Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Теоретическое и экспериментальное обоснование создания инфузионных дисперсных сред с адсорбционнымисвойствами на основе эмульсий перфторорганическихсоединений

РГБ ОД

2 7 АПР 2002

на правах рукописи

Терешина Елена Владимировна

Теоретическое и экспериментальное обоснование создания инфузионных дисперсных сред с адсорбционными свойствами на основе эмульсий перфторорганических

соединений.

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в Российском НИИ геронтологии г. Москва

#

Научные консультанты: 'о

Доктор медицинских наук, профессор Л.Д. Серова Доктор медицинских наук, профессор Н.И. Афонин

Официальные оппоненты: Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Г. А. Софронов Член.-корр. ПАНИ, доктор медицинских наук, профессор И. Г. Дутксвич Доктор биологических наук И.Н. Кузнецова

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт кровезаменителей и медицинских препаратов

Защита диссертации состоится-^* _____2002 г. в ч на

заседании Диссертационного совета Д 208.074.01 в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16, РНИИГиТ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИИГиТ

Автореферат разослан_ 2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук В.С.Быков

РЛЗЪ 52.1, СЛ

Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Современная инфузионная терапия располагает рядом препаратов эмульсионного типа на основе жировых эмульсий. В настоящее время разработаны два препарата на основе эмульгированных полностью фторированных органических соединений (ПФС): препарат Оксигент (фармацевтическая фирма Alliance, США) и препарат Перфторан (фирма Перфторан, Россия). Эмульсии ПФС предназначены для применения как газопереносящая среда, и их создание является одной из актуальных задач медицины. Они показали высокую эффективность при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (при инфарктах миокарда), а также как средство, используемое гтри кардиоплегии и реперфузии. Значительного снижение опухолевого роста удалось достичь при применении концентрированных эмульсий ПФС в сочетании с химио- и радиотерапией. В последнее время область их применения как-терапевтического средства расширяется. Р1зучается возможность использования эмульсий ПФС при церебральной ишемии, перфузии органов и конечностей, в микрохирургии глаза и т.д.

Основным препятствием для широкого клинического применения мнфузконных препаратов на основе эмульсий ПФС является их большое время удерживания в органах. Остается не понятой взаимосвязь между структурой ПФС и скоростью их выведения из организма. Предполагается, что на миграцию ПФС в организме влияет их липофильность и гидрофильность. Для понимания механизма взаимодействия эмульсии ПФС при ее инфузии в кровеносное русло с системами организма-реципиента необходимо выработать принципиально новый методологический подход к инфузионным препаратам эмульсионного типа, которые необходимо рассматривать как дисперсные системы. Искусственные дисперсные системы представляют собой дисперсии типа «масло в воде». Дисперсную фазу

жировых эмульсий и липосом образуют природные соединения -триглицериды и фосфолипиды. Эмульсии ПФС - первая из предназначенных для применения в медицине дисперсий, содерисащая синтетические неметабилизируемые компоненты. Такой взгляд на инфузионные препараты эмульсионного типа позволяет рассматривать их воздействие на организм с позиций взаимодействия двух дисперсных систем - искусственной дисперсии и природной дисперсии, которой является кровь. Дисперсия частиц ПФС обладает большой гидрофобной поверхностью, что определяет неизбежность ее взаимодействия с компонентами природной дисперсии (липопротеидами плазмы крови, плазматическими мембранами клеток крови). Изучение такого взаимодействия представляет несомненный теоретический и практический интерес.

ПФС - это неметаболизируемые инертные органические соединения. Они обладают различной степенью гидрофобносги, что позволяет моделировать свойства их дисперсий в широком диапазоне. Уникальность ПФС превращает их в эффективный инструмент для исследования ранее неизвестных сторон липидного обмена в кровотоке.

Большой научный интерес представляет изучение результатов направленного воздействия дисперсий искусственных гидрофобных соединений на баланс лшгадов в кровотоке. Актуальность проблемы определяется также тем, что открывается возможность создания на основе эмульсий ПФС ряда препаратов для направленной коррекции дисбаланса лшгадов в кровотоке, в том числе при нарушениях в транспорте ХС. Подобные препараты могут применяться также при посттравматических состояниях, вызванных жировой эмболией сосудов.

Указанные обстоятельства определили

Цель работы:

научно обосновать и разработать методологические подходы к созданию дисперсных систем (эмульсий ПФС), как основы инфузионных сред, обладающих адсорбционными свойствами.

Задачи исследования:

1. Определить адсорбционный потенциал эмульсий ПФС, стабилизированных различными эмульгаторами и имеющих различный состав гидрофобного ядра.

2. Выявить характерные особенности влияния дисперсий ПФС, стабилизированных различными эмульгаторами, на соотношения основных классов липидов в плазме крови, печени и легких при внутривенном в пелен ил.

3. ОпределюI. характер влияния химической структуры соединений, образующих гидрофобную фазу дисперсии, на взаимодействие частиц дисперсии с лиггидами организма.

4. Выявить механизм замены эмульгатора на частицах ПФС, стабилизированных фосфолиггадами.

5. Определить степень сорбции холестерина частицами дисперсии ПФС при взаимодействии с липопротеадами плазмы и с мембраной эритроцитов.

6. Изучить влияние инфузии эмульсий ПФС, стабилизированных различными эмульгаторами, на состояние мембраны эритроцита.

7. Установить причины, влияющие на продолжительность циркуляции эмульсий ПФС в кровотоке в диспергированном состоянии.

8. Выявить факторы побочных реакций в ответ на инфузию эмульсий, содержащих перфтордекалин и неионногенное поверхностно-активное вещество.

Научная новизна работы.

• Новый методологический подход к решению проблемы создания инфузионных сред, обладающих выраженными адсорбционными свойствами, позволил впервые изучить свойства эмульсий ПФС как гидрофобной дисперсной система, взаимодействующей с природной липидсодержащей средой организма при ее инфузии в кровеносное русло.

Впервые кровь рассматривается как дисперсная система, дисперсной фазой которой являются липопротеиды и плазматические клетки.

• Впервые были обнаружены такие свойства дисперсии ПФС как:

- замещение эмульгатора (переэмульгирование) на поверхности частиц ПФС на эндогенные дипиды в процессе циркуляции эмульсий в кровотоке;

- влияние химического строения ПФС и их смесей на состав поверхностного монослоя, образующегося на частицах в кровотоке;

- избирательная сорбция липидов крови и плазматических мембран частицами дисперсии ПФС;

- высокая аффинность дисперсий исследованных классов ПФС по отношению к свободному холестерину;

- высокая избирательная сорбция эфиров холестерина дисперсией параметилци клогексилпипериди на;

• Впервые показано, что в восполнении содержания фосфолшшдов в плазме крови, адсорбированных на частицах эмульсии ПФС, наряду с печенью принимают участие и легкие, в которых наблюдаются глубокие изменения в содержании фосфолипидов в ответ на инфузию эмульсий ПФС. Таким образом, выявлен неизвестный ранее факт, что легкие участвуют в поддержании постоянства концентраций свободных фосфолипидов в плазме.

• Впервые обнаружено, что на гидрофобной поверхности частиц, сразу поело инфузии начинается спонтанное формирование монослоя из фосфолипидов, в котором основными компонентами являются фосфатидилхолин и/или сфингомиелин. После формирования монослоя из фосфолипидов начинается адсорбция свободного холестерина. Гидрофобная фаза, образованная соединениями, принадлежащими к различным классам структур, способна растворять триглицериды, свободные жирные кислоты и эфиры холестерина. Показано, что их количество зависит от химической природы гидрофобной фазы.

• Показано, что отток холестерина на частицы акцептора не имеет прямой пропорциональной зависимости от количества частиц ПФС. Максимальная акцепция холестерина имеет место при определенных соотношениях донорпых и акцепторных частиц.

• На модели инфицирования в клеточной культуре МТ-4 перевиваемых лимфоцитов вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) , нуклеокапсйд которого имеет липидную оболочку, впервые продемонстрирована прямая зависимость количества жизнеспособных клеток от холестерин-акцепторной активности частиц ПФС.

• Инфузия в кровоток неионяогенного поверхностно-активного вещества (нПАБ) может вызывать триглицеридемию в результате блокирования пиролиза тригяицерид-содержащих частиц природной дисперсии, что приводит к компенсаторному увеличению синтеза триглицеридов в печени. Впервые показано, что синтез триглицеридов в печени имеет пролонгированный двухфазный характер, несмотря на быстрое выведение нПАВ из кровотока и восстановление гидролиза.

