Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Технологическая разработка иммобилизованных лекарственных форм с биоспорином и их исследования

На правах рукописи

Корочинский Алексей Викторович

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С БИОСПОРИНОМ И ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

14.04.01 —технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

11 сен щ

Пятигорск-2014 005552280

005552280

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте -филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный доктор фармацевтических наук, профессор

руководитель: Степанова Элеонора Фёдоровна Официальные Петров Александр Юрьевич, доктор фармацевтических оппоненты: наук, профессор, ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий кафедрой фармации

Каухова Ирина Евгеньевна, доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России, заведующая кафедрой промышленной технологии лекарственных препаратов Ведущая ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский

организация: университет» Минздрава России

Защита состоится 24 октября 2014 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) и на сайте http://www.pmedpharm.ru

Автореферат разослан 2014 года.

Учёный секретарь диссертационного совета

/

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Произошедшие в последнее время кардинальные преобразован™ среды обитания, урбанизация условий жизни, изменения структуры и качества пищи, воды и воздуха, включая микробно-антигенную контаминацию, обусловливают дезадаптационные нарушения гомеостаза у все большего числа людей, затрагивающие, прежде всего, функции иммунной и нейроэндокринной систем, обеспечивающих устойчивость организма к стрессорам, в том числе инфекционным, соматическим, онкологическим и другим заболеваниям. На фоне таких острых и хронических болезней часто развивается дисбактериоз.

Лечение, проводимое при дисбактериозах, осуществляется комплексно с учетом изменений в процессе пищепарения, моторных функций кишечника, выработки и усвоения витаминов, макро- и микроэлементов, а также нарушений нормофлоры кишечника и состояния реактивности организма. Все лечебные мероприятия, в том числе фармакотерапия, применяемые при дисбактериозе, должны назначаться с учетом характера, тяжести и фазы основного заболевания, а также характера клинических проявлений, которые могут быть связаны с ним.

В настоящее время, традиционно существовавший дефицит бактерийных и биопрепаратов, в основном снят, усилиями новых промышленных структур. Более того, помимо таких «знакомых» лекарственных препаратов, как Бифидумбактерин, Лактобактерин, Колибактерин и Бификол, появилось множество новых.

Особое внимание уделяется такому лекарственному препарату, как Биоспорин. Его основу составляют микроорганизмы Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в вегетативных и споровых формах. Это лекарственный препарат, который был разработан специалистами института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного HAH Украины.

Приказом Минздрава РФ № 353 от 29.12.92 Биоспорин был разрешен к применению на территории Российской Федерации. С 1996 г. он выпускается

во флаконах, а с 2003 г. биоспорин производится также и в таблетках. Однако, учитывая значительную эффективность и в связи с этим определенную привлекательность биоспорина, использование таких традиционных форм его приема, является недостаточным. Поэтому расширение ассортимента лекарственных форм биоспорина правомерно и актуально. Особенно в этом отношении могут быть значимы соответствующие лекарственные формы с пролонгированным эффектом.

Хотя дополнительные экономические затраты, сопряженные с получением таких продуктов, пока не способствует дальнейшему развитию и их производства.

Таким образом, подборка соответствующих технологий и исследования по выбору оптимальных форм лекарственных пробиотиков вполне обоснована и своевременна.

Микрокапсулированные формы микроорганизмов в настоящее время вызывают все больший интерес и привлекают внимание исследователей в отношении повышения стрессоустойчивости клеток к агрессивным факторам.

Это заложило основу для проведения направленных исследований для осуществления рациональных условий микрокапсулирования пробиотических культур, в том числе это несомненно целесообразно и для биоспорина.

Степень разработанности темы. К настоящему времени имеется определенный ассортимент лекарственных форм пробиотиков, однако иммобилизованных структур, которые способны были бы обеспечить выраженный пролонгированный эффект и отличались защищенностью от внешних воздействий, в этом перечне пока нет. Что касается собственно биоспорина, несмотря на имеющееся его подробное биологическое и фармакологическое изучение, потенциальные возможности этого препарата пока не раскрыты, а что касается лекарственных форм, то их перечень более чем скромен.

Цели и задачи диссертационной работы является - проведение технологических исследований по созданию иммобилизованных

микрокапсулированных лекарственных форм с биоспорином, их стандартизация и фармакологический скрининг.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать и обосновать оптимальный способ иммобилизации биоспорина.

2. Определить состав оптимальных агентов для иммобилизации биоспорина, в том числе модифицированных.

3. Установить соответствие разработанных структур требованиям, предъявляемым к кишечнорастворимым лекарственным формам.

