Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Свободнорадикальный статус клеток крови и костного мозга у детей с острыми лейкозами и анемией Фанкони

т5 оа

? ? •

На правах рукописи ЧИВИЛЕВА ИНГА ЮРЬЕВНА

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ СТАТУС КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА У ДЕ ТЕЙ С ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ И АНЕМИЕЙ ФЛНКОНИ

14.00.29. - Гематология и переливание крови 03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Детской гематологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Л. Г. Коркина; Е. В. Самочатова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Р. В. Ленская; А. И. Деев

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт Физико-химической медицины Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

Защита состоится "_"_1996 года на заседании диссертационного совета Д. 084.64.01. Научно-исследовательского института Детской Гематологии (Москва, 117513, Ленинский пр., 117)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан "_

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А. Е. Бухны

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Острые лейкозы являются самыми частыми опухолями у детей. Изучение патогенеза острых лейкозов и использование современных терапевтических подходов привело к определенным успехам: в настоящее время излечению поддаются более половины заболевших. Однако проблема развития рецидивов, в том числе и поздних, наступающих через несколько лет после достижения ремиссии, так же, как и проблема вторичных опухолей, остается далеко не решенной. Причиной этих явлений может быть неполная элиминация опухолевых клеток в результате проведенной терапии либо сохранение условий для развития исходной или вторичной опухоли; проведенные курсы химио-и радиотерапии могут сами по себе индуцировать вторичный неопластический процесс.

Очевидно, что в этиологии неопластического процесса многое до сих пор не выяснено. По одной из существующих гипотез, вероятной причиной индукции и промотирования опухоли являются свободные радикалы кислорода (СРК) (Burdon R. Н., 1990-1992). Эти активные в химическом отношении агенты могут прямо или опосредованно взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами, белками и липидами, оказывая тем самым влияние на генетический материал клетки, изменяя активность ферментов и проницаемость клеточных мембран. В результате взаимодействия СРК с цитоплазматическими факторами регуляции генома возможна активация онкогенов и ингибирование антионкогенов (Borrello S. et al., 1993). Наряду с этим кислородные радикалы :пособны напрямую активировать гены и транскрипционные факторы, контролирующие рост, дифференцировку, развитие, метаболизм и' эазмножение клеток (Crawford D., 1988; Orrenius S„ 1993).

В нормально функционирующих клетках зукариотов и прокариотов образование кислородных радикалов, которое происходит при те^ствии различных эндо- и экзогенных факторов, сопровождается сомпенсаторным усилением антиокислительной защиты клеток и вне-слеточного вещества. В совокупности параметры, характеризующие штенсивность процессов образования и элиминации свободных ради-салов, определяют свободнорадикальный статус (СРС) отдельных тка-ieii и организма в целом. К системе антирадикальной защиты относят-:я такие ферменты, как медно-цинковая (С^пСОД) и марганцевая МпСОД) супероксиддисмутазы, каталаза, глутатионпероксидаза, глу-атионредуктаза, белки и олигопептиды, связывающие ионы металлов : переменной валентностью (церулошшмин, трансферрин, ферритин, [льбумин), а также ряд низкомолекулярных соединений, таких как глу-атион, мочевая кислота, витамины с антиоксидантной активностью.

По современным представлениям разнообразные условия, при которых происходит нарушение исходного баланса в работе проокси-дантной и антиоксидантной систем, что приводит к увеличению некомпенсированного уровня свободных радикалов, могут стать причиной развития неопластического процесса (Breimer L. Н., 1990; Burdon R. Н„ 1990; Cerutti Р. А., 1991; Oberley L. W., 1979, 1984). Ряд авторов исследовали показатели СРС в опухолевых клетках и в нормальных тканях организма-опухоленосителя, такие как интенсивность образования свободных радикалов или активность антиокислительных ферментов, особенно МпСОД. Было выявлено снижение активности МпСОД в опухолевых тканях (Marlhens F., 1985; Oberley L. W., 1979). Это явление связывается некоторыми исследователями с опухолевым фенотипом (Oberley L. W., 1984). Марганецсодержащая супероксид-дисмутаза (МпСОД) расположена в митохондриях клеток и может быть индуцирована разными физико-химическими факторами, такими как тепло, ионизирующее излучение, цитокины, химиотерапевтические препараты (Wong G. Н. W., 1988-92). Активность МпСОД в клетках опухоли отличается от таковой в окружающих тканях, она может меняться в процессе развития опухоли и под влиянием проводимой терапии. Гак описана потеря активности фермента в опухолевых клетках на поздних этапах неопластического процесса, в то время, как на ранних его стадиях активность МпСОД даже превышала нормальную (Ланкин В. 3., 1976).

