Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клиническое значение состояния системы оксиданты-антиоксиданты у детей с болезнями крови

' 9 .

министерство здравоохранения РОССИИ научно-исследовательский институт детскоп гематологии

Ил руколча:

УДК 516.053.2-02:6! 4.Ы7си-07.

слмсчлтооа

ел ПИЛ владимиров!! •*.

клиническое значение состояния системы оксиданты - лнтпоксидлнты у детей с болезнями к роли

14.00.С9. - педиатрия

34.00,29. - гематологе? а переливание

крови

Диссертация на соискание умной степени доктора медиитских няу: форме ПЕсшмренкого докладл

;

М.-ККЧА 1992 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте детской гематологии Министерства здравоохранения России.

Научные консультанты:

доктор медицинских каук. профессор А. Г. Румянцев; доктор биологических наук Л. Г. Коркина.

Официальные оппоненты Доктор медицинских наук, а;садемик РАМН, профессор й Е. ВельтищеВ Доктор медицинских наук, профессор И. Е Кошель; Доктор медицишшх наук, заслуженный деятель науки Российской Федерации, профессор Ю. Н. Токарев.

Ведущее учреждение Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится " // " ^¿Л / 1992 г. в часов

на заседании специализированного Совета Д. 084.61.01. при Научно-исследовательском институте детской гематологии МЗ России (117513, г. йэсква. Ленинский проспект, д. 113).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ детской гематологии МЗ России.

Диссертация разослана "____"___ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук, профессор А. Е. Бухны.

ВВЕДЕШЖ

Важнейшее звено гомеостаза живых бксеь'стем - окислительно-восстановительный баланс. В ходе реакций с участием кислорода образуется энергия, необходимая для большинства процессов, идупдх в живых клетках. Нзбс г.мпая часть кислорода (1-2%) при этом превращается в ьысокореактогенные свободно-радикальные соединения (CP) - активные формы кислорода (АФК).

Действие CP неспецифично и повсеместно, в некотор!^ процессах АФК играют ведущую роль, в других - едва заметны. Вездесущность, с одной стороны, короткая экспозиция и близко-дистантность, глубокая " законспириросакность" - с другой, являются причиной скептического отношения ¡Уфокого круга биологов и медиков к сЕсбоднорадикальным проблемам. Однако, пс?ле того, как в 50-ме годы Сила выдвинута гипотеза о ролл АФК в осуществлении токсического действия кислорода (R. Gorschnan и D.Gilgert, 1954 г.), ссоОодкорадикалышя биохимия раз^лза^ась чрезвычайно успешо.

Доказана роль АФК в действии ионизирующего излучения на биологические системы, разработаны теории ивободкорацккального механизм-! старения (D. Нагпап, 1956,1981, J. Fleming, 1986) к мутагенеза (L. Obsrly. 1981). Определена роль АФК в процессе гемолиза (R. Carrel, 1975 ), синдрома реперфузии и патогенеза ayvo-имунных заболеваний (В. НаШтеП, 1984). С конца 60-х годов после открытия Фридовичем супероксиддис.утазы, активно исс.>:::-дуется система антиоксидантной (АО) защиты (I.Fridovich, li&J. А. М-Michel son, 1978, 1984).

Список болезней, в патогенезе которых участрувт С?, юе расширяется, также Kai; и перечень препаратов я биологичзсьчк соединений, обладающих АО свойствам:?. Однако неследоьоние свободно радикальных процессов биохимики и биофизики нередко ча-дут з отрыве от клиники, прорыв з теории свободнорзддаш'.коЯ химик ке нашел пса отражения а гслиничесгссй практике', По определено значение и роль АФК в нермэ и при разнообразно., патологии, плохо изучена возможность и- необходимость корргюш свсбоднорадпкальной продукции, езмо поняти«:- свободнсрздикаяь-

ной патологии для многих остается весьма спорным.

Отдавая должное роли АФК в ряде биологических реакций (особенно в обеспечении занятных функций нейтрофилов через механизм "дыхательного взрыва"), понимание значения этих процессов как основополагающих для существования прежде все клеток крови (наряду с другими) происходит с трудом.

Это делает исследование окислительного обмена при ряде гематологических заболеваний у детей актуальной теоретической к практической задачей детской гематологии.

цель и зддош

Целью работы явилось определение роли АФК, соотношения их продукции и элиминации в патогенезе болезней крови у детей и разработка рекомендаций терапевтической коррекции выявленных изменений.

Исходя из поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить закономерности продукции А® лейкоцитами крови у здоровых лиц, при различных патологических состояниях теыо-позза ( гемолитические анемии, аплазии кроветворения, острые лейкозы) и функциональных расстройствах кроветворения, связанных с действием малых ;,сз радиации;

- определить качес-гьенпьй спектр ' продуцируемых АФК в норме и при вышеуказанных заболеваниях;

- выявись количест ;вкные различия в способности к продукции АФК лейкоцитами крови при использовании различных фо-тосенсибилизаторсз и активаторов;

- исследовать активность основных ферментов АО защиты клеток крови и определить их значение в развитии патологического процесса;

-• провести возможные корреляции выявленных характеристик окислительного обмена с развитием и течением изучаемых болезней; ■

■ - исходя из выявленных особенностей СР продукции при заболеваниях крови у детей разработать и апробировать методы медикаментозной коррекции с помощью препаратов, обладающих АО

активностью; оценить их эффективность в ходе динамического обследования больных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

- Впервые изучены показатели продукции АФК - количественные и качественные - клеткаш крови (лимфоцита?.« и граьу-лоцитами) у здоровых детей и при реактивных состояниях.

- Определен характер изменений продукции АФК клетками крови при различных гемолитических анем::ях.

- Впервые выявлены закономерности продукции AJK лейкоцитами крови при анемии Фанкони (АФ> - изменение способности к активации изучаемых реакций и особенности спегггра продуцируемых АФК; проведена корреляция особенностей окислительного обмена с течением и прогнозом болезни.

- Показано значение АФК для способности к Вгшзанга и пролиферации в условиях in vitro клеток-предшествэнников фиб-робластов костного мозга больных АФ.

- Выявлена однонаправленность измзпений характера продукции АФК лейкоцитами кровк у детей, «ивуют в условиях действия мапых доз радиации, что вырагается в снижении спссои-ности к активации радикальных реакций при исходно высоком уровне образования АФК.

- Впервые описаны закономерности продукции КШ властными клеткаш костного мозга и крови при ОЛ, выявлены лейкозш» клетки о лимфоидным иммукефенотипом и способностью к образованию фагосом и проду;ощи А4К.

- Предложено теоретическое обоснование необходимости терапевтической коррекции нарушений продукции АФК с использованием препаратов различной направленности - ингибиторов продукции, инактиваторов и "ловупек" CP, хелаторов железа.

- Доказана необходимость изучения продукции АФК гемопоэ-тическимй клеткаш и состояния ДО зашиты при кироксм круге болезней крови для раскрытия патогенеза йак отдельных си> атомов и осложнений, так и заболевания в целом.