4. Провести исследования по разработке условий микрокапсулирования биоспорина в том числе время контакта с соответствующим сшивающим агентом.

5. Установить и обосновать технологические характеристики микрокапсул, необходимые для получения конечной лекарственной формы - твердых капсул.

6. Доказать стабильность лекарственной формы в процессе хранения.

7. Выполнить фармакологические исследования полученного лекарственного препарата.

8. Разработать на него нормативную документацию.

Научная новизна исследования. Впервые разработана оригинальная лекарственная форма биоспорина, с пролонгированным эффектом, основанная на принципах иммобилизации; установлены ее физико-химические показатели: выбран оптимальный способ получения микрокапсулированного биоспорина и впервые проведены биофармацевтические исследования полученных лекарственных форм. Впервые предложена технологическая схема производства микрокапсулированного биоспорина, проведены скрининговые фармакологические исследования, в итоге которых подтверждена жизнеспособность и целесообразность разработанной лекарственной формы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретический аспект работы заключается в создании иммобилизованной лекарственной формы пробиотика биоспорина, использовании его в микрокапсулированном

виде, разработке оптимальных способов оценки, а также фармакологическое подтверждение целесообразности и эффективности данной лекарственной формы.

Предложена оптимальная технология иммобилизованной структуры с биоспорином и рассмотрены кинетические особенности взаимодействия биоспорина с альгинатом натрия.

Практическая значимость состоит в апробации предложенной технологии и стандартизации лекарственного препарата, и разработке НД (ФСП, и лабораторный регламент) принятой к апробации на предприятии ООО «Витаукт-пром», о чем имеется акт апробации (дата от 2 августа 2013 года).

Методология и методы исследования. В настоящем диссертационном исследовании использовались различные методы — физико-химические, технологические, биофармацевтические, микробиологические,

фармакологические, гистологические.

Методология исследования базируется на основных технологических позициях создания и изучения оригинальных лекарственных форм пробиотиков и касается основных этапов общих процессов микрокапсулирования.

Дизайн исследования отражает структуру и последовательность выполнения всех этапов работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

- обоснование выбора метода и способа для иммобилизации биоспорина;

- результаты по выбору носителя - полимера для микрокапсулирования;

- результаты по исследованию кинетики сшивки биоспорина альгината натрием;

- результаты исследований по модификации микрокапсул биоспорина;

- результаты биофармацевтических исследований модифицированных микрокапсул биоспорина;

- результаты технологических исследований микрокапсул биоспорина;

- результаты оценки биологической активности, сроков годности лекарственных препаратов на основе иммобилизованного биоспорина;

- результаты фармакологических исследований в отношении безопасности и специфической активности разработанных лекарственных форм биоспорина.

Степень достоверности и апробация результатов работы.

Достоверность полученных результатов определяется, прежде всего, комплексностью выполненных исследований и тщательностью проведенного эксперимента. Все полученные результаты статистически обработаны с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, являются обоснованными, достоверными и логически вытекают из результатов эксперимента.

Обоснованность и достоверность научных положений и выводов базируется на большом литературном и фактическом материале, полученном с использованием современных методов исследования - физико-химических, технологических, фармакологических.

Результаты диссертационной работы опубликованы в 9-ти научных статьях (из них 4 в изданиях, рекомендуемых ВАК), материалы исследований докладывались на конференциях различного уровня: "Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики" (Владикавказ 2010), "Молодые ученые в решении актуальных проблем науки" (Владикавказ 2010), "Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах" (Белгород 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста в компьютерном наборе, содержит 26 таблиц и 32 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, двух глав собственных исследований, выводов, списка литературы, который включает 99 отечественных и 28 зарубежных источника, и приложений (проект ФСП, лабораторный регламент, акт апробации).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Современное состояние исследований лекарственных препаратов и парафармацевтических средств, содержащих пробиотики

(Обзор литературы)

Рассмотрены понятия пробиотиков, их действие на регуляцию обменных процессов в организме путем повышения активности метаболизма кишечной флоры, иммуномодулирующее действие и оказание позитивных влияний на местный и системный иммунитет.

Также рассмотрены различные методы иммобилизации и возможности их использования.

Глава 2. Объекты и методы исследования

При проведении исследований по технологической разработке иммобилизованных лекарственных форм основным объектом являлся лекарственный препарат биоспорин — лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения, флаконы по 5 доз, также использовалась концентрированная субстанция биоспорина (1 г - 100 доз).

