Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы при бронхиальной астме у детей

На правах рукописи

Максимова Анна Владимировна

РАСТВОРИМЫЕ ФОРМЫ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ У ДЕТЕЙ

14.0036 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород, 2006

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Федерального агентства по образованию

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.В. Новиков Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.И. Краснопрошина, доктор биологических наук, профессор В.Я. Арион

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Российский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится 2006 года в « ^^ » часов на

заседании Диссертационного совета К 208.046.01 при ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « ^ » С-Я^'С ^^у-^ЭРб года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма служит классическим примером иммунопатологии и является частым хроническим заболеванием легких у детей. В течение последних десятилетий во всем мире отмечен рост ее распространенности, а также увеличение числа детей с тяжелыми формами заболевания. Среди школьников России частота астмы составляет 3-12% [Научно-практическая программа «Бронхиальная астма у детей: диагностика, лечение и профилактика», 2004]. Многими специалистами признается потенцирующая роль респираторной вирусной и бактериальной инфекции в утяжелении бронхиальной астмы, развитии ее обострений [Балаболкин И.И., 2003, Балкарова Е.О., Чучалин А.Г., 1998, Федосеев Г.Б., 1996]. В частности, это относится к таким патогенам как цитомегаловирус и Mycoplasma pneumoniae. Инфицированность микоплазмами детей с астмой составляет 66-88%, а смешанная, вирусно-микоплазменная инфекция отмечается у 40-42% больных детей. Инфекционные микроорганизмы часто персистируют в слизистой оболочке дыхательных путей и могут влиять на функциональное состояние иммунной системы больных бронхиальной астмой [Вишнякова Л.А., 1990, Кузьменко Л.Г. и др., 1999, Овсянников Д.Ю. и др., 2002].

Широкая распространенность бронхиальной астмы обусловливает актуальность детального исследования молекулярных механизмов иммунного ответа при различных формах данного заболевания у детей. Это относится и к изучению роли растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы в патогенезе астмы.

Мембранные белки клеток иммунной системы играют важную роль в активации, регуляции, кооперации этих клеток и реализации иммунного ответа в целом. Известно, что мембранные протеины могут иметь растворимые изоформы, образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов [Новиков В.В. и

др., 2005, Adamashvili I. et al., 2002, Drummer R. et al., 1992].

Оценка сывороточного уровня отдельных антигенов и иммунофенотипирование мононуклеарных клеток крови могут быть полезны как в теоретическом аспекте для определения их роли в патогенезе различных заболеваний (в том числе и бронхиальной астмы), так и в практической медицине для мониторинговых и прогностических целей. Цель исследования

Изучить характер изменения сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы во взаимосвязи с популяционным составом мононуклеарных клеток крови детей, больных бронхиальной астмой. Задачи

1. Исследовать относительное содержание клеток периферической крови, несущих на своей поверхностной мембране гликопротеины CD4, CD8 и CD 16 у детей, больных бронхиальной астмой.

2. Определить сывороточное содержание растворимых CD25, CD95, CD38, CD50, CD54, HLA-I, HLA-DR антигенов и относительное содержание положительных по этим антигенам мононуклеарных клеток периферической крови у детей, больных астмой разной степени тяжести.

3. Определить уровень вышеприведенных растворимых антигенов сыворотки крови и популяционный состав мононуклеарных клеток в периоды обострения и ремиссии астмы.

4. Оценить характер изменения сывороточного содержания растворимых форм CD25, CD95, CD38, CD50, CD54, HLA-I, HLA-DR антигенов и CD25+, CD95+, CD38+, CD50+, CD54+, HLA-f, HLA-DR* мононуклеарных клеток крови при бронхиальной астме, ассоциированной с инфицированием цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae.

5. Исследовать возможность существования корреляционных взаимоотношений между сывороточным уровнем тестированных растворимых антигенов, популяционным составом мононуклеарных клеток крови и проходимостью бронхов у детей.

Научная новизна

Показано, что развитие бронхиальной астмы у детей сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы. Сывороточный уровень антигенов адгезии sCDSO1*' и sCD54, а также содержание растворимых форм активационных антигенов CD25, HLA-DR и опосредующего апоптоз белка sCD95, повышается по мере нарастания степени тяжести заболевания, что свидетельствует об их возможном участии в патогенетических механизмах формирования иммунных реакций у детей при бронхиальной астме. У детей при различных вариантах течения бронхиальной астмы выявлены изменения иммунофенотипа мононуклеарных клеток периферической крови, несущих на своей поверхностной мембране рецепторы CD25, CD38, CD50, CD54 и HLA-DR.

Впервые продемонстрировано влияние возбудителей оппортунистических инфекций (цитомегаловируса и Mycoplasma pneumoniae) на уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у детей с астмой. Отмечено, что как моноинфицирование цитомегаловирусом (ЦМВ) или микоплазмой, так и микст-инфицирование (ЦМВ+микоплазма) сопровождаются повышением сывороточного содержания антигенов sCD25 и sHLA-DR. У микст-инфицированных детей, больных бронхиальной астмой обнаружен также рост сывороточного уровня растворимых антигенов адгезии CD50, CD54 и снижение уровня SCD38 антигена. Выявлено, что моноинфицирование цитомегаловирусом ассоциировано у больных детей с уменьшением уровня антигена sCD50 и понижением относительного количества CD54+, HLA-DR+ и HLA-I+ мононуклеарных клеток крови, определяемых в реакции иммунофлуоресценции. Сравнительное сопоставление показало, что микст-инфицирование сопровождается наиболее

r> sCD25, sCD95, sCD38, sCDSO, sCD54, sHLA-I, sHLA-DR - растворимые формы CD25, CD95, CD38, CD50, CD54 мембранных белков клеток иммунной системы и молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов.

выраженными изменениями уровня тестированных антигенов. Эти изменения отражают вариабельность иммунологических реакций организма в зависимости от вида инфицирования.

Практическая значимость

Содержание растворимых ICAM-1 и HLA-DR антигенов в сыворотке крови может быть использовано в качестве дополнительных показателей тяжести бронхиальной астмы и выраженности бронхообструкции, и рассматриваться как возможный мониторинговый показатель неблагоприятного течения астмы у детей.

Увеличение сывороточной концентрации растворимой формы антигена адгезии ICAM-1 у детей при бронхиальной астме взаимосвязано со снижением проходимости средних бронхов (величиной коэффициента МОС5о). Увеличение уровня HLA-DR-положительных клеток и растворимых HLA-DR антигенов ассоциировано с усилением обструкции мелких и средних бронхов (параметры МОС75 и МОС50), соответственно.

Определение уровня растворимых форм CD25, CD95, CD54, HLA-DR антигенов клеток иммунной системы может применяться для прогнозирования тяжести течения бронхиальной астмы у детей (в том числе и ассоциированной с инфицированием цитомегаловирусом и микоплазмой) в аллергологических и пульмонологических педиатрических службах.

Полученные сведения применяются в работе врачами аллергологического центра детской городской клинической больницы №27 «Айболит», а также используются в курсе лекций по иммунологии для студентов биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

Положения, выносимые на защиту

1. Бронхиальная астма у детей сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы, относящихся к различным функциональным группам белков.

2. Инфицированность больных бронхиальной астмой детей цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae ассоциирована с модуляцией уровня растворимых форм мембранных антигенов.

3. Содержание в крови растворимых форм антигенов CD54 и HLA-DR, а также HLA-DR-положительных мононуклеарных клеток отрицательно коррелирует с проходимостью бронхов у детей, больных бронхиальной астмой.

Апробация работы

Работа была апробирована 2 марта 2005 года на совместном расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, Нижегородского отделения Российского научного общества иммунологов, Нижегородского отделения Российского научного общества биохимиков и молекулярных биологов.

Результаты работы представлены на Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», (Санкт-Петербург, 2002); VII и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002, 2004); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов, 2004»; Научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», (Н. Новгород, 2004); 3-м российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», (Москва, 2004); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», 2005; 15-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания и 1-м Учредительном конгрессе Евроазиатского респираторного общества, (Москва, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 155 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 23 таблицами.