ШОТИЧЕШШ ЗКДЧЕШЗ РАБОТЫ •

1. ГазраСотаны принципы изучения продукции АФК клеткаый Kpoí vi -л оценки клинического значения полученных показателей, что дас? возможность использовать их в комплексе определена тяжести '.сечения и прогноза болезни - при гемолитических анемиях, АФ, острых лейкозах.

2. Изучзнпе характера продукции А® лейкоцитами крови детей, зяязущнх в загрязненных радионуклидами районах, позволяет определить различные факторы риска - по развитию "сво-боднэрадниалыюй пшологии" или формированию группы часто болеющих детей, что требует дифференцированных методов коррекции.

3. Использование нетоксичных АО препаратов без кумулятивного действия у больных с гемолитическими анемиями, ЛФ позволяет просолить патогенетически обоснованное эффективное лечение.

Апробация работы. Основные положения работы долозшны на заседаниях секция гешатолс„"оа Московского общества педиатров (1987, 1989, 1900, 1991 гг. У, на VI, VII и VIH Всесоюзных семинарах "Кислородные рчдикалч в химии, биологии и медицине" (1987, 1988, 1989 гг.), на Московском научном обществе гематологов и трачсфузиолот ,в (1908г.), на Ыеждународной школе-. "Свободные радикалы в хшш, биологии и медицине" (Ленинград, 1991г.), на Международном семинаре "Современные проблема лейкемии'ЧС. Петербург, 1992г.).

Внедрение в практику. Рекомендации по диагностике и коррекции свободно-радикальных расстройств при гемолитических анемиях, аплазиях кроветворения, лейкозах и расстройствах, вызванных инкорпорированными радионуклидами, внедрены в практику работы отделения общей гематологии и онкогематологии РДКБ Минздрава РФ, отделения гематологии 1 ДКБ ГУ2Ы, санатория "Васильевское" (реабилитация детей,' пропивавших на территориях РФ, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС). Материалы диссертации используются в лек-

циях и практических занятиях для студентов на кафедрах педиатрии и ФУВ Российского государственного медицинского университета.

Работа выполнена в Институте детской гематологии Минздрава РФ ка базе Республгесалской датской ¡шп1«ч?ской бсльню;^ (гл. врач к. м, н. Дроздов В. X ) и Детской клинической болыг.чцы N1 ( гл. врач Еорнпаин ÎL А. )

Обследование Сольных проводилось с гсгюлъзовением комплекса клинических, инструментальных, цитологических, циуоге--кстических, культуральных, биохимических и биофизических методов в клинических подразделениях ■•■.хститута, а лаборатории патогенеза пнезюкониозов 1Щ Российского госудерстсэкного мздкщшского универс1гге?а ( зав. аксдм*кк Россия, проф. Взличгсоеский Б. т. ) и биофизики у, биохимии клеток кроен НШ ДГ ( зав. д. б. н. Коркина JL Г. ), гетскоЯ гематологии при кафедр? педиатр™ Н1 РГМУ ( зав. д. б.п. Лзникая Р.В.). лаборатории цитогв/гаиЕ« Института 4зрмз!от;:огкк F.lîîH м. и. Дурнев

А. Д.} н ГЗШ ДГ ( зав. д. и. я., проф. Куле ¡топ ILE), патолог:-^ эритрона и обмена железа Ш<К ДГ ( зав. д. м. и., прсф. Toranes НЕ), регуляции кроветворения БШ ДГ (зав. к. м. Эаулраовз . RE), цитологии и глекгропяой микроскопии НИИ ДР ( Д. и. 11. . прсф. Банил а В. ) , ЙЬЫУЯЕОДЮТЙОСПЯО! и иу?<унноло-:«■;-ческого мониторинга гемсАласгозов НИИ ДГ (¿av.. к. к и, Байдун ЛВ.).

■ НТКРШТЗ^Я СТГДЕГД

Кислород, являясь идеэ.ънш аквдгпторси электронов, окисляет сложите соединения с ооргооаэиием м&фогрггпгесю-ах ко.- з-куа, поставляй®!* энергию цлл гизкокоательиссти клеток и тканей. 1'олэкула кислорода (02) в основном состоянии Kv>er 2 кеспарекных эяе.-ггропа с оздааковыын. юйшами на равных орЗяти-. лях, что обеспечивает згой ьголекуле стабильность к оелыгу» знергоо?.&сосгь. Напше кс-опаренкого электроки или • домене,«;» направлений сппка делао? мох.екулу кислорода высскоргсктс еч-:юЛ, образуются ективниз $ор.м «гдалсрода (Л-ЯХ).

98Г кислорода в организм чйsosera в обычных условиях

полностью восстанавливаются каталитически через цепь цитохро-мов с участием цитохромоксидаз с образованием воды. 1-2% подвергается неполному восстановлению с образованием радикальных и норадикальных A3>It суиероксида (0£), перекиси (Н2). гидрокснльного радикала ( ОН * ). синглетного кислорода

(/°-2)- S ^ + н+ё

р2---> Н ---> Н0.Г1>ё> Нг0

°2 + Ш2. + Н """> + го^ + ^н* —> н^о^ + ог

Ok" + HjO^ ---> 0Н«+ 0Н"+ Oz

U2°2 Wft Ш"+ F°3+

Соединения с неспаренным электроном - свободные радикалы (CP) постоянно образуется в организме в ограниченных количествах по ходу практически всех окислительно-восстановительных реакций и играют ваетую ( не всегда видимую) роль на всех этапах существования клетки. Невидимому, именно CP обеспечивают конечное зффекторное звено многих биофизических процессов - от стимуляции клетки к определенным превращениям до необратимых изменений клеточки'-, структур, ведущих к утарте функций, старению и гибели. (D. Н=ачгйп,1985 )

Дейетвиэ CP соединений ьеспецифично по своей природе, эффект зависит от места доЛ'^'бия, его силы и характера лиган-да и акцептора, что обуславливает многообразие эффектов сво-боднорадикальных реакций. '

Для развития свободнорадикальной биологии важное значение имело раскрытие механизма действия ионизирующей радиации как преимущественно радикального (D.Lea, 1946, Е.Wills, 1964, G. Spinks, R. Woods, 1976).

Валным этапом в изучении значения АФК было открытие системы антиоксидантнэй (АО) защиты. В 1969 г. Оридович было доказано существование высокоспецифического фермента суперок-сиддисмутазы (СОД), в присутствиии которой происходит инакти-вирование оЬ

ДИСМУТАЦИЯ СУПЕРОХСИДЛ

2 Н, ♦ О; ♦ О2 ц2о3

/ \ ая-

.2*

ОН • ♦ ОН" ♦ Л20 -г- О,

Повреддающее действие А® ограничивается не только СОД, существует многокомпонентная антиоксидантная система, которая включает АО ферменты - СОД, каталазу, глютатиоклероксидазу и редуктаэу,' и неферментатипнкз АО - церулоплазмин, трансфер-рин, мочевину, аскорба?, билирубин, глютатиоа -л др.; очень многие биологические соединения обладают антиокеидзнтной активностью с различными точками приложения:

ДНК

реУ1 о2 * пг02 —-р о2 ♦ ОН" ♦ ОН "

СОД КАТ. гс**тоги Ре пд«<мгаи " ^^ _

гл-цсрпн »»"»ии" е

дмсо

Сбалансированность образования и элиминации АФК обязательное условие нормальной шзнедеятельностч аэробов.