При постановке эксперимента были использованы технологические, биофармацевтические, физико-химические, микробиологические,

фармакологические, морфологические методы исследования и методы вариационной статистики. Все необходимые реологические, технологические и структурно-механические характеристики микрокапсул определяли по известным методикам. Оценку биологической активности и сохраняемости препаратов на основе иммобилизованных бактерий, проводили путем определения биологической концентрации микроорганизмов методом высева на плотную питательную среду.

Предварительные скрининговые токсикологические эксперименты выполнялись на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона и на переднем сегменте глаза морских свинок.

Определение специфической активности разработанного препарата проводилось на экспериментальной модели дисбиоза кишечника у крыс.

Глава 3. Возможности получения иммобилизованных лекарственных форм биоспорина

В настоящее время применение лекарственных препаратов-пробиотиков основано на схеме дозирования, предусматривающей применение значительных количеств бактерий. Одним из вариантов решения данной задачи является применение различных методов защиты вводимой клеточной массы пробиотика.

Для иммобилизации микроорганизмов пробиотиков используются: адсорбция, включение в структуру геля и микрокапсулирование.

Поэтому технологические исследования по разработке иммобилизованных лекарственных форм, в частности биоспорина, не теряют актуальности и привлекают к себе внимание.

Следующим этапом наших исследований был выбор оптимального носителя - полимера для микрокапсул и способа микрокапсулирования (таблица 1).

Таблица 1 - Выбор полимеров для микрокапсулирования биоспорина

Наименование полимера н сшивающего агента Концентрация Результаты визуального осмотра

Альгинат натрия и кальция хлорид 2% Сферические гранулы правильной формы, механически прочные

Пектин и кальция хлорид 2% Частицы неправильной формы, механически непрочные

ПВС и тетраборат натрия 2% Днсковидные частицы желеобразной структуры

Смесь хитозана и альгината и кальция хлорид 2-2% Частицы неправильной формы, механически непрочные

Таким образом, оптимальной способностью к образованию микрокапсул с биоспорином обладает гель альгината натрия, сшитый кальция хлоридом.

В качестве способа микрокапсулирования была выбрана экструзия, т.е. капельный способ.

Далее были измерены такие параметры микрокапсул биоспорина с апьгинатом как диаметр и средняя масса. Также были проведены испытания на растворимость в воде, для чего микрокапсулы выдерживали в течение 2 часов в воде очищенной и вели наблюдения за состоянием оболочки и ядра. Результаты

представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристики микрокапсул биоспорина с альгинатом

Наименование образца микрокапсул Наименование показателя Результаты эксперимента

Микрокапсулы на базе алыината натрия Диаметр, мм 0.1

Средняя масса микрокапсул, мг 2.0

Растворимость в воде Набухание внешней оболочки с сохранением структуры и ядра, в отдельных случаях сильное разрыхление оболочки (5%)

Таким образом, диаметр микрокапсул составил 0,1 мм при массе 2,0 мг. Однако недостатками полученных микрокапсул является появление микротрещин в оболочке и неустойчивость в водной среде. Поэтому микрокапсулы были модифицированы с использованием активированного угля и хитозана. Возможность этого выбора обосновывается тем, что на частицах угля удается создать микроколонии бактерий, находящихся в особом физико-химическом окружении, и это повышает их устойчивость и антагонистическую активность. Модификация микрокапсул раствором хитозана позволяет также обеспечить защиту от агрессивных факторов среды ЖКТ.

Для модификации микрокапсул биоспорина хитозаном их выдерживали в течение часа в 0,4% растворе хитозана. затем высушивали.

Внешний вид микрокапсул биоспорина с альгинатом натрия представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Микрокапсулы биоспорина с альгинатом натрия и хитозаном. Далее для получения микрокапсул биоспорина с активированным углем

проводили смешение с ним суспензии биоспорина в соотношении 5 г биоспорина и 4 г угля активированного. Полученную суспензию смешивали с равным количеством 4% раствора апьгината натрия и полученную смесь с помощью пипетки капали с высоты 20 см в 0,2 М раствор кальция хлорида. Затем микрокапсулы оставляли «на созревание». Полученные микрокапсулы биоспорина с активированным углем выдерживали в 0,4% растворе хитозана в течение часа, затем высушивали.

Внешний вид микрокапсул представлен на рисунке 2.

