Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакогенетический анализ феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции

На правах рукописи

005048077

ЯРКОВА МИЛАДА АЛЬНОРДОВНА

ФАРМАКОГЕИЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЕНОМЕНА СТРЕССИНДУЦИРОВАННОГО ПАДЕНИЯ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВОЙ

РЕЦЕПЦИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 0 п'пВ 2013

Москва - 2012

005048077

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В.Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН)

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАН и РАМН Ссрсденнн Сергей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, зав. кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.Пирогова Минздрава России

Шимановский Николай Львович

доктор медицинских наук, профессор,

главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии

имени В.В.Закусова» РАМН Островская Рита Ушеровна

доктор биологических наук, профессор,

зав. кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета

МГУ им. М.В.Ломоносова Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный меднко-стоматологическнй университет имени А.И.Евдокнмова» Минздрава России

Защита состоится « года в часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН по адресу: 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская, 8.

Автореферат разослан »

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

Вальдман Елена Артуровна

Актуальность исследования. Со времени введения Vogel в 1957 г. термина «фармакогенетика» и публикации первых монографий по проблеме [Ralow W. 1962; Motulsky AG. 1964] основной задачей нового направления пауки является поиск наследственных характеристик фенотипа состояния. подлежащего фармакологической коррекции и систем, опосредующих фармакокинетику и фармакодинамику применяемого лекарства у данного индивидуума. Если для многих моногенно контролируемых заболеваний или лекарственных эффектов задача решена либо близка к решению, то при мультифакториальном наследовании, несмотря на чрезвычайно большое число исследований, однозначных результатов не получено [Середенин С.Б., 2004]. Развернутые после расшифровки генома человека работы по фармакогеномике выявили ряд ассоциаций, не превышающих, однако, 60-70%, что ограничивает использование полученных данных для персонифицированной медицины. Поэтому в современной фармакогенетике наиболее важным остается поиск интегральных фенотипических показателей, основанных на понимании патогенеза заболевания и механизма действия препарата [Середенин С.Б., 2004: Kalow W. et al., 2005; Porcelli S et al„ 2011]. Задача актуальна как для клинической, так и для экспериментальной фармакологии. В последнем случае обнаружение фармакодинамических маркеров ведет к выявлению новых фармакологических мишеней, что, в свою очередь, создает основу для разработки новых оригинальных лекарственных средств.

Состояния тревоги в современных системах классификации рассматриваются в качестве, как самостоятельных нозологических единиц, так и коморбндных большому числу соматических заболеваний. На сегодняшний день фармакотерапия тревожных расстройств далека от совершенства, поскольку, основные фармакотерапевтические средства - бензодиазепнновые транквилизаторы и препараты, влияющие на серотонинергическую передачу, имеют с, одной стороны, целый ряд недостатков, обусловленных побочными действиями, длительностью наступления эффекта и пр., а с другой - требуют учета индивидуальной чувствительности, методы объективной оценки которой не разработаны. Поэтому, актуальным остается поиск новых анксиолитиков реализующих свой эффект через разные мишени, что требует дальнейшего изучения центральных механизмов формирования тревоги и реакции страха.

Наиболее важной нейрохимической структурой, регулирующей процессы торможения, является ГАМКд рецептор: белковый комплекс осуществляющий транспорт ионов СГ в клетку, в состав которого в разных сочетаниях могут входить до 19 субъединиц [Rudolph U, Knoflach F., 2011]. ГАМКд рецептор опосредует

влияние многих фармакологических препаратов с анксиолитическими, седативными, снотворными, противосудорожными, а также анксиогенными и просудорожными свойствами. Наибольшее распространение получили бензодиазепиновые транквилизаторы, усиливающие при специфическом связывании с ГАМКд рецептором ГАМК трансмиссию.

Почти одновременно с открытием бензодиазепинового участка ГАМКа рецептора [Möhler Н, Okada Т. 1977; Squires RF, Braestrup С. 1977] были получены экспериментальные результаты, демонстрирующие изменения его связывающей способности при стрессовых воздействиях [Lippa AS et al, 1978; Braestrup С. et al., 1979]. В последние годы появились отдельные клинические исследования, подтверждающие данный феномен методами нейровизуализации [Bremner JD., 2004; Holzschneider К, Mulert С., 2011]. Однако, систематического фармакологического изучения стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции не проводилось. Прежде всего, весьма противоречивы данные о генетической зависимости феномена [Beizung С., 2001; Skilbeck KJ, Johnston GA, Hinton Т., 2010]. Не ясно, при каких видах стрессовых воздействий снижение рецепции бензодиазепинов возникает. Какова выраженность и продолжительность сдвигов. Открытым остается вопрос о значимости феномена в формировании эффекта анксиолитиков разных химических структур и механизмов действия, для соединений с анксиогенными свойствами.

Для решения этих проблем предпринято комплексное экспериментально-фармакогенетическое изучение связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора.

Цель работы. Определение значения феномена падения связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора для характеристики состояния тревоги и эффектов фармакологических препаратов с анксиолитическими и анксигенными свойствами.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Оценить связывающую способность бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора у инбредных животных с активной стратегией поведения - мышей С57В1/6, крыс MNRA и реакцией замирания - мышей Balb/c, крыс MR, в тесте «открытое поле».

2. Исследовать изменения бензодиазепиновой рецепции у инбредных мышей С57В1/6 и Balb/c при эмоционально-стрессовом воздействии в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт», иммобилизация, «контакт с хищником», вынужденного плавания, «горячая пластинка».

3. Установить продолжительность падения бензодиазепиновой рецепции у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с после экспериментов в тестах «открытое поле» и «контакт с хищником».

4. На экспериментальных моделях тревоги исследовать влияние на бензодиазепиновую рецепцию препаратов афобазол, М-11, ладастен, ноопент, ГБ-115 и диазеиам.

5. Изучить влияние на бензодиазепиновую рецепцию фармакологических препаратов с анксиогенными свойствами.

6. Выполнить фармакологические исследования по выявлению анксиолитической активности у препаратов, предотвращавших падение бензодиазепиновой рецепции при эмоционально-стрессовых воздействиях.

7. Оценить изменения бензодиазепиновый рецепции у беспородных мышей, разделенных по признакам поведения в тесте «открытое поле» на субпопуляции с активной стратегией поведения и с реакцией замирания.

8. Исследовать изменения бензодиазепиновой рецепции у выделенных субпопуляцин беспородных мышей при эмоционально-стрессовом воздействии в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт» и «контакт с хищником».

9. Оценить на беспородных мышах выделенных субпопуляций влияние фармакологических препаратов с анксиолитическими свойствами.

Научная новнзна. Впервые проведен комплексный анализ стрессиндуцированных нарушений бензодиазепиновой рецепции на инбредных и беспородных животных с разным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Доказана генетически обусловленная зависимость сопряженного с тревогой падения бензодиазепиновой рецепции от силы стресснрующего фактора.

Впервые установлено, что временные характеристики стрессиндуцированного снижения беизодиазепинового связывания специфичны для генотипа.

Экспериментально показано, что соединения с анксиогенными свойствами вызывают падение бензодиазепиновой рецепции.

Впервые выявлено, что иротивотревожная активность препаратов афобазол, МИ, ноопент, ладастен и соединения ГБ-115 с различной химической структурой и механизмами действия связана с нормализацией уровня бензодиазепиновой рецепции, нарушенной стрессирующими факторами.

Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как нейрохимическом маркере состояний тревоги и эффектов анксиолитиков.

Разработан метод разделения беспородной популяции мышей на высоко- и низкотревожные субпопуляции с объективизацией типирования по стрессиндуцированному падению бензодиазепинового связывания.

На беспородных субпопуляциях мышей с разным фенотипом стрессового ответа полностью подтверждены результаты, полученные на инбредных животных, демонстрирующие изменения бензодиазепиновой рецепции при стрессовых воздействиях и при введении анксиолитиков, что позволяет сделать заключение о маркерной значимости данного феномена для характеристики тревожных состояний и их фармакологической коррекции.

Научно-практическая значимость. Доказательство маркерного значения феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции явилось основой для методических рекомендаций по новым экспериментальным моделям состояний тревоги и доклиническому изучению эффектов анксиолитиков.

На основе сформулированной и экспериментально подтвержденной гипотезы о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как маркере состояния тревоги и фармакологической мишени анксиолитиков разработаны и внедрены в медицинскую практику лекарственные препараты афобазол и ладастен. Установленные данные об анксиолитических свойствах препарата ноопепт вошли в досье при регистрации препарата в Минздрасоцразвия РФ. Данные по препарату ГБ-115 включены в регистрационное досье для получения разрешения на клинические исследования.

Материалы диссертации использованы в учебном лекционном курсе по фармакогенетике для студентов ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова, Сибирского государственного медицинского университета.

На основании экспериментальных данных получены Патенты РФ №2061686 от 10.06.1996, №2175229 от 27.10. 2001, №2261709 от 10.10.2005, № 2373202 от 27.04.2009.

Предложен новый метод разделения беспородной популяции лабораторных животных по фенотипу стрессового ответа. Выявленные закономерности изменения рецепции в бензодиазепиновом сайте ГАМКа рецептора перспективны для разработки в клинике способов диагностики тревожных состояний и оценки действия анксиолитиков методами нейровизуализации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Формирование реакции страха при эмоционально-стрессовых воздействиях сопряжено со снижением связывающей способности в бензодиазепиновом участке ГАМКа рецептора

2. Наследственные различия в стрессиндуцированном падении связывания бензодиазепинов зависят от силы стрессирующего фактора и характеризуются разным периодом восстановления рецепции

3. Фармакологические препараты с анксиогенными свойствами вызывают, а анксиолитики предотвращают стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции

4. У беспородных мышей, разделенных по типу поведения в тесте «открытое поле» на высоко- и низкотревожных в физиологических и фармакологических экспериме нтах подтверждены закономерности изменений бензодиазепиновой рецепции, установленные на инбредных животных с различным фенотипом ответа на эмоциональный стресс

5. Изменения бензодиазепиновой рецепции могут быть использованы в качестве нейрохимического маркера состояния тревоги и эффекта анксиолитиков

ЛнчныП вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования. На основе сформулированной гипотезы о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как нейрохимическом маркере состояний тревоги и эффектов анксиолитиков автором самостоятельно разработаны методические подходы, протоколы исследований. Автор принимал непосредственное участие в выполнении экспериментов, анализировал и осуществлял статистическую обработку полученных результатов, нх обобщение и подготовку публикаций.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на международных конференциях: 5th ECNP Regional Meeting, Санкт-Петербург, 2000 г.; 3-ей, 4-ой и 5-ой Международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Россия. 2001, 2006 и 2010 гг.; II, III и IV Съезде Российского Научного общества фармакологов 2003, 2007 и 2012 гг.; 14-ом, 15-ом и 16-ом Всемирном конгрессе фармакологов, Сан-Франциско, 2002 г., Пекин, 2006 г. и Копенгаген, 2010 г.; 8th ECNP Regional Meeting, Москва, 2005; Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения», Гродно, 2007 г.; VIth ежегодной международной конференции «Pharmacogenetics in Psychiatry», Нью-Йорк, 2007; XXVII Congress of the CINP, Гонконг, 2010 г.; 28lh CINP World congress of Neuropsychopharmacology, Стокгольм, 2012.

Работа апробирована на заседании межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН (протокол № 3 ог 18.10.2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ. Основное содержание диссертации отражено в 16 статьях в ведущих рецензируемых

научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. По результатам работы получено 4 патента РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 317 страницах, содержит 53 таблицы и 43 рисунка и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3-6), заключения, выводов и списка литературы, включающего 802 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использованы мыши-самцы инбредных линий Balb/c и С57В1/6 массой 19-25 г, крысы-самцы инбредных линий Maudsley Reactive (MR) и Maudsley Non-reactive (MNRA) массой 200-250 г, беспородные мыши-самцы линии CD-I массой 19-25 г. (питомники РАМН и РАН). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в контролируемых условиях окружающей среды (20-22°С и 30-70% относительная влажность, 12-часовой цикл освещения, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой, обеспыленной из деревянной стружки, по 10 крыс или 20 мышей в каждой клетке, при постоянном доступе к экструдированному брикетированному корму ГОСТ Р 50258-92 [1993] и питьевой воде. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики и Приказу МЗ и CP РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Животные распределялись по группам рандомизированно, по критерию массы тела, с отклонением от среднего значения не более чем на ±10%. Перед опытом животных выдерживали в экспериментальной комнате в «домашних» клетках в течение 24 часов. При проведении экспериментов были приняты меры, позволяющие избежать излишних физических страданий или повреждений животных.