В последние годы появилось много работ о СРС опухолевых клеток как в экспериментальных, так и в клинических условиях (Вялушкина М. Д., 1973; Asoh К.., 1989; Baud L., 1989; Cerutti P. А., 199!; Kizari М., 1993; Kokoglu Е., 1989; Masotti L.( 1988; Sun Y„ 1990; Wasosier W., 1989; Yamanaka N., 1979). Интерес к данной проблеме определяется в основном стремлением получить новые знания о патогенезе опухолевого процесса, определить роль и место СРС в цепи событий. ведущих к развитию опухолевого клона, развить новые патогенетические методы терапии опухолей.

Вышесказанное определило наш интерес к изучению СРС клеток крови и костного мозга у детей с острыми лейкозами в динамике заболевания и проводимой терапии. С этой точки зрения крайне интересным» представлялись состояния высокого риска заболевания лейкозами, в частности, при анемии Фанкони.

Цель исследования: изучить особенности свободнорадикального статуса клеток костного мозга и крови (продукцию свободных радикалов и активность антиокислительных ферментов) у больных острыми лейкозами и анемией Фанкони. Определить их патогенетическое значение и прогностическую ценность.

Задачи исследования

1. Разработать доступный, дешевый, быстрый и воспроизводимый лабораторный микрометод определения активности Мп- и CuZnCCVl в лейкоцитах крови и костного мозга.

2. Оценить показатели СРС клеток крови и костного мозга у детей с острыми лейкозами (OJIJI и ОМЛ) в первом остром периоде до начала противолейкозной терапии, а также в динамике заболевания и терапии.

3. Исследовать СРС лейкоцитов крови детей, больных анемией Фанкони, до и в ходе лечения, а также до и после трансплантации костного мозга (ТКМ). Провести сравнительное исследование СРС Лц крови у доноров костного мозга.

4. Исследовать особенность индукции марганцевой и медно-цинковой СОД в лейкоцитах крови здоровых лиц, больных анемией Фанкони и их родственников.

Научная новизна

При решении поставленных в работе задач исследования впервые были показаны:

- значительные изменения в уровнях продукции СРК, а также активности Мп- и Си2пС0Д в опухолевых клетках периферической крови и костного мозга у детей с острыми лейкозами в первом остром периоде до начала терапии по сравнению с лейкоцитами крови доноров;

- выявлена динамика изменений СРС лейкоцитов крови в ходе проводимой химко- и радиотерапии у детей с ОЛ;

- особенности СРС и индукции МпСОД в лейкоцитах крови детей с анемией Фанкони и их родственников.

Научно-практическое значение

Разработан новый комплекс микрометодов клинико-лабораторного обследования детей, страдающих серьезными гематологическими заболеваниями, который позволяет наблюдать за эффективностью проводимой терапии и осуществлять ее своевременную коррекцию; он позволяет также в определенной степени прогнозировать исход заболевания. Разработанный метод позволяет оценивать состояние детей, входящих в группу риска по лимфопролиферативным заболеваниям.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены:

1. International Conference on Clinical Chemiluminescence. Berlin,

1994;

2. International Conference on Natural Antioxidants and Lipid Peroxidation in Atherosclerosis and Cancer. Helsinki, Finland, 1995;

3. На межлабораторной конференции НИИ ДГ МЗ МП РФ, Москва, 1995 год.

з

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ и одна принята в печать.

Структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение; обзор литературы; описание используемых в работе материалов и методов исследования, результаты собственных исследований; обсуждение результатов; выводы и практические рекомендации; список литературы. Работа содержит 20 таблиц и 32 рисунка. Диссертация изложена на......страницах машинописного текста, библиография включает 208 источников, из них 196 зарубежных.

Работа выполнена в лаборатории биофизики и биохимии клеток крови НИИ ДГ МЗ и МП РФ (зав. лаб. проф. Л. Г. Коркина).

Клинический материал и методы исследования

Для определения контрольных значений исследуемых характеристик обследовано 39 практически здоровых детей, 14 девочек и 25 мальчиков в возрасте от 4 до 14 лет (медиана 9 лет), проживающих в Москве. У всех детей не было выявлено признаков острых и обострения хронических заболеваний, показатели общего и биохимического анализа крови находились в пределах возрастной нормы. В течение месяца дети не принимали препаратов, оказывающих влияние на исследуемые нами параметры. Эти дети составили контрольную группу.

