертилизации сперматозоидов.

Научно-практическая ценность работы. Установленное для дибазола, эноксифола и бемитила влияние на процессы репродукции, обусловленное как нейротоксикологическими особенностами дозового воздействия на «предтестикулярные», «тестикулярные» и «посттестикулярные» уровни регуляции системы фертилизации, так и прямым гонадотропным действием данных производных бензимидазола, позволяет провести прогноз степени «польза/риск» с целью коррекции показаний и противопоказаний для их клинического применения.

Реализация результатов исследования. Полученные данные по влиянию на различные уровни регуляции процессов репродукции крыс-самцов производных бензимидазола - дибазола, эноксифо.ла и бемитила, включены в пакет документов по доклиническому изучению эноксифола, а так же используются в научно-исследовательской работе НИИ фармакологии ВолгГМУ и Волгоградского медицинского научного центра.

Результаты работы включены в учебно-методические комплексы на кафедре фармакологии ВолгГМУ и на кафедре фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ, кафедре фармакологии Кубанского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии и клинической фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Производные бензимидазола - препараты дибазол и бемитил, а также вещество эноксифол в зависимости от дозы и длительности введения оказывают разнонаправленное влияние на «предтестикулярньш», «тестикулярный» и «посттестнкулярный» уровень репродуктивной системы крыс-самцов.

2. Препарат дибазол на «предтестикулярном» уровне регуляции репродуктивной системы: потенцирует эффекты никотина, фенамина, апоморфина (в дозах 0,1 мг/кг,1 мг/кг, 5 мг/кг) и 5-ГТФ; активирует процептивное половое поведение при 5-ти дневном введении в дозе 5 .мг/кг и рецептивное - в дозе 160 мг/кг при 2-х месячном введении. Под действием препарата на «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы в обеих дозах выявлены признаки выхолащивающей стимуляции на сперматогенез и снижение фертильности крыс-самцов.

3. Вещество эноксифол на «предтестикулярном» у ровне регуляции репродуктивной системы потенцирует эффекты никотина, фенамина, апоморфина (в дозах 0,1 мг/кг и 5 мг/кг), 5-ГТФ, и оказывает влияние на половое поведение: не зависимо от курса введения у крыс-самцов под действием эноксифола в дозе 5 мг/кг снижается процептивное и рецептивное половое поведение, тогда как в дозе 60 мг/кг активируются процептивное и рецептивное поведение - при 5-ти дневном введении и только процептивное - при 2-х месячном курсе введения. На «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы у крыс-самцов под действием эноксифола в дозе 5 мг/кг активируется сперматогенез и снижается оплодотворяющая способность. Под действием эноксифола в дозе 60 мг/кг, у крыс-самцов физиологический выброс сперматозоидов из тестикул в эпидидимисы и оплодотворяющая способность активируются.

4. Для препарата бемитил на «предтестикулярном» уровне регуляции репродуктивной системы показано разнонаправленное зависимое от дозы: взаимодействие с нейроанализаторами в дозе 5 мг/кг - потенцирование эффектов никотина, апоморфина (в дозе 0,1 мг/кг), 5-ГТФ и угнетение эффектов ареколина, фенамина и галоперидола; в дозе 160 мг/кг - потенцирование эффектов ареколина, апоморфина (в дозе 0,1 мг/кг), 5-ГТФ и утнетение эффектов никотина, фенамина и галоперидола; влияние на половое поведение: активация при 5-ти дневном курсе введения в дозе 5 мг/кг и угнетение в дозе 160 мг/кг - при различных курсах введения. Под действием бемитила на «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы под действием бемитила при различных курсах введения в дозе 5 мг/кг активируются процессы сперматогенеза и фертилизации и, наоборот, угнетаются — в дозе 160 мг/кг.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на: IV Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 13-16 марта Москва, 2006 г.; III Международной наз'чно-практической конференции «Современные медицинские технологии (диагностика, терапия, реабилитация и профилактика)», Москва-Барселона, 2006 г.; Межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» У81?Р-2006, Саратов , 2006 г.; II Международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» Египет (Шарм-эль-Шейх), 2006 г; 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Волгоград, 2006 г.; Международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки (фармацевтические науки)» США (Нью-Йорк), 2007 г.; III Международной научной конференции «Современные проблемы

экспериментальной и клинической медицины», Таиланд - Камбоджа, 2008 г.; V Международной конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2008г.; V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008 г.; I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере», Сыктывкар, 2008 г.; Архангельской международной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Архангельск, 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным 5-частием, посвященной 65-летию Ярославской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 2009 г.; 63-й «Итоговой научной конференции молодых ученых», посвященной 70-летию Молодежного научного общества Ростовского государственного медицинского университета, Ростов, 2009 г.; II Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования», Пенза, 2009 г.; 66,67,68 и 69-й открытых научно-практических конференциях молодых учёных с международным участием «Актуачьные проблемы экспериментатьной и клинической медицины», Волгоград, 20082011 гг.; XIV Международной научной конференции «Инновационные медицинские технологии», Москва, 2012 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 3 в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 212 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками, 59 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), материалов и методов (глава II) экспериментатьной части (главы III-V), * обсуждения результатов (глава VI), выводов и списка литературы, включающего 317 источников, в том числе 136 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы исследования. Исследования проведены на трех биологически активных производных бензимидазола: веществе эноксифол* (лабораторный шифр РУ-185) - (9-(2-диэтиламиноэтил)-2-(3,4-диоксифенил)имидазо-[1,2-а]-бензимидазола дигидробромид;

препаратах дибазол (бендазол, тромаседан) - 2-бензилбензимидазола гидробромид (Хим,-фарм. объединение «Фармакон», Санкт-Петербург, серия № 430288) и бемитил - 2-этатгиобензимидазола гидробромид (Хим.-фарм. объединение «Дарница», Украина).

В работе в ходе исследований по изучению взаимодействия с агентами, возбуждающими холинергические и моноаминергические структуры ЦНС были использованы: гатоперидол («Gedeon Richter», Венгрия), апоморфина гидрохлорид («ICN Biomedical», США), 5-гидрокситриптофан (5-ОТФ), никотин (производства «SIGMA-ALDRICH», Германия) и ареколин («Фармакон», Россия).

Исследования выполнены на 1338 половозрелых аутбредных, конвекциональных белых крысах обоего пола, массой 200-240 гр. и 140 белых нелинейных лабораторных мышах самцах массой 18-22 гр.

Животные содержались в виварии НИИ фармакологии ВолгГМУ с совмещенным (естественным и искусственным) световым режимом, при относительной влажности воздуха не более 65% и температуре +20-+24°С на стандартной полнорационной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) и свободном доступе к воде в соответствии с правилами, принятым Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986; директива 86/609/ЕЕС), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96).

♦ Выражаем глубокую признательность ведущему научному сотруднику НИИ ФОХ РГУ, к.х.н. Вере Алексеевне Анисимовой за синтез и предоставление для исследований субстанции РУ-185 (Эноксифол).

Методы исследования. Острая токсичность вещества эноксифол и препаратов -дибазол и бемитил определялась на крысах-самцах при их внутрижелудочном введении [Беленький М.Л., 1961; Гуськова Т.А., 2010; Арзамасцев Е.В., 2012].

Расчет LD50 проводили по методу Litchfield-Wilcoxon, с помощью пакета программ стандартного пробит-анализа Microsoft Excell 2000.

Исследование нейротоксикологического действия исследуемых биологически активных производных бензимидазола оценивали, с использованием балльной системы по S. Irvin (1964), при этом препарат дибазол испытывался в дозах - от 1,25 мг/кг до 2560 мг/кг; вещество эноксифол от 1,7 мг/кг до 1800 мг/кг; препарат бемитил - от 1,25 мг/кг до 640 мг/кг. Характер изменений функционально-поведенческого статуса животных, сопутствующий каждой вводимой дозе, представляли, в интегральном виде графически и по интегральной «дозовой траектории» рассчитывали терапевтический интервал, диапазоны безопасной нейротоксикологической активности и опасного нейротоксикологического действия. В пределах этих диапазонов определяли «эффективные дозы» (дозы веществ, вызывающие резкие изменения профиля функционально-поведенческой активности животных) [Бугаева Л.И. и др., 2000]. В дальнейшем, в этих «эффективных дозах» исследовали поведенческую активность животных в тесте «открытое поле» [Bures J., Burcsova О., 1991; Воронина Т.А., 2005].

При изучении влияния на репродуктивную функцию исследуемые производные бензимидазола вводились подопытным животным (опытные группы) внутрижелудочно в течение 5 суток - «5-ти дневный курс», что соответствует однократному применению препаратов у человека [Арзамасцев Е.В. и др., 2005; Гуськова Т.А., 2008] и «2-х месячным курсом» - в течение 60 дней, что соответствует 1 циклу сперматогенеза у крыс-самцов [Рузен-Ранге В.П., 1982] - в «эффективных дозах», установленных на предыдущем этапе исследований как - «терапевтически эффективная безопасная» (для дибазола - 5 мг/кг, для эноксифола - 5 мг/кг и для бемитила - 5 мг/кг) и «высшая эффективная безопасная близкая к токсической» (для дибазола - 160 мг/кг, для эноксифола - 60 мг/кг и для бемитила - 160 мг/кг). Крысы-самцы группы контроля оставались интактными.