В работе использовали фармацевтические субстанции афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид), ноопепта (этиловый эфир N-фенилацетил-1.-пролилглицина), ГБ-115 (амид К-фенилгексаноил-глицил-Ь-триптофана), микронизированную переосажденную субстанцию ладастена (N-(2-адамантил)-Ы-(парабромфеннл)амина), субстанцию МП (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этокси-бензимидазола гидрохлорид). Все вещества синтезированы в ФГБУ «НИИ фармакологии имена В.В.Закусова» РАМН. Диазепам использовался в виде лекарственной формы раствора для инъекций фирмы Polfa Tarchamin S.A., содержащего в пересчете на 1 мл раствора 5 мг действующего вещества. Растворы афобазола, ноопепта, Mil и диазепама готовились в дистиллированной воде и вводились однократной внутрибрюшинпой инъекцией. Субстанции ладастена и ГБ-

115 готовились в виде суспензии с Твин-80 и дистиллированной водой и вводились однократно зондом в желудок.

В экспериментах использовались: [М-метил-3Н]-диазепам (Радиевый институт им. В.Г. Хлопина), [N-mctiiji-3! 1|-флушпразепам (Amcrsham Bioscience), TRIS-(гидроксиметил)-аминомонометан (Biosolve, Нидерланды), HCl (Реахим), нафталин (Fluka), 1,4-диоксан (ЗЛО Мосреактив), 2,5-дифенилоксазол (РРО) (Fluka), 1,4-бис-(5-фенил-2-оксазолил)-бензол (РОРОР) (Fluka), диазепам (Sigma), альбумин (Bovine, albumin, SIGMA Chemical Co), NaOÜ (ДиаэМ, Россия), Na2C03 (ДиаэМ, Россия), CuS04 • 5H20 (ДиаэМ, Россия), натрий виннокислый (ДиаэМ, Россия), реактив Фолина (Рапгеас, Испания), кофеин (Sigma), n-Butyl-ß-carboline-3 carboxylate (ß-CCB) (RBI), yohimbine hydrochloride (Acros Organics, США), стекловолоконные фильтры (GF/B,Whatman). Составы использованных стандартных растворов: сцинтилляционная жидкость (0,375 г РОРОР; 8,75 г РРО; 125 г нафталин; 1 л 1,4-диоксан); TR1S-HC1 буферный раствор (t=4°, 50мМ, рН=7,4) (6 г TRIS-(гидроксиметил)-амипомонометана; 1 л дистиллированной воды; HCl (доведение pH до 7,4).

Для моделирования различных воздействий и/или оценки изучения влияния соединений на поведение и нейрохимические эффекты у лабораторных животных применяли стандартные методы исследования, включенные в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [ред. - Р.У.Хабрнев, 2005], в их числе: тесты «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), «открытое поле» (ОП) в модификации [Бородин П.М. с соавт., 1976]. темно-светлая камера (ТСК), «горячая пластинка» (ГП), «вынужденное плавание» (ВП).

Реакцию страха моделировали в тестах «контакт с хищником» (КХ) и «кратковременная иммобилизация» (Им) [Rodgers RJ, et al., 1997; Bhatia N. et al., 2011].

Для оценки седативных или активирующих свойств соединений вне стрессового воздействия использовали установку Optovarimex (Columbus Corp., США).

Для оценки координации и моторных функций использовали установку Rotarod компании Panlab (Испания).

Анализ рецепции в бензодиазепиновом участке ГАМКа рецептора мембранной фракции головного мозга мышей и крыс проводили радиолигандиым методом с использованием [М-метил-3Н]-диазепама (удельная активность 67,4 Ки/ммоль) и [N-метил-3Н]-флунитразепама (удельная активность 87,0 Ки/ммоль).

Мембранную фракцию головного мозга крыс выделяли по следующей схеме: после декапитации немедленно извлекали головной мозг, отделяли стволовые структуры и мозжечок. Оставшуюся часть мозга гомогенизировали в 16 мл ледяного TR1S-HC1 буферного раствора (t=0-4°, 50мМ, РН=7,4) используя гомогенизатор Ultra-turrax Т25 (IKA-labortechnik). Полученную суспензию центрифугировали при 42 ООО g в течение 25 мин в ультрацентрифуге Beckman. После центрифугирования супернатант сливали. Осадок ресуспендировали гомогенизацией в исходном объеме буфера и центрифугировали в тех же условиях. Процедуру отмывки повторяли трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл раствора буфера.

Выделение мембранной фракции головного мозга мышей проводили по аналогичной схеме со следующими изменениями: гомогенизацию мозга проводили в 20 мл ледяного TR1S-HC1 буферного раствора. Полученную суспензию центрифугировали при 54000g в течение 25 минут.

Для исследования связывания [1М-метил-3Н]-диазепама мембранную фракцию головного мозга (250 мкл) инкубировали с 50 мкл [М-метил-3Н]-диазепама в конечной концентрации 1 нМ в течение 30 мин при температуре таящего льда (0-4°С) в трех повторах для каждого образца. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого диазепама, растворенного в 5% этаноле до конечной концентрации 10 мкМ для мышей и 20 мкМ для крыс. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим связыванием и неспецифическим связыванием. Объем инкубационной смеси составлял 500 мкл. Реакцию бензодиазепинового связывания останавливали путем добавления ледяного буфера и быстрой вакуумной фильтрации через стекловолоконные фильтры с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объемом 8 мл. Фильтры высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещали в сциптилляционную жидкость объемом 5 мл и использовали для сцинтилляционного счета. Радиоактивность проб определяли на счетчике Wallac 1411. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего. Данные приведены в cpm/мг белка.

Для исследования связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама с мембранами головного мозга в инкубационную среду вносили 250 мкл полученной мембранной фракции, 50 мкл 10 нМ раствора [Ы-метил-3Н]-флунитразепама. Для определения неспецифического связывания вносили 50 мкл раствора 400цМ диазепама в 5% этиловом спирте. Последующая процедура проводилась, как описано выше. Радиоактивность проб определяли на счетчике Beckman после добавления жидкого сциициллята в объеме 3 мл. Данные приведены в dpm/мг белка.

Определение содержания белка в пробах проводили по методу Лоури [ Lowry О.Н., Rosenbrough N.J. , Farr A.R., 1951] с использованием альбумина в качестве стандарта. Оптическую плотность (/.=700 нм) измеряли на спектрофотометре Genesys 10 (THERMO FICHER SCIENTIFIC INC., США).

Для обработки численных данных применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение (М), стандартная ошибка среднего (SEM), стандартное отклонение (SD), которые вместе со значением п (количество животных в группе) представлены в итоговых таблицах и рисунках. Межгруниовые различия проанализированы с помощью U-критерия Манн-Уитни. При разделении аутбредных животных использовали метод максимального правдоподобия.

Статистический анализ проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, США, номер лицензии: 31415926535897). Различия определяли как статистически значимые при уровне не более 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Фундаментальными исследованиями по генетике поведения доказан наследственный контроль эмоционально-стрессовых реакций (ЭСР) у млекопитающих [Беляев Д.К., 1979; Hall C.S., 1934]. В качестве экспериментальных моделей изучения разных фенотипов ЭСР нами использованы инбредные линии животных противоположные по поведению в тесте ОП: мыши С57В1/6 и Balb/c и крысы MNRA и MR. Как видно из данных таблиц 1 и 2, мыши C57BI/6 и крысы MNRA характеризуются высокой двигательной и исследовательской активностью и незначительным количеством дефекаций. Наоборот, мыши линии Balb/c и крысы MR в ОП демонстрируют реакцию замирания (freezing reaction), выражающуюся в ограниченном числе передвижений и большем уровне дефекаций, что интерпретируется как выраженная реакция страха. Полученные контрольные результаты полностью соответствуют данным литературы и были воспроизведены многократно в ходе дальнейшего выполнения работы [Середенин С.Б., Ведерников A.A., 1979; Seredenin S.B. et al., 1994].

Таблица 1- Поведение мышей линий Balb/c и С57В1/6 в тесте «открытое поле»

Линии ПА ЦА Ц ВА ОДА Количество дефекаций

Balb/c(n=10) 17,5±2,5 0,5±0.4 0,0±0,0 0,0±0,0 19,5±2,5 0,4±0,1

С57В1/6(п=10) 71,8±4,3* 19,0±3,8* 0,9±0,6 11,3±3,5* 110,8±7,2* (),0±0,0

Примечание: данные представлены в виде М±5ЕМ; п — число животных в группе; *, ** — статистически значимое (р<0.05 и р < 0.01) межлинейное отличие согласно и-критерию Манн-Уитни.

Линии ПА ДА ВА ОДА Количество дефекаций

МЯ (п=10) 22,5 ± 2,9 0,4 ± 0,2 4,8 ± 1,2 27,8 ±3,8 4,8 ± 0,5

МЫЯА(п=10) 40,4 ±3,4 ** 3,6 ± 1,2 * 14,4 ± 2,1** 58,5 ±5,8 ** 2,6 ± 0,6

Примечание: как к табл. I

Сравнительная оценка рецепции [Ы-метил-3Н]-диазепама у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с и крыс МЫЯА и МИ показала, что у интактных животных уровень специфического связывания [М-метил-3! 1]-диазепама синаптосомальной фракцией мозга не отличается. После эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП установлено резкое падение связывания меченного лиганда у мышей Ва1Ь/с, и крыс МЯ, в то время как у мышей С57В1/6 и крыс М^А параметры рецепции не изменились (рис. 1).

Установленные изменения связывающей способности бензодизепинового участка ГАМКд рецептора согласуются с представлениями о закономерностях формирования реакции страха у мышей Ва1Ь/с и крыс МЯ в ОП. Наоборот, для мышей С57В1/6 и крыс МЫЯА обстановка в ОП не является анксиогенной и не вызывала функциональных нарушений в рецепции меченого лиганда.

И

Шй 26534 .

Ва1Ь/с(п-5) С57В1/6 (п-5) МК(п=7) ММГ!А(п=6) щщщш

после ОП » интактные

О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 срт/мг белка

Рис. 1. Специфическое связывание []Ч-метил-3Н]—диазепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с, С57В1/6 и крыс МЯ, МЫЛА до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "открытое поле'" (ОП).

Примечание: п-количество животных в группе; *, ** — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05; р<0.01 соответственно) согласно и-критерию Манн-Уитни.

Однако остается неясным, является ли этот признак, специфичным для линий с freezing реакцией в ОГ1, либо данный эффект сопровождает реакцию страха при ее возникновении, вне зависимости от генотипа. Для ответа на этот вопрос исследован уровень специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией мозга мышей С57В1/6 и Balb/c после стрессового воздействия в различных тестах; ОП, ПКЛ, «кратковременной иммобилизации» (Им) и «контакт с хищником» (КХ).

Повторный анализ поведения мышей C57BI/6 и Balb/c в тесте ОП, подтвердил установленные ранее закономерности межлинейных различий их эмоционально-стрессовой реакции по критерию двигательной активности (табл. 3). Также, как при использовании в качестве лиганда [Г4-метил-3Н]-диазепама в ОГ1 наблюдали значительное падение специфического связывания [Ы-метил-'] 1|-флунитразепама мембранами мозга мышей Balb/c, в то время как у C57BI/6 параметры рецепции не менялись (рис.2).

Таблица 3 -Поведение мышей линий Baib/c и С57В1/6 в тесте ОП

Линия Виды двигательной активности Кол-во дефекаций

Периферическая активность Центральная активность Центр Вертикальная активность Общая двигательная активность

Balb/c п=10 13,4±1,7 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 13,4±1,7 0,6±0,2

С57В1/6 п=10 66,5±5,4* 24,4±2,3* 2,0±0,5* 14,6±1,6* 107,5±7,9* 1,5±0,5

Примечание: как к табл. 1

Рис. 2. Специфическое связывание [Ы-метил-" 11]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до п после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП. Примечание:

* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05) согласно и-критерию Мани-Уитни.

Анализ поведения мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте ПКЛ выявил выраженные межлинейные различия по показателям двигательной активности и времени нахождения в закрытых рукавах лабиринта, так мыши Ва1Ь/с проводили в два раза

5 8000-

6000Л 40005

О.

о 2000Н

4640

2448

«

5081

К,

интактные ОП

Balb/c

интактные ОП

C57BI/6

больше времени в закрытых рукавах и в два раза реже меняли рукава лабиринта, чем мыши линии С57В1/6 (табл. 4).

Таблица 4 - Поведение мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 в тесте ПКЛ

Линия % нахождения в открытых рукавах % нахождения в закрытых рукавах Двигательная активность,

Ва1Ь/с п=8 12,13+3,54 44,04+6,11* 3,88+0,30*

С 57В1/6 п=8 7,29+3,06 23,88+4,04 9,13+0,55

Примечание: как к табл. 1

Пятиминутная экспозиция мышей линии Ва1Ь/с в ПКЛ статистически значимо снижала уровень специфического связывания ["Ы-метил-3Н|-флунитразепама, в то время как у С57В1/6 параметры рецепции не менялись (рис. 3). Учитывая, что тесты ОП и ПКЛ имеют в качестве основного стрессирующего фактора новую обстановку, сходство полученных результатов можно считать закономерным.

Рис. 3. Специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва!Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ПКЛ. Примечание:

* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05) согласно и-критерию Манн-Уитни.