Свободно-радикальные процессы в Гематологии.

Предположения о роли СР в регуляции ' гемопозза пека не получили неоспоримых 5ксперименташ>ных доказательств, но имеется ряд фактов, подтверэдавдих вьшесказакное:

- 10 -

1. Известно значение напряжения кислорода в культуральных системах при культивировании геыопоэтических клетск как фактора, изменяющего способность роста клеток - предшественников й культурах (н. Joenie, д. Aostra, 1983, G. Hengenstad et al, 1986).

2. Описано изменение способности роста фибробластов при добавлении антиоксидантов в культурную систему (ß. Murrell et al, 1989).

3. Известно действие лейкотриенов и простатландинов на пролиферацию и дифференцировку геыопоэтических предшественников (Р.Reizenstein et al, 1992г.). В цепи образования этих соединений по цикло - или ко липоксигеназному путям продуцируется большое количество АФК. Имеются такле сообщения о сво-боднорадикальных механизмах действии in vitro ряда интерлей-кинов и колокиестимулируюцих факторов (Р. Zibby, 1985, Т. Matsubura, 1986).

4. Клеточные мутации могут быть результатом свободноради-калыюго повравдешш ДНК (C.Moody, Н. Hassan, 1982); дальнейший рост опухоли идет также с участием этих образований - на уровне, например, регуляции скорости пролиферации (L. Qberley et al,1979, К. Natahara et cu, 1984, С.Grocnstock, 1986). Показана способность фпбро0л;.стов и макрофагов костного дазга к выработке АФК (G.Murrsll et al, 1S89). Активация мли угнетение этого процесса вледствие действия различных факторов может проявиться в конечно." результате развитием гипоплазии или •„ опухоли кроветворной системы.

Геыопоэтическая система - уникальный симбиоз кроветворной. и строгальной ткани; последнюю называют "микроокрулением" (МО) гемопоэза, тем самым уже терминологически определяя ее как-Оы второстепенную роль относительно кроветворения. Между тем такое разделение задач по важности для всей биосистеш искусственно. Доказано значение строки в регуляции гемопоэза, главным образом поддержания его постоянства. Стромальные элементы довольно жестко локализованы, и их действие осуществляется в основном за счет прямых межклеточных взаимодействий или продукции близкодействующих медиаторов- ростовых факторов (РФ). интерлейкинов (ИЛ), лимфокинов. Эти факторы реализуют

активацию пролиферации, дифференцировки и улучшают выживаемость гемопозтических предшественников. Ключевым компонентом ¡слеточной сети Ш являются макрофаги. Они продуцируют му ль импотентный грануло-моноцитарный (ГМ) и мсжпчгграий колониести-мулирующне факторы (КСФ), интерлейкин 1 и iv:<?op некроза опухоли. ИЛ-1 в свою очередь индуцирует выработку других интер-лейкинов Т-клетками и РЗ>-стромцльннш клетками. Мгт'.изм клеточных взаимодействия далеко пе раскрыт. Несмотря на низкое относительное содержите ¡¿акрофэгальтг,; эд-зментов в костном мозге, экспериментально показано, что количественные и качественные- их изменения нарупаят гемопоэз (S. Rccctai et. al, 1989, A. HsKintosh et al,193i). Бегl экого:риментальш« подтверждения, что иигибирукедге действие гакрофяго:. опосредуется через АФК (К. Jacob et al,. 1920).

Роль гемопозтической " надстройки" для строка изучена ¡'•ало, очевидна трофическая функция, известно регулирующее действие факторов, вырабатываеьах гемопоэтиуеокимя клгтками, на продиферацию и дифференцлровку МО - например, мегакарисш?-тов для роста фибробластов и ihpaScvcii ими коллагена.

Взаимодействие гемопозза и строш - суть взаимной регуляции, нврупение равновесия леяге в основе падохогйи кроветворения. Немаловажная роль в этом процессе принадлежит МИ,

Участие в осуществлении физиологических функций 1слсток крови.

Наиболее изучена роль АФЕ для фушщионирования грануло-цитов и макрофзгот?. Установлено, чтонейтрсфилы, эезинофплу и моноциты крови, тканевые макрофаги и. строуаышые клетки способны генерировать больше количества oj"n Н^О^в процессе своей жизнедеятельности и резко усиливать этот процесс под действием многих факторов (F.Rossi et al, 1980, R.Allen et al, 1972, B.Babior et al, 1973).

В результате "дыхательного взрыва" гранулоциты осусг ггв-ляют функцию фагоцитоза и бактерицидиости (P.Eellavite. 1988). Оли содержат специфические гранулы, з которых локализуются ферменты, обеспечивающие химические реакции с образо-

\

ванием свободно-радикальных соединений (Б. К1еЬапо!Т,1992).

Механизм активации окислительного метаболизма фагоцитирующие клеток сложен и многоступенчат - от момента действия на рецепторные локусы мембраны, трансмембранной передачи сигнала с участием кальциевых каналов и последующего запуска цепи рекщий с участием каскада белков, фосфолипидов и ферментов, основными из которых являются МАБРН-оксидаза, ксантинок-сидаза (КО), липо- и циклоксигеназы (ЛОДО). Продукция А® в плазму и межклеточную жидкость приводит к повреждениям в мембранах других клеток и ускоряет их старение и гибель. Наглядным примером та^-ого процесса является разрушение эритроцитов в синусах селезенки.

Лимфоциты в состояниии покоя продуцируют А® в следовых количествах, но при взаимодействии с лектинами, иммунными комплексами и метками-мишенями может происходить активация этого процесса. Если фагоцитирующие клетки филогенетически являются самым древним неспецифическим элементом защиты живого от экзои эндогенных воздействий, где ведущая роль принад-лежит-СР соединениям, то. лимфоидная система с ее вьюокоспеци-ализированныыи функциями иммунитета, для осуществления которых развиты сложные механизмы восприятия и ответа, возникла много позднее, 5 и на определенных этапах это были клетки со смешанными свойствами. У высших организмов неспецифические механизмы, связанные о образованием АФК,' не определяют функциональной активности ли? ^¿оцитов при том, что существуют воз-' можности активации этих процессов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Мы провели комплексную оценку спосбобности клеток: крови к продукции АФК и состояния АО защиты с анализом клинических параметров и течения болезни у детей с различными болезнями системы крови (анемиями, лейкозами, предлейкозными состояниями). В развитии которых предполагается участие свободноради-кальных механизмов, а также у детей с реактивными изменениями гемопоэза без четкоочерченной патологии. Оценка результатов невозможна без сравнения с аналогичными показателями у прак-

- 13 -

тически здоровых детей и взрослых.