По окончании курсов введения биологически активных производных бензимидазола исследовали их вмешательство на «предтестикулярном» уровне репродуктивной системы -изучали взаимодействие дибазола, эноксифола и бемитила с агентами, возбуждающими центральные М-холинорецепторы - ареколин (25 мг/кг, в/бр.) [Хараузов Н.А., 1958; Аничков C.B., 1982] и Н-холинорецепторы - никотин (6 мг/кг, в/бр.) [Бородкин Ю.С., 1970], а также центральные моноаминорецепторы - фенамин (10 мг/кг, в/бр.) [Щелкунов Е.И., 1964; Островская Р.У. и др., 2012], галоперидол (1 мг/кг, в/бр.) [Андреева Н.И., 2005], апоморфин (0,1 мг/кг, 1 мг/кг и 5 мг/кг - п/к.) и 5-гидрокситриптофан (300 мг/кг, в/бр.) [Раевский К.С., Наркевич В.Б., 1976, 2005; Воронина Т.А., 2012; Vasse M. et al., 1985; Sonsalla P.K. et al., 1986], a также оценивали половую активность животных. О воздействии на «тестикулярном» уровне судили по изменению сперматогенеза - изучали спермиограмму и проводили морфометрию гонад, а для выявления «посттестикулярных» воздействий - изучали функциональные показатели сперматозоидов и оплодотворяющую функцию крыс-самцов.

Исследование полового поведения у крыс-самцов проводили с учетом рекомендаций Пошиватова В.П. (1976), Event B.J. (1983), Буреш Я. и др. (1991), Кузубовой Е.А. (2001), Бугаевой Л.И. и др. (2006), Agmo А. (1997), при этом учитывали показатели процепгивности (латентный период начала половой активности, длительность половой активности и количество «эмоциональных» подходов самца к самке) и рецептивности (число садок с интрамиссией и без интрамиссии).

Для исследования оплодотворяющей способности крыс-салщов проводили спаривание экспериментальных и контрольных самцов с интактными самками в течение 10 дней, в соответствии с правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств [Дурнев А Д. и др., 2012; Amann R.P., 1982]. По истечении 10 дней от первой подсадки к самцам для спариваний от крыс-самок отсаживали самцов, в последующем -

через 10 cvtok - самок забивали и вычисляли «Индекс оплодотворяющей способности самцов». При этом у забеременевших самок определяли сроки беременности, количество желтых тел беременности, количество имплантированных плодов, количество живых плодов, а также определяли ориентировочные сроки зачатия.

При изучении влияния исследуемых производных бензимидазола на сперматогенез, крыс-самцов подвергали эвтаназии (декапитация под эфирным наркозом). Проводили макроскопическое обследование (кровенаполнение, воспалительные изменения, атрофия) органов репродуктивной системы самцов. Семенники и эпидидимисы выделяли и взвешивали на весах модели BJIKT-500 (Россия). Массу семенников и эпидидимусов (гр.) представляли в относительных величинах по отношению к весу животного (гр.), выраженную в процентах (коэффициент масс органов). Семенники фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина для последующего микроскопического исследования, а из эпидидимисов извлекали семенной материал, по которому исследовали спермиограмму.

В спермиограммс учитывали следующие показатели: длительность движения сперматозоидов выраженная в минутах; резистентность сперматозоидов по отношению к изменениям рН среды и их осмотическую стойкость; общее количество сперматозоидов (1*10б) в 1 мл гомогената [Саноцкий И.В. и др., 1975; Евдокимов В.В., 1999; Петрищев B.C. и др., 2002; Дурнев А.Д. и др., 2012]; относительное количество неподвижных форм сперматозоидов (%); относительное количество патологических форм (деформации, удвоения и др.) сперматозоидов (%); общее количество неподвижных форм сперматозоидов (1*10б); общее количество патологических форм сперматозоидов (1*10 ); количество потенциально активных сперматозоидов (у.е.) и коэффициент их фертилизации (у.е.).

Морфологическую ог\енку состояния генеративного эпителия проводили на бинокулярном микроскопе №851.327.646 GZ 0034 («Leika DM 750», Германия) при увеличении 10x90 по следующим показателям: индекс сперматогенеза - подсчитывали по 4-х балльной системе [Райцина С.С., 1982; Хилькевич Л.В., 1990; Дурнев А.Д. и др., 2012]; общее количество сперматогоний; процент канальцев со спущенным генеративным эпителием; процент канальцев с 12 стадией мейоза. Одновременно отмечали качественные изменения: отслоение эпителия от базальной мембраны, дегенеративные явления в генеративном эпителии, наличие гигантских клеток [Саноцкий И.В., 1970, Курило Л.Ф., 1989].

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, США) и Excel 2007 (MS Office 2007, США), о достоверности судили по двуххвостовому t- критерию Стьюдента с поправкой Бенферрони [Гланц С., 1999, Реброва О.Ю, 2006].

Результаты исследований и нх обсуждение.

В исследованиях по определению границ LD30 производных бензимидазола -дибазола, эноксифола и бемитила установлено (таблица 1), что с учетом классификации ксенобиотиков по уровню их токсичности [Саноцкий И.В., Уланова И.П., 1975; Березовская И.В., 2003 , 2010], дибазол, эноксифол и бемитил могут быть отнесены к классу умеренно токсичных веществ.

В клинике токсических эффектов у исследуемых веществ, были выявлены характерные для бензимидазолов признаки отравления - влияние на центральные структуры, регулирующие поведенческие реакции животных, дыхательную и сердечнососудистую системы - проявляющиеся угнетением локомоторной активности, судорожной активностью, угнетением дыхания, отдышкой, полнокровием органов малого круга кровообращения, геморрагическим транссудатом в легких. Подобные токсические эффекты описаны и для других производных бензимидазола [Спасов А.А. и др., 1999; Бугаева Л.И. и др., 2010; Кузубова Е.А., 2012]. При этом с учетом литературных данных [Голиков С.Н., 1986; Курляндский Б.А., 2002; Куценко С .А., 2004; Ed. Hayes A.W., 1982] по ряду признаков отравления: общему психомоторному возбуждению, переходящему в генерализованные клонико-тонические судороги, можно предположить наличие в механизме токсического

действия диоазола центрального эрготропного компонента. По угнетению подвижности, дыхания, седации, релаксации можно предположить в механизме токсичности эноксифола наличие центрального депримирующего действия. На основании же клиники интоксикации бемитилом - глубокая седация, гиперсативация, мелкоаплитудный тремор, можно предположить наличие в его токсических эффектах трофотропного механизма на фоне его общеугнетающего психотропного действия на ЦНС.

Таблица 1.

Величины острой токсичности (мг/кг) производных бензимидазола при внутрижелудочном введении крысам-самцам.

Исследуемое вещество

1Х>50 (мг/кг)

Тера певтический интервал (ТИ)

Диапазон безопасной активности (ДБА)

Диапазон токсической активности (ДТА)

Дибазол

2560,10 (2443,72+2675,7-1)'

от 1,2 5 мг/кг до 2560 мг/кг

от 1,25 мг/кг до 160 мг/кг

от 161 мг/кг до 2560 мг/кг

Эноксифол

1920,96 (1858,47 +1935,55)

от 1,9 мг/кг до 1900 мг/кг

от 1,9 мг/кг до 238 мг/кг

Бемигил

от 239 мг/кг до 1900 мг/кг

638,77 (553,38 +737,340)

от 1,25 мг/кг до 640 мг/кг

от 1,25 мг/кг до 160 мг/кг

от 161 мг/кг до 640 мг/кг

Примечание: " - доверигельнын интервал.

По результатам изучения иейротоксикологического профгая данных производных бензимидазола - дибазола, эноксифола и бемитила установлены дозозависимые эффекты их воздействия на различные спектры поведенческих, нервно-мышечных и вегетотропных эффектов в функционально-поведенческой активности крыс-самцов. При этом выявлено, что препараты дибазол и бемитил в малых дозах (1,25 мг/кг до 10 мг/кг) вызывали активацию поведенческих реакций, тогда как в более высоких дозах под их действием поведенческие реакции у животных угнетались. Подобные эффекты у этих препаратов наблюдались и со стороны нервно-мышечной возбудимости. Вегетативные же эффекты дибазола и бемитила в безопасных дозах изменялись несущественно, тогда как в токсических дозах - отчетливо угнетались. При этом частота дыхания под действием бемитила и дибазола в малых дозах активировалась, а в токсических - угнеталась. В нейротоксикологическом профиле эноксифола установлено резкое угнетение поведенческих реакций крыс-самцов (снижение настороженности, спонтанной двигательной активности и др.), дозозависимое угнетение нервно-мышечной возбудимости (угнетение рефлекторной активности, снижение тонуса конечностей вплоть до релаксации) на фоне вегетотропных эффектов.