Рисунок 2 — Микрокапсулы биоспорина с активированным углем Характеристики модифицированных микрокапсул представлены в таблице 3. Таблица 3 - Характеристика модифицированных микрокапсул биоспорина

Микрокапсулы, содержащие Описание микрокапсул Средняя масса микрокапсул, мг Диаметр микрокапсул, мм

АЛЬГИНАТ-ХИТОЗАН сферические частицы, коричневого цвета, поверхность гладкая 1,0 0,5

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ сферические частицы. черного цвета, поверхность гладкая 2,0 1,0

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ-ХИТОЗАН сферические частицы. серого цвета, поверхность гладкая 4,5 0,5-1,0

При иммобилизации клеток образовывались микрокапсулы, имеющие одинаковый диаметр. При этом средняя масса микрокапсул апьгината натрия с хитозаном составила 1,0 мг, размеры - 0,5 мм, масса микрокапсул альгината натрия с активированным углем составила 2,0 мг, размеры от 0,5 до 1,0 мм, средняя масса микрокапсул альгината натрия с активированным углем и хитозаном составила 4,5 мг, размеры от 0.5-1,0 мм. Модификация хитозаном приводила к увеличению массы микрокапсул биоспорина как с альгинатом, так

и биоспорина с альгинатом, адсорбированного на активированном угле.

При анализе растворимости микрокапсул альгината натрия с биоспорином в воде очищенной было установлено, что микрокапсулы всех типов несколько увеличивались в размерах, становились мягкими. Происходило набухание внешней оболочки с сохранением структуры и четко выраженного ядра. При механическом воздействии наблюдалось частичное разрушение только 1% микрокапсул с активированным углем, однако другие образцы полностью сохраняли свою целостность.

Важным биофармацевтическим показателем структур иммобилизованных клеток пробиотических микроорганизмов является их способность сохранять целостность в кислой среде желудка и распадаться в щелочной среде кишечника. Для исследования данной характеристики микрокапсул биоспорина, была изучена их устойчивость в следующих модельных средах: 1) физиологический раствор; 2) 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной; 3) раствор натрия гидрокарбоната; 4) фосфатный буферный раствор №1 (динатрия фосфат и лимонная кислота); 5)фосфатный буферный раствор №2 (динатрия фосфат и калия дигидрофосфат). Результаты представлены в таблице 4

Таблица 4 - Биофармацевтические характеристики микрокапсул

№ АЛЬГИНАТ АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ АЛЬГИНАТ-ХИТОЗАН АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ-ХИТОЗАН

1 Набухание микрокапсул Незначительное набухание микрокапсул, сохранение плотной структуры. Образование на поверхности микрокапсул пузырьков газа. Сохранение плотной структуры оболочки микрокапсул Микрокапсулы оставались плотными

2 Разрушение при приложении механического воздействия Размягчение микрокапсул с сохранением формы и структуры и их целостности. Образование на поверхности микрокапсул пузырьков газа. Отсутствие видимых изменений в структуре Не происходило каких-либо видимых изменений в структуре

3 Полное растворение микрокапсул с образованием мутного раствора и осадка Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры.Образование на поверхности микрокапсул пузырьков газа. Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры Полное растворение гранул с образованием мутного раствора и осадка

4 Разрушение с частичным сохранением целостности и структуры Полное растворение микрокапсул с образованием .мутного раствора и осадка. Образование на поверхности микрокапсул пузырьков газа Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры

5 Разрушение с частичным сохранением целостности и структуры Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры.Образование на поверхности микрокапсул пузырьков газа. Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры Разрушение микрокапсул с частичной сохранностью целостности и структуры

В результате проведенных исследований было показано, что обработка микрокапсул биоспорина раствором хитозана обеспечивала улучшение качества и стабильности микрокапсул. Это можно объяснить появлением оболочки полиэлектролитного комплекса на поверхности структуры и возможным дальнейшим распространением реакции между макромолекулами полиэлектролитов вглубь ядра.

Дальнейшие исследования были посвящены условиям процесса поперечной сшивки альгиновой кислоты кальция хлоридом, для чего была использована традиционная методика Кирстена и Быока. при этом очевидно, что при образовании гранул протекает реакция замещения катионов на катионы Са~^ с образованием нерастворимого в воде кальция альгината.

Са

I

о

он 0/ он

0

1 _|п

Са

: 0,0125

О 20 40 60 80 100 120

Рисунок 3 - Структурная формула кальция альгината и кинетическая кривая изменения концентрации кальция хлорида в приёмном растворе

Концентрацию ионов кальция в пересчёте на кальция хлорид определяли по методике ОФС 42-0090-08. Титрант - 0,05 М раствор натрия эдетата, индикатор — кислотный хром тёмно-синий.