• Выдвинуто и экспериментально обосновано предположение о том, что побочные реакции, наблюдаемые во время клинических испытаний препаратов эмульсий ПФС, содержащих одновременно проксанол и перфтордекалин,, обусловлены не только присутствием нПАВ, но также структурой поверхностного монослоя, в который из гидрофобного ядра проникает перфтордекалин. Такой монослой способен сорбировать низкомолекулярные соединения, имеющие алифатические углеводородные радикалы, которые являются причиной реактогенностн препаратов.

• Предложена гипотеза, объясняющая скорость элиминации различных ПФС из организма их химическим строением, которое позволяет ПФС взаимодействовать с кристаллической фазой, образованной ацильными радикалами сложных липидов.

Практическая значимость работы.

Впервые обнаруженное уникальное свойство неметаболизируемой гидрофобной фазы дисперсий 11ФС в процессе циркуляции в кровеносном русле сорбировать различные классы липидов, включая свободный холестерин и эфиры холестерина, может быть использовано для разработки целого ряда препаратов направленного действия для коррекции нарушений в соотношениях липидов в плазме крови. Высокая способность дисперсий ПФС акцептировать и выводить из кровотока мембранный холестерин и холестерин липопротеидов плазмы позволяет проводить прямые исследования последствий для организма долговременного индуцированного оттока холестерина.

Эмульсии ПФС образуютновый класс внутрисосудистых сорбентов холестерина, которые могут найти применение при профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний и в геронтологической практике.

Благодаря высокой степени адсорбции эндогенного жира эмульсии ПФС могут быть использованы в лечении посттравматических осложнений, вызванных развитием жировой эмболии.

Высокая аффинность частиц дисперсии ПФС к мембранному холестерину открывает возможность применения их для снижения инфекционной активности вирусов, имеющих липидную оболочку, в частности вируса иммунодефицита человека. Эмульсии ПФС можно использовать при первичной обработке донорской крови с целью снижения риска трансфузии возбудителей инфекционных заболеваний.

Зависимость скорости выведения ПФС от растворимости в кристаллической структуре, образованной ацильными радикалами сложных литпидов позволяет вести направленный поиск соединений с коротким периодом кумуляции в макрофагах РЭС.

Основные положения, выносимыемые на защиту.

1. Агрегативная устойчивость дисперсий ПФС во время циркуляции в кровеносном русле обеспечивается не за счет эмульгаторов, используемых для ее сгабшгазиации in vitro, а благодаря адсорбции на гидрофобной поверхности частиц липидов при взаимодействии с липидсодержашей средой организма.

2. Внутривенная инфузия дисперсий ПФС оказывает влияние на метаболизм липидов в плазме крови, печени и легких. Характер изменений зависит от того, какой эмульгатор был использован для стабилизации эмульсии in vitro. Инфузия неионногенного поверхностно-активного вещества вызывает кратковременную гипертриглицеридемию. Инфузия совместно с эмульсией ПФС экзогенных фосфолипидов нивелирует эффект, вызываемый адсорбцией эндогенных липидов частицами дисперсии ПФС.

3. Гидрофобная фаза дисперсий ПФС адсорбирует на поверхности фосфолипиды и холестерин и растворяет нейтральные липиды (свободные жирные кисло ты, триглицериды, эфиры холестерина). Состав ассоциированных липидов зависит от химической природы ПФС. Адсорбция холестерина осуществляется частицами дисперсии ПФС независимо от их химической природы и начинается после формирования на поверхности монослоя, состоящего из фосфолипидов.

4. Адсорбция холестерина частицами ПФС происходит в результате физического контакта искусственной и природной дисперсий и зависит от структуры взаимодействующих поверхностей.

5. Инфузионные среды на основе эмульсий ПФС наряд}' с жировыми эмульсиями и липосомами представляют собой один тип дисперсии «масло в воде». Такие препараты способны оказывать влияние на метаболизм липидов в кровотоке, в частности на транспорт холестерина. Химическая инертность ПФС, развитая гидрофобная поверхность их дисперсий, высокая акцепторная способность по отношению к холестерину и эфирам холестерина и

продолжительное время циркуляции в кровотоке обсновывают перспективность разработки на их основе препаратов для направленной коррекции нарушений транспорта холестерина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции «Медико-биологические аспекты применения кровезамещающих фторуглеродпых эмульсий» (1984 г., Астрахань); Втором всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (1986, Челябинск); Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы разработки и применения эмульсий ПФУ» (1990 г. Пущино); научно-производственном совещании «Проблемы и перспективы разработки и клинического применения кровезаменителей и инфузионных растворов» (1990, Москва); I Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (1992 г., Москва); Всесоюзном совещании «Перфторуглеродные активные среды для медицины и биологии (новые аспекты исследований)» (1993 г., Пущино); IX Международном симпозиуме по изучению перфторуглеродных соединений в медицине и биологии «РегАиогасагЬоп'96» (1996 г., Пущино); 3-ем Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (1996, С.-Петербург); Всеармейской научной конференции «Физиологически активные вещества на основе перфторутлеродов в военной медицине» (1997, С,- Петербург); 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной А.Мясникову (1999, Москва); XII международном симпозиуме по атеросклерозу, сагт-слитный симпозиум «Липопротеиды высокой плотности и атеросклероз» (2000, Хельсинки). Всероссийской научной конференции «Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине» (2001г. Санкт-Петербург). Работа выполнялась в рамках проблемы №4 Союзного значения, а также по Союзной программе ОЦ.042. Результаты работы отражены в отчетах НИР Гематологического научного центра РАМН и Российского НИИ геронтологии МЗРФ.

Структура диссератции. Работа изложена на 331 страницах и включает 47 таблиц и 30 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), изложения материалов и методов (глава 2), трех глав собственных исследований (главы 3-5). Заканчивается работа обидам заключением, выводами и списком литературы, включающим 401 отечественных и иностранных наименований.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы ПФС, полученные в ГИПХ и ИНЭОС по технологиям, разработанным отечественными учеными - ПФТПА (Фожалин), ПФД, ПМЦГП. В качестве эмульгатора жидких ПФС использовалось нПАВ проксанол 268, который является блоксополимером оксида этилена и оксида пропилена, и фосфолипиды яичного желтка, технология получения которых была разработана на Харьковском предприятии бакпрепаратов. В экспериментах были использованы два типа эмульсий - эмульсия бинарной смеси ПФД/ПФТПА, стабилизированная проксанолом (эмульсия 1), и эмульсия ПФД/ПФТПА, стабилизированная двухкомпонентным эмульгатором, проксанолом и ЯФЛ, (эмульсия 2), а также эмульсии ПФД, ПФТПА и ПМЦГП, стабилизированные проксанолом. Все эмульсии, стабилизированные проксанолом готовились ex témpora на ультразвуковом диспергаторе Branson. Эмульсию 2 готовили на гомогенизаторе высокого давления Mentengaulín.

Эксперименты проводили в системе in vivo на белых беспородных крысах - самках массой 120-140 г, которым плеторически однократно в яремиую вену инфузировали 5% раствор проксанола, эмульсию 1, эмульсию 2 и эмульсии ПФД, ПФТПА, ПМЦГП в количестве 2,5 мл эмульсии на 100 г массы тела. Животных декапитировали в различные сроки ( 1, 3, 6, 24, 72 часа и 7 суток) после инфузии, выделяли из крови эмульсию и анализировали состав липидов, связавшихся с эмульсией в кровотоке. У животных изымали легкие и печень, которые сразу же замораживали в жидком азоте. В системе in vitro эмульсии инкубировали в течение 6-ти часов (срок оптимальной

адсорбции липидов на частицах ПФС) с цельной донорской кровью, с донорской плазмой, со взвесью отмытых свежеприготовленных эритроцитов, с' лимфоцитарно-лейкоцитарной фракцией крови. Для выяснения зависимости адсорбции от соотношений взаимодействующих частиц дисперсии ПФС и липидсодержащсй среды эмульсию смешивали с инкубационной средой в соотношениях 1:1,1.2, 1:4 и 1:8.

Лшщды из органов и цельной крови экстрагировали по методу Folch, из мембран эритроцитов, лимфоцитов, эмульсии ПФС - по методу Bligh и Dyer. Анализ состава липидов проводили с использованием метода одномерной аналитической тонкослойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля Merck, пятна проявляли сжиганием в парах концентрированной серной кислоты с последующим обсчетом на денситометре CDS-200 Beckman; метода препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле Whoelm.. Жирнокислотаый состав липидных фракций анализировали на газовом хроматографе Carlo Erba с пламенно-ионизационным детектором на набивной металлической колонке 0,03x2,0 м , заполненной хромосорбом W\AW 100-120 mesh с 10% диэтиленгликольсукцинатной фазой при температуре 186° С.