Характеристика больных и методов исследования

Закономерности продукции АФК клетками гемопоэза изучены в результате обследования более 250 детеЯ и взрослых, на основании чего разработан комплекс необходимых методов, позпо -мякших оценить эти процессы по возможности болое полно и клр-регано. В ачэлиз мы еключклн показатели 214. человек: 118 детей и 3 взрослых с болезнями крови, 53 дете.Ч, дивуцих в .условиях загрязнения радионуклидами, И гоматолэгичеекч здоровых родственников больных анемией (Сакгани. Больные лечилась в гематологических отделениях РДКБ и ДНЕ N1. Группу сравнения составили 21 клинически здоровий ребенок в позрзсте от 0,5 до 15 лет, поступивши для плановых глазних или реконструктивных onepaiuifl, и 8 взрослых. Изучены таске характеристики клеток тимуса 3 Детей (тинуо удален во время опер?цяи на сердце).

Обследованы дети со следующими заболеваниям: системы гемопоэза: гемолитические анемии ( наследственные к приобретенные)" 2.6 детей, анемия Факкоки -18 детей и 11 гематологически здоровых сибсов, острые и хронические лейкозы - Сб человек, S детей с нейгропенией и 2 с инфекционным лимфоцитозом.

Во всех случаях проведено подробное клиническое обследование с изучением анамнеза, оценкой Физического и психического развития ( по перцеитильным скалам) и клинических симптомов - при поступлении под наблюдение и в динамике.

Стандартные методы обследования: клинический и биохимический анализы крови, исследование миелограмми с определением клеточности и клеточного состава,R-графия грудкой клетки, 2КГ и 3X0-КГ, УЗИ органов брюшной полости.

В зависимости от нозологии, комплекс обеледозанг;; раз.'.и - ' чадся: при гемолитических анемиях проводили определен;« осуо-резкстентности и диаметра эритроцитов,характеристики гемогло-бинов и ферментов эритроцитов,исследование показателей обмена железа: келеза сыворотки (по Genry), ферритина, трансферркка, уровня фетального гемоглобина ( Ветке); при аплазиях кроветворения в комплекс обследования включено гистологическое исследование костного мозга .

- 14 -

Верификация диагноза аплаетичеекой анемии проводилась с использованием цитогенетических методов: хромосомный анализ лимфоцитов периферической крови после 72-х часового культивирования с фитогемагглюгинином по методу Д. Hungerford и с тестом с Mytomycin С . Изучение колониеобразухцей способности предшественников гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ) и фиброб-ласт.'З (КОЕ-Ф) с помощью культуральных методов: КОЕ-ГЫ в системе "агаровая капля - жидкая среда" по Б. В. Афанасьеву с со-авт.. 1983г. и KOS-Ф по методу клоногенного культивирования по А. Я. <2риденштейну с соавт., 1970.

У больных лейкозами проведен цитохимический и цитоимму-нологкческий анализ клеток крови и костного мозга с использованием стандартного набора реакций ( активность мнелоперокси-дазы, зстерази с вариантом с NaF, ПИК-реакции) и реакций ро-зетксобразования, в ряде случаев - исследование фенотипа с помощью панели моноклолальных антител.

Лучение ультраструктуры лейкозных клеток проведено с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Исследование продукции АФК.

Объектом исследования служили периферическая кровь - у всех обследованных, и костей мозг - при лейкозах , полученные стандартно и помещена.;:- в среду 199 с гепарином.

Исследуемиз показатели определяли в цельных субстратах, в лейковэвэси после 2-краггого отмывания физиологическим рас-•„ твором и в клеточных су.пеизиях, выделенных на градиентах плотности по общепринятой методике (лимфоциты, нейтрофилы, лейкозныэ мэнонуклеары).

Для определения способности различных клеточных субстратов генерировать АФК использован метод хемилюминисценции (ХЛ). впервые предложенный R. Allen с соавт. в 1974 г.Иетод основан на возникновении сверхслабого свечения под действием продуктов неполного восстановления кислорода и их производных. При добавлении к " нативной" хемилюминисцентной системе некоторых соединений ( люминол, люцигенин) интенсивность светового эффекта возрастает и мозкет быть зарегистрирована. Показана специфическая чувствительность люцигенина к 0Г(Т. Hoyan

еЬ а1.. 1383 г., Д. Кагг et а1. , 1983 г.); интенсивность ХЛ в присутствии лшииола при физиологически;; значениях рн зант;с1гг преимущественно от образования НуО^и, слежоьателыю, ОН - -радикала (й. Мегепу е1 з1., 1935 г., К. йзгсъоу оЬ а1., 1957) Значителен вклад в лшинольную ХЧ сингле-гного г-мслорола. Метод позволяет быстро и с-высокой сдагенью чувствительности определять функциональное состояние клеток, всвуэякостн их активации и образования юс; А®.

Измерение бюоддогшшкецеиот исследуемых кя??ок доводили на лжминометрэ Ц<В-1251 (Швеция) в условиях стандартизации метода Оценивали количественное пшнагсглч и тшетику ХЯ-ответа при использовании различии;: »от.-аатсроп к чувствительность экспериментальной системы к добавлению в ере л? ьш-гибиторов и "ловушек" АФК (СОД, мгндагэла, рутина). Б качестве аггиватороп использовали частит? кремнезема (5)0.») размеров до.б- мкм, 'латекса (31 кита, США), ы-ю'а&пъъжлг Л (Рапгдсма, ФРГ). XI измеряли в условных единицах или в микровольтах (юу) ( в зависимости от регистрирующей анкартгуг?!) аьтоматччеом в цифровом выражении.

При исследовании цельной крови сделан пересчет по.?ус?й-ных результатов на 1 гранулоцкт. Данный показатель нельзя считать достоверным, ш ксполйзоволи его только для сравления у разных групп обследованных детой.

Вопрос о способности ЛНМч'гадНЫХ клагок продуцирогугь МК остается спорным,' су>гэотвует мнение, что при оцеш*е суспензии дт'фоцитов ХЛ регистрирует СБ прскикщно присутствующих вс взвеси гранулецитов и моноцитов. В каждом случае исследования лимфоидных клеток (крови и костного мозга) >и проьодилк сцек-ку выделенной суспензии на мазкох, ократзшгых по Романовскому и на активность мнелоперокеидайн, оттреле'ля гтримесь гранул*;?- ' цитоя, которые составляли не более 5%. Так как ганетика активированного ХЙ-ответа неГ.трофплов и лш.'фовдьы:: клеток имеет свои особенности, при исследовании клеток здоровых детей г.;><5-лизировали не только количественные результаты, но и ¡сш: гику ответа на активатор. Кинетика .ерзжых-. активации суспензий сч-деленных иейтрофалов и лимфоцитов имела качеств«-номе разлагая, свидетельствуя з пользу того факта, что АФК образуется

разными видах® клеток.

Необходимо отметить лабильность и чувствительность метода ХЯ, зависимость от условий опыта. Большое значение при проведении эксперимента имеет тщательность выделения клеток, оценка жизнеспособности и клеточного состава исследуемой суспензии (морфологическая, цитохш.;лческая), иначе 1штерпретация полученных результатов может быть ошибочной.

Определение активности АО ферментов эритроцитов.