Таким образом полученная лекарственная форма, состоящая из

адсорбированных клеток, пространственно ограниченных гелями полимеров, имеет достаточно большие перспективы как самостоятельная форма выпуска лекарственных средств и как промежуточный продукт, который после дополнительной относительно несложной модификации возможно использовать не только в составе твердых, но и жидких лекарственных форм, что расширит круг выпускаемых в настоящее время пробиотиков, а также значительно улучшит их потребительские свойства.

Изучение технологических характеристик микрокапсулированных субстанций биоспорина проводили с помощью ситового анализа (таблица 5).

Таблица 5- Результаты ситового анализа микрокапсул биоспорина

Диаметр отверстий в сите, мм Содержание фракций микрокапсул биоспорина с альгинатом, % Содержание фракций микрокапсул биоспорина с альгинатом и активированным углем, %

+ - + -

5.0 0 100 0 100

2.0 0 100 0 100

1.0 0 100 100 0

0.5 100 0 0 0

Оказалось, что модификация микрокапсул хитозаном не влияла на их размер. Во всех образцах отсутствовали частицы размером менее 0,2 и более 2,0 мм, что положительно влияет на точность дозирования по объему.

Далее определяли такой параметр как насыпная (или объемная) плотность, т.е. масса единицы объема свободно насыпанных микрокапсул. Ее определяли путем свободного насыпания микрокапсул в емкость определенного объема со стандартным уплотнением. По значению насыпной плотности можно прогнозировать объем матричного канала и характер применяемых вспомогательных веществ в случае предполагаемого дальнейшего таблетирования. Насыпную плотность микрокапсул измеряли на приборе модели 545Р-АК-3 (МЗТО). По полученным величинам насыпной и истинной плотности осуществляли расчет пористости исследуемых микрокапсул. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Результаты определения технологических характеристик микрокапсул с биоспорином

Микрокапсулы биоспорина, содержащие: Насыпная плотность, кг/м3 Истинная плотность, кг/м3 Пористость, %

АЛЬГИНАТ 960 1560 38,46

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ 590 1140 48,26

АЛЬГИНАТ-ХИТОЗАН 910 1520 40.13

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ-ХИТОЗАН 560 1090 48.62

По величине насыпной плотности микрокапсулы биоспорина с альгинатом натрия и вариант с хитозаном, относятся к средним порошкам, а микрокапсулы биоспорина с альгинатом и активированным углем и модифицированные хитозаном - к легким. Модификация поверхности хитозаном приводила к снижению насыпной плотности гранулятов в пределах 5%.

Сыпучесть определяли по скорости высыпания материала на вибрационном устройстве модели ВП-12А (МЗТО). Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Результаты определения сыпучести полученных микрокапсул

Микрокапсулы биоспорина. содержащие: Время истечения, с Сыпучесть, кг/с

АЛЬГИНАТ 1,98 0,0101

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ 2.1 0,0095

АЛЬГИНАТ-ХИТОЗАН 2.04 0.0098

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ-ХИТОЗАН 2.15 0,0093

Все исследуемые образцы микрокапсул обладали отличной сыпучестью, что позволило прогнозировать возможность их использования в дальнейшем в таблетках, а также в такой современной лекарственной форме как твердые желатиновые капсулы.

С помощью прибора ВП-12А определяли также угол естественного откоса. Для микрокапсул альгината величина угла естественного откоса составила 33°, а для микрокапсул альгината с углем активированным - 36°. Полученные величины незначительно превышали верхний предел для хорошо сыпучих материалов (30°).

Важной технологической характеристикой является способность таблетируемой массы к перемещению и деформации. Оценку этой способности проводят через значение коэффициента (степени) сжатия. Коэффициент сжатия определяется как отношение высоты вещества в матрице к высоте изготовленной таблетки. Для микрокапсул биоспорина с альгинатом и их

модификации величина коэффициента сжатия составила 4,0 и 4,1, соответственно, а для микрокапсул с активированным углем и их модификации — 2,22 и 2,21, соответственно, т.е. для прессования более предпочтительны микрокапсулы, содержащие активированный уголь.

Исходя из высоких технологических параметров исследуемых микрокапсул, была рассмотрена возможность их таблетирования. С этой целью были определены такие технологические показатели как прессуемость. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты определения коэффициента прессуемости полученных микрокапсул

Микрокапсулы биоспорина, содержащие: Коэффициент прессуемости

АЛЬГИНАТ 0,153

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ 0,074

АЛЬГИНАТ-ХИТОЗАН 0,151

АЛЬГИНАТ-УГОЛЬ-ХИТОЗАН 0,076

Однако в процессе дальнейших исследований было определено, что получаемые из исследуемых микрокапсул таблетки обладают крайне низкой прочностью. На основании полученных результатов нами был сделан вывод о том, что получение таблеток из микрокапсул прямым прессованием не представляется возможным из-за низкой прессуемости и крупного гранулометрического состава. Теоретически возможно проводить таблетирование при условии добавления больших количеств связующих веществ в качестве наполнителя, (полимерные матрицы высокомолекулярных жиров и их эфиров и др.), однако, это нецелесообразно из-за высоких затрат. Более предпочтительным выглядит вариант использования исследуемых микрокапсул, как самостоятельной лекарственной формы при дозировании по пакетикам (саше) или капсулам.