С помощью интегрального графического представления иейротоксикологического профиля дибазола, эноксифола и бемитила в виде «дозовых траекторий» (рис.1) были определены различные по эффекту дозозависимые уровни их активности. Так, при анализе прохождения «дозовой траектории» дибазола по отдельным секторам физиологической активности крыс, выделено 3 уровня активности: на 1-м уровне (в диапазоне доз от 1,25 до 5 мг/кг) отмечается превалирующее влияние препарата на поведенческие реакции, тогда как на

2-м уровне активности (дозы от 10 до 160 мг/кг) интегральная «дозовая траектория» смещается в сектор нервно-мышечных реакций, что можно расценивать как усиление влияния препарата на нервно-мышечную передачу; в интервале доз от 320 и до 2560 мг/кг -

3-й хровень активности препарата - спектр его действия постепенно смещается в сектор вегетотропных токсических реакций.

На ((дозовой траектории» эноксифола выделяется 3 уровня активности: на 1-м уровне активности вещества, (в интервале доз от 1,9 мг/кг до 15 мг/кг), в нейротоксикологическом действии эноксифола превалируют вегетотропные эффекты; на 2-м уровне - интегратьная «дозовая траектория» вещества находится преимущественно в секторе поведенческих реакций (дозы от 30 мг/кг до 238 мг/кг), указанная активность эноксифола в этих дозах приблизительно одинакова и максимальна; на 3-м уровне активности нейротоксикологические эффекты эноксифола формируются на интегральной «дозовой

9

траектории» в диапазоне доз от 475 мг/кг до 1900 мг/кг, при этом в действии эноксифола постепенно начинают вновь активироваться вегетотропные эффекты, что, вероятно, может свидетельствовать о превалировании токсикотропной динамики, формирующей эффекты, в последующем приводящие к гибели животных.

На интегральной «дозовой траектории», в нейротоксикологическом профиле бемитила выявляется преимущественно 2 уровня функционально-поведенческой активности: 1-й уровень активности - отражен на «дозовой траектории» в диапазоне доз от 1,25 мг/кг до 80 мг/кг и характеризуется превалированием активации поведенческих реакции у'крыс-самцов; 2-й уровень - формируется в дозах от 160 мг/кг до 640 мг/кг, а в действии препарата превалируют эффекты влияния на вегетативную симптоматику, в последующем формирующих токсическую динамику изменений, следствием которой явилась 50% гибель животных.

На следующем этапе с помощью интегрального графического представления функционально-поведенческого профиля дибазола, эноксифола и бемитила в их «дозовом портрете» были определены различные по эффекту дозозависимые диапазоны активности: был проведен расчет терапевтического интервата, а затем, в его пределах определены диапазоны безопасного и токсического действия (таблица 1).

Из приведенных данных следует, что по широте диапазонов безопасной активности, исследуемые биологически активные производные бензимидазола, могут быть расположены в следующей последовательности: эноксифол > дибазол > бемитил.

"В дальнейшем в диапазонах безопасной и токсической активностей изученных производных бензимидазола были выявлены «эффективные дозы», которые условно были обозначены как «терапевтически эффективная безопасная доза» и «высшая эффективная безопасная доза, близкая к токсической».

В решении вопроса о правильности выбора доз, которые составили для дибазола - 5 мг/кг и 160 мг/кг, для эноксифола - 5 мг/кг и 60 мг/кг и для бемитила - 5 мг/кг и 160 мг/кг, в последующем были проведены исследования по изучению влияния данных производных бензимидазола на поведенческую активность крыс-самцов в тесте «открытое поле».

Исследования по изучению влияния дибазола, эноксифола и бемитила на поведенческую активность крыс-самцов в тесте «открытое поле» выявили зависимые от дозы эффекты их влияния на поведенческую активность животных. Установлено, что наиболее чувствительным звеном в структуре изменений поведения крыс-самцов, под влиянием исследуемых биологически активных производных бензимидазола, является локомоторная активность и груминг. Так под действием эноксифола у крыс-самцов зависимо от дозы снижается локомоторная активность - наиболее значимо в дозе 5 мг/кг (на 71,9%, при р<0,05), а количество актов груминга увеличивается - наиболее значимо в дозе 60 мг/кг (на 300,0%, при р<0,05). Тогда как под влиянием дибазола и бемитила в «безопасных» дозах (5 мг/кг) у крыс усиливается локомоторная активность (на 10,2%, при р>0,05 и 75,5%, при р<0,05, соответственно), при снижении уровня груминга (на 75,0%, при р<0,05 и 42,9,5%, при р<0,05, соответственно). Выявленные эффекты влияния дибазола и бемитила в дозах из диапазона их безопасной активности (5 мг/кг) на показатели двигательной активности и груминга крыс, с учетом литературных данных [Кругликов Р.И., 1981; Воронина Т.А. и др., 2000; Калуев A.B., 2002, 2004; "Beizung C.et al., 2002; Trainor B.C., 2011] - могут быть интерпретированы - как стресспротекторное действие препаратов, в основе которого, вероятно, лежат описанные ранее адаптивные механизмы действия дибазола [Беленький Е.Е., 1958, 1959; Kvctob В.В., 1960; Амиров P.O., 1963] и бемитила [Бобков Ю.Г. и др., 1984; Иеж'ица И.Н., 2000]. У препаратов в дозах, соответствующих максимально безопасному диапазону их действия наблюдалась инверсия данных эффектов - снижение количества горизонтальных перебежек на 24,4% (р<0,05) у крыс-самцов на фоне внутрижелудочного введения дибазола в дозе 160 мг/кг, а также снижение локомоций на 49,0% (р<0,05) и рост уровня груминга на 108,6% (р<0,05) у крыс-самцов на фоне внутрижелудочного введения бемитила в дозе 160 мг/кг.

Таким образом, полученные данные об особенностях поведения крыс-самцов на фоне внутрижелудочного введения изучаемых биологически активных производных бензимидазола в дозах из различных диапазонов активности, вероятно, может служить доказательством различных зависимых от дозы механизмов их нейротоксикологической активности.

Учитывая данное обстоятельство, а также литературные данные о регулирующем влиянии моноаминергической и холинергической нейромедиаторных систем различных отделов головного мозга на уровень двигательной активности животных, их эмоциональность и систему репродукции [Аничков C.B., 1982; Арушанян Э.Б., 2001; Agmo А., 2003; Kondo Y. et. al., 2005; Goodman A., 2008; Torterolo P. et. al., 2011], сочли целесообразным из\-чить возможные механизмы центрального вмешательства дибазола, эноксифола и бемитила в «терапевтически эффективных безопасных» и «высших эффективных безопасных, близких к токсическим» дозах на «предтестикулярном» уровне регуляции репродуктивной системы. Результаты данной серии исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что при взаимодействии дибазола с нейроанализаторами центральных холннергических и моноаминергических структур увеличивается продолжительность «никотинового тремора» и «фенаминовой стереотипии», активируется «апоморфиновая стереотипия» и «гло.чорфиновая вертикализация», растет количество спонтанных эрекций и усиливается выраженность 5-ГТФ гиперкинеза, при этом отсутствует влияние на «ареколиновый гиперкинез» и «галоперидоловую каталепсию». Полученные данные могут свидетельствовать о наличии у дибазола центрального Н-холиномиметического, а также дофамино- и серотонинопозитивного действия.

В экспериментах по изучению взаимодействия эноксифола с нейроанализаторами центральных холннергических и моноаминергических структур у вещества установлено: потенцирование длительности «никотинового тремора» и «фенаминовой стереотипии», усиление выраженности «апоморфиновой вертикадизации», дозозависимое увеличение количества зевательных движений, рост количества спонтанных эрекций (эноксифол в дозе 60 мг/кг) и усиление выраженности 5-ГТФ гиперкинеза, снижение }ровня «галоперидоловой каталепсии», отсутствие влияния на «ареколиновый гиперкинез» и «апоморфиновую стереотипию». Таким образом, в эффектах эноксифола присутствуют компоненты позитивного центрального Н-холинергического действия, пресинаптическое дофаминергическое действие на уровне мезолимбической системы головного мозга и серотонинопозитивное действие.

Характер же взаимодействия бемитила с нейроанализаторами центральных холннергических и моноамипергических структур напрямую зависит от дозы препарата. Так у препарата установлены зависимые от дозы эффекты: при введении препарата в дозе 5 мг/кг укорочение продолжительности «ареколинового гиперкинеза», увеличение продолжительности «никотинового тремора» и количества зевательных движений: при введении препарата в дозе 160 мг/кг - удлинение продолжительности «ареколинового гиперкинеза» и «фенаминового гиперкинеза», укорочение продолжительности «никотинового тремора»; при введении препарата в дозах 5 мг/кг и 160 мг/кг - укорочение длительности «фенаминовой стереотипии», снижение выраженности «галоперидоловой каталепсии», дозозависимый рост количества спонтанных эрекций, дозозависимое усиление выраженности 5-ГТФ гиперкинеза, отсутствие влияния на «апоморфиновую стереотипию».

