Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Миелотоксичность противоопухолевого препарата паклитаксела и ее фармакологическая коррекция

4856610

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ЕЛЕНА ПАВЛОВНА

МИЕЛОТОКСИЧНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ПАКЛИТАКСЕЛА И ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 3 [,:;.р жй

Томск-2011

4856610

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Дыгай

профессор, академик РАМН, Александр Михайлович

заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук Чурин

Алексей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Венгеровский

профессор, заслуженный работник Александр Исаакович

высшей школы РФ

доктор медицинских наук Удут

Елена Владимировна

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ онкологии СО РАМН

Защита состоится "_"_______2011г. в__часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наух НИИ фармакологии СО РАМИ

Автореферат разослан "_" февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Амосова Е. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успехи в развитии новых методов терапии опухолевых заболеваний, классическая химиотерапия еще длительное время будет оставаться основой медикаментозного лечения онкологических больных [Гольдберг Е. Д. и др. 1994; Городецкий В. М., 1998; Волкова М. А., 2001; Попов А. М. и др., 2005]. В настоящее время в клинической практике в режиме монотерапии и в комбинации с другими цитостатиками используют противоопухолевые препараты растительного происхождения, в том числе, паклитаксел [Тюляндин С. А., 1997; Sledge G. W. et al. 1997; Bolis G. et al., 2000; Piccart M. J. et al., 2000; Sundstrom S. et al., 2002; Duenas-Gonzalez A. et. al., 2003]. Паклитаксел применяется для лечения рака яичников, молочной железы, головы, шеи, немелкоклеточного рака легкого и др. [Тюляндин С. А. и др., 1998; Тюляндин С. А., 2000; Манзюк Л. В., 2001; Verweij J. et al., 1994; Nabholtz J.-M. et al., 1996; Seidman A. D. et al., 1998]. Однако недостатком большинства антибластомных средств является их токсическое влияние на кроветворную ткань [Гершаиович М. JL, 1982; Гольдберг Е. Д. и др., 1992; Гольдберг Е. Д. и др., 1994; Гурьянцева J1. А. и др., 2006]. Паклитаксел, как и большинство противоопухолевых препаратов, при воздействии на организм, поражает систему крови [Ларионов J1. Ф., 1972; Гарин А. М., 2001; Гольдберг Е. Д. и др., 2007; Perez Е. A. et al., 1999]. Вследствие этого, развиваются анемия и нейтропения, возникновение которых в значительной степени повышает риск развития инфекционных осложнений [Гольдберг Е. Д. и др., 1992; Домникова Н. П. и др., 2004; Ватутин Н. Т. и др., 2009; Klastersky J., 1998; Lyman G. H. et al., 2005.]. Поэтому борьба именно с гематологическими осложнениями противоопухолевой химиотерапии остается по-прежнему актуальной в современной онкологии [Гершанович А. М., 1982; Переводчикова Н. И., 1993; Дыгай А. М. и др., 2001; Дыгай А. М. и др., 2008; Markman М. сt al., 2004]. Вскрытие механизмов гематотоксического действия противоопухолевых препаратов, при этом, является основой для разработки методов фармакологической коррекции их токсического влияния на систему крови.

Однако большинство препаратов, применяемых для нивелирования побочных эффектов химиотерапии, обладают рядом недостатков. Они могут вызывать повышение артериального давления, нарушения в системе гемостаза, приводить к дефициту железа в сыворотке крови и др. [Удут Е. В. и др., 2005; Singbartl G., 1994; Jabs К. et al., 1996]. В связи с этим, актуальным является поиск препаратов, которые, обладая минимальными побочными действиями, могли бы снижать токсическое влияние антибластомных средств на организм, в частности, на систему крови, не снижая при этом противоопухолевого действия цитостатиков. К настоящему времени накоплено большое количество экспериментальных и клинических данных о применении препаратов растений в профилактике и коррекции нарушений в системе крови, возникающих на фоне химиотерапии [Гольдберг Е. Д. и др., 2007; Дыгай А. М. и др., 2009]. Из данных литературы известно, что препараты, основными действующими веществами которых являются флавоноиды, снижают гематотоксичность антибластомных средств [Гольдберг Е. Д. и др., 1994; Разина Т. Г. и др., 2005; Дыгай А. М. и др.,

2009]. С целью коррекции побочных эффектов химиотерапии достаточно широко используются препараты с антиоксидантными свойствами [Скакун Н. П. и др., 1995; Сторожок Н. Н. 1998;].

В связи с вышеизложенным, перспективным является изучение веществ с антиоксидантными и гемостимулирующими эффектами (тиофана, эплира и экстракта шлемника байкальского) в качестве корректоров побочного действия противоопухолевой терапии на моделях миелосупрессии, вызванной паклитакселом.

Цель исследования. Изучить влияние паклитаксела на систему крови и лимфоидные органы экспериментальных животных, исследовать механизмы нарушения процессов кроветворения на фоне действия противоопухолевого препарата и оценить возможность коррекции повреждающего воздействия паклитаксела на систему крови крыс с помощью препаратов различного происхождения.

Задачи исследования.

1. Оценить характер повреждающего действия паклитаксела при его однократном введении в максимально переносимой дозе на параметры периферической крови, костного мозга, лимфоидных органов экспериментальных животных.

2. Исследовать динамику содержания клеток-предшественников в костном мозге у мышей после однократного введения паклитаксела.

3. Изучить механизмы развития нарушений в системе крови и лимфоидных органах экспериментальных животных после применения паклитаксела.

4. Исследовать возможные пути коррекции миелотоксичности паклитаксела после его однократного введения крысам фармакологическими веществами различного происхождения (тиофаном, эплиром, экстрактом шлемника байкальского).

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые проведена комплексная оценка влияния паклитаксела в ранние и отдаленные сроки цитостатической миелосупрессии на кроветворные прекурсоры, морфофунк-циональные показатели клеток костного мозга, периферической крови и лимфоидных органов экспериментальных животных. Обнаружено, что введение паклитаксела приводит к угнетению всех ростков кроветворения, сопровождающемуся истощением пула клеток-предшественников, развитием гипопластической анемии, тромбоцитопении, лейкопении в периферической крови, апоптотиче-ской гибелью клеток в тимусе. Показана однотипность влияния паклитаксела на систему крови у разных видов животных (мыши линии СВА/СаЬас и аутбред-ные крысы). Впервые на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной паклитакселом, показано влияние препаратов различного происхождения (тиофана, эплира, экстракта шлемника байкальского) на гемопоэз. При этом, выявлено, что применение изученных веществ в качестве корректоров цитостатиче-ских нарушений в системе крови и лимфоидных органах приводит к снижению токсического действия паклитаксела и нормализации процессов кроветворения. Показано выраженное влияние тиофана и эплира на лимфопоэз. Экстракт шлемника байкальского, в равной степени, стимулирует все ростки кроветворения.

Полученные данные позволяют судить о механизмах нарушений, возникающих в системе крови под влиянием паклитаксела, а также о возможных путях коррекции гематологических нарушений после его применения. Результаты исследования могут быть использованы в разработке рекомендаций для клинической практики, с целью повышения эффективности применения противоопухолевых препаратов группы таксанов в схемах химиотерапии злокачественных новообразований, с минимальными осложнениями со стороны системы крови.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2007), «Науки о человеке» (Томск, 2007), «Проблемы онкофармакологии» (Томск, 2008), «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2007,2008,2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получен I патент (RU) на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 262 литературных источника, из них 133 отечественных и 129 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 100 мышах-самцах линии CBA/CaLae I категории массой 18-20 г и 140 аутбредных крысах-самках массой 250-300 г. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986 г.).