Для моделирования более выраженного анксиогенеза отобраны тесты «кратковременная иммобилизация» (Им) и «контакт с хищником» (КХ).

Полное лишение подвижности мышей на 90 минут привело к значимому снижению бензодиазепинового связывания как у мышей Ва1Ь/с, так и С57В1/6 (рис.4).

В следующей серии экспериментов оценивали влияние анксиогенной обстановки, вызванной присутствием природного хищника - домашней кошки на уровень специфического связывания меченого флунитразепама мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6.

8000-1

£ 6000-

ш ю

* 4000-1 2

^ 2000-

4710 4441

• •

£ Л

••

интактные ПКЛ

Ва1Ь/с

интактные ПКЛ

С57В1/6

8000-,

g 6000-<8

^ 4000-Е

■о 2000-

4640

О 3452*

□

од □ □

о П О

□

□ □

4710

3349*

Balb/c

C57BI/6

Рис. 4. Специфическое связывание [1М-метнл-3!!]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "иммобилизация" (Им). Примечание:

* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).

Интактные Им

Интактные Им

Визуальные наблюдения за поведением мышей в тесте с «контакт с хищником» показали, что в контрольной группе, в отсутствии хищника. - животные свободно перемещались по всей площадке плексиглазового короба с характерными проявлениями исследовательской активности, более выраженной у мышей С57В1/6.

В опытной группе как у мышей Ва1Ь/с, так и у С57В1/6 наблюдались этологически значимые проявления тревоги и страха. В присутствии хищника двигательная активность мышей Ва1Ь/с снижалась, отмечались длительные реакции замирания, животные часто принимали распростертые позы, закапывались в опилки. У мышей линии С57ВІ/6 значительно снижалась исследовательская активность, короткие реакции замирания чередовались с активно защитной формой поведения -побегом на противоположную от хищника сторону клетки. Полученные данные соответствуют результатам работ, выполненных сходными методами [Яос^егв Ги, et аі., 1997].

8000

6000-

с; ф

ю

£ 4000-

£ 2000'

Рис. 5. Специфическое связывание [N1-метил- Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга мышеи линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "Контакт с хищником" (КХ). * — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).

контроль КХ

Balb/c

контроль КХ

C57BI/6

В результате исследования связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранами мозга мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте КХ показано, что при сходстве контрольных параметров рецепции контакт с хищником приводил к падению

связывания лиганда как у мышей Ва1Ь/с, так у С57В1/6, несколько более выраженному у Ва1Ь/с (рис. 5).

Результаты, демонстрирующие падение рецепции [1М-метил-3Н]-флунитразепама у мышей обеих исследованных линий в тестах Им и КХ, в отличие от ОП и ПКЛ, в которых данный эффект установлен только у мышей линии Ва1Ь/с, позволяют заключить, что генетические различия в стрессиндуцированом падении связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора зависят от силы стрессирующего фактора, иными словами генотип определяет уровень стрессустойчивости, однако, при возникновении реакции страха нейрохимические сдвиги ее сопровождающие оказываются сходными.

Для оценки специфичности функциональных изменений Г'АМКд рецептора для анксиогенеза бензодиазепиновая рецепция была изучена в тестах моделирующих депрессивное состояние - «вынужденное плавание» (ВП) и болевое воздействие -«горячая пластинка» (ГП).

□

О

о п

Ва1Ь/с

С57ВІ/6

Интактные ВП 5 мин

Интактные ВП 5 мин

міиїтииитятиіпгшмям пецнфическое связывание рч-

мегил-^Н]—флунитразепама

мембранной фракцией (Р1+Р2)

головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и

С57В1/6 до и после эмоционально-

стрессового воздействия в тесте

"вынужденное плавание" (ВП 5 мин).

а

5*.

■ ■

4911

Ва1Ь/с

С57ВІ/6

Рис.

Интактные ВП Интактные ВП

15 мин 15 мин

МННШМИНМНШНММШ:: 7. Специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте '"вынужденное плавание" (ВП 15 мин).

Полагая, что развитие депрессивного состояния у мышей в тесте ВП проходит через стадию повышения тревожности были проведены эксперименты с различной продолжительностью воздействия 5 и 15 минут. Однако, в исследованных интервалах времени сдвигов в бензодиазепиновой рецепции обнаружено не было, что свидетельствует в пользу сопряжения феномена стресс-индуцированного падения бензодиазепинового связывания с реакцией страха, а не с состоянием, моделируемым в тесте ВП (рис. 6 и 7). Полученные данные соответствуют результатам клинических

исследований, не выявивших у больных с депрессией изменений бензодиазепинового связывания [Stocks GM, et al., 1990; Kugaya A. et al, 2003; Merali Z., et al., 2004; Rochet Т. et al., 1992; Zhu H. et al., 2006].

ГП - стандартный тест для изучения болевой чувствительности грызунов, оценивает болевой рефлекс при контакте подушечек лап с горячей поверхностью [Eddy NB and Leimbach D , 1953]. Острое ноцицентивное раздражение в тесте ГП не вызывало снижения бензодиазепиновой рецепции, и наоборот приводило к значительному подъему уровня в сравнении с интактной группой у обеих линий мышей (рис.8). Увеличение бензодиазепиновой рецепции в тесте «горячая пластинка» однозначно соотносится с представлениями об активации ГАМК трансмиссии при болевом воздействии, как элемента эндогенной системы антиноциценции [Наша А.Т., Borsook D., 2005; Möhler Н. et al., 2004; Enna SJ, McCarson KE„ 2006; Rudolph U, Knoflach F., 2011].

10000

5000-

4126

-5-

Balb/c

Интактные

1тГ

4531

C57BI/6 Интактные FrT

Рис. 8. Специфическое связывание [Ы-метил-'Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "горячая пластинка" (ГП).

* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).

Обобщая результаты данного этапа работы, можно заключить, что феномен падения бензодиазепиновой рецепции специфичен для тревожных состояний, и, что наследственные различия в сгрессустойчивости так же могут быть типированы по снижению связывающей способности бензодиазепинового сайта ГАМКд рецептора. Данное заключение дополнено анализом продолжительности изменений в бензодиазепиновой рецепции при различных по силе стрессовых воздействиях для разных фенотипов стрессового ответа. Проведено исследование временных характеристик падения бензодиазепиновой рецепции у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с после экспериментов в тестах ОП и КХ.

Статистически значимое снижение специфического связывания меченого флунитразепама у мышей Ва1Ь/с после трехминутной экспозиции в ОП, в сравнении с интактным контролем, установлено для временного интервала 0-90 минут (табл. 5).

Анксиогенная обстановка в присутствии хищника привела к снижению рецепции как у мышей Ва1Ь/с, гак и у С57В1/6 которое сохранялось у Ва1Ь/с в течение восьми часов, а у С57В1/6 - на протяжении 24 часов (табл. 6).

Таблица 5 - Продолжительность изменений уровня специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р]+Р>) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с после стресса в тесте ОП.

Линии Контроль Время после стресса в тесте «открытое поле», мин

0 60 90 120 150

Balb/c 4250(94) n=4 3607(125) п=4 2654(563) п=4 3523(247) п=4 4594(782) п=4 4127(193) п=4

Р р<0.05 р<0.05 р<0.05

Примечание: данные представлены в виде М(БО); п-колнчество животных в группе' р- статистически значимое отличие уровня рецепции по сравнению с контрольной группой согласно и критерию Манн-Уитни

Таблица 6 - Продолжительность изменений уровня специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2)головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 после стресса в тесте «контакт с хищником»

Контроль Время после стресса в тесте «контакт с хищником», часы

0 8 16 24 32

Balb/c 4353(663) 3144(744) 3029(369) 3536(1251) 4585(156) 4323(327)

п=6 п=4 п=4 п=4 п=4 п=4

Р р<0.05 р<0.05

С57В1/6 5310(404) 4351(325) 3587(282) 3341(498) 3287(304) 4630(493)

п=4 п=4 п=4 п=4 п=4 п=4

Р р<0.05 р<0.05 р<0.05 р<0.05

Примечание: как к таблице 5

Установленные нами данные о временных характеристиках межлинейных различий в бензодиазепиновой рецепции соответствуют литературным сведениям по другим параметрам оценки реакции на стресс у инбредных животных с разной стрессустойчивостыо. Временные межлинейные различия выявлены В Р" норадренергической, глутаматной, глюкокортикоидной и минералкортикоидной рецепторных системах [Blundell J. et al„ 2005; Adamec R et al., 2010; Adamec R. et al., 2007], в изменениях 5-HT1A, 5-HT2A и CRFi рецепторов [Adamec R. et al., 2004; Adamec R. et al., 2010]. Длительные сдвиги возникают в уровне экспрессии белков нейрональной пластичности, например вызванное присутствием хищника увеличение экспрессии pCREB в различных регионах мозга (от 6 часов до 7 дней после стресса) [Adamec R., Hebert М., Blundell J., 2011; Adamec R. et al. 2006]. Получены данные об

активации экспрессии cFos в префронталыюй коре и амигдале у крыс через два часа после предъявления хищника [Adamec R. et al., 2012]. Важно, что указанные изменения также различались у высоко- и низкотревожных крыс [Adamec R. et al., 2010].

Таким образом, констатируя наличие временных различий в нейрохимических изменениях у инбредных животных с разными фенотипами стрессового ответа, включая установленные нами функциональные сдвиги, возникающие в короткие сроки в ГАМКд рецепторе, можно полагать, что данные параметры дополняя представления о патогенетических механизмах формирования тревоги могут быть полезными для диагностики состояния и оценки эффективности фармакотерапии.

Следующий этап работы был посвящен изучению влияния на бензодиазепиновую рецепцию фармакологически индуцированного анксиогенеза.

Использованы три апксиогенных соединения, воздействующих на различные нейромедиаторные системы: производное p-карболинов - соединение р-ССВ, йохимбин и кофеин.

Бета-карболины, являясь функционально неоднородной группой лигандов бензодиазепинового рецептора, рассматриваются в ряде работ как эндогенные лиганды и функционально проявляют свойства обратных агонисгов бензодиазепинового участка ГАМКа рецептора, вызывая аиксиогенез у лабораторных крыс н мышей в диапазоне доз 1-30 мг/кг [Novas ML, ct al., 1988; Hindley SW, et al., 1985; File SE, Pellow S. ,1984] н обезьян [Ninan PT, et al., 1982; Crawley JN, et al., 1985]. Анксиогенная активность p-карболинов, подтверждается наблюдениями на людях [Skolnick Р, et al., 1984; DukaT, et al., 1988; Dorovv R, et al.,1987],

В настоящем эксперименте использовалось внутрибрюшинное введение р-ССВ инбредпым мышам в дозе 3,0 мг/кг за полчаса до тестирования в ПКЛ или декапитации, при определении уровня бензодиазепинового связывания.

Р-ССВ, вызывал выраженный анксиогенный эффект как у мышей линии Balb/c, так и С57В1/6. У мышей линии Balb/c снижение двигательной активности сопровождалось сокращением времени проведенного в рукавах лабиринта за счет нахождения на центральной площадке, у мышей линии С57В1/6 значимым сокращением пребывания в открытых рукавах лабиринта (табл. 7).

Таблица 7 - Влияние р-ССВ на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ПКЛ

Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)

открытые закрытые центр открытые закрытые

Balb/c КИ п=8 31,0±4.43 163,2,0±12,9 105,7±11,9 3,5±0,2 4,6±0,6

р-ссв (3,0мг/кг) п=8 16,5±5,8 99,4±22,9 р<0.05 184,1±22,2 р<0.05 1,6±0,6 р<0.05 4,7±0,7

С57В1/6 КИ п=8 52,7±9,4 162,1±20,4 85,1±13,6 3,0±0,4 6,1 ±0,4

р-ссв (3,0мг/кг) п=8 15,6±2,1 р<0.01 196,5±10,1 87,8±11,0 1,7±0,2 р<0.»5 5,4±0,3 р<0.05

Примечание: данные представлены в виде М±8ЕМ; п-количество животных в группе; р — статистически значимое отличие от группы «контрольная инъекция» (КИ) согласно и критерию Манн-Уитни

Рис. 8. Влияние соединения р-ССВ в дозе 3,0 мг/кг на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р]+Р>) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).

Анализ связывания [ Ы-метил-3Н|-флунитразепама мембранами мозга мышей линий Balb/c и С57В1/6, которым за 30 мин до декапитации в/бр ввели Р-ССВ в дозе 3,0 мг/кг показал значимое снижение (на 40%) бензодиазепиновой рецепции у мышей обеих линий (рис.8).