Таким образом, у бемитила в малых дозах присутствует М-холинонегативное и Н-холинопозитивное действие, при повышении дозы препарата возрастает его М-холинопозитивное и Н-холинонегативное вмешательство в ЦНС. Дофаминопозитивное пресинаптическое действие препарата на уровне мезолимбической системы выявлено в дозе бемитила - 5 мг/кг, тогда как в дозе 160 мг/кг данные эффекты инвертированы на дофаминонегативное действие. Кроме того, у бемитила отмечено дозозависимое центральное серотониномиметическое действие.

Дибазол

Дозы препарата (мг/кг)

I-II -Ш-

IV -

V -

VI-

VII-VIII

IX-

X-

XI-

1,25 2,5 5 10 20 40 80 160 320-640 1280 2560

Бсмигил M

/[ты препарата г/

(mi/кг): Т

1- 1.25 !

II - 2.5 «о

Ш - 5 1 14 I,

IV - 10

V - 20 \

VI- 80 1S «

VU - 160

VIII - 320

IX - 640

VIII

1 т ------а.......ZI....." 21

13 „ го

Рис 1. Интегральная опенка иснротокснколигичсского профиля биологически активных пронтподных оетимидазола.

Обозначения: вокализациям-1, настороженное-] ь-2, активность -3. стереотипия-4. бесноконство-5. агрессия-6. грумнпг-7, спонтанная двигательная активпость-8, реакция на пршчОснокснис-9, реакция на 6омь-10, реакция на слук-1 L фсмор-12. подергиваншМЗ, судорош-14, расстройство иерсдвижсшпМ 5. тонус конечностей-16, moi-17. размеры 'шачка-18, саливации-19, vpiihjuhh-20. лсФскацни-21, температура icjia-22, цист кожных нокровов-23, частота дыхання-24.

По результатам проведенных исследований можно заключить, что в нейротоксикологических эффектах препарата дибазол - превалирует эрготропный эффект, присутствуют центратьное дофаминопозитивное и Н-холиномиметическое действие; вещества эноксифол - центральный депримирующий эффект, дофаминергическое действие на подкорковые центры головного мозга и центратьное Н-холинергическое действие; препарата бемитил - трофотропное токсическое влияние и зависимое от дозы дофаминергическое и холинергическое действие.

Таблица 2.

Взаимодействие производных бензнмидазола с неироанализаторами, возбуждающими

центральные холинергнческие и моноаминергнческие структуры, in vivo*.

Вещество Эффект Дибазол 5 мг/кг Дибазол 160 мг/кг Эноксифол 5 мг/кг Эноксифол 60 мг/кг Бсмигил 5 мг/кг Бсмигил 160 мг/кг

С холшюмимстичсски ми пейромедиаторами Длительность «ареколинового гиперкинеза» 3,0f 2,Of

Длительность « никотинового тремора» 12,ОТ* 12,ОТ* 13,от* 8,ОТ* 9,Of 2,Of

С мопоаминньтми пейромедиаторами Длительность фенаминовой стереотипии 10,Of 9,Of 13,от* 2,Of

Галоперидоловая каталепсия 3,01* 4,Of

Апоморфиновая вертика лизация (апоморфии в дозе 5 мг/кг) 11,Of 4,Of* 4,Of 16,Of 13,Of

Апоморфиновая стереотипия (апоморфин в дозе 1 мг/кг) 4,0 Г 4,Of

Кол-во зевательных движешш (апоморфин в дозе ОД мг/кг) 5,Of 4,Of 6,от* 7,ОТ*

Кол-во эрекций (апоморфин в дозе 0,1 мг/кг) 32.0Т* 33,Of 8,ОТ* 32,Of*

Выраженность 5-гидроксигрипго фанового пшеркинеза 10,от* 11,Of 11,от* 14,ОТ* 9,ОТ* 9,0f

Примечание: • - представлены статистически значимые эффекты, «|» - увеличение параметра на 10%, «1» -уменьшение параметра на 10%, * - значения статистически значимы по отношению к контролю при р<0,05.

Наличие данных эффектов, с учетом литературных данных по механизмам регуляции репродуктивной системы [Йен С.С.К., Джаффе Р.Б., 1998; Кация Г.В. и др., 1994; Гомула А., 2009; Morales A. et al., 2004; Pawlisch В.А. et al., 2010], позволяет

рассматривать исследуемые биологически активные производные бензимидазола как «потенциально активные» в отношении «предтестикулярного » уровня регуляции системы фертилизации крыс-самцов.

В дальнейших исследованиях репродуктивной токсичности дибазола, эноксифола и бемитила их вводили двумя курсами: 5-ти дневным (короткий) - соответствует однократному приему у человека [Арзамасцев Е.В. и др., 2005; Гуськова Т.А., 2008J и 2-х месячным (длительный) - соответствует одному циклу сперматогенеза у крыс-самцов [Рузенг-Ранге В.П., 1982]. По окончании курсов введения биологически активных производных бензимидазола исследовали их влияние на «предтестикулярном» уровне репродуктивной системы - изучали половую активность животных, о воздействии на «тестикулярном» уровне судили по изменению сперматогенеза - изучали спермиограмму и проводили морфометрию гонад, а для выявления «постгестикулярных» воздействий - изучали функциональные показатели сперматозоидов и оплодотворяющую функцию крыс-самцов.

На «предтестикулярном» уровне репродуктивной системы - как после 5-ти дневного введения, так и после 2-х месячного курса введения дибазола, обнаружено неоднозначное, зависимое от дозы препарата, влияние на процептивные и рецептивные компоненты полового поведения крыс-самцов (таблица 3). Установлено, что при коротком курсе введения под влиянием дибазола в дозе 5 мг/кг процептивное половое поведение крыс-самцов активируется (25,0%, при р<0,05), но рецептивность снижается (25,0%, при р<0,05).

Схожие эффекты отмечались и под влиянием дибазола в дозе 160 мг/кг, при этом у опытных крыс-самцов отмечаюсь достоверное снижение и процептивного (30,0%) и рецептивного (88,9%) поведения. При курсовом 2-х месячном введении крысам-самцам дибазол дозозависимо достоверно активировал процептивное поведение (21,0% и 44,0%, соответственно дозам 5 мг/кг и 160 мг/кг). Однако в рецептивном поведении крыс-самцов получавших препарат в дозе 5 мг/кг обращает на себя внимание снижение числа покрытий интактных самок (18,5%, при р<0,05), которые в большинстве случаев негативно реагировали на попытки крыс-самцов к покрытию с интромиссиями, схожие эффекты наблюдались и после 5-ти дневного введения дибазола в обеих дозах. С учетом литературных данных [Bell M.R. et al., 2010; Guarraci F.A., 2010; Dadomo H. et al., 2011] можно предположить, что такое поведение крыс-самок, вероятно, может быть связано с изменением качественного фона выделяемых феромонов у данной группы самцов и во многом зависит от особенностей обмена тестостерона [Agmo А., 1997; Attila M. et al., 2010; Andersen M.L. et al., 2011]. Учитывая эти сведения, можно предположить возможность вмешательства дибазола в процессы нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции крыс-самцов. Данное предположение согласуется с результатами исследований по взаимодействию дибазола с нейротрансмитгерами на «предтестикулярном» уровне регуляции репродуктивной системы и нашло свое подтверждение в дальнейших исследованиях.

На «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы при исследовании сперматогенеза у крыс-самцов после 5-ти дневного введения дибазола в дозе 5 мг/кг общее количество сперматозоидов не изменялось, но при этом общее число патологических (28,8%, при р<0,05) и неподвижных (16,2%, при р>0,05) форм увеличивалось. Отмечалось так же снижение времени подвижности сперматозоидов (34,2%, при р<0,05), что возможно обусловлено обнаруженным у дибазола серотонинопозитивным действием, поскольку серотонин повышает концентрацию пролактина [Кация Г.В. и др., 1994; Иловайская И.А. и др., 2000; Гудин В.А., 2005; Мельниченко Г.А., 2008; Colao A. et al., 2004], а при этом, существует взаимосвязь между содержанием пролактина в плазме крови и числом подвижных сперматозоидов [Марова Е.И. и др., 2000; Тюзиков И.А., 2013; Boe-Hansen G.B. et al., 2006]. У самцов, получавших дибазол в дозе 160 мг/кг, общее количество сперматозоидов возрастало (11,9%, при р<0,05), но в тоже время, наблюдался рост патологических (28,2%, при р<0,05) и

14

неподвижных (13,7%, при р<0,05) форм сперматозоидов, что, отразилось на снижении времени их подвижности (24,0%, при р<0,05). При этом осмотическая резистентность сперматозоидов возрастала (12,4%, при р<0,05), а кислотная не изменялась, что, по мнению ряда авторов [Snell W.J. et al., 1996; Yang M.G. et al., 2005], может положительно сказываться на их оплодотворяющей способности, что и наблюдалось в дальнейших экспериментах.