Активность СОД эритроцитов крови определяли по методу N. Шз1ик1гп1 (1972) и по методу Н. М1зга,1987 ; активность ката-лазы в эритроцитах по О. Г.' Архиповой (1988г.) ; содержание гдютатиока, активность глютатионпероксидазы и глотатионредук-тазы по Е. Bout.ler.1975 г.

Математическая обработка результатов выполнена методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической величины (Ю и средней ошибки (м), коэффициента корреляции (г) и достоверности (р) с пошдыо стандартных формул. Различия считались достоверными при р менее 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИОСЛЖДОВАНШ!

1. Продукция АФК лейкоцитами здоровых людей

Продукция АФК изучалась методом ХЛ в'цельной крови (11 детей в возрасте от 5 юсяцав до 9 дет и 2 взрослых) и в суспензии лимфоцитов, получаема в результате выделения на градиенте плотности (11 детеЛ и 6 взрослых). Также оценивали показатели в суспензии тимоцитов, лимфоцитов крови больных ХЛЛ (В-клеточным), инфекционным лимфоцитозом и нейтропенией (суспензия зрелых лимфоцитов с соотношением Е4-Р0К и ЕАС-РОК как у здоровых детей) и в суспензии нейтрофилов, полученной после специального выделения на градиенте плотности в центрифуге с заданным температурным режимом.

Результаты ХЛ ответа лимфоцитов с различной иммунологической принадлежностью использованы для сравнения с показателями бластных клеток при ОЛЛ. Расчет ХЛ проведен на 10бядро-содержаших клеток.

- 17 -

Типичные кинетические кривые М ответов при использовании клеток крови доноров представлены на рис. 1. Они соответствуют результатам, полученным при обследовании бользоЯ группы взрослых ЗДОРОЕЫХ лиц Л.Г. Коркиной (1987 г.).

Количественные показатели ХЛ - спонтанной и активированной представлены ь таблицах 1 и 2.

100еу.

í мчи.

МАНН.

Рис. 1. Кинетика активированной ХЛ лейкоцитов крови здорового ребенка.

• Таблица 1. Показатели ХЛ клеток цельной крови (М + м)

п-13 человек

6

ХЯ шУ на 10 клеток

Акти-| ! Без актнштора | 1 На БЮ* Ьа1ех

вация| 1 Всего | 1 1 на 1 кф*| 1 1 . 1 Всего ! ! 1 на 1 нф Всего | на 1 нф

ХЛ | 1 144.2 | 3.23 3983.3 | 77.7 1743.41 36.9

1 1 1 1 ± 1 + + | +

М+м | 0.6 | ! 1.8 | 1 822.7 | 1 20.4 391.2! 7.45

* - кейтрофил

г ( ХЛ б/а - на ЗЮ2) - -0,09

г ( ХЛ б/а - ¿.а Ьа1 ) - 0,35

Корреляция исходных показателей ХЛ ции е ответ на отсутствует,на ЬаЬ ции положительный низкий.

(суммарно) и актива- коэффициент корреля-

Таблица 2.

М клеток крови (лимфоцигов, гранулоцггы) здоровых доноров.

Обгеит исследования | ХЛ иУ на 10° клегск .

1 эюг | 1 М+П» ( Сзп А ■

Доноры здоровые (лимфоциты) ' п-17 | 356.4 | 1 + 1 | 75.4 | 1 1 ' 181 + 51.3

Инф. ЛШ4фОЦИТОЗ, . нейтропения (лимфоциты) п-5 I 117.1 | ! ± 1 ! 28.2 | 1 I 1 1 40.75 1 11,5

Тиуоциты п-3 1 1а 1 +1.4 | ! 1 I 1 4.1 1 1. 4

ХЛЛ( В-клетки) п-3 | 74. 8 + 48. 6 | 1 1 18.1 +8.4

Нейтрофчлы Доноры здоровые . п-4 | 6877.5 I 1 1 1 | 202В. 2 | 1 1 1803.2 + 595.0

. На основании проведенных обследований модно зшиычмть следующее:

Клетки крови - нейтрофияы и лимфоциты - способны к спонтанному образования яродугщия увеличивается при активации' ¡слеток частицам кремнезема, лате:сеа, конканавалииом А.

ХЛ-ответ на активацию кремнеземом и Latex всегда выше, чем на Con А. Нет корреляции ыеаду Leличиной исходной продукции АФК и увеличением при активации SiO¿ .

Диапазон колебаний регистрируемых показателей значителен, но находился в определенных пределах, которые можно рассматривать как возможную корму для сравнения результатов, полученных у детей с болезнями крови. Лимфоидные клетки способны к -гктивации образования АФК (по данным ХЛ), интенсивность этого процесса невелика, колебания показателей меньше, чем у гранулоцитов; ХЛ-отвег на SiO^суспензии лимфоцитов выше, чем на Con А.

Самая низкая продукция АФК свойственна тимоцитам; также низкие показатели выявлены в популяции лимфоидных клеток при Е-клеточном ХЛЛ. В лимфоидных клеточных суспензиях примесь гранулоцитов не превышала 5%, в ряде случаев - 1-2%; кинетика ХЛ-ответов имела специфический характер, описанный как типичный для лимфоцитов (Коркина Л. Г. с соавт. ,1985).

Активность АО ферментов эритроцитов крови у обследованных 15 здоровых детей (1,5 -12 лет) и 8 взрослых составила: СОД - 3,34+0,28 мэкв/мг НЬ; каталаза- 14,1+2,4 ед.

Полученные показатели были отправными для сравнения всех последующих экспериментальных данных.

I. Гемолитические анемии: патогенетическое значение АФК.

Участие АФК в лизис? эритроцитов общепризнано,радикальный гемолиз изучен преимущгственно при гемоглобинопатиях (Е L Freeman, 1982 ,Ы. R. Clark ,1985).

В физиологических условиях ежедневно разрушается около IX "старых" эритроцитов. "Старение" эритроцитов - результат комплекса событий,включающего аутоокисление липидов мембран, дегидратацию и увеличение вязкости цитоплазмы.

В эритроцитах в ходе обмена гемоглобина (Гб, НЬ) постоянно образуются АФК (рис. 2.).

НЬРе**

дезлкск нь)

НЬГа"Ог О КС и нь>

НЬРа иотнь)

Г

НЬРэ'^О:» ,0'лсинЫ

/

супероксидо^)

геиих^ош'

1

иерояснд (нгог) Рис.2. Образование АФК в обыен? гемоглоСы^

По такому пути в норчэ оююляотся около 3% НЬ; /сношается эндогенное обрадовеж» АФК в эритроцитах под иоздейстьи-ем УХО, радиации, оксидаитов, при повыиении парциального напряжения кислорода. Накопление гемихрсмовв мембране эритроцитов увеличивает ее ригидность и хрупкость. По мере старей«, эритроцитов уменьшается активность фэрменюа АО защиты - СОД( неясно, колстествекный это дефицит или качественный), катачп-зы и ГП и. Р. Нот-лап, 1958, Р. I,. Ьа Се11е,196$?.Т. БсЬеда, Б. М. (?аророгЬ ,1981, Б. ВеиЬ1ег,1985). Это облегчает возмех-ность механического разрушения эритроцитов, дэлает уязвимыми для макрофагов с их способностью продуцировать АФК. показано-что ведущее значение в этом процессе принадлежит 0£н Н^О^, в защите важную роль играют ферменты, детоксищтоуюиие перокеид - каталаза, ГП.