Исследование показателей у детей с заболеваниями крови проводилось в клинических гематологических отделениях РДКБ г. Москвы.

Первую группу обследованных составили 16 детей в возрасте от 1 года до 16 лет с острыми лейкозами (ОЛ), поступивших в гематологические отделения с предположительным диагнозом "острый лейкоз" и не получавших противолейкозной терапии в момент обследования.

Диагноз ОЛ был подтвержден на основании анализа костного мозга, полученного пункционно из грудины или из подвздошной кости. Проведен подсчет миелограммы, проанализированы цитохимические характеристики лейкозных клеток для определения формы ОЛ (реакции на ми.елопероксидазу, Судан черный В, на гликоген, активность неспецифической эстеразы с ингибированием фтористым натрием). Вариант острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) определен с помощью иммунофенотипирования с использованием стандартной панели антител на приборе FAC SCAN.

Костный мозг исследован у 13 детей 2-ой группы; у 11 диагностирован ОЛЛ и у 2 больных - ОНЛЛ (острый нелимфобластный лейкоз). У 6 из них одновременно исследованы клетки периферической крови. У 3 больных ОЛЛ до начала лечения исследованы только клетки крови.

В 3-ю группу вошли 27 детей с ОЛ в ремиссии, в 19 случаях диагностирован ОЛЛ, в 8 - ОНЛЛ. Наряду с этим 13 человек с ОЛЛ и 5 с ОНЛЛ были обследованы в ходе проведения краниального, облучения

(доза 12-18 грей, аппарат Со-60). Эти дети получали препараты с ан-тиоксидантным действием Unizinc и бионормалайзер (BNL).

Обследовано 8 больных АФ: 5 мальчиков и 3 девочки в возрасте от 6 до 14 лет, 4 здоровых родственника детей с АФ.

Диагноз анемии Фанкони был установлен на основании типичной клинико-гематологической картины заболевания: множественные соматические аномалии в сочетании с гипоплазией кроветворения. Диагноз подтверждался цитогенетически на основании значительного увеличения клеток с хромосомными аберрациями (в лимфоцитах периферической крови).

5 детей были обследованы до терапии и 4 - на лечении метандро-стенолоном. Трое детей исследованы в динамике - до терапии и после 4+6 месяцев ее получения. Двум детям с АФ проведена успешная алло-генная ТКМ. Показатели СРС клеток крови исследованы до ТКМ, через 4+5 месяцев после ТКМ и у доноров костного мозга.

Образцы крови пациентов получали пункцией локтевой вены, образцы костного мозга - пункцией грудины с последующей стабилизацией их в гепарине. Суммарную фракцию лейкоцитов (Лц) выделяли на смеси 6% декстрана и 33% метризоата натрия, дважды отмывали в физиологическом растворе NaCl и осаждали центрифугированием 15 минут при 1500 об/мин. Подсчет Лц производили в камере Горяева при разведении клеток водным раствором метиленового синего с 3% уксусной кислотой.

Хемнлюминесцентный анализ

Для исследования генерации свободных радикалов кислорода лейкоцитами периферической крови и костного мозга использовали метод хемилюминесценции (ХЛ). Интенсивность ХЛ регистрировали на люминометре LKB 1251 (Швеция). 0.1 млн Лц вносили в полисте-реновую измерительную кювету, содержащую 800 мкл среды для измерения с люминолом, рН 7.4. Содержимое кюветы непрерывно автоматически перемешивалось и термостатировалось при 37°С. Через 3 минуты измеряли интенсивность спонтанного свечения (1хл споит.), посте чего к суспензии клеток добавляли активатор окислительного мета-эолизма - 20 мкл 5% суспензии Latex с размером частиц 0.9-1 мкм или 10 мкл 1 мкг/мл форболмиристатацетата (ФМА) в ДМСО. При взаимодействии активатора с клетками в кювете развивается люминол-¡ависимая ХЛ, свидетельствующая о генерации кислородных радика-10в 02: и ОН. клетками. Регистрировали максимальную интенсивность жтивированного свечения (1хл акт.), которая является информативным показателем метаболической активности Лц. Поскольку зсновной вклад в клеточную ХЛ обусловлен в основном нейтрофила-ии, то приводимые в работе значения ХЛ пересчитывали на миллион >тих клеток.