Противоопухолевый препарат - паклитаксел (митотакс «Д-р Редди'с Лабораторис ЛТД» производство Индия) вводили мышам однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (МПД) 40 мг/кг и крысам однократно внутривенно в МПД 5 мг/кг. МПД рассчитывали методом графического пробит-аиализа при наблюдении за животными в течении 30 дней. За величину МПД принимали дозу, вызывающую 10% летальность [Беленький Л. М., 1963]. Цитостатик растворяли ex tempore. Физиологический раствор группе контрольных животных вводили в эквивалентном объёме: мышам однократно внутрибрюшинно и крысам однократно внутривенно. Исследования проводили в динамике через 6, 24, 48 часов на 5-е, 9-е, 11-е, 14-е сутки после введения цитостатика для мышей, через 6, 24, 48 часов на 5-е, 10-е, 15-е, 30-е сутки - для крыс.

В качестве корректоров токсических эффектов вводили фармакологические вещества: антиоксидант синтетического происхождения тиофан (фонд «Биоантиоксидант», г. Новосибирск), антиоксидант природного происхождения эплир (ООО «Биолит», г. Томск) в дозе 30 мг/кг в 1% крахмальной слизи, экстракт шлемника байкальского в дозе 40 мг/кг, разведенный в дистиллированной воде. Сырьем для экстракта послужили

«волосатые корни» шлемника байкальского, полученные и выращенные биотехнологическим способом (к. б. н. Кузовкина И. Н., Институт Физиологии Растений РАН, г. Москва). Экстракт шлемника байкальского представляет собой комплекс веществ, извлекаемый из сырья (так называемых «волосатых корней») 70% раствором этанола, и содержит 50%-57% флавоноидов вогонина и вогонизида в пересчете на сухое вещество. Исследования проводили через 6,24, 48 часов и на 5-е, 10-е, 15-е, 30-е сутки наблюдения для крыс, получавших тиофан и эплир, и через 6, 24, 48 часов и на 5-е, 10-е сутки для животных, получавших экстракт шлемника байкальского. Для оценки изучаемых показателей на ранних этапах (6, 24, 48 часов, 5-е сутки) корректоры вводили внутрижелудочно, непосредственно после введения цитостатика, затем один раз в сутки, до выведения животных из эксперимента. Для анализа значений на 10-е, 15-е, 30-е сутки исследования корректоры вводили пятикратно один раз в сутки, начиная через 24 часа после применения цитостатика.

Определение показателей периферической крови (концентрация гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гематокритное число) проводили, используя автоматический гематологический анализатор Abacus (Diatron, Austria) и общепринятые методы исследования [Меньшиков В. В., 1987]. Дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы в периферической крови, миелограмм в костном мозге, цитограмм в тимусе и селезенке, производили стандартными гематологическими методами. Содержание клеток-предшественников гемопоэза исследовали методом клонирования миелокариоцитов в метилцеллюлозной культуральной среде [Гольдберг Е. Д., 1992]. При подсчете цитограмм тимуса определяли процент клеток с признаками апоптоза (конденсацией и маргинацией хроматина ядра, его пикнозом и фрагментозом, расщеплением на глыбки и др.) [Martin S. J. et al., 1994]. Полученные показатели выражали в относительных (%) единицах. Гистологическое исследование селезенки и тимуса проводили после фиксации в жидкости Карнуа и заливки в парафин. Полученные срезы окрашивали гемотоксилином и эозином [Меркулов Г. А., 1969]. Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с помощью факторного анализа в среде программ «StatPlus 2009». Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое (X), ошибку среднего арифметического (m). Проверку на нормальность распределения проводили с помощью стандартизированных коэффициентов ассиметрии и эксцесса. При несоответствии распределения нормальному закону, использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Уровень значимости критериев задавали рапным 1% и 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ проведенных исследований показал, что введение паклитаксела в МПД вызывает угнетение всех ростков кроветворения у экспериментальных мышей. В костном мозге мышей выявлено снижение содержания КОЕ-Э, КлОЕ-Э в период наблюдения с 6 часов по 2-е сутки, с последующим его увеличением до контрольных величин (рис. 1). Это свидетельствует об ускоренном созревании эритроидных клеток-предшественников, что предполагает

В КОЕ-Э □ КлОЕ-Э С ИД-Э

И зритроидные клетки Е митозы

24 ч 48 ч 5сут Эсут 14сут

сроки исследования

6ч 24ч 48ч 5сут 9сут 11сут 14сут сроки исследования

Рис. I Содержание клеток-предшественников эритроидного ростка кроветворения в костном мозге мышей линии СВА/СаЬас, после введения иаклитаксела в МПД

6ч 24ч 43ч 5сут 7сут Эсут 11сут 14сут

сроки исследования

а ретикулоциты и гематокрит

Рис. 2. Содержание эритроидных клеток и митозов эритроидного ростка кроветворения в костном мозге мышей линии СВА/СаЬас, после введения иаклитаксела в МПД

еч

24ч 48ч 5сут 7сут Эсут 11сут 14суг

сроки исследования е; гемоглобин н эритроциты

Рис. 3. Содержание гемоглобина и эритроцитов в периферической Рис. 4. Содержание ретикулоцитов и гематокритного числа в перифе-крови мышей линии СВА/СаЬас, после введения иаклитаксела в ческой крови мышей линии СВА/СаЬас, после введения паклитаксела МЦЦ в МВД

Примечание. На рис 1 - 8 * - знак достоверности (Р<0,05), ** - знак достоверности (Р<0,01) при сравнении группы животных, получавших

паклитаксел с группой животных, получавших физиологический раствор.

незначительное их повреждение цитостатиком [Гольдберг Е. Д. и др., 1999; Дыгай А. М. и др., 2001].

Количество эритроидных клеток в костном мозге мышей было достоверно ниже контрольных значений на протяжении всего периода исследования (исключая 5-е сутки) (рис. 2). Следует отметить, что такое действие препарата на эритроидные клетки может быть связано с угнетающим эффектом на Т-лимфоциты. Известно, что Т-лимфоциты периферической крови, Т-клетки селезенки и тимоциты обладают способностью стимулировать пролиферацию ранних клеток-предшественников эритропоэза [Гольдберг Е. Д. и др., 1983; Агафонов В. И. и др., 1994]. Отражением состояния костномозгового эритропоэза после введения противоопухолевого препарата стали соответствующие изменения в периферической крови. Так, было отмечено снижение содержания эритроцитов (исключая б, 48 часов), ретикулоцитов, уровня гемоглобина (рис. 3). Однако наиболее выраженное снижение абсолютного количества эритроцитов было отмечено на 5-е и 11-е сутки (на 20% и 25% соответственно, по сравнению с контрольными величинами). Минимальный уровень гемоглобина наблюдался на 9-е сутки и составил 63% от соответствующего контрольного значения. Количество ретикулоцитов было выше контрольных величин с 9-х суток эксперимента и до конца наблюдения (рис. 4). Гематокритное число снижалось через 24 часа, повышалось на 2-е сутки (122% от исходных величин) и снова уменьшалось на 5-е, 11-е сутки (рис. 4). В селезенке отмечалось снижение числа эритроидных клеток через 24 часа у мышей линии CBA/CaLac, но уже на 9-е сутки их количество возрастало в 28 раз и достоверно превышало контрольные значения.