Эритроциты существуют в аэробной среде, их мембраны содержат обилие ненасыщенных липидэв,. в состав Гб входит жело-зо. В процессе эволюции у них развилась мощная аитискемдлг:'-ная система, обеспечивающая относительное равновесие повре»-паюших и затд'ко-Еосстансвительных механизмов, (рис. 3 "АО систем эритроцитов".

Реакции ртох<ика- ' Няруииимл репарации * еса

•о, — : ~—.--

■»миис.ени

Пере-кись ъьм^

и,в,

катало^*

НЛО

гли/голм^

ЯГоЛ

_______

имя'

1МЧ> мунг

окис*, глютатиец

на ---а»н

^шыдг&^аиух

.от >____МАО»

' гл!^ шунт

Рис. 3. ДО системы эритроцитов.

При патологии происходи сдвиг равновесии. Нарушение его мозкат косить случайный характер и тогда довольно легко' кбрре-гируется. Повышение гемолиза и развитие гемолитической анемии (ГА) вызывают разные причины - аномалии строения мембран и цитоскелета эритроцитов, гемоглобинов, дефицит АО ферментов и т.д. (табл. 3).

В механизме гемолиза важная роль принадлежит АФК, продуцируемым гранулоцитами и макрофагами. В эксперименте 1 фагоцит ( персональный) способен повредить 10 эритроцитов, этот процесс можно предотвратить с помощью каталазы и ГП, но не СОД, что свидетельствует о том, что экзогенное действие на мембраны эритроцитов в большей степени оказывают Н^О^и гид роке ильный

радикал. Активация продукции АФК фагоцитами при бактериальных и некоторых вирусных инфекциях у детей с наелзглтяе'пг-г?,'™ гемолитическими анемиями любого генеза еыэыв<?.ъ>г ус-м/текн»? гемолиза и проявляется кризом.

Тсблипа 2.

Потенциальные причини гемолиза под действие;.* АФК (Р. V. СаггэП ^ а!.. 1975)

УВЕЛИЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ АШ.

С ЖШ5 АО ОД'ДИТЫ

Талассемические синдромы Нестабильные НЬ Приам оксидантов Высокая- температура

к

Ионы металлов го „ Си ПРЯШЕ ДЕПСТВИЕ АФК Радиация

Гипербарическая сксигекзция Свободный ясрфирик

Дефкадты: Гбч'ЛГ

Глызтион- персксий!'ла Глугагйои- редуктаэа Глхггзтион- си;!тет';;л Каталаза СОЦ У^ Е

Свободнорадикалыше механизм* могут иметь патогенетически

разное значение - в одних случаях как экзогенной иняГОГатор гемолиза при от!тос1ггелько нормальном окислитель в см метаболизме самих эритроцитов, например, при аутоиммунной ГА (АКГЛ>,геш-фагощг;а?ном синдроае, в других - ш эндогенная оссснциальпап первопричина болегня, вызывая такке изменения структуры зрят-роцитов, которые делают их узнаваемыми и уязвляю лл;< действия экзогенных (пасторов. { рис. 4)

Состояние актко;жиданткой защиты, в «асгкоста - яок ¿за-те.пл октушссти основных АС ф&риептоз СОХ я каталазы з ъоит-роцитах отрежет иаиргявнность окиелителышх реакций в лих. Изучение эткх показателей лае? -гзмоэтость сутгяь об участии

АФК в развитии гемолиза.

Рис. 4. АФК и гемолиз

Ыы обследовали 26 лат с гемолитическими анемиями различного генеза: наследственным микросфероцитозом (НМ)- 10 человек, гемоглобинопатиями - 10 человек, дефицитом Г6ФДГ ( 2 детей) н пируваткинаэы ( 1 больной), АИГА до начала лечения ( 3 детей).

Ш - классическая гемолитическая анемия, протекающая с кризами различной частоты и тяжести; симптомы НМ можно выявить в раннем возрасте, однако диагноз чаще ставится у детей после 2-х лет. Причиной повышенного разрушения эритроцитов является аномалия структуры цитоскелета мембраны, которая делает их нестойкими к изменениям осмотических условий. Мембрана эритроцитов повышенно проницаема для Ма+, в них усилен

гликолиз, необходимый для образования' достаточного для обеспечения адекватного обмена количества энергии; это требует больших количеств глюкозы я сопровождается продукцией Л®. Принципиальное значение для гемолиза име-ет действие экзогенных АФК 1сак причины повреждений Ю1ето'П!ой мембраны. Гемолиз сопровождается усилением продукции АФХ (распад Гб, перегрузка годовом, поступление пуринов в русло крови и последующие превращения с участием аденозиндезакклазы и ксантииоксидазы), т.ч. возникает порочный цикл: продукция гемолиз—>уси-

ление про дугами! ДОК— >... При Ш СР процессы игоают таким образом не этиологическую, но патогенетическую рс-ль.

Среди обследованных нами 10 больных НМ было 4 детей в возрасте до 1 года и 6 - старпе 2 лет. У детей до 1. года течение заболевания было тяяяльм, уровень НЬ во время кризов составлял 55-60 г/л, что требовало активной заместительной терапии к сопровождалось позкпением содержании сывороточного л»леза и ферритина. Двум детям по тякести состояния была произведена спленокгомия, дшад-эм^о/кзация селезенки с хорогпш гффегстом. У детей более старяего всзгаста (3-12 лет) теченго болезни было средней тялксти, с кризами 1-2 раза в год, редко трэбовавекми заместительной терапии.

Обследование проведено при поступлении в стационар до назначения заместительной терапии ( как минимум ч'ерез 2 месяца после предлествовавшел гемотрансфузии) и включаю обычно"; комплекс клинических тестов для уточнения диагноза и тяжести анемии и определение активности СОД и каголазы в эритроцитах крови.

Мы обследовали также детой с гемоглобинспатиями - 10 человек. Среди них было 3 ребенка с аномальным гомоглзби'юм возрасте 10-13 лет) и 7 детей с В-талаосемией (1,6-11 лет). Большая талассемия была у 1-го ребенка раннего возраста, у остальных - промежуточная форма. Заболевание имело типичное течение и клиническое оформление, все дети были трансфузк^ч-нозависимы. При обследовании отмечалась анемия ( от 57 до 104 г/л) с ретикулоцитозом, признаю? гемолиза и вторичного гек \<-роматоза. У этой группы больных проведено исследование показателей ХЛ в цельной крови I*. в суспензии отмытых лейкоцитов.

Полученные результаты отличаются тем, что у 4 детей активация в ответ на ЬгЛех в цельной крови была выше, чем в лейковзве-си, тогда как у всех других больных и здоровья детей отношения обратные: XI лсйковзвэси > ХЛ в отмытых клетках > ХЛ в цельной крови. Невидимому, у больных талассемией суммарная ХЛ цельной крови вшэ за счет продукции АФК эритроцитами.