Активность СОД в эритроцитах измеряли с помощью люциге-шш-зависимой XJI, позволяющей оценивать образование 02- радикалов - субстрата СОД (Misra и Fridovich, 1972; Черемисина 3. П., 1989).

В данной работе был разработан новый высокочувствительный специфический метод определения активности CuZn- и МпСОД в лейкоцитах крови человека. Предварительно были подобраны оптимальные условия выделения чистых лейкоцитов, получения лизатов и выделения из них СОД-содержащих образцов. Суммарную фракцию Лц предварительно освобождали от примеси эритроцитов гемолизом красных клеток с 3-кратным объемом дистиллированной воды в течение 10 минут на льду. Тени эритроцитов и вышедший из них гемоглобин убирали центрифугированием. Осадок Лц дважды отмывали 0.9% раствором NaCl и затем разрушали с помощью 0.5% детергента тритон Х-100. Для получения СОД-содержащего образца к 1 мл лизированных Лц добавляли 0.5 мл смеси хлороформ-этанол (3V/5V). После интенсивного встряхивания эту смесь центрифугировали 15 минут при 12000 об/мин. СОД-активность определялась в верхнем прозрачном суперна-танте. Для определения активности МпСОД в Лц СОД-содержащие образцы инкубировали с 4мМ цианидом натрия в течение 10 минут при 4°С. При этом происходило полное ингибирование СиЕпСОД.

Количество белка в образцах определяли по микробиуретовому методу Lowry (1959).

Результаты исследования и их обсуждение Исследование СРС клеток крови и костного мозга у больных OJI в первом остром периоде до начала противолейкозной терапии

Поскольку костный мозг больных ОЛ в остром периоде представлен почти тотально бластными клетками, исследование этого субстрата имеет принципиальное значение при изучении этиологии неопластического процесса.

У 11 детей с OJ1J1 и у 2 детей с ОН Л Л интенсивность спонтанного и активированного свечения клеток костного мозга были значительно снижены по сравнению с такими же показателями для Лц крови доноров. Значения активности С^пСОД и МпСОД в лейкозных клетках костного мозга на порядок превышают контрольные значения. (Таблица 1).

В Лц крови детей с ОЛ до начала терапии также наблюдалось снижение уровня генерации СРК и повышение активности CuZn- и МпСОД по сравнению с контролем. Между этими показателями, измеренными параллельно в Лц крови и в клетках костного мозга, обнаружены прямые корреляционные зависимости: для спонтанной ХЛ значение коэффициента корреляции (R) равно 0.97 при уровне достоверности

б

Таблица 1. Показатели СРС Лц крови и клеток костного мозга детей с ОЛ в первом остром периоде заболевания и в ремиссии

объект исслед. диагноз 1 хл спонт., м В/млн клеток 1 хл актив. мВ/млн клеток МпСОД нг/мг белка СигпСОД нг/мг белка

в первом остром периоде заболевания, до начала терапии

костный мозг ОЛЛ ОМЛ 9 13 . 68 171 905±696 1359±1010 770±421

кровь ОЛЛ ОМЛ 30 45 460 666 619±333 1163 699±417

после X. т. после обл. после X. т. после обл. после х. т. после обл. после х. т. после обл.

кровь ОЛЛ ОМЛ 792 1445 1056 628 9193 16700 12017 11657 148±118 37±19 163±89 162±86 117±101 60±52 137±85 85±26

кровь доноры 290 5287 210±146 85±55

В таблице приведены медианы значений 1 хл на млн нф для крови, на млн клеток для костного мозга и средние значения активности СОД.

(В) 0.99; для активированной ХЛ 11=0.98, при В=0.99. Высокий уровень достоверности (В=0.9) наблюдается также для корреляции активности марганцевой СОД в этих типах клеток (11=0.78).

Эти данные показывают, что в опухолевых клетках костного мозга сильно изменен СРС, поскольку явно выражен дисбаланс про-оксиданты/антиоксиданты: на фоне подавленной генерации СРК клетками чрезмерно увеличены активности Си2пС0Д и МпСОД.

Можно было предположить, что между содержанием бластов в крови и активностью СОД также должна наблюдаться прямая зависимость, а между содержанием бластов и продукцией СРК лейкоцитами -обратная. Действительно, такие зависимости были найдены (рис. 1, 2).