Анксиогенвый эффект Д-карболинов обусловлен изменением функционального состояния ГАМКд рецептора. Однако первичные механизмы анксиолитического действия бензодиазепинов и анксиогенных эффектов p-карболинов, по-видимому, не идентичны, поскольку точкой приложения p-карболинов в ГАМКд рецепторном комплексе является р субъединица, пары «р [von Blankenfeld О. et al., 1990; Kleingoor С. et al., 199; Stevenson A. et al., 1995; Sieghart W., 2006], a беызодиазепины

8000-,

g 60005

Ю

s

4000-

є

•о 2000-

p<0.05

«78

uo о

2792*

□

Balb/c

p<0.05

□

C57B1/6

КИ

(3-CCB (3 мг/кг)

КИ

р-ссв

(3 мг/кг)

взаимодействуют на границе пары иу [Sieghart W. et al., 2011]. Известно, что ß-карболины концентрационно зависимо ингибируют специфическое связывание 35S-TBPS, что свидетельствует о реализации их анксиогенпого эффекта изменением функционального состояния С1-ионофора. Являясь негативными аллостерическими модуляторами ß-карболины препятствуют входящему току хлора и вызывают анксиогенный эффект. [Stephens DN, Shearman GT, Kehr W., 1984; Stephens DN. et al., 1984]. Учитывая взаимосвязь рецепции в бензодиазепиновом сайте, ГАМК и транспорта СГ, установленный нами эффект может быть опосредован снижением входа СГ в клетку.

Следующее изученное соединение йохимбин обладает высокой аффинностью к аг-адренорецепторам, проявляет умеренное сродство к ai-адренорецепторам, 5-НТ1В, 5-НТщ, 5-HTif, 5-НТ2В и D2 рецепторам и является частичным агонистом 5-НТ1А рецепторов [Millan M J, et al., 2000; Johnston AL, File SE. , 1989; Cheng CH, et al., 1993], вызывает состояние страха и тревоги как у людей [Cameron OG, et al., 2000], так и животных (Braun АА, et al., 2011), при этом его анксиогенное действие не связано непосредственно с ГАМКд рецепторами [Pellow S, Chopin Р, File SE., 1985].

Йохимбин, введенный внутрибрюшинно в дозе 5,0 мг/кг за 30 мин до эксперимента в ОП угнетал все виды двигательной активности мышей как линии Balb/c, так и линии С57В1/6, вызывая выраженную freezing реакцию (табл. 8).

Таблица 8 - Влияние йохимбина на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ОП

Линия Препарат ПА ЦА Ц ВА ОДА Деф

Balb/c КИ п=10 13,4 ±1,7 0,0±0,0 0,0±0.0 0,0 ±0,0 13,4±1,7 0,6±0,2

йохимбин (5,0мг/кг) п=10 1,9±0,6 pcO.OOOl 0,5±0,3 0,0±0,() 0,0±0,0 2,4±0,7 р<0.0001 0,1 ±0,1

С57В1/6 КИ п=10 66,5±5,4 24,4±2,3 2,0± 0,5 14,6 ±1,6 107,5±7,9 1,5±0,5

йохимбин (5,0мг/кг) п=10 3,6± 1,4 р<0.0001 1,1 ±0,9 р<0.0001 0,0± 0,0 р<0.05 0,0±0,0 р<0.0001 4,7±2,3 р<0.0001 0,2±0,1

Примечание: как в таблице 7.

Анксиогенный эффект йохимбина по-разному проявлялся у мышей исследуемых линий в тесте ПКЛ. На фоне снижения двигательной активности животные линии Ва1Ь/с отдавали предпочтение закрытым рукавам лабиринта в

сравнении с контрольной группой. У мышей С57В1/6 статистически значимо снижалась количество смен рукавов (табл. 9).

Предварительное введение йохимбина за 30 мин до декапитации приводило к нарушению специфического связывания меченого лиганда мембранной фракцией головного мозга как мышей Ва1Ь/с, так и мышей С57В1/6 (рис.9).

Таблица 9 - Влияние йохимбина на поведение мышей линии С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте ПКЛ

Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)

открытые закрытые центр открытые закрытые

Ва1Ь/с КИ 11=8 80,0±20,8 92,0±21,6 128,0±22,1 3,5±0,6 3,0±0,5

йохимбин (5,0мг/кг) п=8 2,3±Т,2 р<0.001 240,1±8,5 р<0.001 58,5±7,7 р<0.05 0,5±0,3 р<0.001 2,8±0,3

С57В1/6 КИ п=8 46,9±9,9 173,8±14,3 80,6±7,1 4,0±0,4 7,б±0,9

йохимбин (5,0мг/кг) п=8 33,0±8,3 183,5±17,9 83.5±15,2 1,7±0,5 р<0.05 3,1±0,4 р<0.001

Примечание: как в таблице 7.

8000-1

* 6000-

^ 4000-

I

т> 2000-

р<0.05

«78

оо

о

о

:008*

Ва1Ь/с

□

р<0.05

4702

«Ь|

С57ВІ/6

ки

Йохимбин (5,0 мг/кг)

КИ

Рис. 9. Влияние йохимбина в дозе 5,0 мг/кг на специфическое связывание метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).

Йохимбин (5,0 мг/кг)

Таким образом, анксиогенный агент йохимбин, не являясь лигандом к ГАМКа рецептору, вызывал изменения связывающей способности бензодиазепинового сайта аналогично наблюдаемым при воздействии других факторов, индуцирующих тревожность.

В основе психостимулирующего действия кофеина лежит его способность подавлять активность центральных аденозиновых рецепторов (А| и А2) в коре

головного мозга и подкорковых образованиях ЦНС [Fcnc S. , 2010; Lopes LV, Sebastiao AM, Ribeiro JA. , 2011]. Психофармакологические эффекты кофеина в существенно» мере зависят от дозы препарата. Доказано, что в малых и средних дозах кофеин оказывает возбуждающее, а в больших дозах - угнетающее действие на функциональную активность ЦНС, включая усиление тревожности [Hughes R., 1996; Bhattacharya SK, Satyan KS, Chakrabarti A. , 1997; Childs E, et al., 2008]. Кофеин не обладает избирательной способностью блокировать только А|-аденозиновые рецепторы головного мозга. Он может блокировать и А2-аденозиновые рецепторы, что в свою очередь способствует усилению функциональной активности D;-дофаминовых рецепторов [Baldwin НА, File SE. , 1989; Fuxe К, et al., 2005] и как следствие приводит к анксиогенезу [de la Mora MP, et al., 2010; de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML., 2006].

Для моделирования анксиогенного состояния в настоящем исследовании использовалась высокая доза кофеина 100,0 мг/кг. Препарат вводили интрагастрально за 60 мин до тестирования в ОН и I1КЛ, или декапитации.

В тестах ОП и ПКЛ кофеин вызывал выраженный анксиогенсз, значимо угнетая двигательную активность обеих линий мышей (табл. 10 и 11).

Анализ функционального состояния бензодиазенинового участка ГАМКд рецептора показал значительное снижение связывания меченого флунитразепама синаптосомами головного мозга мышей обеих линий, на фоне премедикации кофеином в сравнении с группой «контрольная инъекция» (рис.10).

Таблица 10 - Влияние кофеина на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ОП

Линия Препарат ПА ЦА Ц ВА ОДА Деф

Balb/c КИ п=8 16,1±|,5 0,7± 0,3 0,0±0,0 0,0± 0,0 16,9± 1,6 0,7±0,3

кофеин (1 ОО.Омг/кг) п=8 5,8±2,2 р<0.05 0,0± 0.0 0,0± 0,0 0,0± 0,0 5,6± 2,2 р<0.05 0,5±0,2

С57В1/6 КИ п=8 б 1,1 ±3,6 19,6±2.9 0,5±0,3 11,0±1,4 92,3±5,5 0,4±0,2

кофеин (100,0мг/кг) п=8 12,4±4,4 р<0.0001 20.9±7,6 0,9±0,4 0,0± 0,0 р<0.0001 34,1±11,9 р<0.001 0,0±0,0

Примечание: как в таблице 7.

Таблица 1 I - Влияние кофеина на поведение мышей линии С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте Г1КЛ

Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)

открытые закрытые центр открытые закрытые

Ва1Ь/с КИ п=8 31,0±4,4 163,3±12,9 105,8±11,9 3,3±0,3 4,5±0,7

кофеин (100,0мг/кг) п=8 3,8±2,2 р<0.0001 218,8±5,0 р<0.05 77,5±5,8 р<0.05 0,4±0,2 р<0.0001 1,5±0,2 р<0.05

С57В1/6 КИ п=8 14,1 ±7,4 172,8±9,1 113,1±П,1 1,1 ±0,5 6,8±0,7

кофеин (100,0мг/кг) п=8 2,6±1,7 214,1±7,9 р<0.05 83,3±6,9 р<0.05 0,4±0,3 10,8±1,1 р<0.05

Примечание: как в таблице 7.

Рис. 10. Влияние кофеина в дозе 100,0 мг/кг на специфическое связывание [14-метил- Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).

о-1-1-1-1-1-1-

КИ Кофеин КИ Кофеин {100,0 мг/кг) (100,0 мг/кг)

Таким образом, применение трех различных по механизму действия анксиогенов, привело к сходным результатам - формированию реакции страха и падению бензодиазепиновой рецепции вне зависимости от генотипа изученных животных.

Следовательно, можно заключить, что и в случае фармакологически индуцированного анксиогенеза феномен падения бензодиазепиновой рецепции имеет маркерное значение.

Полученные данные о сопряжении тревоги с падением рецепции в бензодиазепиновом участке и возникновении этого эффекта в зависимости от силы стрессируюшего фактора, определили постановку следующей задачи. А именно, изучение изменений бензодиазепиновой рецепции при введении разных по структуре и механизму действия анксиолитиков для выяснения ранее поставленного вопроса,

50004000300020001000-

р<0.05

ВаіЬ/с

р<0.05

С57ВІ/6

может ли данный параметр иметь маркерную значимость для анксиолитического эффекта.

Исследовали разработанные в ФГ'БУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН препараты: афобазол - производное 2-меркаптобензимидазола, новый оригинальный анксиолитик; МП - основной метаболит афобазола; ноопепт -новый оригинальный препарат усиливающий когнитивные функции при их нарушении, обладающий анксиолитическими свойствами; ладастен - производное адамантана. новый оригинальный препарат в спектре психофармакологического действия которого установлены психостимулирующий и анксиолитический эффекты; ГБ-115 - соединение пептидной природы, взаимодействующее с холицистокининовыми I типа, бомбезииовыми и каппа опиоидными рецепторами, обладающее выраженными противотревожпыми свойствами. Все соединения относятся к разным химическим группам. В радиолигандных исследованиях совместно с компанией СЕЯЕР (Франция) установлено, что они не являются лигандами ГАМКа рецептора. Анксиолитические свойства препаратов продемонстрированы в собственных экспериментах с применением стандартных методов. В качестве референтного препарата использован диазепам.

Исследование выполнено по следующему протоколу: предварительное введение соединений мышам С57В1/6 и Ва1Ь/с, оценка их поведения в тестах ОН, ПКЛ и Г<Х, определение уровня специфического связывания |ТМ-метил-3Н]-флупитразепама синаптосомальными мембранами мозга. Параллельно изучали влияние препаратов на бензодиазепиновую рецепцию вне стрессового воздействия.

Предварительное введение афобазола в дозе 1,0 мг/кг, ноопепта в дозе 1,5 мг/кг, ладастена в дозе 50,0 мг/кг, ГБ-115 в дозе 0,025 мг/кг значимо увеличивало двигательную активность в тесте ОП у мышей линии Ва1Ь/с и предотвращало наблюдаемое в тесте падение бензодиазенинового связывания. Поведение мышей С57В1/6 и уровень специфического связывания радиолиганда после эксперимента в ОП не изменялись (рис. 11, рис. 12).

В тесте ПКЛ соединения вызывали аиксиолитическое действие и также предотвращали падение связывания радиолиганда только у мышей линии Ва1Ь/с (рис.13, рис. 14).

Balb/c

i КИ Препарат

44,4**"

Ношепт Ладастен

30,2"' Ш 07.5,04,6

11

я

9,1 11 я

1 11 я

ГБ-115 Диазепам Афобэзол

C57BI/6

в КИ * Препарат

134 115,2

Ноопепг Ладастен ГБ-115 Диазепам

Рис.11 Влияние анксиолитиков на уровень «общей двигательной активности» мышей линий Balb/c и С57В1/6 в тесте «открытое поле»

Примечание: количество животных в группе=8; —статистически значимые (р<0.05;

р<0.01; р<0.001) отличия от группы «контрольная инъекция»(КИ) согласно U критерию Манн-Уитни.

5157(5571* 5287(10491* -ЧЗ)"

5265(8431*_

4192(8495*

Диазепам 1,0 мг/кг + Öff|

ГБ-115 0,025 мг/кг +ОП |

Ладастен 50,0 мг/кг + ОгГ

.............Ноопепг 1,5 мг/кг + оп]

Афобаэол 1,0 мг/кг 4- ОН 3155(614) Контрольная инъекция -ЮП[

4847(7841

Диазепам 1,0 мг/кг + рП |

4661(4511 0 1000

Контрольная инъекция -ЮП 2000 3000 4000 5000

6000

Рис. 12. Влияние препаратов на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (P|+Pi) головного мозга мышей линии Balb/c и С57В1/6 после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "открытое поле".