Показатели активности СОЛ и каталаьы эритроцитов больных с НМ и с Гб-патиями представлены в табл. 4.

В таблицу также вклвчены показатели активности АО ферментов эритроцитов больных аутоимунной гемолитической анемией и здоровых детей - для сравнения.

Таблица 4.

Активность СОД и каталазы эритроцитов у детей с гемолитическими анемиями

Диагноз ! 1 СОД (мэкв/мгНЬ) Каталаза (ед.)

НЬ - патии | п-10 | 1 2. 48+0. 40 9.75+2. 50

Наследственный | микросфероцитоз | п-10 | из них: до 1 г. | п-4 | старке 2 дет | п-6 | 1 2. 59+0. 23 1. 98+0. 28 2. 82+0. 30 7.38+0. 39 5.28+0. 90 9.1+0. 4

АИГА I п-3 | ! 3. 20+0. 58 10. 20+1. 02

Доноры | п=23 | 3. 34+0. 28 14.1+2. 4,

- 27 -

У 2-х братьев с дефищггом ГбФДГ СОД в эритроцитах была 2,3 и 3,2, каталаза- 13,2 и 9,4; у мальчика е дефолтом пиру-ватганази СОД-2,1, каталаза -6,8.

Таким образом, при гемолитических анемиях различного ге-неза снижена активность ключевых ферментов АО зак^тты, причем меньше всего это выражено у детей с ЛИГА, гдэ гемолет обусловлен не особенностями строл'ия эритроцитов и связанной с этим повышенной продукцией внутри зритроцитарьлх CP кислорода- Эта ситуация достаточно стабильна, г;рччи:юА кричав является усиление выработки ШЛ шжрофэтачи и пплулощггаьп ( яи-фегсцкл, прием лекарств и т.д.}

При оценке корреляционной значимости активности крученных ферментов при НМ и КЬ- патиях получены следукдае результаты: при шкросферешггозе возраст появления сдаптомов болезни, что определяет тяжесть ее течения:, коррелировал о летня псстью эритоцнтарноЛ каталлзы в значительно степени,

чем СОД; та :~£ закономерность наблюдается при анализе тягости анемии:

г (СОД -НЬ)-0,21; г (СОД- возраст диагностики}»-0,31 г( кат. -НЬ) -0,56; г _(ksv. -возраст днагьостики)-0,30

Tcjcidí образом, у дэтей с НМ изменения активности катаг.а-зы больше связано с тяяестыо болезни ( частота и тягоэсть кризов), чем СОД. Особенно это выра^эно у детей раннего возраста с тяжелым течением НМ, у них показатели активности СОД и ка-талазы ниже, чем у детей старшего возраста (рс0,05).

У всех больных Гб-патиями в аритроцитах снижена активность СОД и в 75" случаев - каталазч. Степень сиияеиия показателя гемоглобина прямо коррелировала с .активностью исследованных зритроцитарных ферментов: г( НЬ -СОД) -0,55 г( НЬ -кат.)-0.40

Выявленные изменения нельзя считать причиной геиолиза, это показатель интенсивности реакций превращения ДФК с участием СОД и каталазы. Небольшое число'исследований не позво. лет делать обобщающие вызоды, однако можно заключить следую щзе:

- га -

1. при нарушениях структуры НЬ гемолиз связан со свобод-норадикальным механизмом за счет избыточного образования АФК;

2. эндогенно образуется преимущественно 0£. .Образование ОН зависит от многих составляющих, в том числе от активности эритроцитарной 1сатадазы, всаженное снижение этого показателя коррелирует к бодеэ тяжелым течением болезни.

Так как подавить образование 0£ невозможно (исхода из зтиологш: болезни), терапевтическая коррекция у больных с подобной патологией должна бвдь, направлена на предупреждение образования ОН».

III. Роль АФК в патогенезе анеми» фанкони

Если трудно найти патологические состояния, в развитии которых АФК вовсе не участвуют, то заболеваний, в патогенезе которых доказано приоритетное значение нарушений свободнора-дикальиых реакций, также не так уж много. В первые патогенетическая роль АФК была постулирована в развитии конституциональной гипопластической анемии Фанкони (АФ) (Н. Joenje et al, 1979,1981).

АФ - наследственное еутосомно-рецессивное заболевание, которое проявляется классическим сиидромокомплексом, включающим врожденные соматические аномалии в сочетании с панцитопе-нией в результате недостаточности костного мозга(Q.Fankoni,• 1927). Типичные аномалии многократно описаны, в последние го-* ды показано, что у 20-25% больных АФ не определяется выраженной органной патологии (В. Alter, N.Young, 1992). Симптомы и лабораторные изменения, характерные для состояния аплазии кроветворения, появляются обычно у детей в разном возрасте, чаще Есего в 5-6 лет, редко ( но возмо.шо) до 1 года и после 16 лет; проявления аплазии также варьируют,не всегда, обычно в развернутой стадии болезни, у больных АФ бывает 3-хростко-вая аплазия, обычно доминирует тромбоцитопения или/и лейкопения, реже анемия с развитием соответствующих клинических син-дромокомплексов.

Специфическим диагностическим тестом для АФ является ци-

тогенетнчэсксе исследование культивируемых .-дафоцитов кропи (или фибрсбластов кояи, хориснальных :ж?ок), при котором 0'1~ родоляется повышенная хромосомная нестабиду^сть, что проявляется увеличением числа кхегск с типичными еберрация!<и- сьо-тринасичи обменами, наличием одиночных и парных фрагментов и др. (7.3сЬгоос1ег, Р. ДисЬи1г, 1964). Число чч регло увеличила-ется в присутствии ХШ-поврегщеисишх агап'ов: дчэлоксибутана (ДЭБ), митомицина С (ШЗ), цдс платим; (Т. ЗоЬгесс'*.-, А. АиегЬасЬ, К.М>1пеп 1576, М. 1лигга1 1075, /.. Вчгдэг .>1 ,а1. , 1900, Н1Ье1го еЬ а1.. 1953). Тест дает вовчютаость диагностировать АЗ у больных без физяксльяих гигомалкй.

Если хомосошая нестабильность г^еток при Д£ оаклэначко докгяана, то механизм, леяишй в основе этого фенота, плогго понимаем.

В последнее десятилетие А® ассизко прмв».г;тесу вкигъаке исследователей, поскольку на иэдел« этого заболевания изучает механизм мутагенеза. состояний, связанных с повюгеияой ломкостью или нарушениями репарации ДНК, идут направленные поие-ки. гена АФ (С-Б^а^ее, М. ВисЬ*а1<3, 19С2).

В 1977 г. появились сообщений о защитнее эффекте СОД на частоту развития хромосомных аномалий а культурах клеток больных АФ и была предлояряа гипотеза о говровдагоем действии на клеточный геном Ж1 - вследствие их ггак-рпрокукдаи или дефицита АО запиты. Эгк исследования ведутся параллельно изучению состояния репарздии ДНК ( Сг. Ногс1зпзса, 1977, Н. Леег1е, 1978, 1979, К. 6егиИа,1983) и ряд авторов определяют /-Ф яе как болезнь репарации ДШч, а как свсбодкорядиктльнуа пато таги» (Н.Мгие. .ЬНаШгеП, 1937, ]. аииег!<э?е„ Я. 1йзК1п1-х^. 1991).