Хромато-масс-спектрометрическое исследование углеводородов, содержащихся во фракции проксанода, содержащегося в эмульсии, выделенной из крови после периода циркуляции, проводили на хромато-«асс-спектрометре «Финниган-3200» (энергия ионизирующих электронов 70 эвб, температура источников ионов 120° С). Хроматографическое разделение осуществлялось на капиллярной колонке 60 м х 0,25 мм. из плавленного кварца с фазой SE-54 при температуре 90°С - 2 мин., 200°С - 18 мин. С дальнейшим программированием температуры по 6°С/мин. до 290°С.

Препаративное разделение основных классов липопротеидов плазмы крови осуществляли методом. препаративного ультрацентрифугирояания в градиенте плотности NaBr. Коэффициент рефракции определяли на

рефрактометре ИРФ-22. Использовали ротор 40,3 Beck man. Л ипо протеиды выделяли из крови последовательно. На первом этапе выделяли J1110H1I (18 час., 36000 об/мин., t =7-13°С), на втором (центрифугирование в тех же условиях) - ЛПНН. Донную фракцию доводят NaBr до плотности 1,125 г/мл. Центрифугируют в течение 24 часов при скорости 40Ü0U об/мин. и температуре 17-20°С. С поверхности забирают подфракцию ЛПВГЬ Оставшуюся донную фракцию доводят до плотности 1,21 г/мл и центрифугируют в том же режиме. ! мл верхней фракции представляет собой ЛПВПз. ЛТТВП2 и ЛПВГЬ объединяют. В образцах ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВЛ определяли концентрации холестерина, триглицеридов и фосфолипидов. Содержание этих же липидов определяли в инкубационной до и после добавления эмульсий ПФС, а также в плазме крови в различные сроки после инфузии эмульсий ПФС. Общий холестерин определяли ,используя реактив Либермана-Бурхарта. триглицеридов - по содержанию глицерола, высвободившегося после их гидролиза , фосфорлипидов - по содержанию окрашенного комплекса при взаимодействии с молибдатом аммония в щелочной среде.

Протективную противовирусную активность эмульсий ПФС, а также препаратов жировых эмульсий Интралипид 20% и Интрапипид 10% изучали на культуре перевиваемых лимфоцитов МТ-4 Клетки культивировались и поддерживались в среде RPM1-1640. Клетки рассеивали в лунки микропанелей и инфицировали ВИЧ-1.

Основные результаты и их обсуждение

Дисперсии ПФС, стабилизированные проксанолом, сохраняют свою устойчивость в кровеносном русле, несмотря на то, что около 70% инфузировашюго нПАВ выводится из организма через почки уже через 30 мин. после внутривенного введения эмульсии (Naito, 1978). Нами было выдвинуто предположение, что поддержание диспергированного соостояния

ПФС обеспечивается за счет природных амфифильных соединений -фосфолипидов, которые адсорбируются на поверхности частиц в кровотоке. Следовательно, частицы дисперсии ПФС взаимодействуют с частицами липидной дисперсии крови. Для выяснения особенностей этого взаимодействия необходимо рассматривать кровь как полидиспсрсную систему, обладающую свойствами грубой и топкой дисперсии. Грубую дисперсию образуют клетки крови, тонкую - белок-липидные комплексы (липопротеиды). В природной дисперсии частицы тонкой и грубой дисперсии взаимодействуют друг с другом, обмениваясь белками и липидами. Дисперсии ПФС и липопротеиды низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) кровь принадлежат к одному типу дисперсий «масло в воде«. В составе препаратов эмульсий ПФС, в рецептуру которых входят фосфолипиды, используемые в качестве эмульгаторов, содержатся липосомы, образуемые из избыточного количества фосфолипидов. При используемом методе получения эмульсий - гомогенизация при высоком давлении - образуются мультиламеллярные липосомы. В соответствии со своим размером и особенностями строения частицы дисперсии ПФС в кровеносном русле будут вступать в контакт с липопротеидами и мембранами плазматических клеток. Метаболизм липосом и их взаимодействие с природной дисперсией крови хорошо изучены, поэтому их присутствие в кровотоке оценивалось по известным результатам, полученным другими авторами. Эмульгатор проксанол как неионногенное ПАВ, обладающее значительной гидрофобной поверхностью, также взаимодействует с липидами и белками, имеющими гидрофобные участки молекулы. Последствия дисбаланса, вносимого инфузией эмульсии ПФС в липидный гомеостаз кровотока, необходимо оценить, исходя из безопасности применения этих эмульсий в медицинской практике. Частица липопротеидов крови подобна по своей структуре частицам дисперсии ПФС. ЛПОНП и ЛПНП содержат гидрофобное ядро, окруженное монослоем из ФЛ и ХС. Гидрофобное ядро частиц ПФС проявляет аффинность к гидрофобным

соединениям и будет растворять определенные количества неполярных липидов. В связи с этим нами были проведены две серии экспериментов. В первой серии были изучены эмульсии, гидрофобная фаза которых была идентична, но в качестве эмульгаров использовались различные соединения - проксанол 268 (10%) (эмульсия 1) и двухкомпонентный эмульгатор, состоящий из проксанола и смеси яичных фосфолипидов (эмульсия 2). Во второй серии экспериментов использовались эмульсии ПФС, принадлежащих к различным классам органических соединений (11ФД, ПФТ11А, ПМЦП1, 11ФДД1ФТ11А), стабилизированные проксанолом. С помощью этих модельных эмульсий предполагалось изучить влияние химической структуры ПФС на их способность взаимодействовать с различными классами липидов. Впервые представляется возможность прямого изучения влияния химической природы гидрофобного ядра на состав поверхностного слоя. Исследования такого рода позволяют оценить роль ядра в метаболизме природной дисперсии липопротеидов.

Метаболизм липидов после инфузии дисперсии псрфторуглеродных соединений с различными поверхностно-активными свойствами.

Инфузия эмульсии ПФС в кровоток оказывает комплексное воздействие на липидную дисперсию крови, гак как препарат эмульсии содержит компоненты, взаимодействующие с липидами, - частицы дисперсии, свободный проксанол и свободные фосфолипиды, которые содержатся в препарате в виде мулътиламеллярных липосом. После инфузии в кровоток липосом ы в течение часа деградируют при взаимодействии с белками плазмы, в частности, с альбумином. Кроме того, они активно захватываются макрофагами РЭС, главным образом гепатоцитами. В процессе непродолжительной циркуляции в кровотоке они взаимодействуют с липопротеидами высокой плотности (ЛПВП) и мембранами эритроцитов, обмениваясь фосфатидилхолином (ФХ) и адсорбируя свободный холестерин. До настоящего времени липосомы были единственным инструментом для

изучения миграции холестерина из плазматических мембран. Большим недостатком липосом является их высокая нестабильность и трудность прямй количественной оценки обменивающегося холестерина. нПАВ находят применение в медицине в качестве наружного средства и как компоненты инфузионных растворов. Из нПАВ, инфузируемых в кровоток, в большей степени исследован Triton WR 1339. Известно, что, адсорбируясь на поверхности частиц ЛПОНП, он ингибируег действие фермента липопротеиддипазы, которая гидролизует триглицериды. Поэтому инфузия раствора проксанола вызывает значительное увеличение содержания ТГ в плазме, которое проявляется в течение первого часа после инфузии. Затем, вслед за выведение проксанола из кровотока, выраженность триглицеридемии снижается.

Рисунок 1. Содержание общих ФЛ в плазме (% от нормы) после инфузии:<> - 5% раствора проксанола 268;П - эмульсии 2; А - эмульсии 1.

Влияние компонентов, входящих в состав дисперсии ПФС, на липиды плазмы, наиболее интересным образом проявляется при исследовании

содержания общих ФЛ после инфузии в кровоток 5% раствора проксанола, эмульсии 1 и эмульсии 2 (рис. 1). Инфузия проксанола вызывает кратковременное (в течение 1 часа), но значительное увеличение содержания общих ФЛ в плазме крови, одновременное с повышением содержания ТГ, что свидетельствует о накоплении ТГ-содержащих липопротеидов, что вызвано блокированием процессов гидролиза ТГ. Ингибирование действия липопротеидлипазы сопровождалось снижением содержания ЭХ, так как приостанавливался процессинг Л110Ш1 в Л1ШП. Инфузия эмульсии 2 также вызывала кратковременное повышение содержания общих ФЛ, но уже по другой причине.