Примечание: абсцисса — dpm/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде M(SD); количество животных в каждой группе 8; *-статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция+ОП» (р<0.05).

Предварительное введение афобазола, ноопепта, ладастена и ГБ-115 в анксиолитических дозах с последующим стрессированием мышей в тесте КХ предотвращало стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции как у мышей линии Balb/c, так и С57В1/6 (рис. 15).

Визуальные наблюдения за поведением мышей в тесте с КХ показали, что в отличие от группы «контрольная инъекция» в опытных группах мышей обеих линий, которым предварительно были введены анксиолитики, животные свободно

Ва1Ь/с

% времени в открытых рукавах

■ КИ ® Препарат

Двигательная активность

«КИ в Препарат

С57В1/6

% времени в открытых рунаеах Двигательная активность

жКИ Препарат т КИ Препарат

Рис. 13 - Влияние анксиолитиков на поведение мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 в гесте ПКЛ. Примечание: количество животных в группе-8; *,**— статистически значимые (р<0.05: рсО.ОП отличия от группы «контрольная инъекция» согласно и критерию Манн-Уитни.

перемещались в пределах экспериментального короба с характерными для каждой линии проявлениями исследовательской активности, более выраженной у мышей С57В1/6. Отсутствие проявлений тревоги в присутствии хищника на фоне препаратов дает основание сделать вывод о наличие у них анксиолитического влияния в данном тесте у мышей обеих линий.

4549(7011* Диазепам 1,0 мг/кг V ПКЛ |

4095(911)* ГБ-115 0,025 мг/кг + ПК/1 ?. |

4405(236)* 4800(592) Ладастен 50,0 мг/кг + пкл | Ноопепт 1,5 мг/кг + ПКЛ 1

4343(479)* Афобазол 1,0 мг/кг«- ПКЛ • 2809(822) Консрот,»а«ины>«цик ншя|

4420(831! Диазепам 1.0 мг/кг + ПКЛ 1

4853(501) ГБ-115 0,025 Мг/кг+ПКЛ|

4265(1098) Ладастен 50,0 мг/кг+ПКЛ1

4554(473) Ноопепт 1,5 мг/кг *ПКЛ|

3989(479) 4300(586) Афобазол 1,0 юг/кг + ПКЛ Кошрольная инъекция 4ПКЛ I

; . ' 1 Г

О 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Рис. 14. Влияние препаратов на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт". Примечание: Абсцисса — с1рт/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде М(ЗО); количество животных в каждой группе 8; *-статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция+ПКЛ» (р<0.05).

4843(908)* Диазепам 1,0 мг/кг * КХ |

4244(357)* ГБ-115 0,025 мг/кг + КХ _1

3522(750)* 4186(340)* Ладастен 50,0 мг/кг + КХ [ Ноопепт 1,5 мг/кг + КХ м

4829(652)* Афобазол 1,0 мг/кг + КХ

1942(4311_ КИ + КХ [

3770(1020)* Диазепам 1.0 мг/кг + КХ 1

2957(463) ГБ-115 0,025 мг/кг+КХ |

3082(6Д)* 3689(576)* Ладастен 50,0 мг/кг *КХ{__ Ноопепт 1,5 мг/кг +КХ |

4135(752)* 2116(637) Афобазол 1,0 мг/кг + КХ КИ + КХ Т я

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Рис. 15. Влияние препаратов на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "контакт с хищником".

Примечание: Абсцисса — <3рт/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде М(БО); количество животных в каждой группе 4; *-статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция (КИ)+КХ» (р<0.05).

Результаты, позволяющие судить о маркерной значимости феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции, получены при исследовании метаболита афобазола соединения М-11.

Противотревожная активность соединения Mil в дозе 0,5 мг/кг в тестах ОП и ПКЛ оказалась сопряженной с нормализацией уровня специфического связывания [N-метил-3Н]-флунитразепама синаптосомальными мембранами мозга, нарушенного в данных тестах у мышей линии Balb/c (рис. 11, рис. 13; рис. 16). В тоже время при усилении модальности стресса в тесте «контакт с хищником» введение соединения МП в дозе 0.5 мг/кг не привело к предотвращению стрессиндуцироваиных изменений в бензодиазепиновом участке ГАМКд рецептора (рис. 16). Ml 1 в тесте КХ не вызывал анксиолитического действия, в поведении мышей в присутствии хищника зарегистрированы проявления реакции страха. Таким образом, поведенческий опыт демонстрирует меньшую анксиолитическую активность Mil в сравнении с афобазолом. Эти отличия подтверждаются отсутствием эффекта на бензодиазепиновую рецепцию.

! <:« > <:Г ■ М5 i . 1 S :: 1 : 1

2324(333! Mil 0,5 мг/кг + КХ

1942(431) Контрольная инъекция + кх! 3416(3091* Г Ш /■ • МП 0,5 мг/кг + ПКЛ

2264(179)

3698(349)* Mil 0,5 мг/кг + ОГ

2715(310) Контрольная инъекция + ОП

2700(579) Mil 0,5 мг/кг +КХ

2116(637) Контрольная инъекция + КХ

3735(812) МИ 0,5 мг/кг + ПКЛ

3679(535) Контрольная инъекция + ПКЛ

3590(561) МИ 0,5 мг/кг+ОП

3348(291) Контрольная инъекция + ОП 1

__________

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Рис.16. Влияние Mil на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга мышей линии Balb/c и С57В1/6 после эмоционально-стрессового воздействия в тестах "открытое поле", «проподнятый крестообразный лабиринт» и «контакт с хищником».

Абсцисса — dpm/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде M(SD); количество животных в каждой группе 4; *- статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция+ОП» и «контрольная инъекция+ПКЛ» (р<0.05).

Препарат сравнения - диазепам в дозе 1,0 мг/кг как в тесте ОП, так и в ПКЛ вызывал анксиолитический эффект у мышей Balb/c, проявившейся в активации их

исследовательской активности и седативное действие у мышей C57BI/6 (рис. 11, 13), что полностью соответствует многократно воспроизведенным данным нашей лаборатории [Середенин С.Б. с соавт., 1979, 2001; Yarkova М.А., 2005]. Диазепам, как и другие анксиолитикн, предотвращал падение связывания меченого флунитразепама как в тестах ОП, ПКЛ, так и в тесте КХ (рис. 12-14, 15).

Вне стрессового воздействия все изученные соединения не изменяли параметры связывания меченого лиганда по сравнению с контрольной инъекцией воды [Яркова М.А., 2011].

Выявленные механизмы действия афобазола, дадастена, ноопепта и ГБ-115 позволяет сделать ряд предположений о нейрохимических путях их влияния на бензодиазепиновую рецепцию.

Афобазол взаимодействует с Оь МТ[, МТ3 и МАО А рецепторами [Середенин С.Б., Воронин М.В., 2009]. Лигандная активация oí рецепторов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме в составе липидных рафтов, ведет к их транслокации в плазматическую мембрану вместе с фосфолнпидным окружением. Известно, что увеличение при стрессе содержания активных форм кислорода и липидных радикалов изменяет фосфолипидный состав мембраны и может вызывать опосредованные липид-белковыми взаимодействиями конформационные изменения в ГАМКд рецепторе, ведущие к падению рецепции в бензодиазепиновом сайте [Hovatta I. et al., 2010; Bouayed J., et al., 2009]. Транспорт ст, рецептора с каркасными фосфолипидами к поверхностной мембране [Morin-Surun МР et al., 1999; Hayashi Т., Su ТР., 2005] может способствовать восстановлению липидного окружения и конформации ГАМКд рецептора. Нельзя также исключить и другой механизм. В эндоплазматическом ретикулуме a¡ рецептор связан с белком анкерином, который регулирует рецептор tPi. связывающий белки PRIP. Последние, участвуют в быстрых функциональных изменениях ГАМКа рецептора через транспорт и интернализацию рецептора [Kanematsu Т. et al., 2002; Mizokami A. et al., 2007].

Взаимодействие афобазола с МТ| рецепторами, подобно мелатоннну, может усиливать ГАМК трансмиссию, что как известно сопряжено с увеличением связывания в бензодиазепиновом сайте [Xia СМ. et al., 2008; Sato S. et al., 2008].

Ладастен способен снижать экспрессию ГАМК транспортера, что ведет к увеличению ГАМК в синаптической щели [Вахитова Ю.В. с соавт., 2005], Также, ладастен активирует Са2+/кальмодулин-зависимую протеинкиназу II, которая оказывает влияние на функциональные свойства ГАМКд рецептора [Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Середенин С.Б., 2004; Tyagarajan SK, Fritschy JM , 2010].

Для ноопепта установлено холинопозитивное действие [Островская Р.У., с соавт., 2001], снижение накопления свободных радикалов кислорода и усиление антиоксидантной системы [Менджерицкий A.M., Лысенко A.B., Демьяненко C.B., 2003; Лысенко A.B. с соавт., 1997], стимуляция экспрессии нейротрофинов [Островская Р.У. с соавт., 2008]. Каждый из этих механизмов, в особенности антиоксидантные свойства, могут вести к восстановлению функциональной активности ГАМКд рецептора.

Механизм противотревожного действия соединения ГБ-115 связан с увеличением ГАМК трансмиссии через взаимодействие с холицисткининовыми 1го типа, бомбезиновыми 3го типа и каппа опиоидными рецепторами, а также функциональным антагонизмом с агонистом холицисткининовых рецепторов 2го типа [Kolik L.O., Gudasheva T.A., Seredenin S.B., 2011; Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Середенин С.Б., 2012; Antonelli Т, et al., 2009; Rezayat M, et al., 2005].

Таким образом, изученные препараты, имея различные первичные нейрохимические мишени опосредуют фенотипически сходный анксиолитический эффект. Поэтому наличие общего признака в их фармакодинамике - предотвращения стрессиндуцированного падения бснзодназепиновой рецепции, позволяет рассматривать данный феномен в качестве общего, возможно результирующего звена в механизмах, опосредующих анксиолитическое влияние.

Можно заключить, что фармакологический этап выполненного исследования подтвердил маркерную значимость для состояния тревоги и страха, стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции.

Однако, практическое обсуждение фармакогенетических данных требует их экстраполяции на гетерозиготные популяции. Полиморфизм по эмоционально-стрессовым реакциям многократно подтвержден, например MNRA и MR линии выведены методом инбридинга из беспородной популяции крыс по признакам поведения в тесте «открытое поле».

С нашей точки зрения надежность разделения для практического использования различных по фенотипу стрессового ответа беспородных животных может быть повышена дополнением визуально регистрируемых поведенческих характеристик объективным маркером, отражающим реакцию страха. В качестве последних в литературе апробированы самые разнообразные показатели, от катехоламинов и кортикостероидов до генов кандидатов [Clement Y., Calatayud F., Beizung С., 2002; Edgar V.A., et al., 2003; Roy V., et al., 2007]. Однако, ни один из них не оказался достаточно дифференцирующим.

Установленная в настоящей работе связь между тревогой и функциональной активностью ГАМКд рецептора позволяет предположить возможность классификации и выработки правил разделения беспородной популяции мышей на высоко- (ВТ) и низко-тревожных (НТ) по параметрам поведения с использованием в качестве контрольного показателя уровня рецепции [М-метил-?Н]—флунитразепама.

В первом опыте анализировали возможность применения теста темно-светлой камеры (ТСК).

Исследование поведения 135 беспородных мышей линии CD-I в ТСК выявило унимодальное распределение основных поведенческих параметров: суммарного времени проведенного в темном отсеке, количества переходов между отсеками и количества вертикальных стоек в светлом отсеке камеры, что свидетельствует об однородности популяции и математически не позволяет разделение на группы по данным показателям (рис.17). В следующих экспериментах в группы НТ и ВТ было отобрано по 8 мышей с наибольшими и наименьшими показателями «время нахождения в темном отсеке». К ИТ группе отнесены особи с t от 0 до 74 секунд, а к ВТ - от 220 до 300 секунд. Поведенческие характеристики групп представлены в таблице 12.

Рис.17 Частотные распределения параметров поведения беспородных мышей линии CD-I в темно-светлой камере.

Таблица 12 - Характеристики поведения беспородных мышей линии CD-I отнесенных к НТ и ВТ группам

Субпопуляции Время Количество Количество

нахождения в переходов между вертикальных стоек

темном отсеке, с отсеками в светлом отсеке

НТ М 28,7 3,7 23,9

п=8 SD 32,2 4,4 13,3

SEM 11,4 1,6 4,7

ВТ М 231,4 9,6 8,1

п=8 SD 19,3 7,5 6,9

SEM 6,8 2,7 2,4

U-критерий P 0,0009 0,1015 0,0134

После 10-ти дневного карантина был изучен уровень бензодиазепиновой рецепции отобранных НТ и ВТ мышей до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП.