Библиографический указатель включает 340 источников литературы (79 отечественных и 261 иностранных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы цельной периферической крови и сыворотки крови детей, больных бронхиальной астмой в возрасте 314 лет, наблюдавшихся в Аллергологическом центре Детской городской клинической больницы №27 «Айболит» г. Нижнего Новгорода. Диагноз бронхиальной астмы, тяжесть течения и период заболевания был установлен врачами больницы (доц. Т.А. Богданова, Е.В. Ермолаева) в соответствии с рекомендациями национальной программы «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» (1997 г.).

При оценке состояния иммунитета у детей с разной степенью тяжести бронхиальной астмы был проведен анализ образцов гепаринизированной крови и сыворотки крови 117 детей в возрасте 7-14 лет. Группу контроля составили 24 клинически здоровых ребенка того же возраста без признаков бронхиальной астмы и аллергических реакций.

Исследование на маркеры цитомегаловирусной, микоплазменной и хламидийной инфекций проводилось совместно с к.б.н. Н.И. Кубышевой (ДГКБ №27 «Айболит») и включало в себя определение в крови IgG антител к антигенам Cytomegalovirus, Mycoplasma pneumoniae и Clamidophila pneumoniae с помощью иммуноферментного анализа. Определение фрагментов генома Cytomegalovirus, Mycoplasma pneumoniae, Clamidophila pneumoniae, Herpes simplex virus 1, 2 в крови, моче, слюне, слезе детей методом полимеразной цепной реакции осуществлялось сотрудниками Нижегородского НИИЭМ им. И.Н. Блохиной (к.б.н. В.Н. Мазепа). При определении состояния иммунитета детей, больных астмой, положительных по маркерам инфицированности цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae, тестировали образцы гепаринизированной крови и сыворотки крови 95 больных в возрасте 3-14 лет. Группу контроля составили 22

клинически здоровых ребенка соответствующего возраста, отрицательных по маркерам инфицированности тестированными патогенами.

Исследование функции внешнего дыхания у детей осуществлялось врачом-аллергологом ДГТСБ №27 Ермолаевой Е.В. с помощью спирографа «Vitalograf-alfa» (Англия).

Определение уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы проводили с помощью иммуноферментных методов с использованием поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека и моноклональных антител (МКА) серии ИКО [Новиков, 1988]. Определение сывороточного уровня растворимых CD25, CD95, CD50, CD54, CD38, HLA-DR антигенов проводили с применением МКА ИКО-105, ИКО-160, ИКО-бО, ИКО-184, ИКО-20, ИКО-1, соответственно. Для определения сывороточного уровня растворимых молекул главного комплекса гистосовместимости I класса использовали МКА ИКО-53 и ИКО-216.

Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток крови выполняли методом непрямой иммунофлуоресценции с применением соответствующих МКА серии ИКО. МКА были получены из Российского онкологического научного центра РАМН, г. Москва (проф. Барышников А.Ю.).

Статистический анализ осуществляли с использованием критериев Крускала-Уоллиса, Данна, Стьюдента с поправкой Бонферонни и критерия ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и их обсуждение

В общей группе больных астмой детей обнаружено достоверное снижение относительного содержания CD4+ мононуклеарных клеток крови, а также выявлена тенденция к повышению числа CD16+ клеток при не изменяющемся содержании CD8+ Т-лимфоцитов. То есть, относительное количество Т-хелперов уменьшалось, а содержание цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров оставалось в пределах нормы. Аналогичные изменения отмечены при повышении степени тяжести бронхиальной астмы (БА) и у больных в период ремиссии заболевания. Период обострения

сопровождался снижением относительного числа Т-хелперов (р<0,05) и нормализацией уровня CD 16-положительных клеток.

Известно, что БА у детей нередко сопровождается инфицированием оппортунистическими патогенами, такими как цитомегаловирус и микоплазмы [Федосеев Г.Б., 2001; Балаболкин И.И., 2004].

В настоящем исследовании обнаружено, что при моноинфицировании детей, больных бронхиальной астмой, цитомегаловирусом отмечается снижение относительного количества CD16+ клеток в 1,3 раза (р<0,05) по сравнению с содержанием этих клеток у больных астмой без маркеров тестированных инфекций. Сравнение с контролем позволило выявить у детей при бронхиальной астме уменьшение относительного числа Т-хелперов периферической крови, как при моноинфицировании ЦМВ (р<0,05) или Mycoplasma pneumoniae (р>0,05), так и при отсутствии маркеров ЦМВ и микоплазмы (р<0,05), а также достоверный рост уровня CD16+ клеток при смешанном инфицировании и при отсутствии инфицирования.

Важная роль в механизмах иммунного ответа принадлежит CD25 (IL-2R) и CD95 (Fas) антигенам [Ярилин А.А., 1999; Mellery J. et al., 2002; Vaux D.L. et al., 1999]. У детей при БА выявлено достоверное повышение сывороточного уровня sCD25 и sCD95 антигенов и относительного количества CD95+ мононуклеарных клеток крови, возрастающие при усилении тяжести астмы (табл. 1).

Таблица 1

Уровень бСВ25 и бС095 антигенов в сыворотке крови детей при бронхиальной астме разной степени тяжести

Показ атель, (U/ml) Контроль БА (общая группа) Легкая БА Средне тяжелая БА Тяжелая БА

sCD25 95,1±18,1 270,3±46,1 * 179,8±99,1 272,0±37,5 * 401,8±86,5*

SCD95 378,7±58,6 611,3±88,3 ♦ 447,2±117,7 633,2±90,1 * 724,5±123,б*

* — достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05).

Известно, что высокий уровень данных антигенов ассоциируется с активацией иммунной системы; вместе с тем растворимые формы участвуют в процессах ограничения активности иммунных реакций. В частности, sCD25 антиген связывает интерлейкин-2 и ограничивает, таким образом, пролиферацию Т-лимфоцитов, а также активность эозинофилов у больных детей. Апоптоз, являясь физиологической формой клеточной смерти, играет важную роль в разрешении воспаления. Ингибирование Fas-зависимого апоптоза путем блокады С095-клеточного рецептора растворимым Fas антигеном, способствует хронизации воспаления [Vignola, 2000].

Как в период обострения, так и в период ремиссии у детей при бронхиальной астме среднее содержание sCD25 и sCD95 антигенов было повышено относительно нормы (табл. 2).

Таблица 2

Сывороточное содержание растворимых антигенов у детей при

бронхиальной астме в период ремиссии и обострения

Показатель, (U/rol) Контроль Бронхиальная астма

Обострение Ремиссия

sCD25 95,3±18,1 241,8±53,4* 327,7±88,6*

sCD95 378,7±58,6 576,6±111,6 688,6±143,6*

sCD50 236,0±33,4 522,0±88,9* 494,8±133,4*

sCD54 39,1±5,6 78,4±16,2* 75,0±23,9

sHLA-I 921,5*221,0 785,0±279,7 753,5±220,7

sHLA-DR 99,5±12,5 299,7±58,8* 269,7±83,7*

* — достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05).

У больных астмой среднетяжелого и тяжелого течения в период обострения отмечался статистически значимый рост уровня зС025 антигена' в 3 раза в сравнении с нормой, у детей при тяжелой БА в период ремиссии он был выше нормы в 4,9 раза (р<0,05). Уровень растворимого Раз-антигена достоверно возрастал в 1,9 раза при тяжелой астме в период обострения заболевания.

Относительное содержание CD25+ мононуклеарных клеток крови у детей в среднем соответствовало норме при обострении астмы и имело тенденцию к повышению при ремиссии заболевания. Относительное количество CD95+ мононуклеарных клеток периферической крови также имело лишь тенденцию к повышению во всех группах больных астмой.

Наряду с оценкой сывороточного уровня растворимых антигенов CD25, CD95 и относительного количества CD25+, CD95+ мононуклеарных клеток крови у детей при бронхиальной астме разной степени тяжести, нами проведено изучение характера изменения этих показателей у больных астмой детей, инфицированных ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae (рис. 1).