I

Рис I Зависимость активное™ марганцпой СОД ■ Лц кртии от процентного солержлмнв балетов в периферической крови у детей с леикоммн в первом остром периоде мбшкмкмя.

Рис. 2 Зависимость интенсивное™ ХЛ Лц врови, зцгтивнровж латексом, от процентного содержания бластов » периферической в у детей с лейкозами в первом остром периоде таболсванив.

Исследование динамики показателей СРС лейкоцитов крови у детей с ОЛ в ходе лечения

У обследованных 27 детей с ОЛ после проведения интенсивной химиотерапии по протоколу ВИМ наблюдалось обновление клеточного состава крови. Выход в ремиссию характеризовался полным отсутствием бластных клеток в периферической крови детей. Анализ показал, что на этом этапе Лц новой генерации сильно отличаются от бластных клеток по показателям СРС.

При ОМЛ и ОЛЛ при выходе в ремиссию наблюдалось значительное увеличение как спонтанной, так и активированной ХЛ нф, превышая эти параметры бластных клеток более чем в 25 раз. Существенно, что в Лц новой популяции показатели СРС не только нормализовались, но и превышали контроль почти в 3 раза. Возможно, это усиление метаболической активности клеток - компенсаторная реакция на уменьшение их количества после терапии. (Таблица 1).

Оценка активности антиокислительных ферментов в Лц крови у этих детей показала, что в группе ОЛЛ в ремиссии активность Мп- и С^пСОД практически не отличалась от показателей доноров. У детей с ОМЛ в ремиссии активность медно-цинковой и марганцевой СОД в Лц была достоверно ниже контрольных значений. Поскольку потенциально лейкозными клетками для ОМЛ являются клетки миелоидного ряда, то состояние окислительного стресса (повышенная продукция СРК и снижение активности СОД) может иметь для них неблагоприятные последствия.

Влияние облучения на СРС лейкоцитов у детей с ОЛ

В практике лечения острых лейкозов для предотвращения развития нейролейкозов наряду с эндолюмбальной химиопрофилактикой часто используется облучение головы. Известно, что ионизирующая радиация является одной из причин окислительного стресса в клетках, что может привести к нежелательным последствиям, из которых главным является поражение головного мозга с развитием краниального отека и явлений энцефалопатии. Кроме того, облучение может вызывать развитие вторичных опухолей различной локализации.

Действительно, у всех 13 детей с ОЛЛ и у 5 детей с ОМЛ после облучения головы нф крови продуцировали в 2.5 раза больше СРК, чем в контрольной группе. И это не зависело от характера изменения этого показателя в каждом конкретном случае. (Таблица 1).

Вместе с тем активность СОД в Лц крови после облучения достоверно не отличалась от контрольных показателей.

Для снижения риска возможных нежелательных последствий радиотерапии дети профилактически получали нетоксичную и хорошо усваиваемую пищевую добавку "бионормалайзер" (В1МЬ), содержащую

природные антиоксиданты (Santiago L. A. et ai., 1991; Osato J.A. et al., 1995).

У 13 больных ОЛЛ обследовали СРС клеток крови до и после облучения, из них 6 принимали бионормалайзер в течение 7-19 дней до облучения и 7 - не принимали. Сравнение этих двух групп показало, что ХЛ активированных нф крови у принимавших бионормалайзер детей после облучения было в 1,8 раза ниже, чем у детей, которые не принимали BNL. Таким образом, применение бионормалайзера до облучения снижало интенсивность клеточного радикалообразования, то есть тормозило развитие окислительного стресса, вызванного этой процедурой.

Комплексное обследование показало терапевтический эффект BNL для предотвращения развития энцефалопатии, связанной с облучением головы (Korkina L.G. et al., 1995).

Похожие результаты были получены в работе от применения другого коммерческого препарата - Unizink (производство фирмы Dr.K.ohler GmbH, Германия). Известно, что ионы цинка обладают способностью изменять активность ферментов систем генерации свободные радикалы, также как и антиоксидантных ферментов. Они могут также снижать скорость образования наиболее опасного в биологическом отношении гидроксильного радикала (Afanas'ev et al., 1995).

5 детей с ОЛЛ получали Unizink в течение 2 недель после облучения и двое - месяц после облучения. Статистически значимые изменения показателей СРС были отмечены только после месячного применения этого препарата. При этом спонтанная и активированная ХЛ нф, повышенные в результате облучения, снижались до контрольного уровня, активность МпСОД и Си2пСОД в Лц достигали контрольных значений.