Повышение общих ФЛ в данном случае вызвано инфузией линосом, содержащихся в препарате. После инфузии эмульсии 1 в течение 3 часов наблюдалось снижение количества ФЛ в плазме, которое происходило, несмотря на присутствие в инфузированной дисперсии большого количества не связанного с частицами проксанола. Единственное объяснение этого явления состоит в том, что дисперсия ПФС адсорбирует значительные количества ФЛ организма. Прямым доказательством этого предположения могло быть выделение и анализ липидов, адсорбирумых на частицах дисперсии ПФС. С этой целью была разработана оригинальная методика (авторское свидетельство Л'Ь 1251679). Благодаря использованию этой методики нам удалось определить, что с поверхностью частиц ПФС связываются различные классы ФЛ и свободный ХС, причем прослеживается динамика изменения соотношения ХС/ФЛ в осадке эмульсии 1 в процессе ее циркуляции в кровотоке.

Агрегативная устойчивости дисперсии ПФС в кровеносном русле после выведения из кровотока эмульгатора проксанола может поддерживаться благодаря формированию на поверхности частиц нового адсорбционного слоя из амфифильных соединений организма. Нами показано, что на первом этапе на поверхности частиц бинарной смеси ПФДУПФТПА образуется монослой из ФЛ, основным компонентом которого

является фосфатидилхолин (60% - 66%). Затем начинается постепенная адсорбция ХС до соотношения ХС/ФЛ = 1:1. Образование нового адсорбционного слоя происходит в течение 6 часов, после чего состав липидов на поверхности частиц стабилизируется. Использование ФЛ в составе эмульсии 11ФС не позволяет избежать процесса адсорбции. Было показано, что в кровотоке экзогенные липиды замещаются на эндогенные. Взаимодействие дисперсий ПФС с дисперсией липидов в кровотоке , а также процессы кумуляции ПФС и их выведение из организма оказывают влияние на органы, непосредственно принимающие участие в этих процессах, - на печень и легкие. Изменения содержания основных липидов в печени отражают процессы, происходящие в кровотоке. В ответ на ингибирование гидролиза ТГ в печени активизируется синтез ТГ и ФХ, после инфузии

Время (ч) | д —«в «в- о- с!

Рисунок 2: Содержание общих ФЛ в легких (% от нормы) после инфузии А-5% раствора проксанола 268; В-эмульсии 2; С-змульсии1.

липосом наблюдается увеличение содержания в печени ФЛ - печень является органом, клетки которого захватывают экзогенные липиды.

Адсорбционные свойства дисперсии ПФС снижают степень выраженности указанных эффектов. Более того, в легких отчетливо прослеживается динамика изменения содержания общих ФЛ и ФХ в ответ на инфузию эмульсии ПФС и ее компонентов. Оказалось, что легочная ткань чутко реагирует на изменение содержания в кровотоке свободных ФЛ. При их связывании эмульсией 1 в легких интенсифицируются процессы синтеза общих ФЛ и ФХ. Напротив, при инфузии избыточного количества ФЛ в составе эмульсии 2 продукция ФЛ в легких снижается. Повышение общих ФЛ в легких в ответ на инфузию проксанола может быть также объяснена снижением содержания в кровотоке свободных ФЛ, так как наблюдаемое в это время повышение уровня общих ФЛ происходит благодаря возрастанию количества негидролизованных ЛПОНП, содержащих ФЛ в поверхностном монослое. Полученные данные позволяют предположить, что легкие являются источником свободных ФЛ, в частности ФХ в кровотоке. Ранее считалось, что такими источниками являются печень, клетки тонкого кишечника и избыточная поверхность ЛПОНП, образующаяся при их гидролизе. Косвенным указанием на роль легких в поддержании гомеостаза ФЛ в кровотоке является наблюдаемое у новорожденных младенцев деструкция легочной ткани после долговременной массированной инфузии ;кировых эмульсий, которые содержат ФЛ в качестве эмульгатора.

Адсорбционные свойства дисперсий перфторуглеродных соединений с различным составом гидрофобной фазы

Для исследования адсорбционных свойств дисперсий ПФС, гидрофобная фаза которых образована соединениями, имеющими различную химическую структуру или их смесями, были проведены эксперименты in vivo. Крысам инфузировали эмульсии ПФС, относящихся к различным классам органических соединений, стабилизированные проксанолом. Липиды, выделенные из осадка ПФС в различные сроки после инфузии в кровоток, анализировались на содержание общих ФЛ, холестерина, различных классов

ФЛ и неполярных липидов. Было обнаружено, что состав адсорбированных липидов зависит от химической структуры ПФС, образующих гидрофобное ядро частиц дисперсии. Гидрофобная фаза эмульсий проявляет специфическую аффинность по отношению к определенным классам липидов. Бинарная смесь ПФД/ПФТПА растворяет незначительное количество полярных липидов, из которых наибольшее количество приходится на ТГ (табл. !). Благодаря большой полярной группе ТГ, по-видимому, располагаются вблизи от поверхности ядра. Учитывая, что ПФТПА имеет выраженную полярную группу (атом азота), можно предположить, что при взаимодействии ТГ и ПФТПА на периферии гидрофобного ядра формируется значительная зарядовая поверхность. Основная масса липидов, ассоциирующихся с частицами ПФД/ПФ'ША, сосредоточена в поверхностном монослое и состоит преимущественно из ФХ и свободного ХС.

Таблица 1

Содержание липидов в осадке эмульсии ПФДЩФТПА, стабилизированной проксанолом, выделенном из крови в различные сроки после инфузии эмульсии

Фракции липидов Время наблюдения

1 час 3 час 6 час 24 час

Общие ФЛ 60,9 56,2 27,5 35,7

ХС 17,6 21,6 41,0 42,2

СЖК 6,2 5,7 12,4 6,6

ТГ 15,5 8,0 16,7 7,6

ЭХ 7,6 6,6 2,3 7,8

Дисперсия ПФД растворяет следовые количества полярных липидов: преимущественно свободные жирные кислоты (СЖК), которые имеют слабо выраженную полярную группу, и в меньшей степени ТГ. Следовательно, поверхность ядра содержит незначительный заряд. Поверхностный монослой на частицах этой дисперсии образован ФЛ, в которых через 6 часов (в период окончательного формирования адсорбционного слоя) содержится 49,4% ФХ, 18,3% ФЭ, 10,3% ФС и 22,9% СМ. Особенностью такого состава является снижение доли ФХ и большое содержание СМ.

Дисперсия ПФТПА также практически не взаимодействует с неполярными липидами, в гидрофобной фазе содержатся незначительные количества СЖК, ТГ практически отсутствуют. Такая структура гидрофобного ядра отражается на составе адсорбированных ФЛ, в которых основная доля приходится на ФХ (47,8% - 65%) и на СМ (11,6% - 39,0%). Повышенная адсорбция СМ связана с тем, что поверхность ядра имеет незначительный электрический заряд. Дисперсия ПМЦГТ1 растворяет в гидрофобной фазе значительное количество ЭХ (табл. 2). Возможно, этому способствует очевидная схожесть химического строения ПМЦГП и ЭХ, которое представляет собой большую планарную структуру с ацильным радикалом. Таким образом, структурированная гидрофобная фаза в большей степени способна взаимодействовать с такими неполярными липидами как ТГ и ЭХ, чем неструктурированная фаза, в которой молекулы расположены хаотически. Данное положение подтверждается как относительно высокой растворимостью ТТ в дисперсии бинарной смеси ПФД/ПФТПА, так и большим количеством ЭХ, присутствующим в дисперсии ПМЦГП. Выраженная неполярная гидрофобная фаза, состоящая из ПМЦГП и ЭХ, способствует адсорбции на поверхности ядра значительных количеств СМ (33,6%-59,7%). Таким образом, использование модельных эмульсий ПФС, относящихся к различным классам органических соединений, позволило обнаружить неизвестный ранее факт, что зарядовая поверхность, образующаяся на гидрофобном ядре частиц дисперсии, определяет состав

ФЛ, адсорбирующихся на этой поверхности. Чем значительнее заряд, тем больше ФХ ассоциируется с поверхностью. Напротив, чем гидрофобнее поверхность, тем большую аффинность проявляет ядро к СМ.

Следовательно, в гидрофобном ядре , образованном бинарной смесью ПФД/ПФТПА, происходит структурное взаимодействие НФС, в результате которого молекулы 11ФТ11А располагаются ближе к периферии и ориентированы таким образом, что полярные группы контактируют с поверхностью В дисперсиях ПФД и ПФТПА молекулы ПФС в ядре располагаются хаотично, особенности химического строения не позволяют им создавать регулярные структуры. Тем не менее, эти две дисперсии имеют разную упаковку молекул в ядре, кроме того, ПФД и ПФТПА различаются по степени гидрофобнос-ти, в связи с этим они сорбируют разное количество ХС.