При исследовании эритроидного ростка кроветворения крыс после введения паклитаксела количество эритроидных клеток в костном мозге уменьшалось через 6, 24, 48 часов и на 10-е сутки. В периферической крови наблюдалось снижение уровня гемоглобина и содержания эритроцитов только через 24 часа на 18% и 13% соответственно, в сравнении с контрольными величинами, количество ретикулоцитов понижалось на 24, 48 часов и 5-е сутки. В селезенке крыс было выявлено снижение числа эритроидных клеток через 48 часов на 73%, с последующим увеличением на 5-е, 10-е, 15-е сутки. Возможной причиной токсического эффекта химиотерапии на эритроциты является либо прямое прооксидантное действие цитостатиков, либо создание условий для усиления процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов [Бармина С. Э., 1990; Степовая Е. А. и др., 1999; Плотников М. Б. и др., 2000].

При проведении химиотерапии в стандартных дозах у 10-45% больных развивается нейтропения [Гершанович М. Л., 1982; Ватутин Н. Т. и др., 2009; Rolston К. V., 1999; Ozer Н. et al., 2000; Lyman G. H. et al., 2005]. Согласно данным литературы, смертность от инфекции, развившейся на фоне нейтропении, составляет около 10% [Klastersky J., 1998; Lyman G. H. et al., 2005]. При исследовании миелоидного ростка кроветворения после введения паклитаксела у мышей линии CBA/C'aLac отмечено снижение содержания миелобластов, незрелых и зрелых иейтрофильных лейкоцитов. Максимальное понижение численности зрелых нейтрофильных гранулоцитов наблюдалось на 5-е сутки (8% от контрольных значений), что можно объяснить истощением

пула клеток-предшественников гранулоцитопоэза. Об этом свидетельствует снижение количества КОЕ-Г, КлОЕ-Г от начала эксперимента и до 2-х суток, с последующим повышением на 9-е сутки, и повторным снижением данного параметра на 14-е сутки (рис. 5). Данные изменения могут быть следствием не только прямого повреждающего действия цитостатика на клетки гранулоцитопоэза, но и угнетающего влияния паклитаксела на лимфоидный росток кроветворения. Известно, что лимфоциты в условиях цитостатического воздействия секретируют ИЛ-3 и ГМ-КСФ [Гольдберг Е. Д. и др., 2007; Дыгай А. М. и др., 2009]. ИЛ-3 при этом активирует пролиферацию клеток-предшественников различной степени зрелости, начиная с ПСКК, до коммитированных прекурсоров всех ростков миелопоэза, а ГМ-КСФ стимулирует рост КОЕ-ГЭММ и всех ее потомков [Натан Д. Г. и др., 1994; Гольдберг Е. Д. и др., 2007; Hill A. D. et al., 1995]. При этом содержание КОЕ-ГМ было повышено через 24 часа и на 2-е, 5-е, 9-е сутки. Угнетение гранулоцитарного ростка костного мозга сопровождалось низким содержанием числа нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов в периферической крови мышей с 1-х по 14-е сутки исследования (рис. 6). По-видимому, эти процессы являются следствием воздействия противоопухолевого препарата на систему крови путем повреждения пролиферирующих клеток, замедления клеточного деления из-за влияния на синтез ДНК [Гольдберг Е. Д. и др., 1999; Хричкова Т. Ю. и др., 2005]. Увеличение содержания нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови через 6 часов, по-видимому, является неспецифической стресс-реакцией на введение цитостатика [Гольдберг Е. Д. и др., 1983; Дыгай A.M. и др., 1992; Гольдберг Е. Д. и др., 1997; Карпова Г. В. и др., 2007]. В селезенке мышей отмечалось пониженное содержание зрелых нейтрофильных лейкоцитов с 24 часов по 9-е сутки.

При введении паклитаксела крысам в кроветворной ткани отмечались изменения, сходные со сдвигами в миелоидном ростке кроветворения у мышей. Так, в костном мозге крыс наблюдалось снижение количества миелобластов через 6 часов и на 15-е сутки (рис. 7). Число незрелых нейтрофильных лейкоцитов уменьшалось через 24, 48 часов, а количество зрелых нейтрофилов было достоверно ниже контрольных величин на 5-е сутки и составляло 9% от контрольных величин (рис. 7). При этом, введение препарата крысам вызывало снижение числа нейтрофильных гранулоцитов только на 5-е сутки в периферической крови на 90% (рис. 8) и селезенке на 75%, в сравнении с контрольными величинами.

В костном мозге мышей (рис. 2) и крыс через 6 часов отмечено повышение содержания митозов клеток как миелоидного, так и эритроидного ростков кроветворения, с последующим снижением их числа на 2-е и 9-е сутки. По-видимому, через 6 часов были выявлены так называемые «патологические митозы», что связано с механизмом действия паклитаксела. В основе противоопухолевого действия цитостатика лежит способность индуцировать полимеризацию микротрубочек. Стабилизируя микротрубочки за счет подавления их деполимеризации, паклитаксел приводит к угнетению динамической реорганизации сети микротрубочек. При этом, паклитаксел блокирует делящиеся клетки в фазе G2/M клеточного цикла, образуя

9сут 14сут

сроки исследования

И КОЕ-Г □ КлОЕ-Г с ИД-Г

Рис. 5. Содержание клеток-предшественников миелоидного рсстка кроветворения в костном мозге мышей линии СВА/СаЬас, после введения паклитаксела в МПД

сроки исследования В миелобласты □ незрелые нейтрофилы

Рис. 7. Содержание миелобластов и незрелых нейтрофилов в костном мозге крыс, после введения паклитаксела в МПД

сроки исследования

5 лейкоциты £3 зрелые нейтрофилы

Рис. 6. Содержание лейкоцитов и зрелых нейтрофнлов в периферической крови, мышей линии СВА/СаЬас, после введения паклитаксела в МПД

сроки исследования

Нлейкоцты □ зрелые нейтрофилы

Рис. 8. Содержание лейкоцитов и зрелых нейтрофилоз в периферической крови крыс, после введения паклитаксела в МПД

генетически поврежденные анеуплоидные клетки [Сухачева Т. В. и др., 2001; Бессмельцев С. С., 2003].

При исследовании лимфоидного ростка кроветворения отмечено снижение числа лимфоцитов в костном мозге мышей на 1-е, 2-е и 14-е сутки. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что цитостатики вызывают нарушения функциональной активности лимфоцитов и содержания их отдельных субиопуляций [Гольдберг Е. Д. и др., 2000]. Лейкопения в периферической крови развивалась, за счет снижения содержания лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов. Количество лимфоцитов в периферической крови мышей, понижаясь через б часов, оставалось сниженным на протяжении всего периода исследования. При этом, число моноцитов после введения паклитаксела также было достоверно ниже контрольных значений в течение всего периода наблюдения (исключая 5-е, 9-е сутки). В тимусе количество средних тимоцитов снижалось на 2-е, 5-е, 14-е сутки. Наряду с этим, наблюдалось повышение содержания зрелых лимфоцитов в тимусе мышей через 24 часа на 4%, по сравнению с контрольными величинами, с последующим снижением исследуемого параметра на 2-е, 9-е сутки. После введения цитостатика в селезенке выявлено снижение числа больших лимфоцитов через 6, 24, 48 часов и на 9-е сутки. Количество средних лимфоцитов, напротив, повышалось через 6, 48 часов и на 5-е сутки. Содержание малых лимфоцитов в селезенке было увеличено только на 5-е сутки на 7%, в сравнении с контрольными значениями.