Изменения в спермиограмме подтвердились макроскопическими и морфометрическими исследованиями тестикул у этих самцов, которые выявили достоверное дозозависимое увеличение коэффициентов масс гонад (21,4% и 33,3%, соответственно дозам 5 мг/кг и 160 мг/кг), при этом, под действием дибазола в дозе 160 мг/кг, в семенниках уменьшалось общее количество сперматогоний (10,0%, при р<0,05) и увеличивалось число канальцев с 12-й стадией мейоза (32,0%, при р<0,05), что, по мнению [Ефремов Е.А. и др., 2013], может указывать на активацию митотической фазы сперматогенеза. Рост же канальцев со слущенным эпителием (36,6%, при р<0,05) вероятно связан с нарушением процессов спермиации.

При изучении спермиограммы после 2-х месячного введения дибазола в обеих дозах не выявлено повреждающего действия на структурно-функциональные показатели спермиограммы. Отмечено позитивное влияние дибазола на подвижность сперматозоидов и на коэффициент фертилизации. При этом независимо от числа сперматозоидов в спермиограмме опытных крыс-самцов, обнаружено снижение содержания патологических и неподвижных форм сперматозоидов. Изменения, обнаруженные при изучении спермиограммы, подтвердились при морфологическом исследовании гонад. Было отмечено, что после 2-х месячного введения дибазола самцам в дозе 5 мг/кг росло число канальцев со слушенным эпителием (50,0%, при р<0,05) и с 12-й стадией мейоза (29,4%, при р<0,05). При микроскопии тестикул животных, которым дибазол вводили в дозе 160 мг/кг установлено, что одновременно с достоверным повышением мейотической активности и числа сперматогоний в канальцах тестикул (на 34,15 и 11,9%, соответственно) у данных самцов фиксируется двукратное увеличение количества канальцев со слущенным эпителием (на 95%, при р<0,05), что по данным литераторы [Лысенко А.И. и др., 1991; Гольдберг Е.Д. и др., 2003] может указывать на выхолащивающую стимуляцию сперматогенеза.

При исследовании оплодотворяющей способности крыс-самцов после 5-ти дневного введения дибазола в обеих дозах у крыс-самцов активируется оплодотворяющая способность, о чем свидетельствует более раннее зачатие у интактных самок, спаренных с этими самцами, которое произошло в среднем на 4 - 5 дней раньше, чем в контроле. В тоже время снижается количество и качество зачатий и как следствие снижается индекс оплодотворяющей способности крыс-самцов, что может свидетельствовать о снижении качества фертилизации их семени [Kidd S.A. et al., 2001; Levek-Motola N. et al., 2005; Alexander P.G. et al., 2010].

Схожие эффекты наблюдались и после 2-х месячного введения дибазола. Так от опытных крыс-сачцов, получавших дибазол в дозе 5 мг/кг время наступления зачатий было в среднем на 3 дня раньше, чем в контроле, что указывает на активацию их оплодотворяющей способности. Одновременно с этим у оплодотворенных крыс-самок несколько снижалось качество зачатий, о чем свидетельствуют тенденции повышения эмбриональной гибели плодов. Однако выявленные эффекты у самок опытных групп не выходили за рамки физиологической нормы [Трахтенберг И.М., 1991; Neubert D., 2002].

При исследовании репродуктивных эффектов э ноксифола на «предтестикулярном » уровне регуляции репродуктивной системы (таблица 4) установлено его дозозависимое влияние на половое поведение крыс-самцов. Так при коротком курсе введения вещество в дозе 5 мг/кг снижает процессы процептивного (45,2%, при р<0,05) и рецептивного (41,5%, при р<0,05) поведения. Тогда как в дозе 60 мг/кг, наоборот, активирует и процепцию (39,8%, при р<0,05) и рецептцию (134,2%, при р<0,05). При курсовом 2-х месячном введении крысам-самцам в дозе 5 мг/кг эноксифол

также оказывает сдерживающее влияние на процептивное и рецептивное поведение, тогда как в дозе 60 мг/кг отмечается увеличение времени половой активности (65,0%, при р<0,05) и снижение количества подходов к интактным самкам (27,6%, при р<0,05), а также их покрытие опытными крысами-самцами (48,8%, при р<0,05). По литературным данным [1и51с1 N.1*.. Л а1., 2009; §1агаЬегоуа Я. е1 а1., 2011] известно, что дофамин и его агонисты способны стимулировать процептивное поведение у грызунов, в тоже время дофамин и серотонин угнетают копулятивное поведение (рецептивность). Ранее, в серии экспериментов с нейроанатизаторами, нами были показаны дозозависимые дофамино- и серотонинопозитивные эффекты у эноксифола, которые, возможно, и привели к активации процептивных компонентов полового поведения и угнетению копулятивности животных -наиболее выраженную в дозе 60 мг/кг.

Таблица 3.

Влияние препарата дибазол (внутрижелудочное введение) при 5-ти дневном и 2-х

месячном воздействии на репродуктивную с ункцию крыс-самцов .

5-ти дневное введение в дозах 2-х месячное введение в дозах !

Исследуемые показатели 5 мг/кг 1 160 мг/кг 5 мг/кг 160 мг/кг

«Предтестикулярный» уровень репродуктивной функции

Процептивность(у.е.) 1 5,0?" 8,01« 3,01"

Рецептивность(уе.) | 3,0!" 9,01" 2,01« 7,0?«

«Тестикулярный» у! ювень репродуктивной функции

Общее количество сперматозоидов в 1 ш1 (1*10*) 0,51" 1,0!« 5,01*

Индекс сперматогенеза (у е.)

Общее количество сперматогоний 1,01" 1,01*

Число канальцев со слущенным эпителием (%) 4,01" 5,01" 9,5?«

Число канальцев с ХП стадией мейоза (%) з,от* 3,01» 3,0?*

«Посттестикулярный» уровень репродуктивной функции

Время подвижности сперматозоидов (мин.) 3,0|« 2,01* 3,01* 4,0?«

Осмотическая резистентность сперматозоидов 1,0?" 1,01"

Кислотная резистентность сперматозоидов 0,51* 1,01*

Коэффициент фертилизации (у.е.) 0,31« 0,81* 0,8?"

Индекс оплодотворяющей способности {<$ в %)

Общая эмбриональная гибель плодов (%) 5,9|« 3,31* 4,61*

Срок беременности (дни) 1 3,01« 2,ОТ* 1.0?«

Примечание: #- представлены статистически значимые эффекты по отношению к контролю при рЗ).05, <ф> -увеличение параметра на 10%; «1» - уменьшение параметра на 10%; * - изменения в количество раз относительно контроля.

На «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы в серии экспериментов по изучению структурно-функциональных показателей спермиограммы и морфометрии гонад крыс-самцов установлено, что после короткого курса введения эноксифола в дозах 5 мг/кг и 60 мг/кг отмечается активация выброса сперматозоидов из тестикул в эпидидимисы. В этой связи в сменной жидкости достоверно

повысилось количество сперматозоидов (55,3% и 15,1%, соответственно дозам 5 мг/кг и 60 мг/кг) и их патологических и неподвижных форм, и как следствие уменьшился коэффициент фертилизации. По литературным данным [Герасимов A.M. и др., 2003; Owen D.H. et al., 2005] увеличение абсолютного количества сперматозоидов в семенной жидкости, вследствие конк\ренции за энергетический субстрат, .может приводить к снижению времени их подвижности, что отмечалось и в наших исследованиях. При этом отмечено, что под действием эноксифола осмотическая резистентность сперматозоидов повышалась (в среднем на 8,7%, при р<0,05), что, вероятно, повысило их «фертилизующий патенциал» в половых путях самок [Sharma R.K. et al., 2001] и сказалось на результатах по улучшению качества зачатия и снижении эмбриональной гибели плодов у самок, спаренных с этими самцами.

При исследовании спермиограммы у крыс-самцов после Kjpcosoro (2-х месячного) введения эноксифола обнаружено, что под его действием достоверно дозозависимо увеличиватось общее количество сперматозоидов (17,4% и 34,1%, соответственно дозам 5 мг/кг и 60 мг/кг), а так же общее количество их патологических форм (27,4%, в дозе 60 мг/кг), но при этом общее количество неподвижных форм сперматозоидов изменяется неоднозначно - уменьшается у крыс-самцов в дозе 5 мг/кг (23,4%, при р<0,05) и возрастает -в дозе 60 мг/кг (73,6%, при р<0,05). В тоже время, количество потенциально активных сперматозоидов оставатось повышенным в обеих опытных группах (в среднем на 25,5%, при р<0,05), тогда как коэффициент фертилизации возрастал только у самцов, получавших эноксифол в дозе 5 мг/кг, что, вероятно, и привело к увеличению количества имшантированных плодов у забеременевших самок от этих крыс-самцов.