У интактных НТ и ВТ мышей межгрупповых различий не выявлено. Стрессирование в тесте ОП также не привело к изменениям рецепции в обеих группах, однако па рис. 18 заметно увеличение разброса данных в опытных группах. Этот факт позволяет предполагать, что в обеих классификационных группах имеются мыши, у которых стрессирование в ОП приводило к сдвигам рецепции в бензодиазепиновом участке ГАМКд рецептора.

Рис. 18 - Специфическое связывание [N-метил- II]—флунитразепама мембранной фракцией (Pi+P2) головного мозга ВТ и НТ мышей линии CD-I разделенных в ТСК до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП. Ордината — dpm/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка.

Таким образом, распределения по поведенческим характеристикам и по рецепции [М-метил-3Н]-флунитразепама не дали возможность использовать ТСК для классификации беспородных мышей на НТ и ВТ. В литературе высказывалось мнение о недостаточном стрессирующем воздействием темно-светлой камеры [Bourin, М. and М. Hascoet, 2003; Лапин И.П., 1992].

В следующей серии опытов для типирования беспородной популяции мышей был апробирован тест ОП.

В тесте ОП проанализировано поведение 196 беспородных мышей линии CD-I. На построенных частотных гистограммах всех определяемых по методу параметров видно, что бимодальное распределение произошло по показателю вертикальной активности (ВА), что является свидетельством неоднородности популяции в реакции на воздействие в тесте ОП (рис. 19).

Однако, перекрытие групп не давало возможности создать классификационное правило разделения с удовлетворительной эффективностью.

Ясно, что для учета всех параметров теста, характеризующих поведение мышей, необходим кумулятивный показатель, который будет удовлетворять задаче типирования при бимодальном распределении с квази непересекающимися группами. Суммирование всех видов двигательной активности в показателе общей двигательной активности (ОДА) наиболее простой и часто используемый подход. Однако, мы предполагали возможность усовершенствования классификации, исходя из соображений о том что, весы дискретных параметров двигательной активности не должны быть равны.

Рис. 19 - Частотные гистограммы основных параметров поведения беспородных мышей линии CD-I (п=196) в тесте «открытое поле».

Литературные данные и собственные наблюдения показывают, что высокотревожные особи грызунов в тесте ОП избегают незащищенных центральных областей и концентрируют передвижения вблизи бортов установки, с минимальной исследовательской активностью, отражаемой вертикальными стойками. Обратное соотношение этих показателей - высокий уровень двигательной активности в центральных секторах и вертикальных стоек - служит признаком низкого уровня

® 0

тревожности [Van Abeelen JH, et al., 1973; Thiel, С.M., et al., 1999; Зорина 3.A., 2002; Ramos, A., et al., 2008].

Исходя из этих представлений, были предложены одиннадцать вариантов весов для 4 отдельных поведенческих параметров и проанализированы частотные гистограммы. В итоге вес 2 был назначен для параметра Ц и вес 4 для параметра ВА. Кумулятивный описательный параметр был обозначен как «эффективная общая двигательная активность» (ОДАэфф), равный Г1А+ ЦА+2*1 [+4* В А.

На основе полученного распределения и допуская 2% предельную ошибку, сформулировано следующее правило классификации:

Если ОДАэфф <60, то предполагается, что мыши относятся к ВТ группе. Если ОДАэфф > 66 - к 1 IT группе. Результаты сравнительного статистического анализа групп ВТ и HT рассчитанных по ОДА и ОДАэфф представлены в таблице 13. Из гистограмм на рис.20 видно, что при использовании ОДАэфф разделение на HT и ВТ группы более выражено.

ОДА = ПА+ ЦА+Ц+ВА

13

¡¡Ü щ ж

ц

sü ж!

z !

- - ; m

ОДАэфф = ПА+ ЦА+2*Ц+4*ВА

Рис. 20 - Частотные гистограммы общей двигательной активности беспородных мышей линии CD-I (п=196) в гесте «открытое поле».

Результаты анализа групп Классификационное правило ограниченное 2% ошибкой

ВТ НТ ВТ НТ

ОДА 33.2(17.7) 140.6(43.9) ОДА<50 п=19 (9.7%) ОДА>68 п=167 (85.2%)

ОДАэфф 31.4(17.4) 195,0(65.7) ОДАэфф<60 п=24 (12.2%) ОДАэфф>66 п=171 (87.2%)

Примечание: данные представлены в виде M(SD); n-количество животных в группе

Результаты анализа бензодиазепипового связывания в группах ВТ и НТ. разделенных по ОДАэфф, показывают, что в группе ВТ после эмоционально-стрессового воздействия тесте ОН уровень связывания меченого лиганда значительно снизился по сравнению с интактной группой и не изменился у мышей НТ (рис.21). Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что примененный подход позволяет с одной стороны оптимизировать разделение беспородной популяции мышей на высоко- и низко-тревожных в тесте ОН, а с другой подтверждает выявленные на инбредных животных закономерности изменений беизодиазепиновой рецепции при формировании реакции замирания.

Рис. 21 - Специфическое связывание [N-метил- Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Рг) головного мозга ВТ и НТ мышей линии CD-I до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП.

* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).

Для последующей экстраполяции фармакогенетических данных на беспородную популяцию проведены исследования связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама у беспородных мышей CD-I разделенных по критерию ОДАэфф в ОП на ВТ и НТ группы, при стрессовых воздействиях в тестах ПКЛ и КХ .

В таблице 14 представлены параметры поведения беспородных мышей, вошедших в группы ВТ и НТ.

6000-,

S 4000Н

\о

La £

| 2000-

ОО

ВТ

4632

3481*

-'□я

JLI

□ □

It's К1

НТ

Интактные ОП Интактные ОП

Группы п ПА НА Ц ВА ОДА ОДАЭфф

ВТ 36 39,8(8,0) 3,3(2,9) 0,0(0,0) 1,8(1,8) 44,9(7,5) 50,5(6,2)

НТ 251 91,4(23,3)* 22,8(15,1)* 1,5(1,8) 8,7(5,6)* 124,4(31,8)* 152,0(43,5)*

Примечание: данные представлены в виде М(ЗО); п-количество животных в группе;

* — статистически значимое (р<0.05) межгрупповое отличие согласно и-критерию Мани-

Уитни.

Через 10 дней после процедуры разделения в ОП на ВТ и НТ группы, животные были подвергнуты стрессированию в тесте ПКЛ и «контакт с хищником». Установлено, что после 5 мин экспозиции животных в тесте ГІКЛ у мышей группы ВТ бензодиазепиновое связывание значимо снижается, по сравнению с интактной группой, а у НТ группы изменений в рецепции не возникает (рис. 22).

4759

4632

ОО

rffio

□ „О

ВТ

НТ

Интактные ПКЛ Интактные ПКЛ

Рис. 22. Специфическое связывание [N-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга ВТ и НТ мышей линии CD-I до и после эмоционально-стрессового

воздействия в тесте ПКЛ. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).

5500-S0M-

3

| 4500.

t 4000£

| 3500-■а

30002500

ВТ

НТ

Контроль КХ Контроль КХ

Рис. 23. Специфическое связывание [N-метил-1 11—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга ВТ и НТ мышей линии CD-I до и после эмоционально-стрессового

воздействия в тесте КХ. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контроль (р<0.05).

Анксиогенная обстановка вызванная присутствием хищника привела к значимому снижению связывания [1Ч-метил-31 Г]-флунитразепама как у ВТ, так и НТ групп животных (рис. 23).

Таким образом, на беспородной популяции животных полностью подтверждены ранее полученные на инбредных линиях мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 данные о падении бензодиазепиновой рецепции при формировании реакции страха. Полученный

результат позволяет сделать заключение, что снижение бензодиазепиновой рецепции специфично для фенотипа стрессового ответа и сопровождает реакцию страха при ее возникновении.

Предварительное введение афобазола и диазепама в дозе 1,0 мг/кг за 30 минут до эксперимента статистически достоверно увеличивало двигательную активность ВТ мышей в тесте ПКЛ за счет числа заходов в открытые рукава лабиринта. Возросло время проведенное животными в открытых рукавах и сократилось в закрытых по сравнению с контрольной инъекцией (табл. 15). На фоне афобазола и диазепама эмоционально-стрессовое воздействие в тесте ПКЛ не вызывало падения уровня связывания радиолиганда у мышей субпопуляции ВТ. Поведение мышей субпопуляции ИТ и специфическое связывание [Ы-метил-3Н]-флунитразепама после эксперимента в ПКЛ не изменялись (рис. 24).

Введение анксиолитиков при стрессировании мышей в тесте «контакт с хищником» предотвращало стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции у мышей обеих групп (рис. 25).

Таблица 15 - Влияние диазепама и афобазола на поведение ВТ и НТ мышей в тесте ПКЛ

п Время в открытых рукавах, сек Время в закрытых рукавах, сек Время в центре,сек Число заходов в закрытые рукава Число заходов в открытые рукава Двигательная активность

Мыши субпопуляцин ВТ

Контрольная инъекция 6 36,2(14,8) 149,3 (36,8) 114,7(31,9) 7,5 (1,9) 2,2(0,7) 9,7(2,2)

диазепам 1,0 мг/кг 6 83,7(19,3) р<0.01 107,8 (43,6) р<0.05 122,5 (28,6) 8,7(3,0) 5,8 (3,8) 14,5 (6,7)

афобазол 1,0 мг/кг 6 60,3 (31,5) 93,8 (13,3) р<0.01 145,8 (32,1) 8,3(1,5) 4,8(1,8) р<0.01 13,2(2,8) р<0.05

Мыши субпопуляции НТ

Контрольная инъекция 6 54,5 (13,4) 121,8 (12,4) 123,7(18,8) 8,2(2,3) 3,3 (0,8) 11,5 (2,1)

диазепам 1,0 мг/кг 6 78,7(23,2) 120,3 (14,3) 1.01,0(22,3) 8,5 (3,4) 6,2(1,9) р<0.01 14,7(5,3)

афобазол 1.0 мг/кг 6 52,0 (14,1) 111,8 (8,9) 136,2(13,7) 8,0(1,3) 3,2(2,0) 11,2(2,6)

Примечания: данные представлены в виде М (БЭ); п - число животных в группе; р — статистически значимые различия по сравнению с группой «контрольная инъекция» (КИ) согласно и-критерию Манн-Уитни.

4395(378)« Диазепам 1,0 мг/кг + ПНЯ

h- 4523(393)# Дфобазол 1,0 мг/кг ПКЛ 1

Ш 3346(651)* Контрольная инъекция + ПКЛ

4472(479) Контрольная инъекция

Ш <

4682(235) Диазепам 1,0 мг/кг t ПКЛ

h- 4637(478) Дфобазол 1,0 мг/кг + ПКЛ S

X 4636(365) Контрольная инъекция + ПКЛ :

4475(390) Контрольная инъекция

1000 2000 3000 4000 50 00

Рпс.24. Влияние предварительного введения афобазола и диазепама на специфическое связывание [N-метил- Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга ВТ и НТ мышей линии CD-I после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ПКЛ. Примечание: абсцисса — dpm/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде M(SD); количество животных в каждой группе 4; * — статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция» (р<0.05); #- статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция+ПКЛ» (р<0.05)

Диазепам 1,6 мг/кг ♦ КХ Дфобазол 1,0 мг/кг + КХ \ КИ+ КХ I

Контрольная инъекция

4244(267)» Диазепам 1,0 мг/кг * КХ

4508(359)8 Дфобазол 1,0 мг/кг +■ КХ

[ 3352(208)* КИ+ КХ

4475(390) Контрольная инъекция

Э 1000 2000 3000 4000

4350(303)# к 4375(45б)й Ш 13029(448)* 4472(479)

Рис. 25. Влияние предварительного введения афобазола и диазепама на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга ВТ и НТ мышей линии СО! после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "контакт с хищником" (КХ).

Примечание: абсцисса — дрт/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде М(50); количество животных в каждой группе 4; * — статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция» (р<0.05); #- статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция (КИ)+КХ»(р<0.05).

Анксиолитическое действие отчетливо проявлялось в снижении поведенческих показателей реакции страха. Таким образом, фармакологические исследования на НТ и ВТ субпопуляций беспородных животных также подтвердило данные, установленные на инбредных мышах С57В1/6 и Ва1Ь/с.

В совокупности результаты, полученные па беспородной популяции мышей, соответствуют данным фармакогенетических экспериментов и подтверждают, что функциональные изменения ГАМКд-бензодиазепинового рецепторного комплекса зависят от исходной тревожности животного, от модальности стрессового воздействия, а анксиолитическое влияние различных соединений сопряжено с восстановлением бензодиазеипновой рецепции.

Заключение. Комплексное исследование феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции, выполненное на инбредных и беспородных животных с применением физиологических, фармакологических, фармакогенетических и нейрохимических методов, позволяет заключить, что эмоционально-стрессовые воздействия, вызывающие реакцию страха, сопровождаются снижением связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора. Анализ бензодиазепиновой рецепции дает возможность объективной характеристики состояния тревоги, стрессустойчивости, эффектов фармакологических препаратов с анксиолитическнми и анксиогенными свойствами. Таким образом, феномен стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции может рассматриваться в качестве нейрохимического маркера тревожных состояний и эффектов анксиолитиков. Последнее определяет новую фармакологическую мишень для разработки оригинальных противотревожных средств.