Рис. 1. Сывороточное содержание sCD25 (ряд 1) и sCD95 (ряд 2) антигенов у детей положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae при бронхиальной астме.

1 — контроль; 2 — БА без инфекции (больные БА, отрицательные по маркерам Cytomegalovirus, Mycoplasma pneumoniae, Clamidophila pneumoniae, Herpes simplex virus 1,2); 3 — БА+ЦМВ (больные БА, положительные по маркерам Cytomegalovirus); 4 — БА+микоплазма (больные БА, положительные по маркерам Mycoplasma pneumoniae); 5 — БА+ЦМВ+микоплазма (больные БА, положительные по маркерам Cytomegalovirus и Mycoplasma pneumoniae). * - достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05); ** — достоверные различия по сравнению с неинфицированными больными, (р<0,05).

Сывороточное содержание растворимого CD25 антигена в крови детей, больных бронхиальной астмой, отрицательных по маркерам тестированных

инфекций, имело тенденцию к повышению. Наблюдался достоверный рост уровня sCD25 антигена у детей с астмой, положительных по маркерам 1ДМВ и/или микоплазмы, как относительно нормы, так и относительно группы больных бронхиальной астмой, не инфицированных данными патогенами. Статистически достоверное повышение относительного содержания CD25-положительных клеток по сравнению с нормой было обнаружено при инфицировании детей, больных астмой, микоплазмой и при смешанном инфицировании ЦМВ и микоплазмой.

Выраженное (в 2,4 раза) статистически значимое повышение сывороточного уровня sCD95 антигена было отмечено у детей при бронхиальной астме, ассоциированной одновременно с цитомегаловирусным и микоплазменным инфицированием. В остальных группах обнаружена тенденция к росту содержания sCD95. При оценке относительного количества CD95* мононуклеарных клеток в периферической крови детей, больных астмой, положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или микоплазмы, не выявлено изменений данного показателя ни в одной из групп.

Важными участниками иммунного ответа являются адгезивные гликопротеины поверхности клеток [Александров А.В. и др., 1997; Harris E.S. et al., 2000]. В связи этим, для исследования были выбраны представители молекул адгезии - ICAM-1 (CD54) и ICAM-3 (CD50), а также CD38 антиген.

CD38 антиген является антигеном адгезии, участвующим одновременно в механизмах активации клеток [Deaglio S. et al., 2001; Pfister M. et al., 2001]. В сыворотке крови детей при бронхиальной астмой разной тяжести не выявлено изменений в содержании растворимой формы этого антигена, как в период обострения, так и в период ремиссии. В то же время у детей, больных бронхиальной астмой и одновременно инфицированных ЦМВ и микоплазмой, обнаружено статистически достоверное снижение сывороточного уровня sCD38 антигена по сравнению с нормой и с больными астмой без маркеров тестированных инфекций.

Также обнаружен рост относительного количества CD38+ мононуклеарных

клеток крови при легкой БА в период обострения и у детей с астмой, моноинфицированных ЦМВ или микоплазмой (р<0,05).

Сывороточная концентрация бС050 и бС054 антигенов адгезии у больных общей группы, включающей детей с бронхиальной астмой разной тяжести, была выше нормальных значений в среднем в 2 раза (р<0,05). Более детальный анализ уровня этих антигенов показал, что повышение степени тяжести бронхиальной астмы сопровождалось увеличением сывороточного содержания антигенов адгезии (табл. 3). Достоверный рост уровня зС050 антигена был отмечен у больных со среднетяжелым течением заболевания, а рост уровня бСВ54 антигена - у детей со среднетяжелой и тяжелой астмой.

Относительное содержание С054+ мононуклеарных клеток у больных детей при увеличении степени тяжести астмы менялось противоположным образом. В среднем оно было достоверно снижено в 1,9 раза по сравнению со здоровыми детьми. Количество СБ50+ клеток крови у детей при бронхиальной астме в общей группе достоверно уменьшалось в 1,4 раза.

Таблица 3

Уровень бСВ50 и бС054 антигенов в сыворотке детей при бронхиальной астме разной тяжести

Показатель, (U/ml) Контроль БА (общая группа) Легкая БА Средне тяжелая БА Тяжелая БА

sCD50 236,0±33,4 488,1± 97,4* 242,7± 79,3 472,0±65,7* 725,9±210,9

sCD54 39,1±5,б 77,2±12,5* 32,4±6,3 76,б±11,9* 117,1*26,5*

* — достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05).

Был проведен анализ сывороточного содержания вС050 и вСВ54 антигенов у детей, больных бронхиальной астмой в стадии обострения и ремиссии (табл. 2). Отмечен однонаправленный характер изменения содержания антигенов бС050 и бСВ54 в стадии обострения и ремиссии легкой, среднетяжелой и тяжелой астмы. Бронхиальная астма легкого течения отличалась нормальным уровнем бСП50 и бС054 антигенов при обострении и повышением их содержания в период ремиссии.

Среднетяжелая астма сопровождалась тенденцией к увеличению содержания данных растворимых антигенов адгезии в период обострения относительно периода ремиссии. При тяжелой астме содержание sCD50 и sCD54 антигенов оставалось одинаково высоким в оба периода заболевания. Однако средний сывороточный уровень этих молекул адгезии у больных (в общей группе БА) был увеличен относительно нормы приблизительно в 2 раза.

Определяли также относительное количество CD50* и CD54+ мононуклеарных клеток периферической крови при обострении и ремиссии бронхиальной астмы у детей. Оба периода заболевания сопровождались уменьшением уровня положительных по этим антигенам клеток по сравнению с контрольными значениями.

Был проведен анализ корреляционных взаимоотношений между сывороточным содержанием растворимых антигенов адгезии CD50, CD54, CD38, относительным количеством CD50, CD54, CD38 антиген-положительных клеток и параметрами максимальной объемной скорости выдоха (МОС). Параметры МОС используются в качестве критериев, определяющих выраженность бронхообструкции. Они являются одними из показателей функции внешнего дыхания и регистрируют степень проходимости крупных (МОС25), средних (MOC5q) и мелких (МОС75) бронхов [Баранов B.JL, 2002]. Выявлена отрицательная достоверная корреляционная связь между величиной МОС50 и сывороточным уровнем sCD54 антигена (r=s-0,71, р<0,05). То есть, увеличение сывороточной концентрации sICAM-1 антигена у детей, больных бронхиальной астмой, связано со снижением проходимости средних бронхов.

Повышение сывороточного уровня sCD54 антигена при возрастании тяжести БА и тесная корреляционной взаимосвязь между его уровнем и величиной коэффициента МОС50 демонстрируют важную роль растворимой молекулы ICAM-1 в развитии воспалительных процессов при астме у детей. Рост сывороточного уровня sCD50 антигена у детей при БА, вероятно, обусловлен сходом CD50 антигена с поверхности эпителиальных клеток, что приводит к нарушению процессов инициации иммунного ответа.

Определяли уровень ICAM-1 и ICAM-3 антигенов в крови детей, больных астмой, положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae.

Обнаружено, что сывороточный уровень sCD50 антигена в группе больных астмой лиц без изучаемых инфекций был увеличен в 2,5 раза относительно нормы (р<0,05) (рис. 2). При наличии маркеров микоплазменного инфицирования сывороточное содержание sCD50 имело ярко выраженную тенденцию к повышению. Обращает на себя внимание, что при бронхиальной астме, ассоциированной с наличием маркеров ЦМВ, содержание sCD50 антигена находится в пределах нормы. Наличие у больных одновременно маркеров инфицированности ЦМВ и микоплазмы приводило к увеличению содержания sCD50 в 4,4 раза в сравнении с нормой и в 1,8 раза по сравнению с больными астмой, не инфицированными этими патогенами (р<0,05).

Рис. 2. Сывороточное содержание sCD50 антигена у детей положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae при бронхиальной астме.

1 - контроль; 2 - БА без инфекции; 3 - БА+ЦМВ; 4 - БА+микоплазма; 5 -БА+ЦМВ+микоплазма.

* — достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05);

** — достоверные различия по сравнению с неинфицированными больными,

(р<0,05).