Проведенные подробные технологические исследования позволили предложить конечную дозированную лекарственную форму - твердые желатиновые капсулы по 0,200г (5 доз) и сконструировать соответствующую технологическую схему производства.

ВР.3.1

ВР.4.1.

ВР.4.2.

I ВР.4.3.

ВР.5.1.

ТП.5.2.

ТП6.1.

ВР.2.1. Подготовка воздуха

ВР.2.2. Подготовка дезинфицирующих растворов для санитарной обработки

ВР.2.3. Подготовка помещений и оборудования

ВР.2.4. Подготовка персонала

ВР.2.5. Подготовка технологической одежды

I Мойка

тары

I ВР.4.2_( Сушка тары

I Взвешивание сырья

Измельчение сырья

| Просеивание

Смешивание

| ТП.5.1. | Экструзия

Отстаивание

| ТП.5.3 | Фильтрация

Отстаивание

ВР. 1. Кт, Кх, Км Подготовка воды

ВР. 2 Кт, Кх, Км Санитарная обработка производства

ТП. 6.2 Фильтрация

ТП.6.3. Сушка

УМО .7.1. Фасовка

УМО .7.2. Упаковка

УМО .7.3. Маркировка

УМО .7.3. Отгрузка

Прометок в канализацию

К

ВР.З. Кт, Кх. Км Подготовка тары

ВР.4. Кт, Кх, Км Подготовка сырья

ВР.5. Кт, Кх. Км Приготовление раствора сшивателя

та5. Кт, Кх, Км Получение гранул

ТП.6. Кт, Кх, Км Получение микрокапсул

УМО.7 Кт, Кх. Км Фасовка и упаковка

Потерн

Потери

, Потери

1-ГВс

Потери механические

Готовая продукция на склад

* Карантинное хранение *

Рисунок 4. Технологическая схема производства микрокапсул биоспорина

Кт, Кх, Км - соответственно технологический, химический и микробиологический контроль

ВР - стадии вспомогательных работ

ТП - стадии основных технологических процессов

УМО - стадии упаковывания, маркирования и отгрузки готового продукта

Основными этапами схемы являются собственно экструзия и фильтрация готовых микрокапсул. Таким образом, нами впервые разработаны состав и

технология иммобилизованной лекарственной формы биоспорина.

Затем проводили оценку биологической активности и сохраняемости разработанного лекарственного препарата. Антагонистическую активность оценивали методом отсроченного антагонизма по величине зоны задержки роста тест-культур. В качестве тест-культур использовали Staphilococcus aureus штамм 209, Shigella sonnei штамм 5069, Proteus vulgaris штамм 177, Candida albicans штамм 885-653 из коллекции ГИСК им. Тарасевича.

Таблица 9 -Характеристики общей и биологической концентрации препаратов иммобилизованного биоспорина

№п/п Наименование препарата Концентрация микроорганизмов, *10J сп*Г'

Общая по стандарту мутности Общая по счету в камере Горяева БК

1 Образец 1 0,4 0,37 0,32± 0,06

2 Образец 1 (хр.) 0,5 0,42 0,36 ±0,07

3 Образец 2 55 52 56 ±11

4 Образец 2 (хр.) 60 54 55 ±8

Полученные результаты свидетельствуют о высокой сохраняемости микроорганизмов, входящих в состав препаративной формы, как на стадии приготовления, так и в процессе хранения.

Практическое отсутствие инактивации биоагента в составе препарата при кратковременном хранении позволяет предположить, что препарат будет характеризоваться высокой устойчивостью при хранении в течение одного года и более.

Результаты исследования антагонистической активности препаратов биоспорина свидетельствуют о сохранении микроорганизмами высокой антагонистической активности по отношению к тест-культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что позволяет сделать вывод об отсутствии в ходе приготовления препаративных форм технологических воздействий, способных существенно изменить свойства биоагента.

Глава 4. Фармакологические исследования безопасности и специфической активности разработанных микрокапсул с биоспорином Фармакологические исследования микрокапсул с биоспорином включали изучение общетоксического действия: раздражающей активности острой

18

токсичности и специфической активности препарата.