Выводы:

1. Установлено, что у инбредных мышей Ва1Ь/с и крыс МП выраженная реакция страха в тесте «открытое поле» сопровождается падением связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора, а у животных с активным поведением в данном тесте - мышей С57В1/6 и крыс МЫЯА изменений бензодиазепиновой рецепции ие возникает.

2. При усилении эмоционально-стрессового воздействия в тестах «иммобилизация», «контакт с хищником» выявлено снижение бензодиазепиновой рецепции как у мышей Ва1Ь/с, так и у С57В1/6.

3. На мышах С57В1/6 и Ва1Ь/с показано, что в тестах для моделирования состояний депрессии изменений бензодиазепиновой рецепции не происходит, а в

тесте с болевым воздействием уровень связывания [Ы-мстил-Т I |-флупнтразенама увеличивается.

4. Установлены межлинейные различия по времени восстановления бензодиазепиновой рецепции после эксперимента «контакт с хищником». Стрессиндуцированное падение связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама у мышей С57В1/6 составило 24 часа, у Ва1Ь/с - 8 часов.

5. Анксиогенный эффект препаратов йохимбин в дозе 5,0 мг/кг, производного Р-карболина рССВ в дозе 3,0 мг/кг и кофеина в дозе 100,0 мг/кг сопровождается снижением бензодиазепиновой рецепции у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с.

6. Установлено, что фармакологические препараты, вызывающие анксиолитический эффект, не связывающиеся с ГАМКд рецептором и различные по первичным нейрохимическим механизмам действия: афобазол, ноопепт, ладастен, ГБ-115 предотвращают стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции.

7. Разработан методический прием разделения беспородной популяции мышей по фенотипу поведения в тесте «открытое поле» на высоко- и низкотревожных.

8. На беспородных субпопуляциях высоко- и низкотревожных мышей полностью подтверждены закономерности изменений бензодиазепиновой рецепции при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении анксиолитиков, установленные на инбредных животных с различным фенотипом поведения в тесте «открытое поле».

9. Изменения в связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКа рецептора имеют маркерную значимость для состояния тревоги и эффектов анксиолитиков.

Научно-практнческне рекомендации

1. Анализ уровня бензодиазепиновой рецепции в качестве нейрохимического маркера реакции страха может рекомендоваться к использованию для разработки новых экспериментальных моделей и верификации применяемых в физиологических, нейрофизиологических и фармакологических исследованиях.

2. Оценка связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора рекомендована в качестве дополнительного метода скрининговых исследований при разработке новых анксиолитиков.

3. Разработанный метод разделения беспородной популяции мышей на высоко- и низко-тревожных рекомендован для использования в физиологических исследованиях, для изучения эффектов психотропных препаратов,

ориентированных на определенный фенотип эмоционально-стрессовых реакций, с целью создания методов персонифицированной медицины.

4. Установленные анксиолитические свойства препаратов ладастен и ноопепт учтены в инструкциях к их клиническому применению.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Середенин, С.Б. Фармакогенетическая концепция анксиоселективного эффекта [Текст]/ С.Б.Середенин, Т.А.Воронина, Г.Г.Незнамов, Ю.А.Бледнов, Б.А.Бадыштов, И.В.Виглинская, М.М.Козловская, Н.В.Колотилннская, B.JI. Савельев, Т.Л. Гарибова, Е.А.Вальдман, М.А.Яркова // Вестник РАМН. - 1998. - № 11. - С. 3-9.

2. Середенин, С.Б. Рецепция 3Н-дназепама в мозге инбредных животных с различной реакцией на эмоциональный стресс [Текст] / С.Б.Середешш, М.В.Вороннн, М.Л.Яркова // Экспериментальная п клиническая фармакология. - 2001. - Т. 64. - № 1. - С. 63-65.

3. Середенин, С.Б. Эндогенный дипептид циклопролилглицин проявляет селективную анксиолитическую активность у животных с выраженной реакцией страха [Текст] / С.Б.Середенин, Т.А.Гудашева, С.С.Бонко, Г.И.Ковалев, М.В.Воронин, М.А.Яркова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 133. - № 4. - С. 417-419.

4. Мелкумян, Д.С. Анализ содержания BDNF в структурах головного мозга инбредных мышей с разными фенотипами эмоционально-стрессовой реакции [Текст] / Д.С.Мелкумян, "Г.С.Середенина, М.А.Яркова, Е.А.Вальдман, С.Б.Середенин // Бюлл. экспер. биологии и медицины. - 2005. - Т. 140. - № 11. - С. 549-551.

5. Середенин, С.Б. Влияние Афобазола на трансмебранные ионные токп нейронов моллюска [Текст] / С.Б.Середенин, Ю.Д.Игнатов, А.И.Вислобоков, К.Н.Мельников, М.Л.Яркова // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т. 68. - № 5. - С. 3 -6.

6. Яркова, М.А. Изучение механизма действия Ладастена [Текст] / М.А.Яркова, М.В.Воронин, С.Б.Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т. 68. - № 3. - С. 3-6.

7. Левина, М.Н. Сравнительное изучение влияния ладастена, сиднокарба и их комбинации на физическую работоспособность [Текст] / М.Н.Левина, Б.А.Бадыштов, М.А.Яркова // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2006. - Т. 69. - № 3. - С. 68-70.

8. Середенин, С.Б. Влияние Афобазола на содержание BDNF в структурах мозга инбредных мышеи с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции [Текст] / С.Б.Середенин, Д.С.Мелкумян, Е.А.Вальдман, М.А.Яркова, Т.С.Середенина, М.В.Воронин, А.С.Лапицкая // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2006. - Т. 69. - № 3. - С. 3 -6.

9. Szanyi, 1. In vivo effects of afobazole (2-mercaptobenzimidazole derivative) on the 7,12-dimethylbenz [alpha]anthracene-induced oncogene and suppressor gene expression [Text] / I. Szanyi, L. Lujber, I. Gerlinger, J. Pytel, M. Bauer, A. Csejtey, E. Szele, K. Gombos, I. Kiss, S. Seredenin, M. Yarkova, I. Ember// In Vivo. - 2007. - T. 21. - № 6. - C. 1059-1063.

10. Богдан, Н.Г. Влияние ладастена на психофизиологические показатели здоровых добровольцев [Текст] / Н.Г. Богдан, Н.В. Колотилинская, М.Л.Яркова, С.А. Надоров, Б.А. Бадыштов, С.Б. Середешш // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72. - № 3. - С. 3-9.

11. Каверина, Н.В. Влияние афобазола на вариабельность ритма сердца у крыс, отличающихся по поведению в тесте «открытое поле» [Текст] / Н.В. Каверина, Е.П. Попова, М.Л.Яркова, С.Б. Середенпн // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72. - № 1. - С. 33-40.

12. Середешш, С.Б. Лфобазол снижает двигательные расстройства, вызванные галоперидолом [Текст] / С.Б.Середенин, Т.Л.Гарибова, А.Л.Кузнецова, М.В.Воронин, М.Л.Яркова, Т.А.Ворошша // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72.-№ 1.-С. 15-18.

13. Чекина, К.С. Анализ бензодиазепиновой рецепции у мышей линий С57В1/6 и Balb/c в зависимости от типа стрессирующего воздействия [Текст] / К.С.Чекина, М.Л.Яркова, С.Б.Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148. - № 10.-С. 408-410.

14. Богдан, ІІ.Г. Влняине афобазола на психофизиологические показатели здоровых добровольцев [Текст] / Н.Г.Богдан, Н.В.Колотилинская, С.А.Надоров, М.Л.Яркова, Б.А.Бадыштов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74. - № 8. - С. 8-12.

15. Можаева, Т.Я. Синтез и фармакологическая активность основного метаболита афобазола и его аналогов [Текст] / Т.Я.Можаева, М.А. Яркова, В.ГІ.Лезина, С.Б.Середенин // Хим. фарм. журнал. - 2011. - Т. 45. - № 3. - С. 19-22.

16. Яркова, М.А. Анализ связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМ К А рецептора у мышей С57В1/6 и Balb/c при введении анксиолитиков [Текст] / М.А.Яркова // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74. - № 8. - С. 37.

Материалы всероссийских и международных конференций

17. Seredenin, S.B. Novel selective anxiolytic Afobazol-the mechanism of action. [Text] / S.B.Sercdenin, M.A.Yarkova, M.V.Kutsevalova, G.G. Neznamov / XXII nd CINP Congress, 9-13 July 2000, Brussels. // The International Journal of Neuropsychopharmacology. - Vol.3. - Suppl.1. -S277.

18. Середенин, С.Б. Генетические различия бензодиазепиновой рецепции - молекулярной мишени апксиоселективности. [Текст] / С.Б.Середенин, М.А.Яркова, М.В.Воронин // В сб. международной научной конференции «Новые лекарственные средства - синтез, технология, фармакология, клиника» 14-16 ноября 2001, Минск. - Минск, 2001. - С. 132.

19. Яркова, М.А. Рецепция НЗ-дназепама в мозге инбредных животных с различной реакцией на эмоциональный стресс. [Текст] / М.А.Яркова, М..В.Воронин // В сб. тезисов 3 Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 15-18 мая 2001, Москва. -М., 2001. - С.168.

20. Яркова, М.А. Ладастен - новый фармакологический препарат, сочетающий анксиолнтические и активирующие свойства. [Текст] / М.А.Яркова, М.В.Воронин, И.С.Морозов // В сб. тезисов 3 Международной конференции «Биологические основы

индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 15-18 мая 2001, Москва. -М„ 2001.-С. 169.

21. Середенин, С Б. Нейрохимические мишени анксиоселективното эффекта. [Текст] / С.Б.Середенин, М.А.Яркова, М.В.Ворошш // В сб. «Современные технологии оценки и коррекции боеспособности военнослужащих в экстремальных условиях деятельности». - М.,

2002.-С. 154.

22. Seredenin, S.B. H3-diazepam binding in inbred animals with different open field behavior. [Text] / S.B.Seredenin, M.A.Yarkova, M.V.Voronin, A.T. Bykov / Abstracts from XXIII CINP Congress, June 23-27, 2002, Montreal. / / The International Journal of Neuropsychopharmacology. -Vol. 5. - Suppl.l.- S 150.

23. Yarkova, M.A. Ladasten - novel psychotropic drug combining psychostimulating and anxiolytic properties. [Text] / M.A.Yarkova, I.S.Morozov, S.B.Seredenin / Abstract book XlVth World Congress of Phannacology 2002, San Francisco, USA. // Phamiacologist. - Vol.44. - №2,-Suppl.l. - A 44.

24. Воронин, MB. Гомология рецепции бензодиазепннов в условиях эмоционально-стрессового воздействия у инбредных крыс и мышей. [Текст] / М.В.Воронин, М.А. Яркова, С.Б. Середенин // Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного общества фармакологов, 21-25 апреля 2003, Москва. -М., 2003. - С. 105.

25. Середенин, С.Б. Изучение влияния нового селективного анксиолитика Афобазол на операторскую деятельность здоровых добровольцев в эмоционально-стрессовых условиях. [Текст] / С.Б.Середенин, Б.А.Бадыштов, Н.В.Колотилинская, С.А.Надоров, М.А Яркова // Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного общества фармакологов, 21-25 апреля

2003, Москва. - М., 2003. - С. 160.

26. Середенин, С.Б. Изучение спектра фармакологического действия нового ноотропного средства Ноопепт. [Текст] / С.Б.Середенин, Г.Г.Незнамов, Б.А.Бадыштов, Н.В. Колотилинская, С.А.Надоров, М.А. Яркова // Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного общества фармакологов, 21-25 апреля 2003, Москва. —М., 2003. - С.161.

27. Яркова, М.А. Ладастеи - новый психотропный препарат, обладающий психостимулирующими и анксиолитнческими свойствами. [Текст] / М.А.Яркова, М.В.Воронин, С.Б.Середенин // Материалы научно-практической конференции Медико-бпологнческне науки для теоретической и клинической медицины, посвященной 40- летню МБФ, 2003, Москва,- М., 2003. - С. 109.

28. Незнамов, Г.Г. Ладастеи - перспективное средство коррекции астенических нарушений, развивающихся в экстремальных условиях. [Текст] / Г.Г.Незнамов, С.А.Сюняков, С.А.Гришин, Е.С.Телешева, В. Бочкарев, М.А.Яркова, Середенин С.Б. // Сборник научных трудов симпозиума, посвященного 75-летню ГосНИИ ВМ «Боевой стресс: механизмы стресса в экстремальных условиях». Под ред. И.Б.Ушакова и Ю.А.Бубеева. - М., 2005. - С. 142-144.