Для всех больных острыми лейкозами, независимо от курса лечения, активность CuZnCOfl, содержащейся в эритроцитах, практически не изменялась.

Исследование СРС лейкоцитов крови детей с анемией Фанкони

Было обследовано 5 больных АФ до лечения. У 3 детей была снижена активность МпСОД и у 4 - CuZnCOД в Лц по сравнению с донорами. Через 4-5 месяцев после начала лечения метандростеноло-ном у одного из 2 детей (Аг-н) наблюдалось повышение активности обеих СОД в Лц. По клиническим и гематологическим показателям лечение проходило эффективно. У второго больного (Юс-ов) такая же терапия эффекта не имела: уровни активности лейкоцитарных СОД оставались низкими. Двое других детей были обследованы в ходе лечения метандростенолоном. Шус-ва, у которой лечение проходило эффективно, имела высокую активность обеих СОД в Лц, а Лощ-нин, у

которого длительное лечение не имело эффекта, показывал низкую активность МпСОД в Лц. Данные приведены в таблице 2.

Таблица 2. Изменение активности СигпСОД и МпСОД в лейкоцитах крови больных анемией Фанкони

№ Фамилия Лечение МпСОД сигпсод Клинич.

нг/мг белка нг/мг белка эффект

1 Р-тов до лечения 607 306

2 Лиф-ов до лечения 207 322

3 Шайд-ва до лечения 37 41

4 Хам-ва до лечения 20 15

5 Аг-н до лечения 7 10

МаСт 304 910 есть

6 Юс-ов до лечения 135 46

МаСт 176 78 нет

7 Шус-ва МаСт 177 1827 есть

8 Лощ-ин МаСт 55 207 нет

Эти результаты указывают на принципиальную возможность индукции активности лейкоцитарных СОД метандростенолоном. И если эта индукция происходит, то наблюдается и положительный лечебный эффект.

У двоих детей (Хам-вой и Лощ-на) показатели СРС крови были измерены в динамике: до и после аллогенной трансплантации костного мозга (аллоТКМ). У больного Лощ-на до ТКМ спонтанная ХЛ нф бы-' ла в пределах контрольных значений; ХЛ нф, при активации латексом, была в 5,2 раза (на 81%) снижена по отношению к контролю, а ХЛ нф, активированных ФМА, была в 8 раз ниже контроля (на 88%). Активность МпСОД в Лц была низкой, а Си2пС0Д, напротив, превышала контрольные значения. Данные - в таблице 3.

Следующее измерение параметров СРС было проведено через 5 месяцев после аллоТКМ, при нормализации состояния больного и показателей гемопоэза. Одновременно была обследована сестра Лощ-на -донор костного мозга. Показатели ХЛ нф и активности лейкоцитарных СОД больного и его сестры к этому времени практически не отличались друг от друга и соответствовали контрольным показателям.

У Х-вой спонтанная ХЛ нф крови до аллоТКМ была очень высокой, в 5 раз больше контроля. Показатели активированной ХЛ были также увеличены: при активации латексом ХЛ нф превышала контроль в 6,8 раз; а активированная ФМА - в 12 раз. Активность лейкоцитар-

п

ных СОД была крайне низкой: Си2пСОД - ниже на 76%, а МпСОД -ниже на 90% по сравнению с контрольным уровнем. Через 4 месяца после ТКМ, в состоянии полного восстановления гемопоэза, уровень продукции кислородных радикалов Лц крови снизился. Спонтанная ХЛ уменьшилась по сравнению с исходной в 2,8 раза, но все еще превышала контроль. ХЛ нф, активированных латексом, хотя и снизилась в 2,1 раза, но также осталась выше контроля. Аналогичные результаты получены при активации клеток ФМА, в этом случае ХЛ по сравнению с исходной уменьшилась в 2,4 раза. После ТКМ у этой больной активность обеих СОД в Лц крови значительно выросла и стала соответствовать контрольному уровню. Такой же анализ был проведен с Лц брата Х-ва - донора костного мозга. Основные показатели ХЛ нф у него превышают контрольные значения, как и у больной через 4 месяца после ТКМ; активность Мп- и СигпСОД в Лц крови брата находилась в пределах контрольных значений.

Сопоставление результатов этих двух случаев показывает, что через 4-5 месяцев после проведения аллоТКМ больным анемией Фан-кони их костный мозг функционирует нормально и показатели СРС клеток крови соответствуют таковым у доноров костного мозга.