Изменения, выявленные при изучении спермиограммы у опытных крыс-самцов, подтвердились и морфологическими исследованиями гонад. У экспериментальных самцов (при различных курсах введения) дозозависимо увеличиватись признаки митотической и мейотической активностей в семенных канатьцах (рост числа канатьцев со слущенным эпителием и 12-й стадией мейоза). При этом неоднозначно изменялись коэффициенты масс семенников (достоверно возрастали - при коротком курсе введения эноксифола в дозе 60 мг/кг (11,8%) и снижашсь при курсовом введении эноксифола в дозе 5 мг/кг (11,4%). В тоже время, дозозависимое увеличение числа канатьцев со слущенным эпителием, вероятно, свидетельствует о диссонансе в нормальных трофических взаимоотношениях между спсрматогенными клетками и сустентоцитами [Макарова Н.П., 2006].

Данные влияния на репродуктивную систему нашло своё отражение и в исследованиях по изучению оплодотворяющего способности опытных крыс-самцов, получавших разными ку рсами эноксифол в дозах 5 мг/кг и 60 мг/кг. Установлено, что при коротком курсе введения в дозе 5 мг/кг эноксифол снижал индекс оплодотворяющей способности и сроки наступления беременности, что по ряду литературных данных [Di Sebastiano A.R. et al., 2011; Zhavbert E.S. et al., 2011] может быть следствием отмеченного ранее снижения параметров процептивного и рецептивного компонентов полового поведения. В тоже время в дозе 60 мг/кг, напротив, отмечалось ускорение наступление зачатий у интактных крыс-самок - в среднем на 7 дней по сравнению с контролем, что, вероятно, связано с активацией полового поведения в данной группе опытных крыс-самцов.

Схожие эффекты отмечены и при введении эноксифола в течение 2-х месяцев крысам-самцам в дозах 5 мг/кг и 60 мг/кг. При этом отмечено незначительное снижение индекса оплодотворяющей способности опытных крыс-самцов и ускорение времени наступления зачатий в среднем ка 3 дня по отношению к контролю, что может быть связано с улучшением фертилизирующих свойства сперматозоидов у экспериментальных крыс-самцов.

При исследовании репродуктивных эффектов бемитила на «предтестикулярном» уровне регуляции репродуктивной системы (таблица 5) установлено, что при 5-ти

17

дневном введении под действием бемитила в дозе 5 мг/кг у крыс-самцов повышается уровень процептивности (43,0%, при р<0,05) и активируется рецептивность (82,9%, при р<0,05). Под действием препарата в дозе 160 мг/кг у крыс-самцов, напротив, снижается процептивные мотивации (19,0%, при р<0,05) и рецептивность (22,0%, при р<0,05).

При 2-х месячном введении крысам-самцам в зависимости от дозы бемитил изменяет у них процептивное и рецептивное поведение. Под действием бемитила в дозе 5 мг/кг у самцов снижается процептивное поведение (36,8%, при р<0,05), но удлиняется его длительность (29,1%, при р<0,05), что в большей степени обусловлено избеганием от этих самцов интактных самок. Под действием бемитила в дозе 160 мг/кг половая активность у крыс-самцов снижается, при этом достоверно угнетается и процептивность (41,4%) и рецептивность (70,7%). Таким образом, препарат оказывает в зависимости от дозы разнонаправленное влияние на процессы, регулирующие половую активность крыс-самцов. Так в экспериментах по выявлению взаимодействия бемитила с 5-гидрокситриптофаном, выявлено его ссротонинопозитивное действие, наиболее выраженное в дозе 160 мг/кг, в тоже время серотонин снижает выработку гонадотропин-рилизинг гормона, который в свою очередь через угнетение выработки тестостерона, снижает половую активность крыс-самцов, особенно его рецептивные компоненты [Paredes R.G. et al., 2000], а также способен привести к снижению «репродуктивной привлекательности» самцов для самок [Galecva A.Yu. et al., 2003; HosokawaN. et al., 2010; Moshkin M.P. et al., 2011], что и наблюдалось в данных исследованиях.

При исследовании вмешательства бемитила на «тестикуляупом» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы установлено, что при его 5-ти дневном введении в дозах 5 мг/кг и 160 мг/кг у крыс-самцов достоверно дозозависимо возрастали - общее количество неподвижных форм сперматозоидов (55,5% и 66,0%, соответственно дозам 5 мг/кг и 160 мг/кг) и осмотическая резистентность (в среднем на 21,5% в обеих дозах), а также снижался коэффициент фертилизации (5,5% и 6,9%, соответственно дозам 5 мг/кг и 160 мг/кг). В то же время, у крыс-самцов при 2-х месячном введении бемитила в дозе 5 мг/кг достоверно увеличивалось общее количество сперматозоидов (26,2%) и количество их потенциально активных форм (31,4%), а также время их подвижности (11,1%) и коэффициент фертилизации (4,2%). Тогда как у крыс-самцов, под действием бемитила в дозе 160 мг/кг были отмечены эффекты угнетения сперматогенеза, проявляющиеся в достоверном снижении общего количества сперматозоидов (29,6%), числа их потенциально активных форм (33,9%), понижении коэффициента фертилизации (6,3%) и повышении патологических форм (14,8%, при р>0,05). Разнонаправленные изменения отмечались и в функциональном состоянии сперматозоидов опытных крыс-самцов: снижение кислотной резистентности (13,0%, при р<0,05) при практически не измененной осмотической в 1-й группе и рост кислотной резистентности (17,5%, при р<0,05) - на фоне снижения осмотической резистентности (10,2%, при р<0,05) -во 2-й группе.

В зависимости от дозы при различных курсах введения бемитил неоднозначно влиял на морфометрические параметры сперматогенеза: в дозе 5 мг/кг практически не оказыват действие на генеративный эпителий и только способствовал увеличению количества канальцев со слущенным эпителием на 47,4,2%, (р<0,05) - после 2-х месячного курса. Тогда как в дозе 160 мг/кг - его угнетал, при этом значительно повышалось число канальцев со слущенным эпителием в семенниках (302,4% и 152,6%, соответственно при 5-ти и 2-х месячном курсах введения), что вероятно можно рассматривать как явления застойной ингибиции сперматогенеза. Выявленные изменения, вероятно, обусловлены как наличием кумулирующих свойств бемитила в семенниках [Сергеева С.А. и др., 2003, 2006; Смирнова JI.A., 2002, 2004], так и прямым действием препарата на генеративный эпителий [Кузубова Е.А.,' 2001; Бугаева Л.И. и др., 2006].

При исследовании влияния препарата бемитил на оплодотворяющую способность крыс-самцов выявлено, что под действием бемитила при различных курсах введения в

дозе 5 мг/кг снижался индекс оплодотворяющей способности, но при этом у интактных самок ускорялись сроки наступления зачатия. У крыс-самцов, получавших 2-х месячным курсом бемитил в дозе 160 мг/кг, достоверно также снижался индекс оплодотворяющей способности, при этом качество беременности у ссаженных с ними самок было удовлетворительным: отмечался рост плодовитости, снижение постимплантационной эмбриональной гибели. Указанные изменения могут свидетельствовать о структурных перестройках сперматогенеза у крыс-самцов под воздействием бемитила, дозозависимо снижающих «фертилизирующую способность» сперматозоидов.

Таблица 4.

Влияние вещества энокснфол (внутрижелудочное введение) при 5-ти дневном и 2-х

месячном воздействии на репродуктивную >ункцню крыс-самцов

Исследуемые показатели 5-ти дневное введение в дозах 2-х месячное введение в дозах

5 мт/кг | 160 мг/кг 5 мг/кг 1 160мг/кт

«Предтестикулярный» уровень репродуктивной сЬункшш

Процептивность (у.е.) | 8,01* | 7,ОТ" 10,0|" 4,ОТ*

Рецегггивность (у.е.) | 4,01" | 13,ОТ* 6,01* 5,01*

«Тестикулярный» \ровень репродуктивной функшш

Общее количество сперматозоидов в 1 т1 (1*106) б,ОТ* j 2,ОТ* 2,0Т* з,от*

Индекс сперматогенеза (У.е.)

Общее количество сперматогоний ;

Число канальцев со слущешшм эпителием (%> 3,0Т* I з,от*

Число канальцев с ХП стадией мейоза (% | 3,0Т* 4,ОТ* 6,от* 6,0|*

«Посттестику.тярный» уровень репродуктивной функции

Время подвижности сперматозоидов (мин.) ! ' 4,01* 1,0Т* 1.01-

Осмотическая | резистентность 1 1,01* сперматозоидов > 1,0Г 1,01*

Кислотная резисте1шюсть \ сперматозоидов ! ' 1,01*

Коэффициент фертилизации (у.е.) 0,3|* 0,5Т* 0,41*

Индекс оплодотворяющей способности в %) 5,01."