При исследовании лимфоидного ростка кроветворения крыс после введения паклитаксела была выявлена аналогичная динамика, как и в системе крови мышей. В костном мозге крыс было отмечено снижение числа лимфоцитов через б часов и на 10-е, 15-е сутки, и повышение данного параметра на 5-е сутки (151% от контрольных величин). Увеличение количества лимфоцитов в костном мозге крыс на 5-е сутки можно объяснить тем, что в период резкого обеднения клеточного состава костного мозга развивается лимфоидная реакция, связанная с миграцией клеток тимического происхождения [Мелик-Гайказян Е. В., 1980; Гольдберг Е. Д. и др., 1999]. Об этом свидетельствует повышение количества малых лимфоцитов в тимусе через 48 часов на 6%, по сравнению с контрольными значениями, с последующим снижением на 5-е сутки на 8%, также исследуемый показатель был достоверно выше на 10-е и 30-е сутки в сравнении с контрольными величинами. При этом, число больших лимфоцитов в тимусе при введении цитостатика повышалось на 5-е сутки (на 80%), а на 15-е, 30-е, сутки данный параметр был достоверно ниже контрольных значений. Количество средних тимоцитов было снижено в течение всего периода исследования (исключая 6 часов). В селезенке, напротив, содержание больших лимфоцитов было ниже контрольных величин на протяжении всего периода исследования (за исключением 6, 48 часов), а число средних лимфоцитов снижалось на 1-е и 10-е сутки на 24% и 47% соответственно. Содержание малых лимфоцитов в селезенке понижалось только на 5-е стуки (на 21% по сравнению с группой контроля). По данным гистологического исследования, также наблюдалось снижение клеточности тимуса и селезенки крыс. В периферической крови крыс отмечено снижение

числа лимфоцитов на 1-е, 5-е, 30-е сутки. Исследования, проведенные в НИИ фармакологии СО РАМН, показали, что одним из механизмов развития токсических эффектов паклитаксела является усиление ПОЛ [Ермолаева Л. А., 2008, Колотова О. В. и др., 2008; Колотова О. В. и др., 2009]. Усиление ПОЛ приводит к непосредственному повреждению клеточных мембран при цитостатическом воздействии [Франциянц Е. М. и др., 1995; Ветошкина Т. В. и др., 1998; Ларионова В. Б.и др., 2004; Ермолаева Л. А., 2008]. Перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий, приводит к высвобождению ферментов в цитоплазму и активации апоптотического каскада, запускающего механизм программированной гибели [Ларионова В. Б. и др., 2004; Nelson S. D., 1995; Sturgill M. G. et al., 1997; Anderson К. M. et al., 1999]. Так, в тимусе отмечено повышенное содержание клеток с признаками апоптоза на 2-е и 9-е сутки у мышей (в 4,7 и 13,3 раза, в сравнении с группой контроля), через 24 часа и 5-е сутки у крыс (на 174% и 150% выше контрольных значений). Цитостатическое действие многих противоопухолевых препаратов обусловлено индукцией апоптоза [Владимировская Е. Б. и др., 1997; Гольдберг Е. Д. и др., 1999; Жукова О. Б., 2006; Карпова Г. В. и др., 2006; Балашова Е. Е. и др., 2008]. К таким препаратам относится и паклитаксел [Blagosklonny M. V. et al., 1996; Milross С. G. et al., 1996; Lieu C. H. et al., 1997; Rodi D. J. et al., 1998].

Таким образом, однократное введение паклитаксела в МПД вызывало изменения, соответствующие картине цитостатической миелосупресии, которая сопровождалась угнетением всех ростков кроветворения. При этом развивалась гипоплазия костного мозга, панцитопения в периферической крови, отмечалось развитие процессов апоптоза, что сопровождалось снижением численности субпопуляций лимфоцитов в лимфоидных органах. Наиболее выраженное повреждающее влияние паклитаксел оказывал на миелоидный росток кроветворения. Развитие глубокой нейтропении, которая носила кратковременный характер, отмечалось в костном мозге, периферической крови, селезенке на 5-е сутки. Подобные изменения выявлялись и при введении других цитостатиков, таких как этопозид, адриамицин, циклофосфан [Тимина Е. А., 1998; Гольдберг Е. Д. и др., 1999; Дыгай А. М. и др. 2001].

Одним из основных механизмов повреждающего действия цитостатиков, в том числе и паклитаксела, на нормальные клетки кроветворной ткани при химиотерапии является избыточное накопление активных форм кислорода [Меньщикова Е. Б. и др., 2006; Ермолаева Л. А., 2008]. Следствием этого является повреждение системы антиоксидантной защиты (включая ее ферментативное и неферментативное звенья), нарушение иммунных механизмов, участие которых также чрезвычайно важно в процессах детоксикации и регуляции гемопоэза [Hung К. et. al., 1998; Turner T. T. et al., 2008]. Образование свободных радикалов становится причиной повреждения нуклеиновых кислот, окисления белковых молекул и полисахаридов, а также изменения интегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов, в том числе, и в костном мозге. В результате возникает блокирование митотического цикла гемопоэтических элементов и подавление пролиферативной деятельности костного мозга [Кустикова И. Н. и др., 2009].

Для коррекции обнаруженных нами изменений в системе крови и лимфоидных органах крыс, с учетом механизмов этих нарушений, были исследованы фармакологические вещества с гемостимулирующей и аптиоксидантнои активностью тиофан (антиоксидант синтетического происхождения, фонд «Биоантиоксидант», г. Новосибирск), эплир (антиоксидант природного происхождения, ООО «Биолит», г. Томск) и экстракт шлемника байкальского (адаптогениое, ноотропное и гемостимулирующее средство растительного происхождения). Сырьем для экстракта послужили так называемые «hairy root» («волосатые корни») шлемника байкальского, полученные и выращенные биотехнологическим способом (к. б. н. Кузовкина И. Н., Институт Физиологии Растений РАН, г. Москва). Стандартизация экстракта шлемника байкальского была проведена по основным флавоноидам вогонину и вогонизиду, содержание которых в сухом экстракте составило 50-57%.

Результаты проведенных исследований показали, что курсовое введение корректоров на фоне введения паклитаксела способствовало более раннему восстановлению системы крови, по сравнению с введением одного цитостатика.

Так, исследование эритроидного ростка кроветворения крыс после применения полифункционального антиоксиданта синтетического происхождения тиофана, имеющего в своем составе фенольное кольцо и сульфидную группу, показало повышение числа эритроидных клеток в костном мозге через 24 часа на 116%, в сравнении с группой животных (крыс), получавших паклитаксел, с последующим его снижением на 5-е сутки (на 86%). Применение тиофана приводило к достоверному повышению содержания эритроцитов, гемоглобина и гематокритного числа в периферической крови через 24 часа (рис. 9). Уровень гемоглобина на 10-е сутки был на 9% выше соответствующего показателя в группе животных, получавших паклитаксел. Количество ретикулоцитов увеличивалось на 1-е, 2-е, 15-е, 30-е сутки после применения тиофана (рис. 10). Введение тиофана крысам на фоне действия противоопухолевого препарата способствовало нормализации количества эритронормобластов в селезенке, увеличивая изучаемый параметр на 2-е, 15-е сутки, и снижая его через 6 часов, на 5-е, 10-е сутки. Одним из механизмов повреждающего действия паклитаксела на нормальные клетки кроветворной ткани является перскисное окисление дипидов, конечным продуктом которого являются альдегиды. Самыми известными являются малоновый диальдегид, вызывающий повреждение молекул белков и нуклеиновых кислот, и 4-гидрокси-2-ноненал (4-гидрокеиноненал) [Панкин В. 3. и др., 1997; Зенков Н. К., 2003; Esterbauer Н. et al., 1991]. 4-гидроксиноненал также известен как ростоизменяющий фактор и проапоптозный агент, причем его влияние зависит от его свойства связываться с клеточными белками [Zarkovic N. et al., 1993; Sovic A. et al., 2001]. Следовательно, целесообразно было применить в качестве корректора тиофан, который является ангиоксидантом синтетического происхождения. Тиофан эффективно нейтрализует свободные радикалы и гидроперекиси, что обусловлено синергическим сочетанием антирадикальной