29. Kolotilinskaya, N. Phase-1 investigation of selective anxiolytic afobazole. [Text] / N. Kolotilinskaya, B. Badyshtov, A. Makhnycheva, S. Nadorov, M. Yarkova. / Abstract of the 8th ECNP Regional Meeting, April 2005. Moscow, Russia. // European Neuropsychopharmacology. -Vol. 15. - Suppl. 2.-S 161.

30. Yarkova, M. Anxiolytic properties of afobazole in comparison with diazepam. [Text] / M. Yarkova / Abstract of the 8th ECNP Regional Meeting, April 2005. Moscow, Russia. // European Neuropsychopharmacology. - Vol. 15. - Suppl. 2.- S 145.

31. Yarkova, M. Ex vivo investigation of afobazole effect on H3-diazepam binding by synaptoneurosomal membranes of inbred mice and rats. [Text] / M. Yarkova, M. Voronin / Abstract of tlie 8th ECNP Regional Meeting, April 2005. Moscow, Russia. // European Neuropsychopharmacology. - Vol. 15. - Suppl. 2.- S144.

32. Yarkova, M. The psychopharmacological analysis of Ladasten effects. [Text] M. Yarkova, M. Voronin / Abstract of the 8,h ECNP Regional Meeting, April 2005. Moscow, Russia. // European Neuropsychopharmacology. - Vol. 15. - Suppl. 2. - S 145.

33. Середегаш, С.Б. Тревога и нейродегенерация, общие химические пути и возможности для фармакологической регуляции. [Текст ] / С.Б.Середешш, М.А.Яркова // Материалы 4-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 13-16 марта 2006. Москва, Россия,- М., 2006. -С.66.

34. Яркова, М.Л. Анксиолитические свойства и фармакологическая мишень афобазола. [Текст] / М.А.Яркова // Материалы 4-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительное™ к психотропным средствам», 13-16 марта 2006. Москва, Россия,- М., 2006. - С.84.

35. Zhanataev, A. Antimutagcnic and anticarcinogenic effects of afobazol. [Text] / A. Zhanataev, I. Ember, A. Dumev, M. Yarkova // Abstracts book of the 15th World Congress of Phamiacology, July 2-7, 2006. Beijing, China. - Beijing, China, 2006. - P.240.

36. Yarkova, M. The psychophannacological analysis of Ladasten effects. [Text] / M.Yarkova, M. Voronin // Abstracts book of the I5tli World Congress of Pharmacology, July 2-7, 2006. Beijing, China.- Beijing, China, 2006. - P.74.

37. Богдан Н.Г Особенности влияния Ладастена на психофизиологические показатели здоровых добровольцев с различным уровнем стресс-устойчивости [Текст] / Богдан Н.Г., Надоров С.А., Бадыштов Б.А., Яркова М.А., Колотилинская Н.В., Левина МП,, Посохова С.Т., Середенин С.Б. / Материалы III съезда фармакологов России. Фармакология -практическому здравоохранению. 23-27 сентября 2007 года. Санкт-Петербург, Россия. // Психофармакология и биологическая наркология,- 2007. - Т. 7. - Спец. Выпуск. Часть 1. - С. 1613-1614.

38. Надоров, С.А. Сравнительное (с плацебо) изучение действия антиастенического препарата Ладастен на умственную работоспособность здоровых добровольцев [Текст] / С.А. Надоров, Н.Г. Богдан, Б.А. Бадыштов, М.А. Яркова, Н.В. Колотилинская, М.В. Левина, С.Б. Середенин / Материалы III съезда фармакологов России. Фармакология - практическому здравоохранению. 23-27 сентября 2007 года. Санкт-Петербург, Россия. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7. - Спец. Выпуск. Часть 2. - С. 1868.

39. Yarkova, М. Experimental pharmacogenelic evaluation of Ladasten action [Text] / M.Yarkova, L. Kolik, S.Seredenin // Abstract book of the Sixth Annual Pharmacogenetics in Psychiatry Meeting, April 13-14, 2007. New York, USA. - New York, USA, 2007. - P. 2.

40. Bogdan, N.G. Prediction of mental fatigue development on healthy people by psychological tests parameters [Text] / N.G.Bogdan, B.A.Badyshtov, N.V.Kolotilinskaya, M.A.Yarkova, S.B.Seredenin / Abstracts of the 14th World Congress of Psychophysiology, 8-13 Sept. 2008. St.

Peterburg, Russia // The International Journal of Psychophysiology. - St. Peterburg, Russia, 2008. -Vol. 69.-№3.-P. 255.

41. Bogdan, N.G. Differences in Ladasten influence on psychophysiological parameters of healthy volunteers at presence and absence of mental fatigue [Text] / N.G.Bogdan, M.A.Yarkova,

B.A.Badyshtov, N.V.Kolotilinskaya, S.B.Seredenin // Abstracts book. The 3rd China-Russia International Symposium on Pharmacology, June 10-12, 2008. Harbin, China. - Harbin, China, 2008.-P. 25.

42. Seredenin, S. Complex interaction with sigma-1, melatonin MT1 and MT3 receptors and MAO accounts for the selective anxiolytic and neuroprotective effect [Text] / S. Seredenin, G. Neznamov, M. Yarkova, M. Voronin, T. Zenina, V. Kraineva, D. Sapozhnikova, T. Seredenina, M. Balasanyan / Abstracts of the XXVI CINP Congress, 13-17 July 2008. Munich, Germany. // The International Journal of Neuropsychopharmacology. - 2008. - Vol. 11. - Suppl. 1. - P. 275.

43. Chekina, K..S. Decrease in benzodiazepine binding is a possible sign of fear and anxiety [Text] / K.S. Chekina, M.A. Yarkova // In abstract's book. The 9th World Congress of Biological Psychiatry. June 28-July 02,2009, Pans, France. - Paris, France, 2009. - P. 372.

44. Yarkova, M.A. Novel selective anxiolytic Afobazol prevents stress-induced decrease of Benzodiazepine binding [Text] / M.A. Yarkova, K.S. Chekina, S.B. Seredenin / Abstract of the 9th International forum on mood and anxiety disorders, Monaco, France. 11-13 November 2009. // International Journal of psychiatry in clinical practice. — 2009. - Suppl. 1. - P. 46.

45. Вахитова, Ю. Стрессиндуцнрованное падение бензодиазепиновой рецепции и ее фармакологическая коррекция [Текст] / Ю. Вахитова, Р. Ямидаиов, М. Яркова, М. Воронин,

C. Середенин / Материалы конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 1-4 июня 2010 г. Москва, Россия // Экспериментальная и клиническая фармакология. Приложение. - 2010. - С. 31-32.

46. Можаева, Т. Синтез и фармакологическая активность основного метаболита афобазола [Текст] / Т. Можаева, И. Рыбина, В. Лезина, М. Яркова / Материалы конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 1-4 июня 2010 г. Москва, Россия // Экспериментальная и клиническая фармакология. Приложение. - 2010. - С. 64.

47. Попова, Е. Особенности спектральных характеристик вариабельности сердечного ритма у крыс с различным феноотипом эмоционально-стрессовой реакции на фоне афобазола и феназепама [Текст] / Е. Попова, Н. Каверина, М. Яркова / Материалы конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 1-4 июня 2010 г. Москва, Россия // Экспериментальная и клиническая фармакология. Приложение. - 2010. - С. 73.

48. Чекина, К. Новый подход к типированию беспородных мышей по стрессоустойчивостн [Текст] / К. Чекина, М. Яркова, С. Середенин / Материалы конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 1-4 июня 2010 г. Москва, Россия // Экспериментальная и клиническая фармакология. Приложение. - 2010. - С. 92-93.

49. Яркова, М. Стрессиндуцнрованное падение бензодиазепиновой рецепции н ее фармакологическая коррекция [Текст] / М. Яркова, К. Чекина, С. Середенин / Материалы конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным

средствам». 1-4 июня 2010 г. Москва, Россия // Экспериментальная и клиническая фармакология. Приложение. - 2010. - С. 10.

50. Yarkova, М. Study of benzodiazepine reception in mice C57B1/6 and Balb/c depended on kind of stressing exposure and pretreatment anxiolytics [Text] / M. Yarkova, K. Chekina, S. Seredenin / Abstracts. XXVII CINP World Congress, June 6-10 Hong Kong. // The International Journal of Neuropsychopharmacology. - 2010. - Vol. 13.-Suppl. SI. - P. 122.

51. Seredenin, S. Multitarget effects of anxiolytic [Text] / S. Seredenin, M. Voronin, M. Yarkova / Abstracts. 16th IUPHAR World Congress of Basis and Clinical Pharmacology, July 2010 Copenhagen, Denmark. // Basic & Clinical Phamiacology & Toxicology. - 2010. - Vol. 107. -Suppl. 1.-P. 2120.

52. Tallerova, A. The study of effects of psychotropic drug Ladasten on LSP-induced changes cytokines profile and behavior in mice C57B1/6 [Text] / A. Tallerova, E. Kovalenko, M. Shipaeva, M. Yarkova, A. Durnev, S. Seredenin / Abstracts. 16th IUPHAR World Congress of Basis and Clinical Pharmacology, July 2010 Copenhagen, Denmark. // Basic & Clinical Phannacology & Toxicology - 2010. - Vol. 107. - Suppl. 1. - P. 2253.

53. Yarkova, M. Study of benzodiazepine reception in C57BI/6 and Balb/c mice [электронный ресурс] / M. Yarkova, S.Seredenin / Abstract 28th CINP World congress of Neuropsychophannacology, 2012, Stockholm, Sweden URL: http://wwwl.cinp-congress.org/gues t/AbstractView?ABSID=987.

54. Яркова, M.A. Анализ бензодиазешшовой рецепции у беспородных мышей, разделенных по фенотипу эмоционально-стрессовой реакции [Текст] / М.А.Яркова, И.В.Рыбина, Н.Г.Богдан // Материалы IV съезда фармакологов России. 18-21 сентября 2012 г., Казань, Россия,- Казань, 2012.-С. 207-208.

55. Богдан, Н.Г. Влияние Ноопепта на психофизиологические функции здоровых добровольцев [Текст] / Н.Г.Богдан, Н.В.Колотнлинская, Б.А.Бадыштов, М.А.Яркова // Материалы IV съезда фармакологов России. 18-21 сентября 2012 г., Казань, Россия,- Казань, 2012.-С. 22.

Патенты

56. Патент Российской Федерации №2061686. Производные 2-меркоптобензимидазола, обладающие селективной анксиолнтической активностью. / Бледнов Ю.А., Середенин С.Б., Савельев B.JI., Можаева Т.И., Орлова Е.К., Яркова М.А., Рагимов Х.С. //Бюллетень изобретений - №16 - 10.06.1996.

57. Патент Российской Федерации №2175229. Анксиолнтическое средство. / Середенин С.Б., Яркова М.А., Бадыштов Б.А., Пятин Б.М., Авдюиина Н И., Морозов И.С., Воронина Т.А., Пезнамов Г.Г. //Бюллетень изобретений - №30 -27.10. 2001.

58. Патент Российской Федерации №2261709. I Гснхостимулирующсе средство./ Середенин С.Б., Бадыштов Б.А., Воронина Т А., Незпамов Г.Г., Козловская М.М., Левина М.Н., Рыбина И.В., Яркова М.А., Пятин Б.М.// Бюллетень изобретений - №28 - 10.10.2005.

59. Патент Российской Федерации № 2373202. Замещенные2-[2-(3-оксоморфолнн-4-ил)этилтио] бензимидазолы обладающие анксиолнтической активностью. / Середенин С.Б., Можаева Т.Я., Виглинская А.О., Яркова М.А., Колыванов Г.Б., Жердев В.П., Литвинов А.А.//Бюллетень изобретений - № 12 - 27.04.2009.

Список сокращений

on -тест «открытое поле» ЭСР

ПА -периферическая активность в ГАМК

ОП

ЦА -центральная активность в ОП 5-НТіа, ге

Ц -число заходов в центр ОП CRF,

ВА -вертикальная активность pCREB

ОДА -общая двигательная активность 35S-TBPS

IIKJI -тест «приподнятый PRIP

крестообразный лабиринт

КХ -тест «контакт с хищником» ССКьССІ

ГП -тест «горячая пластинка» D,,D2

ВП -тест «вынужденное плавание» А,, А,

ТСК -тест «темно-светлая камера» МТЬ МТ3

Им -тест «иммобилизация» МАОд

ІІТ -низко-тревожные IP,

ВТ -высоко-тревожные

-эмоционально-стрессовая реакция

-у-амино-масляная кислота

-рецепторы серотонина

-рецептор рилнзинг-фактора

кортикотропина

-camp response element

binding protein

-35s-t-

butylbicyclophosphorotli ionate -phospholipase-c-related catalytically inactive proteins -рецепторы холецистокшпша -рецепторы дофамина -рецепторы аденозина -рецепторы мелатонина -моноаминоксидаза типа А -inositol trisphosphate

Подписано в печать. 12.11.2011г. Формат 21x29,7/4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 2103 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39