Общая эмбриональная гибель плодов (%) з,вт*

Срок беременности (дни) 5,0Т* 2,ОТ* з,от*

Примечание: #- представлены статистически значимые эффекты по отношению к контролю при р<0.05, <ф> -увеличение параметра на 10%; <ф> - уменьшение параметра на 10%; * - изменения в количество раз относительно контроля.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что дибазол, эноксифол и бемитил оказывают выраженное влияние как на «предтестикулярном» уровне воздействия на репродуктивную систему, так и прямое влияние на «тестикулярном» и «посттестикулярном» у ровнях системы фертилизации крыс-самцов. При этом в результате вмешательства изученных биологически активных производных бензимидазола на «предтестикулярном» уровне репродуктивной системы в механизмы, регулирующие половое поведение крыс-самцов, после краткосрочного (5-ти дневного) курса введения, установлено снижение рецептивного и процептивного поведения у животных, получавших дибазол в дозах 5 мг/кг и 160 мг/кг, бемитил - в дозе

160 мг/кг и эноксифол - в дозе 5 мг/кг. И напротив, данные показатели полового поведения активировались у крыс-самцов, получавших эноксифол в дозе 60 мг/кг и бемитил - в дозе 5 мг/кг. При курсовом (2-х месячном) введении крысам-самцам установлено, что в их половом поведении процегттивность увеличивалась под действием дибазола в дозе 5 мг/кг, эноксифола - в дозе 60 мг/кг и снижалась под действием эноксифола - в дозе 5 мг/кг и бемитила - в дозах 5 мг/кг и 160 мг/кг. В тоже время рецептивность активировалась только под действием дибазола в дозе 160 мг/кг, тогда как во всех остальных исследуемых дозах веществ - наблюдалось угнетение данного параметра полового поведения опытных животных, наиболее значимое в дозе бемитила -160 мг/кг.

Таблица 5.

Влияние препарата бемитнл (внутрижелудочное введение) при 5-ти дневном и 2-х _месячном воздействии на репродуктивную функцию крыс-самцов ._

- 5-ти дневное введение в дозах I 2-х месячное введение в дозах

Исследуемые показатели 5 мг/кг I 160 мг/кг | 5 мг/кг 1 160 мг/кг

«Пое1Ггестикулярный» уровень репродуктивной функции

Процепгивность (у. е.) 10,от* 1 2,0|" 1,01* 1 6,01"

Рецептивность (у.е.) 8,ОТ* 2,01* ! 7,01*

«Тестикулярный» \товень репродуктивной функции

Общее количество сперматозоидов в 1 ш1 (1Ч06) з,от* 3,01"

Индекс сперматогенеза (У-е.) 0^т*

Общее количество сперматогоний 2,01"

Число канальцев со слущенным эпителием (%) 30,от* 5,0Т* 15,2Т*

Число канальцев с ХП стадией мейоза (%)

«Посггестикулярный» уровень репродуктивной функции

Время подвижности сперматозоидов (мин.) 1,01* 1,0Т" 2,ОТ*

Осмотическая р езистентность 2,0Т* 2,0 Т* 1,01*

сперматозоидов

Кислотная резистентность сперматозоидов 2,ОТ" 1,01- 2,ОТ*

Коэффициент фертилизации (у.е.) 0,6|* 0,7|* 0у4Г 0,61"

Индекс оплодотворяющей способности (3 в %) 5,01"

Общая эмбриональная гибель плодов (%) 3,2Т" 3,4Г 4,2Г

Срок беременности (дни) 3.0Т* 1 2,0Т"

Примечание: #- представлены статистически значимые эффекты по отношению к контролю при р2105, «|» - увеличение параметра на 10%; <ф> - уменьшение параметра на 10%; * - изменения в количество раз относительно контроля.

На «тестикулярном» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы у крыс-самцов на фоне 5-ти дневного курса введения дибазола, эноксифола и бемитила стимулировался сперматогенез. При этом стимулирующее влияние под действием эноксифола было выражено в большей степени, чем у дибазола и бемитила. При этом можно предположить наличие снижения фертилизующих свойств семени у крыс-самцов, получавших коротким ку рсом изучаемые вещества.

При курсовом (2-х месячном) введении под действием дибазола и бемитила у крыс-самцов отмечены явления нарушения сперматогенеза и снижение качества фертилизации этих самцов, наиболее выраженные в дозах, приближенных к токсическому диапазону (160 мг/кг). Эффекты дибазола и бемитила в минимальных эффективных дозах (5 мг/кг) свидетельствовали о стимуляции сперматогенеза (увеличение общего количества сперматозоидов, времени их подвижности и коэффициента фертилизации) и активации мейотической активности в семенниках (рост числа канальцев с 12-й стадией мейоза). В тоже время уменьшение кислотной резистентности сперматозоидов в спермиограмме -привело к снижению их оплодотворяющих свойств. Стимулирующее влияние эноксифола на сперматогенез было более физиологичным, чем у дибазола и бемитила, а активация мейотической активности в тестикулах не носила выхолащивающий характер.

Выводы.

1. Производные бензимидазола - дибазол, б&читил и эноксифол, в эксперименте оказывают влияние на репродуктивную систем)- крыс-самцов, выраженность которого зависит от дозового воздействия на «предтестикулярный», «тестикулярный» и «постгестикулярный» уровни регуляции генеративной функции крыс-самцов.

2. В нейротоксикологическом профиле препарата дибазол диапазон безопасной активности составляет от 1,25 мг/кг до 160 мг/кг, а диапазон токсической активности - от 161 мг/кг до 2560 мг/кг. При этом в дозе 5 мг/кг - «терапевтически эффективная безопасная доза» превалируют поведенческие и нервно-мышечные реакции, тогда как в дозе 160 мг/кг - «высшая эффективная безопасная доза, близкая к токсической» -вегетотропные реакции.

3. Для дибазола на «предтестикулярном», «тестикулярно.м» и «посттестикулярном» уровнях репродуктивной системы крыс-самцов установлено: увеличение продолжительности «никотинового тремора» и «феначиновой стереотипии», активация «апоморфиновой стереотипии» и «апоморфиновой вертикализации», рост количества спонтанных эрекций и усиление выраженности 5-ГТФ гиперкинеза, при этом отсутствует влияние на «гатоперидоловую каталепсию» и «ареколиновый гиперкинез»; угнетение рецептивное™ .при 5-ти дневном курсе введения в обеих дозах и активация рецептивности самцов при курсовом 2-х месячном введении препарата в дозе 160 мг/кг; признаки выхолащивающей стимуляции сперматогенеза и снижение фертильности сперматозоидов - в обеих дозах препарата при различных курсах введения крысам-самцам.

4. В нейротоксикологическом профиле вещества эноксифол диапазон безопасной активности составляет от 1,9 мг/кг до 238 мг/кг, а диапазон токсической активности - от 239 мг/кг до 1900 мг/кг. При этом в дозе 5 мг/кг - «терапевтически эффективная безопасная доза» превалируют вегетотропные эффекты, тогда как в дозе 60 мг/кг -«высшая эффективная безопасная доза, близкая к токсической» - поведенческие реакции. В тоже время ведущим механизмом его токсического действия является - прямое депримирующее влияние на ЦНС.

5. При изучении воздействия эноксифола на «предтестикулярный», «тестикулярный» и «посттестикулярный» уровни репродуктивной системы крыс-самцов установлено: потенцирование длительности «никотинового тремора» и «фенаминовой стереотипии», усиление выраженности «апоморфиновой вертикализации», дозозависимое увеличение количества зевательных движений, рост количества спонтанных эрекций (эноксифол в дозе 60 мг/кг), усиление выраженности 5-ГТФ гиперкинеза, снижение уровня «галоперидоловой каталепсии», отсутствие влияния на «ареколиновый гиперкинез» и «апоморфиновую стереотипию»; угнетение полового поведения, снижение индекса оплодотворяющей способности и сроков наступления беременности - в дозе 5 мг/кг, и напротив - активация полового

поведения и улучшение фертилизирующих свойств - в дозе 60 мг/кг; при этом в обеих дозах после различных курсов введения вещество активирует сперматогенез.

6. В нейротоксикологическом профиле препарата бемитил диапазон безопасной активности составляет от 1,25 мг/кг до 160 мг/кг, а диапазон токсической активности -от 161 мг/кг до 640 мг/кг. При этом в дозе 5 мг/кг - «минимально эффективная безопасная доза» превалирует активация поведенческих реакции, тогда как в дозе 160 мг/кг - «высшая эффективная безопасная доза, близкая к токсической» - в действии препарата превалируют эффекты трофотропного влияния на фоне его общеугнетающего психотропного действия на ЦНС.