In vitro влияние повышенной температуры, диэпоксибутана и бнонормалайзера на индукцию МпСОД и С^пСОД здоровых детей, больных АФ и их родственников

In vitro исследовали изменение активности МпСОД и Си2пСОД в Лц при действии факторов, способных влиять на систему адаптации к окислительному стрессу. В качестве таких факторов были выбраны: 1) диэпоксибутан (ДЭБ), 2) бионормалайзер (BNL) и 3) температура 42°С. ДЭБ является кластогенным агентом, вызывающим разрывы ДНК и хромосомные мутации (Auerbach A. D., 1989). Поскольку кластоген-ный эффект ДЭБ является кислород-зависимым и ингибируется экзогенными СОД, каталазой и другими ловушками свободных радикалов, мы предположили, что ДЭБ будет оказывать влияние на систему адаптации к окислительному стрессу на уровне генома, в частности, будет влиять на индукцию МпСОД. Известно, что BNL in vitro усиливает генерацию супероксидных радикалов Лц крови и способен индуцировать образование TNF и интерферона клетками (Osato G. А. et al., 1995). Данные цитокины являются, в свою очередь, индукторами эндогенной МпСОД в лейкоцитах мышей и человека (Wong G.H.W, et al., 1988, 1992). При действии температуры 42°С в клетках активируется синтез белка теплового шока (HSP) и одновременно МпСОД. Эти белки закодированы в одном генетическом локусе (Flories & McCord, 1995).

Таблица 3. Показатели СРС лейкоцитов крови детей с АФ до и после аллогенной ТКМ

Клеточная ХЛ, мВ/млн нф МпСОД в Лц СигпСОД в Лц

Фамилия Дата Обследование 1 спонт. 1 акт. латекс 1 акт. РМА нг/мг белка нг/мг белка

Хам-ва 13.04.94 до ТКМ 1438 36087 19060 20 15

20.03.95 через 4 мес. после ТКМ 513 16787 8087 320 128

брат 13.04.94 190 10364 2458 152 134

(донор к.м.)

Лощ-н 06.09.94 до ТКМ 133 1019 198 55 207

20.03.95 через 5 мес. после ТКМ 184 6248 1856 202 574

сестра 08.09.94 163 6237 1107 285 569

(донор к.м.)

В кашей работе образцы цельной крови инкубировали в присутствии или отсутствии этих агентов в течение 1 часа, затем из крови выделяли Лц и далее из них СОД-содержащие экстракты. Активность СОД измеряли, как описано в методике.

Инкубация крови при температуре 27° и 42°С без добавок, в присутствии и отсутствии ДЭБ или BNL, проводилась у 4 доноров, 2 детей с АФ до ТКМ, 2 детей с АФ - через 4-5 месяцев после ТКМ (3 измерения), а также у 2 здоровых родителей детей с АФ. Полученные результаты представлены на рисунке 3.

Из них видно, что повышенная температура, ДЭБ и BNL in vitro очень по-разному действуют на Лц крови здоровых доноров и детей с анемией Фанкони - выявленные изменения активности МпСОД разно-направлены. В здоровых Лц все три фактора вызывали увеличение активности фермента (на 100, 31 и 79% соответственно). Напротив, в Лц больных детей выявлено резкое снижение активности МпСОД при действии ДЭБ и BNL (на 50 и 51% соответственно) и ее неизменность при 42°С.

После ТКМ у детей с АФ ДЭБ и BNL мало или совсем не влияли на активность МпСОД в Лц. В то же время при действии 42°С на Лц после ТКМ отмечено значительное возрастание активности МпСОД -на 63%, аналогично тому, что наблюдалось с клетками доноров, где рост активности фермента составил 100%.

Измерение активности CuZnCOД в Лц крови показало, что этот фермент при тех же условиях изменяется в значительно меньшей степени, чем МпСОД.

Следует отметить, что характер изменений активности МпСОД .в Лц крови детей с АФ и их родителей был одинаковым, но противоположным тому, что наблюдалось с клетками здоровых доноров.

Анализ предварительных данных in vitro с АФ указывает на то, что в Лц крови детей с АФ нарушен механизм индукции МпСОД -важного звена в системе адаптации к окислительному стрессу, который имеет место при этой патологии. Похоже, что нарушение происходит на уровне генома, на что указывает сравнение данных опытов с клетками крови их родителей и доноров.

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ МпСОД, У.