сроки исследования

Рис. 9. Содержание эритроцитов в периферической крови крыс после коррекции тиофаном и эплиром

Рис. 10. Содержание ретикулоцитов в периферической крови крыс после коррекции тиофаном и эплиром

24ч 48ч 5сут Юсут 15сут ЗОсут

сроки, исследования

5сут

Юсут 15сут ЗОсут

сроки исследования

ыпакпитаксел атофан пэллир

Ппаклитаксвл ятиофан ЕЭплир

Рис. 11. Содержание лимфоцитов в костном мозге крыс Рис. 12. Содержание лимфоцитов в периферической крови крыс

после введения тиофана и эплира после введения тиофана и эплира

Примечание. На рис 9 - 16 * - знак достоверности (Р<0,05), ** - знак достоверности (Р<0,01) при сравнении группы животных, получавших корректоры с группой животных получавших паклитаксел, # - зпак достоверности (Р<0,05), ## - знак достоверности (Р<0,01) при сравнении

группы животных получавших корректоры,'с группой контроля.

активности его фенольных фрагментов с противопероксидным действием сульфидной группы [Менщикова Е. Б. и др., 2000; Просенко А. Е. и др., 2004].

При анализе показателей миелоидного ростка кроветворения, выявлено снижение в костном мозге крыс содержания миелобластов на 2-е и 5-е сутки и повышение данного показателя на 15-е сутки (в 2 раза) после введения тиофана, в сравнении с группой животных, получавших только паклитаксел. Число зрелых нейтрофилов повышалось через 6 часов и на 15-е сутки после введения тиофана на фоне действия цитостатика. В периферической крови и селезенке со стороны содержания нейтрофильных лейкоцитов достоверных отличий выявлено не было. По данным литературы, пероральное курсовое применение тиофана оказывает выраженный антиоксидантный эффект и нормализует показатели ПОЛ у больных с ишемической болезнью сердца, при этом, препарат взаимодействует, преимущественно, с липопротеидами низкой плотности, повышая их резистентность к свободнорадикальному окислению, и снижает метаболическую активность циркулирующих граиулоцитов [Бахтина И. А. и др., 2000].

Исследование лимфоидного ростка кроветворения после введения тиофана на фоне действия паклитаксела показало снижение содержания лимфоцитов в костном мозге на 5-е сутки (69% от соответствующего значения группы с противоопухолевым препаратом), с последующим увеличением их числа на 10-е, 15-е сутки (рис. 11). В периферической крови применение тиофана способствовало снижению данного показателя через 6 часов, на 10-е сутки и его увеличению на 30-е сутки (рис. 12). Введение тиофана крысам после инъекции цитостатика приводило к повышению содержания средних лимфоцитов в тимусе через 24, 48 часов, на 10-е сутки (на 76%, 43% и 30% соответственно, в сравнении с группой паклитаксела). Также число малых лимфоцитов повышалось через 6 часов, снижаясь через 48 часов, при введении тиофана, увеличиваясь повторно к 30-м суткам. При этом, в селезенке количество больших лимфоцитов через 24 часа было в 5 раз выше соответствующих значений в группе животных, получавших паклитаксел. Число средних лимфоцитов в этот период снижалось, и повышалось на 10-е, 15-е сутки. Введение тиофана приводило к нормализации содержания малых лимфоцитов, увеличивая данный показатель через 6 часов и на 5-е сутки, и снижая на 15-е сутки. По данным гистологического исследования было выявлено замедление опустошения тимуса и селезенки. Такая же динамика отмечалась в экспериментах на облученных крысах, получавших курсом тиофан [Плотников М. Б. и др., 2003]. Из данных литературы известно, что применение тиофана способствует восстановлению содержания плазматических клеток, макрофагов и средних лимфоцитов. Возможно, такой эффект связан со способностью тиофана активировать регенераторные процессы на клеточно-мембранном уровне, что и приводит к нормализации морфологического соотношения клеточных культур. Так, в ряде исследований показано стимулирующее влияние тиофана на регенерацию костной ткани и кожи [Просенко А. Е. и др., 2004; Агеев А. С. и др., 2005].

Таким образом, введение тиофана крысам снижало токсические эффекты паклитаксела. В большей степени тиофан оказывал свое действие на

лимфоидный росток кроветворения. Также отмечалось повышение содержания эритроидных клеток в костном мозге, числа эритроцитов, уровня гемоглобина, гематокритного числа в периферической крови через 24 часа. Количество ретикулоцитов было повышено в течении всего периода наблюдения. Выявлена нормализация содержания миелобластов и зрелых нейтрофилов в костном мозге крыс. Количество миелобластов, снижаясь на 2-е и 5-е сутки, повышалось на 15-е сутки, число зрелых нейтрофилов повышалось через 6 часов и на 15-е сутки.

Исследование эритроидного ростка кроветворения у крыс после введения эплира на фоне действия паклитаксела выявило снижение числа эритроидных клеток костного мозга на 5-е сутки и повышение на 10-е, 15-е сутки наблюдения. В периферической крови при этом увеличивалось содержание эритроцитов, уровня гемоглобина и гематокритное число через 24 часа на 15%, 11%, 13% соответственно, в сравнении с группой паклитаксела (рис. 9). В этот же период количество ретикулоцитов было достоверно выше соответствующих значений в группе крыс, получавших только паклитаксел (рис. 10). При использовании эплира было отмечено снижение количества эритронормобластов в селезенке через 6, 24 часа и на 10-е сутки в 1,7, 2,9 и 1,7 раза соответственно, по сравнению с группой противоопухолевого препарата. Антиокислительные свойства эплира обусловлены имеющимися в его составе фосфолипидами, ксантофиллами, и каротиноидами, которые являются сильными акцепторами алкильных и перекисных радикалов [Скакун Н. П., 1993; Венгеровский А. И. и др., 2006]. Поэтому, встраиваясь в мембраны клеток, эти вещества нейтрализуют гидроперекиси, превращая их в неактивные оксикислоты, что приводит к обрыву цепей ПОЛ [Венгеровский А. И. и др., 1988; Венгеровский А. И., 2002].

При исследовании миелоидного ростка кроветворения наблюдалось снижение количества миелобластов в костном мозге на 2-е, 5-е сутки после введения эплира на фоне действия паклитаксела. При этом, в периферической крови крыс отмечалось снижение числа нейтрофильных лейкоцитов на 30-е сутки наблюдения (на 46%) после курсового введения эплира, в сравнении с группой животных, получавших только паклитаксел. В селезенке при введении эплира было выявлено повышение содержания зрелых нейтрофилов через 6 часов и на 15-е сутки исследования на 86%, в сравнении с группой паклитаксела. Фосфолипиды эплира препятствуют изменениям белок-липидных взаимодействий и воссоздают нормальную структуру мембран клеток. Это затрудняет доступ свободных радикалов, а также активных форм кислорода вглубь мембран, к полиеновым жирным кислотам [Венгеровский А. И. и др., 2006.].