Инфицирование больных детей ЦМВ и/или микоплазмой было ассоциировано также с повышением уровня бС054 антигена. Инфицирование ЦМВ сопровождалось достоверным повышением концентрации бСВ54 антигена в 1,8 раза, а смешанное инфицирование ЦМВ и микоплазмой — повышением в 3,6 раза относительно нормы (р<0,05) (рис, 3). В отличие от уровня растворимых эСП50 и зС054 антигенов, относительное содержание СБ50+ и С054+ мононуклеарных клеток имело тенденцию к понижению при БА, ассоциированной с инфицированием ЦМВ и/или микоплазмой. Наибольшее снижение относительного количества С050+ и СЭ54+ мононуклеарных клеток крови было выявлено у больных детей, положительных по маркерам инфицированности ЦМВ. Полученные результаты свидетельствуют о преимущественном влиянием

цитомегаловируса, а не микоплазмы на адгезивные процессы у инфицированных детей, больных бронхиальной астмой.

', sCD54, I (U/ml)

140

120

100

80

60

40 Л

70

0 1/ , , 1 1

Группы

Рис. 3, Сывороточное содержание sCD54 антигена у детей положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae при бронхиальной астме.

1 — контроль; 2 — БА без инфекции; 3 — БА+ЦМВ; 4 — БА+микоплазма; 5 — БА+ЦМВ+микоплазма.

* - достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05);

** — достоверные различия по сравнению с неинфицированными больными,

(р<0,05).

Ведущая роль в реализации иммунного ответа в норме и при патологии принадлежит молекулам главного комплекса гистосовместимости, которые могут выступать как в роли мембранных белков, презентирукяцих антиген, так и в роли растворимых молекул, регулирующих иммунные реакции [Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., 2001; Рирро Б. ег а1., 1997; РоеЫаи Б. ег а1., 2000].

Исследование характера изменения сывороточной концентрации зНЬА-1 и относительного содержания выявляемых в реакции иммунофлуоресценции НЬА-Г мононуклеарных клеток периферической крови, не показало достоверных изменений в их содержании при бронхиальной астме разной тяжести (табл. 4). Однако обнаружено достоверное снижение сывороточного уровня молекул зНЬА-1 в период ремиссии при тяжелой астме и уменьшение относительного числа НЬА-1+ мононуклеарных клеток крови при обострении заболевания легкого и среднетяжелого течения.

В отличие от уровня зНЬА-1 молекул, сывороточное содержание бНЬА-БК. антигенов при астме в целом, в общей группе больных детей, было повышено в 2,7 раза. Нарастание тяжести заболевания сопровождалось повышением сывороточного уровня зНЬА-ВЙ. антигенов относительно контроля. Легкая астма характеризовалась тенденцией к нарастанию уровня зНЬАЛЖ, среднетяжелая и тяжелая — достоверным ростом уровня бНЬА-ОК антигенов в 3,0 и 4,3 раза, соответственно (табл. 4).

Таблица 4

Уровень зНЬА-1 и бНЬА-ОК антигенов в сыворотке детей при бронхиальной астме разной тяжести

Показа тель, (и/т1) Контроль БА (общая группа) Легкая БА Средне тяжелая БА Тяжелая БА

зНЬА-I 921,5± 221,0 763,8± 172,6 1334,2± 712,3 671,6±132,2 537,5±82,1

бНЬА-БК 99,5±12,5 290,1±47,6* 116,2±36,4 302,0±45,2* 425,9±77,1*

* - достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05).

Содержание sHLA-DR антигенов в общей группе больных БА детей было повышено относительно нормы при обострении и ремиссии заболевания, соответственно, в 2,7 и 3,0 раза (р<0,05) (табл. 2). При этом прослеживалось нарастание содержания sHLA-DR антигенов при утяжелении астмы, как в период ремиссии, так и в период обострения. Статистически значимым этот рост являлся в период обострения среднетяжелой и тяжелой БА, а также при ремиссии тяжелой астмы. Возможно, высокий сывороточный уровень sHLA-DR антигенов у лиц с БА обусловлен сходом молекул гистосовмеегимости с поверхности активированных макрофагов, B-лимфоцитов, Т-хелперов, а также эндотелиальных, эпителиальных и тучных клеток. Биологический смысл такого явления может заключаться в ограничении пролиферации клеток иммунной системы и угнетении гуморального ответа детей с астмой.

Относительное содержание HLA-DR+ клеток было статистически достоверно повышено у больных в среднем в 1,6 раза независимо от степени тяжести астмы, а также в период обострения и ремиссии в 1,5 раза. Достоверные изменения были выявлены на стадии обострения легкой БА и на стадии ремиссии у больных среднетяжелой и тяжелой астмой.

Был проведен корреляционный анализ между сывороточным уровнем молекул гистосовместимости I, II классов, относительным содержанием HLA-Г, HLA-DR* мононуклеарных клеток крови и параметрами МОС. Важно отметить, что у детей, больных БА, увеличение уровня растворимых HLA-DR антигенов и HLA-DR-положительных клеток оказалось связанным с усилением обструкции средних (МОС50) и мелких (МОС75) бронхов, соответственно (rs=-0,71, р<0,05; rs=-0,67, р<0,05).

Полученные результаты позволяет говорить об ассоциации повышенного уровня sHLA-DR с усилением воспалительного процесса у таких больных. С нашей точки зрения, повышенное сывороточное содержание sHLA-DR антигенов можно рассматривать как возможный мониторинговый показатель неблагоприятного течения БА.

Проведена оценка сывороточного уровня молекул sHLA-I у больных астмой детей, положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae (рис. 4). Обнаружено, что присутствие ЦМВ

сопровождается статистически достоверным снижением уровня молекул зНЬА-1 и относительного числа НЬА-Г мононуклеарных клеток крови у больных по сравнению с нормой. Аналогичные изменения обнаружены у детей при БА, инфицированных ЦМВ и микоплазмой. В группе больных БА, инфицированных только микоплазмой, уровень исследуемых показателей не изменен относительно нормы. Вероятно, при смешанном инфицировании снижение уровня бНЬА-1 молекул и относительного содержания НЬА-1+ клеток преимущественно связано с присутствием ЦМВ. Это может быть обусловлено способностью вируса цитомегалии ингибировать функциональную активность молекул НЪА I класса или белков, принимающих участие в транспортировке молекул НЬА I класса из эндоплазматического ретикулума к мембране зараженной клетки.

Рис. 4. Сывороточное содержание sHLA-DR (ряд I) и sHLA-I (ряд 2) антигенов у детей положительных по маркерам инфицированности ЦМВ и/или Mycoplasma pneumoniae при бронхиальной астме.

1 — контроль; 2 - БА без инфекции; 3 — БА+ЦМВ; 4 — БА+микоплазма; 5 — БА+ЦМВ+микоплазма.

* — достоверные различия по сравнению с контролем, (р<0,05);

** — достоверные различия по сравнению с неинфицированными больными,

(р<0,05).

При астме, ассоциированной с цитомегаловирусным и/или микоплазменным инфицированием, выявлены также изменения сывороточного уровня sHLA-DR антигенов и относительного содержания HLA-DR+ моноиуклеарных клеток (рис. 4). Моноинфицирование ЦМВ или микоплазмой приводило к достоверному повышению в сравнении с нормой сывороточного содержания sHLA-DR антигенов в 2,0 раза и 2,2 раза, соответственно. Смешанное инфицирование сопровождалось повышением уровня sHLA-DR антигенов в 6,3 раза (р<0,05). Во всех трех случаях различия были статистически достоверны не только в сравнении с нормой, но и с больными бронхиальной астмой без маркеров инфицирования ЦМВ и микоплазмой.

Относительное содержание положительных по HLA-DR антигенам моноиуклеарных клеток периферической крови повышалось в 1,6-1,9 раза по сравнению с нормой во всех группах больных БА, как отрицательных, так и положительных по маркерам тестируемых инфекций (р<0,05).