+ 100°/

+31%

+79%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60

-1%

19%

¡¡¡is

42°С ДЭБ

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ CuZnCOfl, •/.

BNL

' I г

о%

о%

0%

0%

42°С

ДЭБ

BNL

Рис. 3. Ишенение активности МпСОД и СигпСОД в J1Ц крови in vitro под влиянием температуры, ДЭБ и BNL

Группы детей

1. Здоровые дети, п=4

2. Дети с анемией Фанкоии до ТКМ, п=2

3. Дети с анемией Фанкоии через 4+5 месяцев после ТКМ, п=2

Выводы

1. Разработан сравнительно простой и воспроизводимый комплекс микрометодов оценки свободнорадикального статуса лейкоцитов крови и клеток костного мозга детей.

2. В бластных клетках у детей с острыми лейкозами в первом остром периоде до начала терапии активность МпСОД в 3 раза и С^пСОД в 7 раз превышают контрольные показатели. Одновременно снижена спонтанная и активированная продукция свободных радикалов кислорода клетками периферической крови, в среднем в 10 раз. Выявлена высокая корреляция продукции свободных радикалов кислорода бластами крови и костного мозга (11=0.97) и активности МпСОД (11=0.78) в этих клетках.

3. В состоянии клинико-гематологической ремиссии ОЛЛ и ОМЛ продукция кислородных радикалов в лейкоцитах крови повышается по сравнению с контрольным уровнем в среднем в 1.5 (ОЛЛ) и 3 раза (ОМЛ). Активность МпСОД и С^пСОД при ремиссии ОЛЛ достигает контрольных значений, а при ремиссии ОМЛ статистически достоверно снижена по сравнению с контролем в 5 раз.

4. В лейкоцитах детей с АФ до лечения отмечено состояние окислительного стресса. Продукция свободных радикалов кислорода лейкоцитами крови, а также активность МпСОД и Си2пС0Д частично нормализуются при успешном лечении метандростенолоном. Аллоген-ная трансплантация костного мозга больным анемией Фанкони приближает показатели свободнорадикального статуса лейкоцитов крови к таковым у доноров костного мозга.

5. В лейкоцитах больных анемией Фанкони и их родственников нарушен генетический контроль индукции основного антиокислительного фермента - МпСОД.

Практические рекомендации

1. Использование высокочувствительных методов определения свободнорадикального статуса у больных острыми лейкозами и анемией Фанкони можно рекомендовать для прогноза течения заболевания и оценки эффективности лечения.

2, Оценка свободнорадикального статуса клеток крови позволяет проводить индивидуальный подбор препаратов для снижения повреждающего действия АФК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Chemiluminescent assay for measuring human leukocyte Mn 2+ superoxide dismutase activity. - Abstracts of International Conference on Clinical Chemiluminescence. Berlin, - 1994. - P-016. (with Cheremisina Z.P., Suslova T.B., Korkina L.G., Samochatova E.V.)

2. The effects of Zn2+ and Bio-normalizer on the free radical status after therapeutic irradiation/ - Nutrition-1995 - v. 59, n. 12, p. 13-15 (with Korkina L.G., Osato G.A., Afanas'ev I.В., Cheremisina Z.P., Samochatova E.V.)

3. Effects of natural antioxidants and zinc ions aganst oxidative stress induced by the accidental and therapeutic irradiation. - Analyst-1995-v. 121-n. 12- p. 24-26 (with Korkina L.G., Snigiryeva T.V., Deeva I.В., Ibragimova G.A., Cheremisina Z.P., Afanas'ev I.B., Osato G.A.)

4. Activity of MnSOD and production of superoxide radicals in the blood and bone marrow leukocytes in children with leukemias. - Abstracts of International Conference on Natural Antioxidants and Lipid Peroxidation in Atherosclerosis and Cancer. Helsinki, Finland,-1995-PA A7. (with Cheremisina Z.P., Samochatova E.V.)

5. Does oxidative stress play a causal role in chromosome instability in Fanconi anemia? - In Proceeding of XHIth Meeting of the International Society of Haematology. Istanbul, Turkey. -1995. (with Korkina L.G., Cheremisina Z.P., Degan P., Pagano G., Afanas'ev I.B.)

6. Preventive effects of Bio-normalizer (natural food supplementation) эп toxicity induced by therapeutic irradiation.-In "Natural antioxidants and lealth effects" (ed. L.Packer). -1996 (в печати) - (with Osato G.A., Cheremisina Z.P., Korkina L.G., Samochatova E.V.)