7. Зависимое от дозы бемитила влияние на «предтестикулярный», «тестикулярный» и «посттестикулярный» уровни регуляции репродуктивной системы крыс-самцов предопределило и дозозависимость в эффектах. Установлены зависимые от дозы эффекты: при введении препарата в дозе 5 мг/кг - укорочение продолжительности «ареколинового гиперкинеза», увеличение продолжительности «никотинового тремора», увеличение количества зевательных движений; при введении препарата в дозе 160 мг/кг - удлинение продолжительности «ареколинового гиперкинеза», укорочение продолжительности «никотинового тремора», увеличение продолжительности «фенаминового гиперкинеза»; при введении препарата в дозах 5 мг/кг и 160 мг/кг - укорочение длительности «фенаминовой стереотипии», дозозависимый рост количества спонтанных эрекций, дозозависимое усиление выраженности 5-ГТФ гиперкинеза, снижение выраженности «гатоперидоловой каталепсии», отсутствие влияния на «апоморфиновую стереотипию». При этом препарат в дозе 5 мг/кг при 5-ти дневном к\рсе активирует рецептивное половое поведение крыс-самцов, а в дозе 160 мг/кг - угнетает. После 2-х месячного курса введения бемитил в дозе 5 мг/кг стимулирует процептивное поведение и угнетает процептивное и рецептивное половое поведение в дозе 160 мг/кг. В зависимости от дозы при различных курсах введения бемитил неоднозначно влияет на сперматогенез и фертилизирующие свойства крыс-самцов: под действием бемитила в дозе 5 мг/кг активируются процессы сперматогенеза и фертилизации и, наоборот, утнегается сперматогенез и оплодотворяющая способность — в дозе 160 мг/кг.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Букатин, М.В. «Влияние дибазола (бендазол) на генеративную функцию крыс» I М.В. Букатин, Е.А. Кузубова, Л.И. Бугаева, A.A. Спасов // Экспериментальная и клиническая фармакология». - 2007. - Том 70, №2. - С. 37-39.

2. Бугаева, Л.И. «Влияние эноксифола на поведенческую активность крыс-самцов» / Л.И. Бугаева, Е.А. Кузубова, A.A. Спасов, М.В. Букатин II «Вестник ВолгГМУ».

- 2012 .- №1. - С. 93-95.

3. Бугаева, Л.И. «Нейротоксикологические свойства препарата «Бендазол» / Л.И. Бугаева, Е.А. Кузубова, A.A. Спасов, М.В. Букатин // «Вестник ВолгГМУ. - 2012 г.

- №2,- С. 83-86

4. Бугаева, Л.И. «Токсические свойства препарата дибазол при однократном введении крысам» / Л.И. Бугаева, Е.А. Кузубова, A.A. Спасов, С.А. Никитин, М.В. Букатин //«Новые технологии в медицине (морфологические, экспериментальные, клинические и социальные аспекты)» Сб. трудов, посвященный 70-летию Сталинградского-Волгоградского института-академии университета. - Волгоград, 2005. - Т. 61, вып.1,-С.36-37.

5. Кузубова, Е.А. «Влияние препарата дибазол на сперматогенез крыс при однократном введении»/ Е.А. Кузубова, Л.И. Бутаева, М.В. Букатин // Материалы IV Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 13-16 марта. - Москва, 2006,- С 46.

6. Бугаева, Л.И. «Влияние эноксифола на гонадотропную функцию самцов» / ЛИ. Бугаева, Е.А. Кузубова, М.В. Букатин, Д.Н. Реброва // «Успехи Современного "Естествознания"». - 2006, № 8. - С.56.

7. Букатин, М.В. «Изучение токсикологических свойств нового антиоксиданта из группы N9 — замещенных имидазобензимидазолов» / М.В. Букатин 11 Материалы Межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с между народным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» YSRP-2006, 2224 ноября 2006 года. - Саратов,2006.-С. 60.

8. Бугаева, Л.И. «The influence of a new antioxidatic preparation on the reproductive function of male-rats» / Л.И. Бугаева, Е.А. Кузубова, A.A. Спасов, M.B. Букатин, Д.Н. Реброва // «European journal of natural history». - 2007, № 1. - с. 115-116.

9. Букатин, М.В. «Влияние препарата дибазол на половое поведение и показатели спермиограммы крыс-самцов» / М.В. Букатин // Материалы 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». 25-28 апреля 2006 г.- 2006 г.- С. 133.

10. Бугаева, Л.И. «Изучение профиля функционально-поведенческой токсичности препарата бемитил» / Л.И. Бугаева, Е.А. Кузубова, М.В. Букатин // «Современные наукоёмкие технологии». 2007, №11. - С. 68-69.

И. Бугаева, Л.И. «Investigation of neurogenic mechanism of dynamic-behavioural activity of Bendazol» / Л.И. Бугаева, A.A. Спасов, Е.А. Кузубова, М.В. Букатин // «European journal of natural history»- - 2008, № 1. - C. 81

12. Букатин, М.В. «Применение нового метода интегральной оценки функционально-поведенческого профиля действия веществ в токсикологических исследованиях производных бензимидазола» / М.В. Букатин // Материалы 66-й открытой научно-практической конференции молодых учёных с международным участием «Актуальные проблемы экспериментачьной и клинической медицины» 23-25 апреля 2008 г -Волгоград, 2008. -С. 156.

13. Букатин, M.B. «New method application of the integral evaluation of dynamic-behavioural aspect of substances in toxicological research of benzimidazole's derivatives» // «Высокие технологи!, фундаментальные и прикладные исследования, образование» Том 12 2008 г., с. 160-161

14. Букатин, М.В. «Изучение гонадотропных эффектов эноксифола у самцов крыс» / М.В. Букатин // «Вестник РАМН», приложение Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая 2008 г. - Москва,- 2008,№6. - С.74-75

15. Букатин, М.В. «Изучение взаимодействия препарата бендазол с агентами, возбуждающими центрачьные моноаминергические и холинергические структуры» / М.В. Букатин // I Всероссийская молодежная научная конференция «Молодежь и Наука на севере» 14-18 апреля 2008 г. - Сыктывкар, 2008. - Т. И. - С.189.

16. Букатин, М.В., «Исследование влияния биологически активных производных бензимидазола на функционально-поведенческий статус животных» / М.В. Букатин // Архангельская международная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Архангельск 16-18 мая 2008): «Бюллетень Северного Государственного Медицинского Университета».- 2008,- №1 (выпуск XX). - С. 21-22.

17. Букатин, М.В. «Действие производного бензимидазола - препарата бемитил на половое поведение самцов крыс при краткосрочном курсе введения» / М.В. Букатин // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 65-летию Ярославской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль 22-24 апреля 2009 г): сб. научн трудов. - Ярославль. - 2009. - С. 114-115.

18. Букатин, М.В. «Исследование поведенческой активности животных в тесте "открытое поле" на фоне предварительного перорального введения бендазола» /

(л

МВ Букатин АН. Кривицкая, О.Ю. Овчинникова, А.В. Кузубов // «63-я итоговая научная конференция молодых ученых», посвященная 70-летию Молодежного научного общества Ростовского государственного медицинского университета (Ростов, 24 апреля): сб. аннотаций докладов и материалов ДНЯ НАУКИ. - Ростов-на-Дону. -2009. - С 179.

19 Букатин, М.В. «Изучение влияния препарата бемитил на сперматогенез при его краткосрочном, интрагастральном введении крысам-самцам» / М.В. Букатин, ВН. Сендрякова // 67-я открытая научно-практическая конференция молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и миническои медицины» (Волгоград, 22-24 апреля): материалы докладов,- Волгоград, 2009. - С.1 /О

20 Букатин, М.В., «Изучение острой токсичности производных бензимидазола -препаратов бендазол и бемитил»/ М.В. Букатин // Сборник трудов II Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы медицинскои науки и образования» (Пенза, 24-25 апреля).- Пенза, 2009. -С. 45-46.

21 Букатин, М.В. «Изучение токсических свойств препарата осмитил» М.В. Ьукатин, ' А В Кузубов // 68-я открытая научно-практическая конференция молодых ученых с

международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и™™и медицины», посвященная 75-легию ВолГМУ (Волгоград, 9-13 сентяоря 2010г). сб. материалов докладов - Волгоград, 2010,- С.176

22 Букатин, М.В. «Морфометрическая характеристика гонад крыс-самцов, коротким курсом получавших бендазол» М.В. Букатин, А.В. Кузубов // 69-я открытая научно-практическая конференция молодых учёных с международным уч^тием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» ВолгГМУ (Волгоград, 2/-3 и апреля 2011): сб. материалов докладов,- Волгоград, 2011,- С.235-236.

23 Букатин, М.В. «Изучение влияния курсового введения бемитила л.а компоненты ' полового поведения'крыс-самцов» / М.В. Букатин, Л.И. Бугаева, Б.А. Кузубова //

«Современные наукоёмкие технологии». - 2013, №1, -С. 100-101.

Отпечатано в ООО «Экспресс-печать» 400005, г. Волгоград, ул. Пражская, 12 Тираж 120 экз.