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что при бронхиальной астме у детей среди тестированных нами показателей наиболее выраженные изменения были обнаружены для sCD54 и sHLA-DR антигенов. Их уровень возрастал при усилении степени тяжести заболевания, при уменьшении проходимости средних бронхов и при ассоциации астмы со смешанным инфицированием ЦМВ и микоплазмой. В связи с этим, сывороточное содержание растворимых sICAM-1 и sHLA-DR антигенов может быть использовано в качестве дополнительных показателей тяжести бронхиальной астмы и выраженности бронхообструкции у детей.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в крови детей, больных бронхиальной астмой, повышается относительное содержание моноиуклеарных клеток, несущих на своей мембране антигены CD25, CD95, HLA-DR, падает содержание CD4+, CD50+ клеток, от стадии к стадии заболевания снижается относительное содержание CD54+ клеток.

2. Обнаружено, что у детей с нарастанием степени тяжести бронхиальной астмы увеличивается сывороточное содержание растворимых CD25, CD95, CD50, CD54, HLA-DR антигенов клеток иммунной системы.

3. Продемонстрировано, что в периоды ремиссии и обострения при бронхиальной астме легкого, среднетяжелого и тяжелого течения наблюдаются разнонаправленные изменения тестированных показателей иммунитета. Чаще всего статистически достоверные различия между ними в периоды ремиссии и обострения обнаруживаются при бронхиальной астме легкого течения.

4. Выявлено, что моноинфицирование детей с бронхиальной астмой цитомегаловирусом или Mycoplasma pneumoniae ассоциировано с достоверным ростом сывороточного содержания растворимого антигена CD25 и молекул HLA-DR. Моноинфицирование цитомегаловирусом у больных астмой связано с нормализацией повышенного уровня антигена sCD50, увеличением относительного количества CD38+ клеток и уменьшением числа CD54+ и HLA-Г мононуклеарных клеток крови.

5. Обнаружено, что смешанное инфицирование больных астмой детей цитомегаловирусом и ' Mycoplasma pneumoniae сопровождается ростом сывороточного уровня антигенов sCD50, sCD54, sHLA-DR и снижением содержания растворимой формы белка CD38.

6. Показано, что уровень растворимых молекул CD54, HLA-DR в сыворотке и относительное содержание HLA-DR-положительных клеток в периферической крови отрицательно коррелируют с параметрами МОС50 и MOC7J, отражающими проходимость средних и мелких бронхов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богданова Т.А., Кубышева Н.И., Максимова А.В., Мазепа В.Н., Ермолаева Е.В, Лазарева Л.Г., Новиков В.В. Иммунологическая реактивность детей, больных бронхиальной астмой, отягощенной цитомегаловирусной и микоплазменной инфекциями // Сборник научных трудов "Здоровье населения Нижегородской области" (Итоги региональной программы). — Н. Новгород. - 2002. - С. 101-105.

2. Богданова Т.А., Кубышева Н.И., Максимова A.B., Новиков В.В., Мазепа В.Н., Ермолаева Е.В, Лазарева Л.Г. Состояние иммунитета у детей, больных бронхиальной астмой, ассоциированной с оппортунистической флорой // Сборник научных работ «Актуальные вопросы педиатрии, перинатологии и репродуктологии». — Н. Новгород. - 2002. - Вып. 1. - С. 2022.

3. Кубышева Н.И., Богданова Т.А., Ермолаева Е.В., Лазарева Л.Г., Постникова Л.Б., Петров А.Б., Максимова A.B. Взаимосвязь функционального состояния клеток воспаления и содержания цитокинов у больных бронхиальной астмой // Материалы Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». — Санкт-Петербург. - 2002. - С. 97-97.

4. Максимова A.B. Особенности клеточного и медиаторного звеньев иммунитета у детей, больных бронхиальной астмой, отягощенной внутриклеточной инфекцией // Сборник тезисов докладов седьмой Нижегородской сессии молодых ученых. - Н. Новгород. - 2002. — С. 266-267.

5. Максимова A.B., Кубышева Н.И., Богданова Т.А., Ермолаева Е.В., Лазарева Л.Г., Мазепа В.Н., Новиков В.В., Павлова С.М. Влияние цитомегаловируса и микоплазмы на иммунитет детей, больных бронхиальной астмой // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 2. - С. 119-120.

6. Максимова A.B. Участие молекул адгезии в аллергическом воспалении // Сборник тезисов докладов девятой Нижегородской сессии молодых ученых. - Н. Новгород. - 2004. - С. 222-223.

7. Максимова A.B., Кубышева Н.И., Богданова Т.А., Птицына Ю.С., Лазарева Л.Г., Новиков В.В. Сывороточный уровень растворимых молекул гистосовместимости и особенности экспрессии молекул HLA на мононуклеарных клетках крови при бронхиальной астме // Материалы научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». — Н. Новгород. —2004.— С. 154-158.

8. Максимова A.B., Кубышева Н.И., Ермолаева Е.В, Богданова Т.А., Лазарева Л.Г., Новиков В.В. Исследование содержания Fas-антигенов в

периферической крови детей с бронхиальной астмой // Сборник научных работ «Актуальные вопросы педиатрии, перинатологии и репродуктологии». - Н. Новгород. - 2004. - Вып. 2. - С. 82-85.

9. Кубышева Н.И., Постникова Л.Б., Максимова A.B., Ермолаева Е.В, Лазарева Л.Г. Участие растворимых и мембранных форм антигенов адгезии и гистосовместимости у больных бронхиальной астмой // Пульмонология. Сборник тезисов 15-ого Национального конгресса по болезням органов дыхания и 1-ого Учредительного конгресса Евроазиатского респираторного общества. — Москва. — 2005. — С. 35-35.

10. Максимова A.B., Кубышева Н.И., Ермолаева Е.В, Постникова Л.Б., Чеснокова Т.В., Лазарева Л.Г., Новиков В.В. Сывороточное содержание растворимых антигенов адгезии и молекул гистосовместимости у детей с бронхиальной астмой // Аллергология. — 2005. - № 4. — С. 30-34.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за плодотворное совместное научное сотрудничество и помощь в проведении диссертационной работы Новикову В.В., Кубышевой Н.И., Богдановой Т.А., Ермолаевой Е.В., Лазаревой Л.Г., Мазепе В.В., Птицыной Ю.В.

Подписано к печати &¿>- О б Бумага газетная. Формат 60x90 1/16 Печать трафаретная. Уч. изд. л. /. . Усл. печ. л. 1,3 . Тираж 100 экз. Заказ № £ 3 ¿Г

Нижегородский государственный архитектурно-строительный университет, 603950, Н. Новгород, Ильинская, 65

Полиграфцентр ННГАСУ, 603950, II. Новгород, Ильинская, 65

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма служит классическим примером иммунопатологии и является частым хроническим заболеванием легких у детей. В течение последних десятилетий во всем мире отмечен рост ее распространенности, а также увеличение числа детей с тяжелыми формами заболевания. Среди школьников России частота астмы составляет 3-12% [37]. Многими специалистами признается потенцирующая роль респираторной вирусной и бактериальной инфекции в утяжелении бронхиальной астмы, развитии ее обострений [5, 6, 60]. В частности, это относится к таким патогенам как цитомегаловирус и Mycoplasma pneumoniae. Инфицированность микоплазмами детей с астмой составляет 66-88%, а смешанная, вирусно-микоплазменная инфекция отмечается у 40-42% больных детей. Инфекционные микроорганизмы часто персистируют в слизистой оболочке дыхательных путей и могут влиять на функциональное состояние иммунной системы больных бронхиальной астмой [14, 30,44].

Широкая распространенность бронхиальной астмы обусловливает актуальность детального исследования молекулярных механизмов иммунного ответа при различных формах данного заболевания у детей. Это относится и к изучению роли растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы в патогенезе астмы.

Мембранные белки клеток иммунной системы играют важную роль в активации, регуляции, кооперации этих клеток и реализации иммунного ответа в целом. Известно, что мембранные протеины могут иметь растворимые изоформы, образующиеся за счет шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или же выступать в роли активаторов иммунологических процессов [40, 81,138].