Анализ показателей лимфоидного ростка кроветворения крыс показал, что использование эплира способствовало увеличению количества лимфоцитов в костном мозге через 6 часов на 30% и снижению исследуемого показателя через 48 часов на 31% (рис. 11). При этом, в периферической крови отмечалось повышение содержания лимфоцитов через 24 часа и на 5-е, 30-е сутки, и снижение данного показателя на 10-е сутки (рис. 12). Использование эплира приводило к увеличению содержания средних тимоцитов тимуса только через 24,48 часов на 55% и 39%, по сравнению с группой паклитаксела. Число малых

лимфоцитов также повышалось через б часов, снижаясь через 48 часов. При анализе спленограмм наблюдалось снижение числа больших лимфоцитов через 6 часов на 52% и повышение через 24 часа на 286% в сравнении с группой цитостатика. Применение эплира у крыс приводило к увеличению количества средних лимфоцитов на 10-е, 15-е сутки и снижению на 30-е сутки. Гистологическое исследование показало более быстрое восстановление клеточного состава лимфоидных органов. Выявленную динамику можно объяснить тем, что эплир способствует миграции клеточных элементов, снижая количество ядросодержащих клеток в селезенке и увеличивая их уровень в перитонеалыюм экссудате [Саратиков А. С. и др., 2005].

Таким образом, введение эплира, так же, как и применение тиофана, способствовало более быстрому восстановлению лимфоидного ростка кроветворения. Отмечалась нормализация содержания эритроидных клеток, миелобластов, зрелых нейтрофилов в костном мозге. Через 24 часа после введения паклитаксела было выявлено повышение числа эритроцитов, ретикулоцитов, уровня гемоглобина и гематокритного числа в периферической крови.

При исследовании эритроидного ростка кроветворения экспериментальных животных выявлено, что введение экстракта шлемника байкальского крысам на фоне действия паклитаксела приводило к увеличению количества эритроидных клеток в костном мозге в течение всего периода исследования, за исключением 5-х суток (рис. 13). В периферической крови, напротив, было отмечено снижение содержания эритроцитов и уровня гемоглобина через 6 часов, на 9% и 14% соответственно и через 48 часов на 15% и 12% соответственно, в сравнении с группой паклитаксела. При этом, число ретикулоцитов, напротив, было выше соответствующих значений в группе животных, получавших только паклитаксел, в течение всего периода наблюдения (рис. 14). В селезенке также было отмечено повышение количества эритронормобластов через 6, 24, 48 часов на 168%, 211%, 145% соответственно, с последующим снижением на 5-е сутки на 53%, в сравнении с группой противоопухолевого препарата. Из данных литературы известно, что применение экстракта шлемника байкальского при цитостатической миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, так же, как и курсовое применение данного препарата без цитостатиков сопровождается повышением в костном мозге содержания КОЕ-Э, гемопоэтических островков (эритроидного типа), и возрастанием концентрации гуморальных факторов регуляции эритропоэза в сыворотке периферической крови [Дыгай А. М. и др., 1991; Удут Е. В. и др., 2005; Dugai А. М. et al., 1996].

Применение экстракта шлемника байкальского также приводило к снижению количества миелобластов в костном мозге крыс. Содержание зрелых нейтрофилов снижалось через 6 часов на 34% после начала исследования, но увеличивалось на 5-е сутки на 368%, в сравнении с соответствующим показателем у животных, получавших паклитаксел (когда было отмечено наиболее выраженное угнетение данного показателя при введении паклитаксела) (рис. 15). Соответствующие изменения были выявлены и со стороны периферической крови, где наблюдалось повышение количества

нейтрофильных лейкоцитов на 5-е, 10-е сутки в 10,7 и 2,0 раза соответственно, в сравнении с группой паклитаксела (рис. 16). В селезенке данный показатель, снижаясь через 48 часов, увеличивался на 5-е сутки наблюдения (на 300% по сравнению с группой цитостатика). Такое действие на лейкоциты можно объяснить воздействием вогонина, входящего в состав экстракта шлемника байкальского. В экспериментальных исследованиях было показано, что вогонин повышает уровень ИЛ-1, ФНО-а в лейкоцитах крыс [Tang N-Y. et al., 2006]. Известно, что ИЛ-1 является синергистом ГМ-КСФ, ИЛ-3, а также стимулирует выработку Г-КСФ и ГМ-КСФ [Гольдберг Е. Д. и др., 2000; Fibbe W. Е. et al., 1988; Johnson С. et al., 1989]. Под действием ФИО наблюдается усиление выработки фибробластами и эндотелиальными клетками ГМ-КСФ и Г-КСФ [Metealf D., 1989; Moore М. A. S., 1989]. При этом ГМ-КСФ стимулирует рост КОЕ-ГЭММ и всех ее потомков [Натан Д. Г. и др., 1994; Гольдберг Е. Д. и др., 2007; Hill A. D. et al., 1995]. Применение ИЛ-1 в клинике приводило к значительному сокращению продолжительности нейтропении после химиотерапии различных типов солидных опухолей, снижению частоты инфекций [Симбирцев А. С., 1998; Гольдберг Е. Д. и др., 2000]. В экспериментальных исследованиях, проведенных в НИИ фармакологии СО РАМН, было показано, что экстракт шлемника байкальского может предупреждать лейкопенический эффект циклофосфана и стимулировать гемопоэз [Разина Т. Г. и др., 2005]. Из данных литературы известно, что экстракт шлемника байкальского (полученный из дикорастущего сырья) в большей степени стимулирует в костном мозге процесс эритро- и в меньшей степени гранулоцитомонопоэза у мышей, получавших противоопухолевые препараты [Абрамова Е. В. и др., 1991; Разина Т. Г. и др., 2005]. При нарушении высшей нервной деятельности, вызываемом депривацией парадоксального сна, экстракт шлемника байкальского нарушал взаимодействие между стромальными клетками и гранулоцитарно-макрофагальными предшественниками, что затрудняло формирование гемопоэтических островков гранулоцитарного типа [Дыгай А. М. и др., 1998]. Это приводило к падению интенсивности дифференцировки прекурсоров гранулоцитомонопоэза [Гольдберг Е. Д. и др., 2007].

Введение экстракта шлемника байкальского способствовало снижению содержания лимфоцитов в костном мозге на 2-е, 5-е сутки в 2,4 и 1,4 раза соответственно, в сравнении с группой паклитаксела. В периферической крови крыс при этом отмечалось повышение количества лимфоцитов через 6, 24 часа и 5-е сутки на 41%, 46% и 102%, по сравнению с группой противоопухолевого препарата. В тимусе повышалось число больших (исключая 5-е, 10-е сутки) и средних тимоцитов в течение всего периода исследования. Количество малых тимоцитов, повышаясь через 6 часов, снижалось на 2-е, 10-е сутки. Анализ спленограмм показал, что применение экстракта шлемника байкальского приводило к увеличению числа больших лимфоцитов на протяжении всего исследования. Количество средних лимфоцитов также было повышенным во все сроки исследования (исключая 48 часов). В отличие от динамики содержания больших и средних лимфоцитов, число малых лимфоцитов снижалось на 6 и 24 часа на 9%, 10% соответственно, при сравнении с группой крыс, получавших

сроки исследования

Рис. 13. Содержание эритроидных клеток в костном мозге крыс после введения экстракта шлемника байкальского

Рис. 15. Содержание зрелых нейтрофильпых лейкоцитов в костном мозге крыс после введения экстракта шлемника байкальского

сроки исследования

Рис. 14. Содержание ретикулоцитов в периферической крови крыс после введения экстракта шлемника байкальского

6ч 24ч 48ч 5сут Юсут

сроки исследования

Рис. 16. Содержание зрелых нейтрофнльных лейкоцитов в периферической крови крыс после введения экстракта шлемника байкальского