Таблица 2.

Содержание липидов в осадке эмульсии ПМЦГП, стабилизированной проксанолом, выделенном из крови в различные сроки после инфузии

эмульсии

Фракции липидов Время наблюдения

1 час 3 час 6 час 24 час

Общие ФЛ 20,0 19,5 20,8 21,3

ХС 25,3 20,4 22,6 23,7

сжк 11,6 8,4 9,7 10,8

ТГ 13,6 18,6 15,4 14,9

ЭХ 29,8 32,1 31,5 26,3

Известно, что ХС может частично растворяться в слабополярной гидрофобной фазе. Поэтому дисперсия ПФТПА сорбирует значительные количества свободного ХС. Через 6 часов циркуляции дисперсии ПФТПА в кровотоке соотношение ХС/ФЛ составляет 2:1. Это свидетельствует в пользу того, что часть ХС содержится в ядре. Известно, что ФХ и ХС являются

комплементарными молекулами. Дисперсии ФХ адсорбируют ХС до равновесного соотношения ХС\ФЛ=1. Активно взимодействуют с ХС также моно- и бислои, состоящие из ФХ и СМ. СМ проявляет высокую аффинность по отношению к ХС. Показано, что возрастание содержания СМ в поверхностном монослос частиц значительно повышает способность дисперсий ПФС сорбировать ХС.

Таблица 3.

Состав жирных кислот фосфатидилхолина, ассоциирующегося с частицами эмульсии ПФД\ПФТПА, стабилизированной прокешолом, в различные сроки после инфузии эмульсии

кислоты Время наблюдения

1 час 3 час 6 час 24 час

С 10:0 0,5 1,6 - -

С ]2:0 1,0 1,0 - -

п ^ !за 6,7 16,2 - 6,4

С ко 1,0 3,9 - -

С ir,-« 28,4 34,8 35,5 46,3

С 16:1 - - 21,7 ■ - -

С tg-o 15,1 14,3 28,2 23,8

С ig:i 19,2 24,6 11,3 14,6

С 18:2 6Д 4,2 2,5 8,9

С 20:0 8,8 - - -

С 22.1 14,1 - - -

ПФД и ПФ'ША различаются по степени гидрофобное™, которая наиболее выражена у ПФД, не имеющего в молекуле полярных групп. Однако объяснить низкую степень растворимости в них неполярных липидов

можно, учитывая особенности их химической структуры, которая не позволяет им организовывать совместные «упаковки» молекул. В то же время небольшие молекулы короткоцепочечных СЖК и ТГ могут взаимодействовать с гидрофобным ядром, располагаясь на его периферии. В бинарной смеси 11ФД/НФША можно предположить существование определенной структуры гидрофобного ядра, так молекулы Ш11А, имеющие ацильные радикалы, должны быть определенным образом ориентированы при взаимодействии с планарной молекулой ПФД. Очевидно, что гидрофобное ядро осуществляет «отбор» определенных классов липидов в соответствии с величиной и полярностью та жирнокислотных радикалов.

Таблица 4.

Состав жирных кислот фракции фосфатидилхолина, ассоциирующегося с частицами эмульсии ПМЦГП, стабилизированной проксанолом, в различные сроки после инфузии эмульсии

кислоты Время наблюдения

1 час 3 час 6 час 24 час

с 12:0 0,8 0,1 _ -

С 14.0 0,9 0,1 -

С 16-0 10,8 9,3 5,6 5,3

С[б-! _ _ 0,1 0,3

С 18 0 12,4 7,0 6,4 6,0

С 18.1 16,9 12,6 15,8 17,0

С 18:2 8,9 15,5 17,8 19,2

С 20:0 10,3 13,2 15,9 14,1

С 20:5 13,6 15,8 16,0 16,6

С 20:4 12,1 11,8 12,0 Н,1

С 22.1 15,6 14,8 10,4 9,8

Анализ жирнокислотного состава отдельных классов амфифильных и неполярных липидов позволил выявить, что на ранних сроках циркуляции

дисперсий ПФС в кровотоке присутствие остаточного количество проксанола на поверхности частиц способствует ассоциации с частицами всех исследованных дисперсий липидов, содержащих длинноцепочечные ЖК с числом углеродных атомов 20-22. К 6 часам состав ЖК у дисперсий бинарной смеси ПФД/ПФТПА, НФД и ПФТГТА ограничивается молекулами средней длины (16-18 у.а.). В этот срок с частицами бинарной смеси ПФД/ПФТПА связываются липиды, содержащие преимущественно ЖК 16:0, 18:0. 18:1, 18:2; с частицами ПФД-ЖК 16:0, 16:1, 18:!; с частицами ПФТПА -16:0, 18:0, 18:1 (табл. 3).

Таблица 5

Изменение соотношения ХС\ФЛ в осадках эмульсий ПФС, выделенных из крови в различные сроки после инфузии эмульсий

Эмульсия ПФС Сроки наблюдения

1 час 3 часа б час 24 час

ПФДПФТПА 1:3 1:2,5 1,5:1 1:1

ПФД 1:1,5 ..... 1:1 2:1 1:1

ПФТПА 2:1 2:1 2:1 2:1

пмцгп 1:1 1:1 1:1 1:1

Состав ацилышх радикалов также свидетельствует о частичной структурированности гидрофобной фазы ПФД/ПФТПА, так как аналогичный состав ЖК присутствует в природных ТГ, составляющих гидрофобное ядро ЛПОНП. Оказалось, что состав ацильных радикалов ФЛ и полярных липидов для каждой из этих гидрофобных фаз, обнаруживаемый через 6 часов, совпадает. Это свойство отличает дисперсии ПФС от природной дисперсии липопротеидов, в которых ФЛ содержат большое количество ненасыщенных ЖК. Тот факт, что с частицами бинарной смеси 11ФД/11ФТПА связывается большое количество ФХ, содержащего пальмитиновую кислоту (до 46,3% от

всех ЖК), служит указанием на причину стимуляции синтеза этого соединения в тканях легких в ответ на инфузию эмульсии 1. Известно, что легочный сурфактант состоит преимущественно из дипальмитоилфосфатидилхолина. По-видимому, содержание этого соединения в плазме крови регулируется его синтезом в легких. С частицами ПМЦГП, циркулирующими в кровотоке, ассоциируется большое количество ЭХ и СМ, которые содержат длинноцепочечные радикалы ненасыщенных жирных кислот (табл. 4). Значительная аффинность к СМ у частиц дисперсии ПМЦГП объясняется также тем, что структура ядра, образованного этим ПФС совместно с ЭХ, позволяет проникать в глубь ядра высокомолекулярным ацильным радикалам, которые содержит СМ. Частица ПМЦГП осуществляет также избирательную адсорбцию не только СМ и ЭХ, но также и ФХ и СЖК, имеющих ацильные радикалы с числом у.а. 20-22. Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показано, что химическая структура соединений, образующих гидрофобное ядро дисперсий типа «масло в воде», определяет качественный и количественный состав амфифильных соединений, адсорбирующихся на поверхности ядра, и адсорбционную способность дисперсий ПФС по отношению к ХС. Как видно, свойства частиц дисперсий ПФС и их поведение в кровеносном русле во многом обусловлены структурой их гидрофобной фазы. По аналогии с частицами ПФС можно утверждать, что и свойства природной дисперсии липопротеидов крови в той же степени определяются составом ядра, которое в данном случае структурируется с участием апобелков. Предпринимались попытки изучать эти свойства с помощью безбелковых жировых эмульсий, имеющих различное соотношение ТГ/ЭХ. Однако использование в экспериментах такого рода дисперсий ПФС гораздо более информативно. Структурой молекулы ПФС можно объяснить наблюдаемые различия растворимости этих соединений в липидах и скорость их элиминации из организма. Мы предполагаем, что не столько молекулярная масса и наличие гетероатомов в молекуле ПФС, сколько структура этих соединений, которая

по форме и степени гидрофобности соответствует структурам липидов, образующих липидные бислои, определяет скорость выведения ПФС как из кровеносного русла, так и го организма в целом. П нашим представлениям скорость выведения зависит от характера взаимодействия молекул ПФС с кристаллическими структурами, образуемыми природными липидами в организме. Так, например, ПФС, структура которых соответствует структуре природных липидов( планарная структура холестерина, ацильные радикалы), быстрее выводятся из организма, мигрируя сквозь бислои ( ПФД, пефтороктштбромид).