Оценка сывороточного уровня отдельных антигенов и иммунофенотипирование мононуклеарных клеток крови могут быть полезны как в теоретическом аспекте для определения их роли в патогенезе различных заболеваний (в том числе и бронхиальной астмы), так и в практической медицине для мониторинговых и прогностических целей. Цель исследования

Изучить характер изменения сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы во взаимосвязи с популяционным составом мононуклеарных клеток крови детей, больных бронхиальной астмой. Задачи

1. Исследовать относительное содержание клеток периферической крови, несущих на своей поверхностной мембране гликопротеины CD4, CD8 и CD 16 у детей, больных бронхиальной астмой.

2. Определить сывороточное содержание растворимых CD25, CD95, CD38, CD50, CD54, HLA-I, HLA-DR антигенов и относительное содержание положительных по этим антигенам мононуклеарных клеток периферической крови у детей, больных астмой разной степени тяжести.

3. Определить уровень вышеприведенных растворимых антигенов сыворотки крови и популяционный состав мононуклеарных клеток в периоды. обострения и ремиссии астмы.

4. Оценить характер изменения сывороточного содержания растворимых форм CD25, CD95, CD38, CD50, CD54, HLA-I, HLA-DR антигенов и CD25+, CD95+, CD38+, CD50+, CD54+, HLA-I+, HLA-DR+ мононуклеарных клеток крови при бронхиальной астме, ассоциированной с инфицированием цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae.

5. Исследовать возможность существования корреляционных взаимоотношений между сывороточным уровнем тестированных растворимых антигенов, популяционным составом мононуклеарных клеток крови и проходимостью бронхов у детей.

Научная новизна

Показано, что развитие бронхиальной астмы у детей сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм ряда мембранных антигенов клеток иммунной системы. Сывороточный уровень антигенов адгезии sCD50 и sCD54, а также содержание растворимых форм активационных антигенов CD25, HLA-DR и опосредующего апоптоз белка sCD95, повышается по мере нарастания степени тяжести заболевания, что свидетельствует об их возможном участии в патогенетических механизмах формирования иммунных реакций у детей при бронхиальной астме. У детей при различных вариантах течения бронхиальной астмы выявлены изменения иммунофенотипа мононуклеарных клеток периферической крови, несущих на своей поверхностной мембране рецепторы CD25, CD38, CD50, CD54 и HLA-DR.

Впервые продемонстрировано влияние возбудителей оппортунистических инфекций (цитомегаловируса и Mycoplasma pneumoniae) на уровень растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у детей с астмой. Отмечено, что как моноинфицирование цитомегаловирусом (ЦМВ) или микоплазмой, так и микст-инфицирование (ЦМВ+микоплазма) сопровождаются повышением сывороточного содержания антигенов sCD25 и sHLA-DR. У микст-инфицированных детей, больных бронхиальной астмой обнаружен также рост сывороточного уровня растворимых антигенов адгезии CD50, CD54 и снижение уровня sCD38 антигена. Выявлено, что; моноинфицирование цитомегаловирусом ассоциировано у больных детей с уменьшением уровня антигена sCD50 и понижением относительного количества CD54+, HLA-DR+ и HLA-I+ мононуклеарных клеток крови, определяемых в реакции иммунофлуоресценции. Сравнительное сопоставление показало, что микст-инфицирование сопровождается наиболее выраженными изменениями уровня тестированных антигенов. Эти изменения отражают вариабельность иммунологических реакций организма в зависимости от вида инфицирования.

Практическая значимость

Содержание растворимых ICAM-1 и HLA-DR антигенов в сыворотке крови может быть использовано в качестве дополнительных показателей тяжести бронхиальной астмы и выраженности бронхообструкции, и рассматриваться как возможный мониторинговый показатель неблагоприятного течения астмы у детей.

Увеличение сывороточной концентрации растворимой формы антигена адгезии ICAM-1 у детей при бронхиальной астме взаимосвязано со снижением проходимости средних бронхов (величиной коэффициента МОС50). Увеличение уровня HLA-DR-положительных клеток и'растворимых HLA-DR антигенов ассоциировано с усилением обструкции мелких и средних бронхов (параметры МОС75 и МОС50), соответственно.

Определение уровня растворимых форм CD25, CD95, CD54, HLA-DR антигенов клеток иммунной системы может применяться для прогнозирования тяжести течения бронхиальной астмы у детей (в том числе и ассоциированной с инфицированием цитомегаловирусом и микоплазмой) в аллергологических и пульмонологических педиатрических службах.

Полученные сведения применяются в работе врачами аллергологического центра детской городской клинической больницы №27 «Айболит», а также используются в курсе лекций по иммунологии для студентов биологического факультета ННГУ им. Н.И. Лобачевского.

Положения, выносимые на защиту

1. Бронхиальная астма у детей сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов клеток; иммунной системы, относящихся к различным функциональным группам белков.

2. Инфицированность больных бронхиальной астмой детей цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae ассоциирована с модуляцией уровня растворимых форм мембранных антигенов.

3. Содержание в крови растворимых форм антигенов CD54 и HLA-DR, а также HLA-DR-положительных мононуклеарных клеток отрицательно коррелирует с проходимостью бронхов у детей, больных бронхиальной астмой.

Апробация работы

Результаты работы представлены на Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», (Санкт-Петербург, 2002); VII и IX Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002, 2004); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов, 2004»; Научной конференции, посвященной 75летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», (Н. Новгород, 2004); 3-м российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», (Москва, 2004); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», 2005; 15-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания и 1-м Учредительном конгрессе Евроазиатского респираторного общества, (Москва, 2005).

Диссертация была апробирована 2 марта 2005 года на совместном расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, Нижегородского отделения Российского научного общества иммунологов, Нижегородского отделения Российского научного общества биохимиков и молекулярных биологов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура и объем диссертации ?

Диссертационная работа в объеме 155 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 16 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает 340 источников литературы (79 отечественных и 261 иностранных авторов).

выводы

1. Показано, что в крови детей, больных бронхиальной астмой, повышается относительное содержание мононуклеарных клеток, несущих на своей мембране антигены CD25, CD95, HLA-DR, падает содержание CD4+, CD50+ клеток, от стадии к стадии заболевания снижается относительное содержание CD54+ клеток.

2. Обнаружено, что у детей с нарастанием степени тяжести бронхиальной астмы увеличивается сывороточное содержание растворимых CD25, CD95, CD50, CD54, HLA-DR антигенов клеток иммунной системы.

3. Продемонстрировано, что в периоды ремиссии и обострения при бронхиальной астме легкого, среднетяжелого и тяжелого течения наблюдаются разнонаправленные изменения тестированных показателей иммунитета. Чаще всего статистически достоверные различия между ними в периоды ремиссии и обострения обнаруживаются при бронхиальной астме легкого течения.

4. Выявлено, что моноинфицирование детей с бронхиальной астмой цитомегаловирусом или Mycoplasma pneumoniae ассоциировано с достоверным ростом сывороточного содержания растворимого антигена CD25 и молекул HLA-DR. Моноинфицирование цитомегаловирусом у больных астмой связано с нормализацией повышенного уровня антигена sCD50, увеличением относительного количества CD38+ клеток и уменьшением числа CD54+ и HLA-I+ мононуклеарных клеток крови.

5. Обнаружено, что смешанное инфицирование больных астмой детей цитомегаловирусом и Mycoplasma pneumoniae сопровождается ростом сывороточного уровня антигенов sCD50, sCD54, sHLA-DR и снижением содержания растворимой формы белка CD38.

6. Показано, что уровень растворимых молекул CD54, HLA-DR в сыворотке и относительное содержание HLA-DR-положительных клеток в периферической крови отрицательно коррелируют с параметрами МОС50 и МОС75, отражающими проходимость средних и мелких бронхов.

Заключение

Бронхиальная астма является классическим примером иммунопатологии и характеризуется, прежде всего, иммунологическим фоном (предрасположенностью), на котором происходит развитие данного заболевания [8]. Астма определяется как хроническое персистирующее воспалительное заболевание дыхательных путей, при котором ведущую роль играют тучные клетки, эозинофилы и Т-лимфоциты [19].