паклитаксел. По данным гистологического исследования, введение экстракта шлемника байкальского замедляло темпы опустошения тимуса и селезенки животных и способствовало более быстрому восстановлению их клеточного состава. Свободные радикалы, образующиеся в процессе ПОЛ (усиление которого происходит при введении цитостатиков), повреждают нормальные клетки, запуская, таким образом, запрограммированную клеточную гибель [Франциянц Е. М., Сидоренко Ю. С. и др., 1995; Ветошкина Т. В., Дубская Т. Ю. и др., 1998; Ларионова В. Б., Коломейцев О. А., 2004; Ермолаева Л. А., 2008; Nelson S. D., 1995; Sturgill М. G., Lambert G. Н., 1997; Anderson К. М., Seed Т. et al., 1999]. Следовательно, применение веществ с антиоксидантными свойствами, сможет защитить клетки от повреждающего действия свободных радикалов. Флавоноиды шлемника байкальского вогонин, вогонизид, байкалеин и байкалин препятствуют избыточной генерации свободных радикалов, выводят их из клетки, проявляя тем самым антиоксидантную активность и защищая клетки от летального оксидантного повреждения [Дыгай А. М. и др., 2009; Gao Z. et al, 1999; Shieh D. E., et al, 2000; Borek C„ 2001; Gao Z. et al, 2001; Choi J. et. al., 2002; Choi Y-J. et. al, 2003; Himeji M. et. al, 2006; Fas С. S. et al, 2006].

Таким образом, применение экстракта шлемника байкальского, полученного из «волосатых корней», способствовало более раннему восстановлению системы крови, в сравнении с группой животных, получавших паклитаксел. Было отмечено повышение содержания эритроидных клеток в костном мозге, эритронормобластов в селезенке, числа ретикулоцитов в периферической крови. Выявлено повышение количества зрелых нейтрофилов в костном мозге, периферической крови, селезенке уже на 5-е сутки (на этот срок исследования наблюдалось наиболее выраженное угнетение миелоидного ростка кроветворения после введения паклитаксела). Также отмечалось повышение содержания лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах. Подобное действие на систему крови может быть связано с содержанием в экстракте шлемника байкальского, полученного из «волосатых корней», флавоноидов вогонина, вогонизида (в сумме 50%-57% от массы сухого вещества) и байкалина, байкалеина (в сумме около 30% от массы сухого вещества), тогда как в экстракте шлемника байкальского, полученного из дикорастущего сырья, содержится в основном байкалин и байкалеин.

В ходе исследования также было отмечено, что введение тиофана и эплира способствовало снижению содержания клеток с признаками апоптоза в тимусе крыс через 24 часа, на 2-е, 5-е сутки. Применение экстракта шлемника байкальского, на фоне действия цитостатика, у крыс приводило к снижению данного показателя через 6 часов, на 5-е, 10-е сутки. Такая активность фармакологических корректоров, по всей видимости, связана с их антиоксидантными свойствами, следствием которых является способность нейтрализовать свободные радикалы и гидроперикиси, образующиеся в результате ПОЛ, оказывающие повреждающее действие на клетку и запускающие механизм программированной гибели клетки [Буркова В. Н. и др., 1998; Просенко А. Е. и др., 2004; Hamada Н. et al, 1993; Gao Z. et al, 1999; Shieh D. E. et al, 2000; Borek C„ 2001; Gao Z. et al, 2001; Choi J. et. al, 2002; Baumann S. et al. 2008; Taniguchi H. et al, 2008].

Анализируя результаты проведенного исследования, можно сделать заключение, что в основе повреждающего действия паклитаксела на систему крови и лимфоидные органы лежат специфический и неспецифический механизмы действия. Специфическая миелотоксичность паклитаксела обусловлена способностью блокировать митоз клетки. Паклигаксел останавливает деление клетки, связываясь с тубулином, повреждая при этом цитоскелет [Сухачева Т. В. и др., 2001; Бессмельцев С. С., 2003; Рагпеэз Л. е1 а1., 1981; Мапй-есИ I. .1. а а1., 1982; Яо^амку Е. К. й а1., 1990]. Об этом свидетельствует повышение количества митозов в костном мозге мышей и крыс. Неспецифическая миелотоксичность обусловлена способностью паклитаксела активировать ПОЛ. Активация процессов ПОЛ приводит к повреждению клеточных мембран, снижению антиоксидантной защиты и повышению активности лизосомальных ферментов. Цитотоксичеекие продукты свободнорадикального окисления, вступая в реакции со структурными компонентами клетки и межклеточного вещества, изменяют физические и биологические свойства мембран, разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают работу встроенных в мембрану ионных насосов и каналов. Это приводит к нарушению структуры и функции, а в конечном итоге, к гибели клетки. Данный факт вносит существенный вклад в развитие гипоплазии костного мозга и, как следствие, в угнетение всех ростков кроветворения, что сопровождается снижением количества эритроцитов, лейкоцитов (пейтрофильных лейкоцитов, лимфоцитов) в периферической крови, лимфоцитов в лимфоидных органах. Кроме того, отмечается повышенное содержание клеток с признаками апоптоза в тимусе (конденсация хроматина, маргинация, кариопикноз), в сравнении с группой контроля.

Применение тиофана, эплира, экстракта шлемника байкальского препятствовало реализации неспецифического механизма миелотоксичности паклитаксела. Антирадикальная активность тиофана обусловлена его фенольным компонентом, противопероксидное действие проявляет его сульфидная группа [Сторожок Н. М., Крысин А. П. и др., 2001; Терах Е. И., Просенко А. Е. и др., 2003; Гуреева Н. В., Сторожок Н. М., 2006]. Антиокислительные свойства эплира связывают с имеющимися в его составе фосфолипидами, ксантофилами, каротнноидами [Конопля Е. Н. и др., 1992; Саратиков А. С. и др., 1995; Скакун Н. П., 1993; Белобородова Э. И. и др., 1998; Саратиков А. С. и др., 1999; Зарипова Т. Н. и др., 2002]. Вагонин и байкалин, входящие в состав шлемника байкальского, также проявляют антиоксидантные свойства. Эплир и экстракт шлемника байкальского, как и тиофан, способны нейтрализовать гидроперекиси, что обусловлено содержанием в экстракте шлемника байкальского флавоноидов и ксантофилов, каротиноидов в эплире [Гольдберг Е. Д. и др., 1994; Саратиков А. С. и др., 1999; Зарипова Т. Н. и др., 2002; Дыгай А. М. и др., 2009; вао Ъ. й а]., 1999; вЫеИ О. Е. Ы а!., 2000; Куоиг^Ьо 8., & а!., 2003].

Таким образом, применение тиофана, эплира, экстракта шлемника байкальского, на фоне введения паклитаксела, способствовало регенерации костного мозга, что проявлялось в нормализации морфологического состава субпопуляций лимфоцитов лимфоидных органов, лейкоцитов в периферической

крови крыс. Установлено, что экстракт шлемника байкальского в равной степени стимулировал эритро- и миелопоэз, проявляя более выраженные гемостимулирующие свойства, в сравнении с группами животных, получавшими тиофан и эплир. Так, при введении экстракта шлемника байкальского отмечалась стимуляция эритропоэза в течение всего периода исследования, что выражалось в повышении числа эритроидных клеток в костном мозге и ретикулоцитов в периферической крови. Применение тиофана повышало данные показатели лишь на отдельные сроки наблюдения, на 1-е сутки увеличивалось содержание эритроидных клеток в костном мозге, и на 1-е, 2-е, 15-е, 30-е сутки количество ретикулоцитов. Введение эплира приводило к увеличению числа эритроидных клеток только на 10-е, 15-е сутки и повышению количества эритроцитов в периферической крови на 24 часа. Использование экстракта шлемника байкальского способствовало более раннему восстановлению миелоидного ростка кроветворения. Так, уже на 5-е сутки отмечалось повышение числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и селезенке и на 5-е, 10-е сутки в периферической крови. Применение тиофана приводило к увеличению данного показателя в костном мозге только на 6 часов и 15-е сутки, применение эплира повышало количество нейтрофилов в эти же периоды исследования в селезенке.