Высокая аффинность частиц ПФС к определенным классам ФЛ была продемонстрирована в экспериментах in vitro при инкубации эмульсии ПФД/ПФТПА, стабилизированной двухкомпонентым эмульгатором, с донорской плазмой. Инкубация проводилась в течете 6 часов, когда полностью завершается замещение поверхностного монослоя. Изменения в содержании ФЛ, ассоциированных с частицами, отслеживали по адильному профилю. Оказалось, что частицы ПФС интенсивно обмениваются ФЛ с липопротеидами плазмы. Обмен происходит до тех пор, пока ацильный профиль ассоциированных ФЛ не оказывается аналогичным тому, который наблюдался после 6 часов циркуляции эмульсии в кровотоке. Более того, было обнаружено, что интенсивность обмена не имеет прямой пропорциональной зависимости от соотношения эмульсия/плазма, т. е. от соотношения числа взаимодействующих частиц. Наиболее интенсивно обмен происходил при определенных концентрациях эмульсии, соответствующих соотношению эмульсия/плазма 1:2, 1:4. Таким образом, независимо от того, содержит эмульсия ФЛ в качестве эмульгатора или нет, частицы ПФС осуществляют избирательную адсорбцию липидов на поверхности, в результате чего происходит замещение эмульгатора, обеспечивавшего стабильность эмульсии in vitro на эмульгатор, поддерживающий дисперсность частиц in vivo. Структура и состав этого нового адсорбционного слоя определяет судьбу частиц ПФС в кровеносном русле.

Сорбция линидов дисперсией перфторуглеродных соединений при взаимодействии с различными природными лшшдсодержащими

средами

1. Взаимодействие эмульсий ПФС с липопротеидами плазмы крови.

Нами показано, что неметаболизирукмциеся частицы ПФС при циркуляции в кровеносном русле в результате физического контакта с частицами природной дисперсии крови «оттягивают» на себя липиды (эмульсия 1) или обмениваются с ними лшщдами (эмуьсия 2). Такими частицами природной дисперсии являются липопротеиды и клетки крови. Эксперименты проводились на крысах, у которых ЛПНП не являются транспортной формой ЭХ. Потребность б полиеновых кислотах удовлетворяется за счет ацилов ФЛ. ЛПНП содержат мало свободного ХС. Напротив, ЛПВП насыщены как ФЛ, так и ХС. ЛПОНП у крыс, как и у человека, являются транспортной формой ТГ и продуцируются печенью. Изменение содержание липидов в липопротеидах плазмы может быть вызвано частицами дисперсии ПФС, а также ее компонентами проксанолом и ФЛ. Проксанол вызывает триглицеридемию. Присутствие ФЛ не экранирует действия проксанола, и эффект его действия наблюдается даже через 3 часа после инфузии эмульсии 2. Триглицеридемия проявлялась как увеличение содержания в плазме ЛПОНП, значительно обогащенных ТГ. Кроме того, неожиданно высокое содержание ТГ отмечается также во фракциях ЛПНП и ЛПВП через 3, и даже через 24 часа, когда не только весь проксанол, но и ПФС покидают кровеносное русло. Помимо ТГ в ЛПНП через 24 часа повышается содержание ХС и ФЛ. Несмотря на инфузию совместно с эмульсией 2 экзогенных ФЛ, вызывающую увеличение уровня общих ФЛ в плазме, содержание их в ЛПВП не повышается. Напротив,

инфузия эмульсии 2 приводит к тому, что содержание ХС и ФЛ в ЛПВП снижается. Следовательно, частицы эмульсии 2 не столько обмениваются липидами с частицами ЛПВП, сколько оттягивают их с этих липопротеидов. Эффект «оттягивания» липидов с частиц природной дисперсии при

эмульсия 1 эмульсия 2

!■ контроль □ 1:01 □ 1:02 £31:04 Р 1:08 {

Рисунок 3. Изменения содержания общего ХС в плазме крови после 6-■га часовой инкубации с эмульсией 1 и эмульсией 2 при различных соотношениях эмульсия/плазма

взаимодействии с эмульсией ПФС наиболее отчетливо проявляется при инфузии эмульсии 1. Единственная фракция, взаимодействующая с частицами эмульсии 1 - ЛПВП, в которых содержание ФЛ снижено через 3 часа, а содержание ХС - снижено в течение 24 часов после инфузии эмульсии.

Известно, что после периода аккумуляции в клетках ПФС вновь поступают в кровоток. В клетках происходит процесс «реэмульгирования», т.е. дробление крупных вакуолей, наполненных ПФС. Образующаяся в

клетке мелкодисперсная фаза ПФС может покидать клетку по механизму ретроэндоцитоза, описанному для ЛПВП. Показано, что через 72 часа после инфузии эмульсии 2 в плазме наблюдается увеличение содержания ФЛ и ХС, не связанных с ЛП. Нами было выдвинуто предположение, что вторичная дисперсия ЛФС представляет собой ультрамелкие частицы, поверхностный слой которых образован из ФЛ и свободного ХС. Таким образом, рециркулируя, частицы ПФС могут осуществлять функции адсорбента ХС в течение продолжительного времени. Учитывая, что в аккумуляции ПФС основное участие принимают макрофаги печени, весь адсорбированный частицами ПФС ХС поступает именно в этот орган.

Адсорбция ХС плазмы дисперсией ПФС продемонстрирована в экспериментах in vitro, когда эмульсии ПФС инкубировали со свежеприготовленной донорской плазмой в течение 6 часов в различных соотношениях эмульсия/плазма. Показано, что взаимодействие частиц дисперсии ПФС с липопрогеидами имеет место только в узком диапазоне взаимных концентраций. При этом эмульсия, содержащая ФЛ, более активно адсорбирует ХС (рис. 3).

2. Взаимодействие дисперсий ПФС с клетками крови Частицы дисперсии ПФС взаимодействуют также с клетками крови. Наиболее удобной моделью для изучения этою взаимодействия являются эритроциты. Эритроцит не синтезирует ФЛ и ХС, я обновление липидов мембраны в кровотоке происходит благодаря интенсивному обмену липшими с лило протеидами. Тем не менее, обменные процессы, происходящие на уровне липопротеидов, не влияют на состав липидов эритроцитарной мембраны. Поэтому изменения в составе липидов мембраны эритроцитов, наблюдаемые во время циркуляции эмульсий ПФС в кровотоке, обусловлены автономным характером взаимодействия компонентов дисперсии ПФС с эритроцитами. Инфузия 5% раствора проксанола существенно изменяет соотношение ФХ и СМ в мембране: содержание СМ увеличивается более чем в два раза. СМ содержит высокомолекулярные

ацильные радикалы и повышение его содержания в мембране увеличивает толщину бислоя. Такое состояние мембраны сохраняется в течение 6 часов. Проксанол, таким образом, значительно изменяет физико-химические параметры мембраны эритроцита. СМ имеет аффинность к свободному ХС сходную с ФХ, поэтому изменение соотношений этих двух классов ФЛ не влияет в целом на соотношение ХС/ФЛ в мембране. После инфузии эмульсии 1 в отдаленные сроки - от 6 до 48часов наблюдаются изменения состава ФЛ, аналогичные вызванным присутствием проксанола. Однако основное воздействие на мембрану оказывают непосредственно частицы дисперсии ПФС, которые стимулируют отток свободного ХС от мембраны на частицы, при этом соотношение ХС/ФЛ в мембране эритроцитов снижается в 2 раза. Действие проксанола на мембрану эритроцитов практически полностью экранируется, если в эмульсии используются ФЛ (эмульсия 2). Напротив, обнаруживается хорошо известное действие липосом, обогащающих мембрану эритроцитов фосфатидилхолином. Наиболее интенсивно это обогащение происходит в течение первого часа после инфузии эмульсии 2 в кровоток, пока экзогенные ФЛ еще циркулируют автономно в кровеносном русле. Присутствие в кровотоке ФЛ везикул и частиц эмульсии 2 активизирует отток мембранного ХС, который происходит более интенсивно, чем в случае эмульсии 1. В организме существуют два механизма оттока ХС от плазматических мембран - один свободный, который происходит при непосредственном контакте поверхностей частиц донора и акцептора или через водную среду, куда частично диффундирует ХС, другой зависимый, когда отток на акцептор осуществляется с помощью специфического мембранного белка-переносчика. Частицы ПФС представляют собой уникальный инструмент для выявления клеток, имеющих тот или иной механизм оттока ХС. Частицы ПФС инкубировали с лимфоцитами человека, со стромой эритроцитов крыс и с Лимфоцитарно-лейкоцитарной стромой коз. Показано, что не происходит оттока ХС с мембран лимфоцитов на частицы ПФС. Полученные результаты согласуются

с установленным недавно фактом, что отток ХС в лимфоцитах регулируется специфическим белком ABC.