Бронхиальная астма у детей сопровождается рядом изменений иммунологической реактивности, которые связаны со степенью тяжести, периодом заболевания или наличием сопутствующего инфицирования. Эти изменения касаются множества мембранных белков-рецепторов, осуществляющих и регулирующих межклеточные взаимодействия, а также их растворимых форм. Растворимые формы мембранных белков клеток иммунной системы осуществляют чаще всего многофункциональное воздействие. Нарушение их равновесия может приводить к блокаде межклеточных мембранных взаимодействий и ограничению иммунного ответа.

В настоящей работе мы исследовали у детей, больных бронхиальной астмой относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов - CD4+ Т-хелперов, CD8+ цитотоксических лимфоцитов, CD16+ натуральных киллеров, а также относительное число CD25-, CD95-, CD38-, CD50-, CD54-, HLA-I-, HLA-DR-положительных мононуклеарных клеток периферической крови и уровень их сывороточных аналогов, находящихся в растворимой форме.

Было обнаружено, что бронхиальная астма у детей сопровождается достоверным снижением относительного содержания CD4+ Т-хелперов периферической крови, тенденцией к росту относительного числа CD16+ натуральных киллеров при не изменяющемся содержании CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. У детей с бронхиальной астмой выявлено достоверное повышение сывороточного уровня sCD25 и sCD95 антигенов, возрастающее при усилении тяжести бронхиальной астмы, и относительного количества CD95+ мононуклеарных клеток крови, высокий уровень которых ассоциируется с активацией иммунной системы. Вместе с тем, растворимые формы данных антигенов участвуют в процессах ограничения активности иммунных реакций. В частности, sCD25 антиген связывает ИЛ-2, и ограничивает, таким образом, пролиферацию Т-лимфоцитов, а также активность эозинофилов у больных детей. Апоптоз, являясь физиологической формой клеточной смерти, играет важную роль в разрешении воспаления. Ингибирование Fas-зависимого апоптоза путем блокады CD95-клеточного рецептора растворимым Fas антигеном способствует хронизации воспаления.

Важным регулятором почти всех видов иммунного и воспалительного ответа являются адгезивные гликопротеины поверхности клеток, в связи с чем для исследования были выбраны представители молекул адгезии - ICAM-1 (CD54) и ICAM-3 (CD50), а также CD38 антиген. CD50 антиген, наряду с широко известной молекулой CD54, является лигандом LFA-1 антигена, экспрессирующегося на всех типах лейкоцитов. Но, в отличие от CD54, мембранная экспрессия которого индуцируется при воздействии многих факторов и, в первую очередь, при воспалении, CD50 антиген характеризуется конститутивной экспрессией. Уровень экспрессии этого антигена не чувствителен к медиаторам воспаления [259].

Отмечен статистически значимый рост уровня растворимых молекул адгезии ICAM-1 и ICAM-3 в сыворотке лиц при Б А; относительное количество положительных по этим антигенам клеток крови, напротив, было понижено у больных детей по сравнению с нормой. При проведении корреляционного анализа было выявлено, что увеличение сывороточной концентрации sICAM-1 антигена у детей, больных бронхиальной астмой, ассоциируется со снижением проходимости средних бронхов (величиной коэффициента МОС50).

В литературе существуют указания на то, что экспозиция аллергена в организме человека приводит к усилению экспрессии ICAM-1 молекул на поверхности эпителиальных и эндотелиальных клеток, причем повышенная экспрессия ICAM-1 сопровождается сопутствующим освобождением его растворимой формы. Возможно, высокий уровень sCD54 антигена в сыворотке детей, больных астмой, обусловлен шеддингом ICAM-1 молекул с этих клеток или синтезом растворимой формы путем альтернативного спалайсинга мРНК. Как было описано выше в главе «Результаты и обсуждение», растворимый антиген адгезии CD54 может выполнять в организме как провоспалительную, так и противовоспалительную функцию. Однако, выявленная нами взаимосвязь роста сывороточного уровня sCD54 антигена со снижением проходимости средних бронхов у лиц с БА, а также увеличение уровня sCD54 у таких больных при возрастании тяжести заболевания, позволяет говорить о том, что в условиях аллергического воспаления у детей с астмой молекула ICAM-1 играет провоспалительную роль.

Рост сывороточного уровня sCD50 антигена у детей при бронхиальной астме может приводить к нарушению инициации иммунного ответа и антигенной презентации, в первую очередь, дендритными клетками. Он, обусловлен сходом растворимой формы CD50 антигена с поверхности эпителиальных клеток либо альтернативным сплайсингом.

Снижение относительного количества CD50+ и CD54+ мононуклеарных клеток крови у детей с БА, вероятно, связано с миграцией этих клеток в очаг воспаления в дыхательные пути. Отсутствие достоверной корреляционной зависимости между относительным числом этих клеток и уровнем sCD50, sCD54 антигенов указывает на то, что мононуклеарные клетки периферической крови не вносят существенного вклада в пополнение пула растворимых антигенов адгезии ICAM-1 и ICAM-3.

Средние значения уровня sCD38 антигена и процентного количества CD38+ клеток у детей при Б А достоверно не отличались от нормальных.

Ведущая роль в презентации чужеродного антигена и формировании иммунного синапса принадлежит молекулам гистосовместимости I и II классов. Так, иммунная система индивидуумов с БА способна к распознаванию и выработке иммунного ответа даже на крайне низкие концентрации ингалируемого антигена. Это осуществляется за счет взаимодействия молекул HLA II класса, несущих пептидный фрагмент аллергена, с рецептором CD4+ Т-хелперов, что приводит к Т-клеточной активации и продукции цитокинов, характерных для аллергической реакции.

Исследование у пациентов с БА содержания антигенов HLA позволило отметить отсутствие статистически значимых отличий от нормы в уровне молекул sHLA-I и в относительном числе HLA-I+ мононуклеарных клеток периферической крови, определяемых в реакции непрямой иммунофлуоресценции. Однако было выявлено достоверное многократное увеличение сывороточного уровня sHLA-DR антигенов и процентного содержания HLA-DR+ клеток в крови детей, больных астмой. Кроме того, обнаружено, что увеличение уровня растворимых HLA-DR антигенов и HLA-DR-положительных клеток ассоциируется с усилением обструкции средних (МОС50) и мелких (МОС75) бронхов, соответственно.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что антигены HLA-I класса не принимают значимого участия в реализации аллергического воспаления при бронхиальной астме у детей.

В то же время антигены HLA-DR, напротив, вносят существенный вклад в патогенез БА. Так, известно, что растворимые молекулы HLA II класса способны блокировать функциональную активность Т-хелперов, связываясь с С04-рецептором на лимфоцитах. Как следствие - торможение стимуляции антигенпрезентирующих клеток, осуществляемое при реализации иммунного ответа посредством Т-хелперов. Кроме того, показано, что антигены HLA-DR определяются на поверхности активированных макрофагов, В-лимфоцитов, Т-хелперов, а также эндотелиальных, эпителиальных и тучных клеток. При бронхиальной астме, как правило, данные клетки активированы. Можно предположить, что высокий сывороточный уровень sHLA-DR антигенов у лиц с астмой обусловлен сходом молекул гистосовместимости с поверхности данных активированных клеток. Биологический смысл такого явления может заключаться в ограничении пролиферации клеток иммунной системы и угнетении гуморального ответа детей с астмой.

Таким образом, увеличение сывороточного уровня sHLA-DR антигенов, выявленное нами у больных при возрастании степени тяжести бронхиальной астмы, и взаимосвязь роста содержания sHLA-DR с нарушением проходимости средних бронхов позволяет говорить об ассоциации повышенного уровня sHLA-DR с усилением воспалительного процесса при бронхиальной астме. С нашей точки, зрения повышенное сывороточное содержание sHLA-DR антигенов можно рассматривать как возможный мониторинговый показатель неблагоприятного течения бронхиальной астмы у детей. Для проверки подобного предположения необходимы дополнительные исследования.

Разделение лиц, больных БА на группы по тяжести течения заболевания позволило обнаружить, что наиболее выраженные отличия от нормы в уровне исследуемых растворимых молекул и антигенположительных клеток крови встречаются у детей со среднетяжелой и, особенно, с тяжелой астмой, в то время как у больных с легким течением заболевания различия с группой сравнения были выявлены только однажды (рост относительного количества CD38+ мононуклеарных клеток).