Безопасность применения лекарственной формы оценивалась по раздражающей активности in situ на хорион-аллантоисной оболочке куриных эмбрионов и in vivo на переднем сегменте глаза морских свинок.

Острую токсичность рассматривали в экспериментах на мышах.

Изучение специфического действия лекарственной формы биоспорина проводили на модели дисбиоза кишечника крыс, индуцированного антибактериальными препаратами. В качестве препарата сравнения использовали зарегистрированный коммерческий препарат - Бактисубтил (Лаборатории Авентис, Франция) - самоэлиминирующийся антагонист II поколения, в одну группу с которым входят такие препараты, как Биоспорин, Споробактерин и др. В качестве активного компонента Бактисубтила выступают лиофильно высушенные споры В. cereus IP 5832.

Для исследования раздражающего действия на хорион-аллантоисную оболочку куриного эмбриона экстемпорально были приготовлены образцы препарата в объеме по 0,3 мл и подогреты в термостате до 37°С.

При нанесении на хорион-аллантоисную оболочку куриного эмбриона всех образцов исследуемых препаратов в чистом виде в шести случаях из шести не отмечалось какого либо воздействия на хорион-аллантоисную оболочку.

Это позволило, согласно классификации веществ по степени раздражения, отнести образцы исследуемые образцы в чистом виде к 1-му классу соединений, коэффициент раздражающего воздействия 1,0+0,0.

Раздражающая активность in vivo исследовалась на переднем сегменте глаза морских свинок. Индекс раздражающего действия оценивали интегрально: суммировали степень отека и покраснения (гиперемии), результаты эксперимента позволили сделать вывод о том, что все рассматриваемые образцы при применении на слизистую оболочку обладали слабым раздражающим действием.

Специфическую активность определяли на экспериментальной модели дисбиоза кишечника крыс. Объект сравнения Бактисубтил.

После воздействия антибиотиков у всех групп животных наблюдалось резкое снижение аппетита. В дальнейшем, аппетит у животных получавших бактерии и Бактисубтил восстанавливался полностью, причем у последних более выраженно. Применение адсорбированных на угле бактерий несколько ухудшило результаты, замедлив темп восстановления. Показатели в группе, получавшей иммобилизованные альгинатом бактерии, незначительно отличаются от показателей предыдущей группы. Восстановление аппетита в группе животных, получавших исследуемый целевой объект, происходило интенсивнее.

В итоге была установлена динамика изменения массы тела животных.

12315678 День

Рисунок 5-Динамика изменения массы тела животных Полученные результаты коррелируют с данными других авторов, свидетельствующих, что большинство пробиотических бактерий, способствует увеличению массы тела людей и животных при их введении. Более быстрое восстановление веса и аппетита животных группы, получавшей исследуемый препарат можно связать с нормализацией пищеварительных функций желудочно-кишечного тракта, более интенсивными процессами разрушения и выведения антибактериальных препаратов в результате использования пробиотиков.

В итоге гистологических исследований, выполненных для подтверждения фармакологического скрининга было установлено, что наименьшее поражение слизистой ЖКТ наблюдается в группе животных получавших исследуемый

препарат биоспорина.

Рисунок б - Гистологические срезы желудка, тонкого и толстого кишечника Анализ гистоморфологических изменений показал, что по степени их выраженности группы распределились в следующей последовательности: группа негативного контроля > группы, получавшие Бактисубтил и адсорбированные на угле бактерии > группа, получавшая бактерии биоспорина > группа, получавшая бактерии, иммобилизованные альгинатом > группа получавшая адсорбированные на угле бактерии, иммобилизованные альгинатом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты выполненных исследований позволили прийти к следующему заключению:

1. Выбран оптимальный способ иммобилизации для биоспорина — микрокапсулирование и установлен наиболее подходящий вариант его технологической реализации.

2. Установлены и экспериментально обоснованы агенты для иммобилизации биоспорина методом микрокапсулирования — адсорбент - уголь активированный и полимер для поперечной сшивки кальция хлоридом -альгинат натрия, а также выполнена модификация микрокапсул биоспорина с альгинатом натрия с помощью хитозана и получены микрокапсулы биоспорина с активированным углем, модифицированные хитозаном и проведена их сравнительная характеристика.

3. Установлено и экспериментально обосновано: микрокапсулы альгината натрия с активированным углем, модифицированные хитозаном

соответствуют требованиям, предъявляемым к кишечнорастворимым лекарственным формам - устойчивость в кислой среде (модельный 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной) и распадаемость в щелочной среде.