Высокая адсорбционная активность дисперсий ПФС по отношению к ХС может найти самое неожиданное практическое применение. Существует обширная группа вирусов, у которых нуклеокапсид заключен в дипидную оболочку, имеющую состав и строение, аналогичное плазматической мембране. Инфекционность вируса в значительной степени определяется белками оболочки, которые участвуют в акте узнавания вирусом клетки-мишени. Изменение физико-химических характеристик липидной оболочки влияет иа степень экспозиции и пространственную ориентацию белков, препятствуя адсорбции вируса на клеточной мембране. Среди активных агентов, снижающих инфекционность оболочечных вирусов, имеются акцепторы ХС. Модель «вирус-клетка» представляет интерес для изучения адсорбционных свойств акцепторов ХС. Свойства четырех типов акцепторов ХС - жировых эмульсий Интралипид 10%, Ишралинид 20%, а также эмульсии 1 и эмульсии 2 были изучены на модели вируса иммунодефицита человека в культуре перевиваемых лимфоцитов МТ-4. В качестве контроля использовался азидотймидин.

Испытываемые препараты использовались в количестве 100 и 300 мг. Интралипид 10% демонстрировал более высокую иротективную активность по сравнению с Интралипидом 20% и эмульсиями ПФС. Эмульсия 1 была менее активна, чем эмульсия 2. Было показано, что протективная акивность эмульсий ПФС проявляется в определенных дозах, при превышении которых проявляется цитотоксичсское действие препаратов. Вопреки ожидаемому результату эмульсия 1 и эмульсия 2 имели практически одинаковое протективное действие. Более высокая акцепторная способность эмульсии 2 компенсировалась мембраноразрыхляюшим действием проксанола. В целом эмульсии ПФС проявляли протективную активность, сопоставимую с действием азидотимиднна.

Определенным препятствованием к пшрокому клиническому применетпо препаратов на основе ПФС, стабилизированных проксанолом,

Таблица 5

Протективная активность Интралипида 10% и 20%, эмульсии 1 и эмульсии 2 в культуре лимфоцитов, зараженных ВИЧ-1.

Наименование препарата Концентрация препарата мкг/мл Цитотоксичность (% жизнеспособных клеток в незараженной культуре) Протективная активность (% жизнеспособных клеток в зараженной культуре

Контроль клеток - 91 -

Контроль вируса - 46

Положительный контроль (азидотимидин) 0,015 89 87

Интралипид 10% 100 90 80

Интралипид 10% 300 90 6

Интралипид 20% 100 91 65

Интралипид 20% 300 91 5

Эмульсия 1 100 89 77

Эмульсия 1 300 89 7

Эмульсия 2 100 89 83

Эмульсия 2 300 89 6

является их реактогенность, проявляющаяся в течение первых минут после инфузии препарата. В процессе проведения исследования нами было обнаружено, что в составе липидов, адсорбированных эмульсией

ПФД/проксанол, содержится неизвестное вещество алифатической природы (Сх).

Это соединение выявлялось в большом количестве при инкубации эмульсии ПФД\проксанол с цельной кровью, в меньшем - при инкубации с плазмой, с лейкоцитарно-лимфоцитарной фракцией крови. Сх обнаруживается преимущественно в ТСХ фракции проксанола, выделенной из состава эмульсии ПФС, содержащей ПФД, после периода ее циркуляции в кровотоке. Из-за того, что невозможности выделить это соединение в чистом виде и накопить его в количествах, необходимых для исследования его структуры методом ЯМР, были использованы косвенные методы анализа. Методами ГЖХ и м асе-спектрометрии установлено, что Сх относится к высокомолекулярным алифатическим соединениям, но не является жирной кислотой. В крови содержатся медленно-реагирующие вещества (МРВ) группы метаболитов арахидоновой кислоты, у которых к углеводородному радикалу присоединены остатки аминокислот. Был проведен аминокислотный анализ реакционной смеси после метилирования экстракта ТСХ фракции проксанола . В смеси были обнаружены аминокислоты цистеин, глицин, аланин. Сх может принадлежать к группе соединений, содержащих аминокислоты. Его адсорбция (концентрирование) на частицах ПФС, содержащих одновременно ПФД и проксанол, приводит к возникновению реакций анафилактоидного типа.

Выводы

1. Впервые обнаружено и исследовано явление адсорбции липидов организма частицами дисперсий ПФС после их инфузии в кровеносное русло.

2. Обнаружено, что на поверхности частиц дисперсий ПФС, стабилизированных нПАВ, во время циркуляции в кровеносном русле происходит замещение эмульгатора на эндогенные липиды, что позволяет поддерживать агрегатввную устойчивость дисперсии в кровотоке после того, как основное количество эмульгатора покидает кровеносное русло. Замещение

эмульгатора происходит независимо от того, какой эмульгатор был использован в рецептуре эмульсии, - синтетическое нПАВ или яичные фосфолипиды.

3. Выявлено, что в циркуляторном русле на частицах дисперсий ПФС происходит формирование нового адсорбционного слоя, который представляет собой мопослой го фосфолипидов, основными компонентами которого являются фосфатидилхолин и сфингомиелин, и холестерина. Адсорбция холестерина начинается не прежде, чем поверхность частицы покроется монослоем из фосфолипидов.

4. Состав и структура поверхностного монослоя, образующегося на частицах дисперсий ПФС в кровеносном русле, определяется химической природой соединений, которые составляют гидрофобное ядро. Гидрофобное ядро, состоящее из параметалциклогсксилпиперидина, растворяет значительные количества эфиров холестерина.

5. Связывание фосфолипидов плазмы крови частицами дисперсии ПФС приводит к значительному снижению содержания фосфолипидов в ткани легких и интенсификации в них синтеза фосфатидилхолина, в связи с чем легкие могут рассматриваться как один из источников свободных фосфолипидов крови.

6. Показано, что дополнительные компоненты, присутствующие в препаратах эмульсий ПФС, не связавшиеся с частицами дисперсии, такие как свободный проксанол и свободные фосфолипиды, оказывают самостоятельное влияние на распределение липидов в плазме крови, в печени и легких. Так, инфузия проксанола ингибирует процессинг липопротеидов, что выражается как повышение содержания общих фосфолипидов и триглицеридов в плазме. Инфузия дисперсии ПФС, содержащей яичные фосфолипиды, ингибирует синтез фосфатидилхолина в печени и легких.

7. Установлено, что при взаимодействии дисперсии ПФС с дисперсной фазой крови (липопротеиды плазмы и мембрана эритроцитов) имеет место обмен липидами между частицами дисперсий, а также происходит отток холестерина на частицы искусственной дисперсии. Отток холестерина не имеет пропорциональной зависимости от числа частиц дисперсии ПФС и находится в

узких пределах пределенных взаимных концентраций природной и искусственной дисперсных фаз.

8. Причиной побочных реакций, наблюдаемых при инфузии в кровоток дисперсий, содержащих перфтордекалин и проксанол, является их свойство адсорбировать низкомолекулярные гидрофобные соединения, создавая на поверхности частиц повышенные концентрации этих соединений.

9. Обоснована гипотеза, согласно которой скорость выведения ПФС из организма определяется их спосбностью растворяться в кристаллической структуре, образуемой ацштьными радикалами сложных липидов.

Список опубликованных работ:

1. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Изучение липидного состава тканей крыс после инфузии поверхностно-активного вещества // В сб.: Биологически-активные эмульсии в эксперименте и клинике. - М.,

1983,- С. 134-145.

2. Е.В.Терешина, H.H.Доронина. Влияние эмульгатора проксанола 268 на некоторые показатели липидного обмена в тканях крыс // Вопр. мед. химии - 1984. - №6. - С. 142-143.

3. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Состояние липидного обмена в организме крыс после инфузии проксанола 268 и фторутлеродной эмульсии // В сб.: Фторуглеродные газопереносящие среды - Пущино,

1984. - С. 93-97.

4. Н.И. Афонин. Ю.Д.Апросин, Д.П.Сидляров, О.Э. Оксинойд, Н.Н.Доронина, Е.В.Терешина и др. Разработка эмульсии перфторуглеродов, газопереносящей основы полифункционального кровезаменителя // Материалы 56-ой научной сессии ЦНИИГПК - М., 1984.-С. 23-25.

5. Н.И. Афонин, Ю.Д.Апросин, Д.П.Сидляров, О.Э. Оксинойд, Н.Н.Доронина, Е.В.Терешина и др. Фторуглеродные эмульсии как кровезаменители с функцией переноса кислорода // В сб.: Клиническая трансфузиология и профилактика посттрансфузионного гепатита. - М., 198-1. - С. 20-25.