Обращает на себя внимание отсутствие, в большинстве своем, межгрупповых различий между величиной исследуемых показателей у детей в стадию ремиссии и обострения астмы. Это связано с персистирующим характером воспалительного процесса при бронхиальной астме и свидетельствует о сохранении характерных для болезни изменений в период клинической ремиссии.

Стоит отметить разнонаправленный характер изменений исследованных иммунологических показателей у детей при бронхиальной астме в стадии ремиссии и обострения при разной степени тяжести заболевания. Так, при легкой БА в период обострения у больных отмечается достоверный рост относительного количества CD8+ и падение количества CD16+ лимфоцитов крови по сравнению с периодом ремиссии. В то же время у детей со среднетяжелой и тяжелой астмой относительное содержание этих клеток в крови не отличается в различные периоды заболевания. Обострение у больных астмой легкого течения сопровождается многократным снижением уровня sCD25 (р>0,05) и sCD95 (р<0,05) антигенов относительно периода ремиссии; у детей со среднетяжелым течением заболевания период обострения отличается тенденцией к увеличению уровня sCD25 и sCD95 антигенов по сравнению с ремиссией; а при обострении тяжелой астмы наблюдается вновь лишь тенденция к снижению уровня sCD25 и повышению sCD95 антигенов.

Подобные разнонаправленные изменения, выраженные в виде тенденций, были выявлены при исследовании уровня антигенов адгезии sCD50 и sCD54. У детей с легкой БА в период обострения обнаружено недостоверное уменьшение сывороточного уровня sCD50 и sCD54 антигенов относительно периода ремиссии, у больных со среднетяжелой БА - отмечена тенденция к увеличению уровня этих антигенов, а у лиц с астмой тяжелого течения сывороточный уровень sCD50 и sCD54 был одинаков в периоды обострения и ремиссии.

Период обострения легкой астмы сопровождался ростом относительного количества CD38+ (р<0,05) и HLA-DR+ (р>0,05) мононуклеарных клеток по сравнению периодом ремиссии. У больных со среднетяжелой и тяжелой БА изменений аналогичной направленности выявлено не было. Сывороточный уровень растворимых антигенов CD38, HLA-I, HLA-DR существенно не изменялся в разные периоды заболевания при всех степенях тяжести БА. Можно подчеркнуть лишь общую тенденцию к росту уровня sHLA-DR при обострении астмы по сравнению с ремиссией у детей, как с легким, так и со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания.

Таким образом, дети, больные легкой БА имеют картину иммунологической реактивности, отличающуюся от реактивности больных среднетяжелой и тяжелой БА. Она менее всего отличается от нормы, но сопровождается противоположной направленностью изменений ряда исследуемых показателей в стадии обострения и ремиссии болезни по сравнению с группой больных бронхиальной астмой среднетяжелого и тяжелого течения.

Вероятно, при среднетяжелом и тяжелом течении БА в организме больных детей уже произошли и носят устойчивый характер перестройки, связанные с заболеванием (в частности, ремоделирование дыхательных путей, изменение цитокинового профиля и т.д.). Иммунная система у таких лиц находится в состоянии постоянной гиперреактивности, которая, тем не менее, имеет условно «сбалансированный» характер, и в реализации механизмов гиперреактивности задействованы многие звенья иммунной системы. Это подтверждается наличием многочисленных достоверных корреляционных зависимостей исследованных иммунологических параметров у больных со среднетяжелой и тяжелой астмой. При легкой БА патологические изменения (морфологические, иммунологические), сопровождающие заболевание, еще менее выражены. Реакция иммунной системы на антиген у детей с легким течением носит условно «несбалансированный» характер. На это указывают как широкий разброс индивидуальных показателей, так и разнонаправленные изменения в периоды обострения и ремиссии. Кроме того, у детей с легкой астмой выявляется очень небольшое число корреляционных взаимосвязей между тестированными в настоящей работе иммунологическими показателями.

В настоящее время все большее внимание направлено на изучение проблемы участия инфекционных агентов в развитии воспалительного процесса и патогенезе БА. Персистенция инфекционных агентов у больных астмой детей обусловливает возникновение сложного многофакторного воспалительного процесса, в котором существуют черты как инфекционного, так и аллергического воспаления. Доказано, что воспаление, обусловленное бактериальной, микоплазменной или вирусной инфекцией, может играть существенную роль как в дебюте, так и прогрессировании Б А [5, 14, 124]. Поэтому, в представленной работе проведено исследование ряда иммунологических показателей у детей, больных бронхиальной астмой, ассоциированной с наличием маркеров инфицированности цитомегаловирусом и/или Mycoplasma pneumoniae.

Установлено, что наличие у детей с бронхиальной астмой маркеров оппортунистических инфекций ассоциируется с дополнительными изменениями в уровне исследованных растворимых антигенов и в популяционном составе мононуклеарных клеток периферической крови. Наиболее показательными оказались различия между состоянием иммунитета инфицированных ЦМВ и/или микоплазмой детей с бронхиальной астмой и больных астмой детей, у которых маркеры тестированных инфекций обнаружены не были. Так, можно отметить рост уровня sCD25 и sHLA-DR антигенов в крови детей, больных БА, ассоциированной с ЦМВ и/или микоплазменным инфицированием, относительно нормы и больных, не инфицированных данными патогенами. Выявленные различия указывают на' способность инфекционных агентов (ЦМВ и микоплазмы) усиливать и без того повышенную гиперреактивность иммунной системы у больных детей и, -возможно, нарушать процессы презентации антигенов.

В зависимости от инфицирования тем или иным возбудителем выявлены отличительные особенности изменения уровня растворимых антигенов и антигенположительных клеток в крови у детей при БА. Так, персистенция цитомегаловируса, помимо описанных в предыдущем абзаце изменений, характерных для всех больных БА, инфицированных ЦМВ и/или микоплазмой, ассоциирована с повышением относительного количества CD16+ и HLA-Г мононуклеарных клеток крови, а также со снижением сывороточного содержания sCD50 антигена по сравнению с группой больных без маркеров тестированных инфекций. Сравнение с нормой позволило обнаружить снижение содержания CD4+, HLA-I+ клеток крови и повышение сывороточного уровня sCD54 и sHLA-I антигенов при астме, отягощенной инфицированием ЦМВ.

Моноинфицирование микоплазмой не приводило у больных астмой детей к статистически значимым изменениям исследованных показателей, за исключением сывороточного уровня растворимых CD25 и HLA-DR антигенов и относительного количества CD25 и HLA-DR положительных мононуклеарных клеток.

Наиболее выраженные изменения уровня тестированных иммунологических показателей выявлены у детей при бронхиальной астме, ассоциированной со смешанным инфицированием ЦМВ и микоплазмой. Для этой группы больных характерно достоверное многократное увеличение сывороточного уровня sCD25, sCD50, sCD54, sHLA-DR антигенов и снижение уровня sCD38 антигена относительно здоровых детей и детей с астмой, отрицательных по маркерам тестированных инфекций. Можно сделать вывод о том, что одновременное присутствие двух видов возбудителей оппортунистических инфекций в наибольшей степени влияет на уровень исследуемых растворимых антигенов, что, вероятно, обусловливается кумулятивным эффектом изменения иммунного ответа организма больного ребенка на инфицирование сразу несколькими патогенами.

Таким образом, можно заключить, что бронхиальная астма у детей, наряду с другими изменениями, сопровождается выраженным увеличением сывороточного уровня растворимых CD54 и HLA-DR антигенов. Причем их уровень возрастает при усилении степени тяжести заболевания, при уменьшении проходимости средних бронхов и при ассоциации астмы с наличием маркеров микст-инфицирования ЦМВ и микоплазмой. В связи с этим, сывороточное содержание растворимых ICAM-1 и HLA-DR антигенов может быть использовано в качестве комплекса дополнительных показателей тяжести бронхиальной астмы и выраженности бронхообструкции у детей.

131