ВЫВОДЫ

1. Однократное введение паклитаксела в МПД вызывает у экспериментальных животных длительную гипоплазию костного мозга с развитием гипопла-стической анемии, лейкопении (лимфо- и нейтропении), тромбоцитопении в периферической крови, а также снижение массы лимфоидных органов, сопровождающееся нарушениями цитологической и гистологической структуры тимуса и селезенки.

2. В развитии гемодепрессии, вызванной введением паклитаксела, важную роль играет угнетающее влияние цитостатика на пул кроветворных клеток-предшественников эритро- и гранулоцитопоэза.

3. В механизме развития гипоплазии лимфоидных органов основным является апоптозиндуцирующее действие паклитаксела на лимфоидные клетки.

4. Тиофан, эплир, экстракт шлемника байкальского оказывают стимулирующее действие на процессы кроветворения в условиях миелосупрессии, вызванной паклитакселом.

5. Активирующее влияние тиофана на эритроидный и лимфоидный ростки кроветворения приводит к росту числа эритроидных клеток в костном мозге и повышению клеточности лимфоидных органов на первые сутки исследования.

6. Эплир в условиях гемодепрессии, вызванной введением паклитаксела оказывает влияние на процессы восстановления костномозгового лимфопоэза и, в меньшей, степени эритропоэза. При этом, возрастание количества лимфоидных элементов костного мозга наблюдается на ранних этапах исследования (6 ч), активирующее действие эплира в отношении эритроидного ростка кроветворения отмечено на поздние сроки исследования (10-е, 15-е сутки).

7. Курсовое применение экстракта шлемника байкальского в условиях цито-статической миелосупрессии оказывает стимулирующее влияние на гранолоци-то-, эритро- и лимфопоэз в костном мозге, следствием чего является восстанов-

ление числа зрелых клеток в периферической крови, начиная с ранних сроков исследования.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ПАТЕНТЫ

1. Патент (RU) № 2397774 от 27.08.2010 г. «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» / Лопатина К. А., Сафонова Е. А., Гурьев А. М., Белоусов М. В., Юсубов М. С., Федорова Е. П., Разина Т. Г., Амосова Е. Н., Крылова С. Г., Ефимова Л. А., Чурин А. А., Зуева Е. П.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Федорова Е. П. Особенности гематотоксического действия паклитаксела (митотакса) / Федорова Е. П., Колотова О. В., Чурин А. А. // VIII конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: Томск, 17-18 мая 2007 г. - С. 205-206.

2. Колотова О. В. Некоторые мутагенные свойства паклитаксела (митотакса) / Колотова О. В., Федорова Е. П. //Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии - Томск, 2007. - С. 40-42.

3. Федорова Е. П. Влияние паклитаксела на систему крови мышей CBA/CaLac / Федорова Е. П., Чурин А. А. //Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии - Томск. - 2007. - С. 91-92.

4. Чурин А. А. К механизму гематотоксического действия паклитаксела (митотакса) / Чурин А. А., Федорова Е. П., Колотова О. В. // Материалы конф. «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии».- Томск, 27 апреля 2007. - С. 120-122.

5. Колотова О. В. Возможность коррекции токсических эффектов паклитаксела / Колотова О. В., Федорова Е. П., Ермолаева Л. А. // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1 Материалы конф. «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии».- Томск, 29 апреля 2008. - С. 66-68.

6. Карпова Г. В. Фармакологическая коррекция общетоксического действия паклитаксела / Карпова Г. В., Чурин А. А., Ермолаева Л. А., Фомина Т. И., Ветошкина Т. В., Воронова О. Л., Дубская Т. Ю., Колотова О. В., Федорова Е. П. // Материалы конференции «Проблемы онкофармакологии» - Томск. - 2008. -С. 44-48.

7. Чурин А. А. Реакции костномозгового кроветворения на токсическое воздействие паклитаксела / Чурин А. А., Гольдберг В. Е., Карпова Г. В., Воронова О. Л., Федорова Е. П., Колотова О. В., Скурихин Е. Г., Першина О. В. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т.145. -№2. -С. 173-177.

8. Сафонова Е. А. Коррекция показателей периферической крови мышей водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного на фоне применения паклитаксела / Сафонова Е. А., Лопатина К. А., Федорова Е. П. // Вестник новых медицинских технологий приложение. Материалы конф. «VIII Всеросийская университетская науно-практическая

конференция молодых ученых по медицине» — Тула. — 2009. — № 2. - Т. XVI. -С. 148-150.

9. Suslov N. I. Pharmacological properties of Scutellariae baicalensis Georg. extract, received from hairy root cultures / Suslov N. I., Churin A. A., Fedorova E. P., Voronova O. L., Kolotova О. V., Kuzovkina I. N., Gusseva A. V. // «German-Russian Forum Biotechnology GRFB'09» Novosibirsk, June 15th - 19th. 2009. - P. 49.

10. Колотова E. П. Токсические эффекты паклитаксела и пути их снижения / Колотова О. В., Федорова Е. П., Ермолаева JI. А. // Сибирский онкологический журнал приложение №1 Материалы конф. «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии».- Томск, 24 апреля 2009. - С. 100-101.

11. Сафонова Е. А. Водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного как корректоры гематотоксического эффекта паклитаксела / Сафонова Е. А., Лопатина К. А., Федорова Е. П. // Сибирский онкологический журнал приложение №1 Материалы конф. «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии».- Томск, 24 апреля 2009.-С. 172-173.

12. Сафонова Е. А. Снижение токсического эффекта паклитаксела на систему крови водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного / Сафонова Е. А., Разина Т. Г., Лопатина К. А.. Федорова Е. П., Зуева Е. П., Гурьев А. М. // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - Т.38. - №2. -С. 42-46.

13. Сафонова Е. А. Коррекция токсического эффекта паклитаксела на систему крови и эпителий тонкого кишечника водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной / Сафонова Е. А., Лопатина К. А., Разина Т. Г., Федорова Е. П., Пахомова А. В., Вычужанина А. В., Зуева Е. П. // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.38. -.№2. - С. 42-46.

14. Воронова О. Л. Фармакологическая коррекция цитогенетических эффектов цисплатина / Воронова О. Л., Неупокоева О. В., Федорова Е. П., Просенко А. Е., Чурин А. А. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т.73. -№10. - С. 37-39.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальньш колониестимулирующий фактор

ИД-Г - индекс дифференцировки гранулоцитопоэза

ИД-Э - индекс дифференцировки эритропоэза

ИЛ-1 - интерлейкин 1

ИЛ-3 - интерлейкин 3

КОЕ (КлОЕ)-Г - колониеобразующая (кластерообразующая) единица гранулоцитарная

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофогальная КОЕ-ГЭММ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарная

КОЕ (КлОЕ)-Э - колониеобразующая (кластерообразующая) единица эритроидная

МПД - максимально переносимая доза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПСКК - полипотентная стволовая кроветворная клетка

ФИО - фактор некроза опухоли

Подписано к печати 07.02.2011. Тираж 100 экз. Кол-во стр. 25. Заказ № 04-31 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» Лицензия Серия ПД №12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54