6. Е.В.Терешина. Влияние лроксанола и эмульсий, приготовленных на его основе, на фосфолипидный состав тканей и крови крыс // Там же. -С. 47-48.

7. Е.В.Терешина, Н.Н.Доропипа. Влияние поверхностно-активного вещества на содержание фосфолипидов и холестерина в тканях крыс И Указатель ВИНИТИ «депониров. Рукописи» №3356-84 деп. От 23.05.84г. - J 984 - №10. - б\о 198.

8. Е.В.Терешина, H.H. Доронина. Фосфолипиды крови и тканей крыс после инфузии перфторуглеродной эмульсии // Гематол. И трансфузиол. - 1985. -№4. - С. 42-45.

9. Н.И.Афонин, Н.Н.Доронина, Ю.Д.Апросин, Ю.Д.Сидляров, Е.В.Терешина и др. Экспериментальное и клиническое изучение кровезаменителя на основе эмульсии перфторуглеродов // Материалы 57-ой научной сессии ЦНИИГПК. - М., 1985, - С. 57-59.

10.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Состояние липидного обмена в организме крыс после введения им проксанола П-268 и перфторуглеродной эмульсии // П Всесоюзный съезд гематол. и трансфузиол. - Львов, 1985. - С. 81-82.

11. В.К.Качоровский, А.М.Черпак, Е.В.Терешина. Разработка жировой эмульсии на основе лецитинов различного происхождения // Международный симпозиум по хроматографии в биол. и мед. - Прага, 1985.-С. 94-95.

12.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина, О.С.Смелова, Н.И.Афонин. Состав липидов, сорбируемых эмульсией перфторсоединений в кровеносном

русле // Материалы 58-ой научной сессии ЦНИИГПК. - М., 1986. -С.58.

13.Е.В.Терешина, Н.Устюжанина, Н.Н.Доронина, Ю.Д.Апросин, Н.И.Афонин. Жирнокислотный состав липидов, сорбированных эмульсией ПФС при циркуляции в кровеносном русле // Гематол. и трансфузиол. - 1986. - №1. - 45-49.

14.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Состав фосфолипидов, сорбированных эмульсией перфторорганических соединений в кровеносном русле // Гематол. и трансфузиол. - 1986. - №5. - С.ЗО-ЗЗ.

15.H.H.Доронина, Е.В.Терешина, Н.И.Афонин. К вопросу о повышении устойчивости эмульсий перфторорганических соединений в кровеносном русле // Второй всероссийский съезд гематол. и трансфузиол. - Челябинск, 1986. - С. 124.

16. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина, М.И.Эпштейн. Влияние инфузии эмульсии перфторсоединений, стабилизированных различными эмульгаторами, на мембрану эритроцитов // Гематол. и трансфузиол. -1987.-№3.-С. 63-64.

17. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Состав липидов, сорбированных некоторыми эмульсиями перфторорганических соединений при циркуляции в кровеносном русле // Хим.-фарм. журнал. - 1990. - № 7. -С. 16-20.

18.Е.В.Терешина. Эффект сорбции холестерина и липидов плазмы крови частицами эмульсии перфторсоединений в кровеносном русле // Современные проблемы получения лекарственных препаратов. -Ленинфад, 1990. - С. 19-20.

19. Е.В.Терешина. Сорбция липидов организма эмульсиями перфторорганических соединений П Проблемы и перспективы разр. и клин. прим. кровезаменителей и инфуз. растворов. Материалы научно-произв. совещания. -М., 1990. - С. 79-83.

20. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина, Н.И.Афонин. Перспективы применения эмульсий перфторорганических соединений в кардиологии // 1 Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М., 1992. -С. 138-139.

21. Е.В.Терешина. Некоторые аспекты взаимодействия эмульсии перфторорганических соединений с кровью // Хим. - фарм. журнал. -1992.-№ 7.-С. 8-13.

22. E.V.Tereshina, N.N.Doronina, N.I.Afonin, I.N.Ozerova, N.N. Tcherbakova. Some aspects of perfhiorochemical emulsion interaction with blood // Artif.Cells, Blood Subst., Immob. Biotech. - 1992. - Vol. 20. - n. 1-2. - P. 1001-1011.

23.E.V.Tereshina, N.I.Afonin. Effect of lipid absorption by perfluorochemical emulsions in the blood stream and perspectives of its clinical application /7 Artif.Cells, Blood Subst., Immob. Biotech. - 1994. - Vol. 22. - P. 334-340.

24. Е.В.Терешина, Н.И.Афонин. Особенности взаимодействия частиц эмульсий перфторсоединений с липидами в процессе циркуляции в кровеносном русле // Хим. - фарм. журнал. - 1994. - №8. - С. 9-13.

25.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина, О.А.Ильина. К вопросу о реакгогенности эмульсий перфторсоединений // Сб.: Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии. Тез. докл. ТП Всероссийский съезд гематол. и трансфузиол. - С.-11ет. - 1996. - С. 96.

26.E.V.Tereshina, N.NDoronina, O.A.Ilyina. Compounds absorbed by PFC emulsion during incubation with blood cells in vitro /7 Artif.Cells, Blood Subst., Immob. Biotech. - 1997. - Vol. 24. - n. 4. - P. 997 .

27.0.П.Плетенева, Е.В.Терешина, Л.Д.Серова. Некоторые аспекты изучения и использования липосомальных иммуноглобулинов // Вестник службы крови. - 1998. - №3. - С. 35-37.

28. Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Эмульсии перфторсоединений -эндосорбент холеечтерина // 1-ая Всерос. конференция по

атеросклерозу, посвященная 100-летию со дня рожд. А.Л. Мясникова. -М., 1999ю-С.72-73.

29. H.Tereshina , N.Doronina. Periluorochemical emulsions mediate efflux of cholesterol from cclls // Atherosclerosis. - 2000. - Vol. 150. - Suppl. 2. -S?I.

30. H. Tereshina. Can lungs be a source of plasma phospholipids'' // V[ Intern Symp. "Drugs affecting lipid metabolism" N.-Y. - sept. 2001 - P315.

31.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Анти-ВИЧ препарат на основе липидных комплексов /У Научная конф РНИИКЭИ. Тезисы докладов. -М., 1996.

32. Е.В.Терешина, Н.И.Афонин, А.С.Новохатский. Противовирусная активность эмульсий перфторорганических соединений // Всеармейская научн. конф. «Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине». - С.-Пб., 1999. - С. 90.

33.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Сравнительная оценка холестеринсорбирующих свойств инфузионных дисперсных сред (жировые эмульсии, фосфатидилхолиновые липосомы, эмульсии перфторсоединений)// - Пущино, 1998. - С.82-83

34.Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина. Антиатерогенные липоротеиды крови после инфузии эмульсии перфторсоединений // - Пущино, 1999.

ЗЗ.Е.В.Терешина. Инфузия эмульсий 11ФС изменяет содержание фосфолипидов в легких П Всеармейская научн. конф. «Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине». - С.-Пб., 2001. - С. 83-85,

36. Е.В.Терешина. Адсорбционные свойства эмульсий

перфторорганических соединений и их использование для снижения инфекционности некоторых вирусов // Вестник службы крови. - №!.-2002.

Авторские свидетельства:

1. Ь.В.Терешина, Н.Н.Доронина, Ю.Д.Апросин, Н.И. Афонин. Способ получения эмульсий перфторсоединений. № 1251679 от 15 апреля 1986г.

2. С.Н.Федоров, В.В.Захаров, Н.И.Афонин, Е.В.Терешина, Н.Н.Доронина, А.Суровцев. Способ лечения нейроваскулярных и воспалительных заболеваний глаза. № 1775889 от 15 июля 1992г.

Список сокращений

ПФС - перфторуглеродные соединения ПФД - перфторлекалин ПФТПА - перфтортрипропиламин ПМЦГП - параметилциклогексилпиперидин БЛК - белок-липидные комплексы ЛП - липопротеиды СЖК - свободные жирные кислоты ЖК - жирные кислоты ТГ - триглицериды ЭХ - эфиры холестерина ХС - холестерол ФХ - фосфатидилхолин ФЭ - фосфатидилэтаноламин СМ - сфингомиелин ФЛ - фосфолипиды ХМ - хиломикроны

ЛПОНП - липопротеиды очень низкой плотности ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ЛПВП - липопротеиды высокой плотности РЭС - ретикулоэндотелиальная система ПАВ - поверхностно-активное вещество

нПАВ - неиояногенное поверх!гостно-активнос вещество

ЯФЛ - яичные фосфолипиды

ТСХ - тонкослойная хроматография

ГЖХ - ¡жоъМ хроматография