4. Проведено исследование кинетики сшивки альгината натрия кальция хлоридом при микрокапсулировании биоспорина и установлено, что оптимальное время выдерживания альгинатных частиц в растворе сшивающего агента - кальция хлорида - 10 минут, весовом соотношении альгината натрия и кальция хлорида 1:1,1 соответственно.

5. Установлены и экспериментально обоснованы технологические характеристики микрокапсул: фракционный состав, пористость, насыпная и истинная плотность, сыпучесть, коэффициент сжатия, прессуемость. Определена величина насыпной плотности биоспорина с альгината натрием - от 1090 кг/м5 до 1560 кг/м3. Пористость смесей составила в среднем от 38 до 48%.

6. Установлено, что в ходе получения лекарственных форм препарата технологические воздействия, существенно не изменяют свойства биоагента, а практическое отсутствие инактивации в процессе хранения предполагает высокую устойчивость лекарственного препарата в течение одного года.

7. Выполнены фармакологические исследования разработанного лекарственного препарата. Проведена оценка терапевтической эффективности на модели экспериментального дисбиоза, индуцированного антибиотиками. Показано, что специфическая активность предложенных микрокапсул сопоставима с эффектом коммерческого препарата Бактисубтил.

8. Разработана нормативная документация на микрокапсулы биоспорина с альгинатом натрия, модифицированные хитозаном и проведена их технологическая апробация в производственных условиях.

Результаты настоящих исследований могут быть продолжены и

расширены в отношении масштабирования технологии производства

лекарственных форм биоспорина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Берниковский, В.В. Изучение технологических свойств гранул поперечно-сшитого альгината, используемых в качестве носителя иммобилизованных клеток/ В.В. Берниковский, A.B. Корочинский, Э.Ф. Степанова// Вестник новых мед. технологий. - 2009. - Т. 16, №4. - С. 93-95.

2. Определение раздражающего действия и острой токсичности иммобилизованных форм бактерий/ A.B. Корочинский, И.А. Савенко, A.B. Сергиенко, М.Н. Ивашев// Биомедицина.- 2010. -№5,- С. 97-99.

3. Корочинский, A.B. Оценка биологической и антагонистической активности препаратов на основе иммобилизованных бактерий/ A.B. Корочинский, Э.Ф. Степанова, Ю.И. Остроумов// Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. -2012. - №10 (129), Вып. 18/2.-С. 143-145.

4. Фармакологические исследования лекарственной формы биоспорина, иммобилизованного на микрокапсулах/ A.B. Корочинский, И.М. Привалов, Э.Ф. Степанова [и др.]// Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. - 2012. - №10 (129), Вып. 18/3. - С. 114-120.

5. Корочинский, A.B. Иммобилизация бактериальных клеток как путь совершенствования препаратов пробиотиков/ A.B. Корочинский, Э.Ф. Степанова,

B.В. Берниковский// Фармация и общественное здоровье: материалы ежегод. конф. - Екатеринбург, 2009. - С. 139-141.

6. Корочинский, A.B. Исследования свойств носителей иммобилизованных клеток/ Корочинский A.B.// Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики: сб. науч. тр. - Владикавказ, 2010. - С. 88-92.

7. Корочинский, A.B. Исследование возможности создания иммобилизованных структур на базе пробиотиков/ A.B. Корочинский, В.В. Берниковский, Э.Ф. Степанова// Успехи современного естествознания. - 2010. - №5. - С. 34-38.

8. Корочинский, A.B. Изучение процесса поперечной сшивки натрия альгината ионами кальция/ A.B. Корочинский, В.В. Берниковский// Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых междунар. науч.-практ. конф. 22-23 мая 2010 г.- Владикавказ, 2010.-C.il 6-118.

9. Создание оригинальных лекарственных форм на базе биотехнологических объектов и их совершенствование с помощью использования особенностей иммобилизационных и экстракционных процессов/ A.B. Корочинский, Э.Ф. Степанова, В.В. Берниковский [и др.]// Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах: учеб.-метод. материалы Всерос. конф. с элементами научной школы для молодёжи 14-17 сен. 2010 г. - Белгород, 2010. -

C. 91-99.

Л-

г ^ "

Корочинский Алексей Викторович

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С БИОСПОРИНОМ И ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

14.04.01 - технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «16» июля 2014 года,

Формат 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0

Тираж 100 экз. Заказ № 4-3 /

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ - ФИЛИАЛ ВОЛГОГРАДСКОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА МИНЗДРАВА

РОССИИ

(357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)