Исследование пролуташ» А<ТК и активности АО Ферментов у йодьныу АФ/

!сл наблюдали в динамике 18 г.'-'теЯ. Сольных АО, и 11 их родственников. Контрольную группу составили дети с другими Фэриами анеьий ( гемодктичесюал, анеиией Да&гояда-Блгжфада,

приобретенной апластической). В группе било 9 мальчиков и 9 девочек в возрасте - яри первом поступлении в клинику - от 5 до 14 лет.

Дети поступали в кликику в различные сроки от момента появления симптомов угнетения костномозгового кроветворения -от 3 месяцев до 3-4 лет, что в значительной степени определяет тяжесть проявлений болезни, так как раннее назначение адекватной терапии нередко дает быстрый клинико-гематологи-ческлй эффект.

Глубина и характер цитопении были вариабельны, также как и показатели миелограшы; гистологически у всех детей определено замещение костного мозга »яровыми клетками более чем на 50Х. Течение заболевания у большинства детей было тяжелым, в 1/3 случаев, когда лечение было начато при длительном сроке ■ болезни, оно оказалось безуспешным. 3 ребенка умерли в результате ослож5;ений геморрагического синдрома, 4 выписаны домой в тяжелом состоянии без существенного улу-ивения.

Показатели течения заболевания - возраст манифестации, выраженность соматических аномалий, тяжесть аплазии, чувствительность к терапии - представлены в таблице 5..

Диагноз верифицирован в результате комплексного клини-ко-лабораторного обследования, которое включало цитогенети-чеекие исследования лимфоцитов периферической' крови для выявления спонтанных и шнции.'.оз&нных ММс типичных для АФ хромосомных аберраций. Дети получали стандартную терапию преднизо-лоном ( 0.6-1. Омг/кг/д) и метандростенолоном длительно плюс рутин ( 10-20 щг/кг/деиь). Первые 2 препарата отменяли через 6-9 месяцев, рутин дети получают постоянно. Контроль за эффективностью лечения осуществлялся ежемесячно - определяли показатели анализов крови обычные и на ХЛ, и 1 раз в 6 месяцев - костного мозга, цитогенетический анализ лимфоцитов крови.

Специальные исследования состояния окислительного обмена проведены до начала лечения всем больным АФ и в динамике, течения болезни - у 7 человек. Для определения способности про-

Таблица 5.

Клиника и течение болезни у детей с ЛС>

NN Пол Возраст Со мат. Анализ п/!срови* К. мозга* Течение п/п обсл. мани- ано- НЬ НЬГ тромб Л-ц % цитоз % болезни ф?стац калии* г/л 7. 1.!?/л 1С?/л ЛФ 1С?/л гран.

зрит.

1 М 8 5 3 80 2. 4 ед 1.1 Г,0 52 1 Б5/7 Без

улучя*.

2 я 7 4 3 74 4 20 1.9 37 15 ■ 47/41 Без улуч.

Ехи^Ь

3 м 13 9 2 33 4.2 ед 1.4 С 5 16. 7 18/37Без улуч-

Ех.

4 м 5 2.5 2 37 И. Д. ед 2.3 05 12. 5 <12'11 Ех. Ш,.

5 .х Э • 3 2 ;я 2.8 ед 2.2 65 17.2 33/19 Без улуч,

6 м 12 10 2 80 н. Д. 90 5.6 81 37 31/51 Улучи.

7 М 10 9 3 58 10. 3 7.5 'с. 8 53 125 24/58 Улучи.

8 д 10 5 2 98 н. Д. 132 4.5 47 82 24/50 Ремиссия

9 м 10 3 2 82 3.4 ¡59 3.6 57 45.5 42/33 Улучи.

10 ж 10 7 3 72 н. Д. 90 2.1 65 СЗ 49/28 Без улуч.

11 м 14 13 1 60 12 85 1.0 55 18.5 18/12 Ремиссия

12 я 10 8 1 52 4.5 28 2.8 78 36 32/25 Ремиссия

13 ж 14 13 3 34 7.6 50 3.0 80 173 21/56 Ремиссия

14 ж 14 13 3 21 5.9 ед 1.3 68 68 21/41 Улучи.

15 я 8 7.5 2 80 н. Д. 29 2.0 70 19 21/51 Ремиссия

16 X 7 6.5 2 65 2.9 ед 1.2 74 11.8 27/15 Улучи.

17 м 7 5,5 1 48 д. ед •1.9 . 60 15.2 25/31 Ремиссия

18 м 6 5.5 3 85 н. д. ед 2.9 80 8.0 11/4 У.г/'Ж

* соматические аномалии:

1 - отставание в физическом развитии, пигментные пятна

2 - 1+измеиения скелета, без патологии внутренних орги т

3 - пороки развития внутренних органов +1 и/или 2

**) анализ крови и костного мозга на момент проведения специального обследования

аудировать АФК использован метод ХЛ с различными аютиваторами и ингибиторами направленного действия для уточнения характера продуцируемых СР.

Анализировали следующие показатели: интенсивность спонтанной и 1а1ех- активированной продукции АФК лейксщггаыи крови Оольн'гх.АФ ( в лейкоконцгзнтрате), разницу ¿¿гаду ниш!- " прирост" активации- суммарно и с пересчетом на 1 гранулоцит; активность СОЛ и каталазы эритроцитов, наличие хромосомных аномалий в культивируемых с ФГА лимфоцитах крови. Результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Показатели состояния окислительного обмена (ХЛ лейкоцитов, СОД эритроцитов), хромосомные абберации и прогноз у больных АФ

I Хемилюлишинсценци)-. глУ/Ю^ клеток СОД КАТ Абер.

I мэ/м ед. клетки

N |Выраж б/а Ьа* прирост НЬ X

|сома?

N |аяом Всего на1гр Веет* | 1;а1гр Всего На1гр 1

I I СП. |Шз 1

1 I з 1877 43 12924| 294 11049 251 ид 9.0 НД | -

2 I з 542 7.8 211801 365 2078 357 2.7 7.2 171 -

3 I 2 200 6.4 289 | 9.3 89 3.0 2.6 5.5 211 -

4 I 2 1063 5 211241 704 20061 669 1.8 3.8 . 56| -

5 I 2 94 5.5 4312 | 254 4218 248 НД НД нд| -

6 I 2 96 6 708 | 42 612 36 3.0 5.1 НД | -

г» I з 113 3.5 259601 811 25847 808 2.9 10.2 НД | -

8 I 2 263 5.6 194СО| 413 19137 407 2.9 16.2 111 -

Хемилюмининсценция тУ/10 клеток СОД КАТ Абер.

мэ/м ед. клетки

N Выраж б/а прирост НЬ %

сомат

N аном Всего на1гр Всего на1гр Всего на1гр

сп. ММс

9 2 875 26 6437 189 5562 164 2.7 4.7 6 -

10 3 2437 87 6006 214 3569 127 2,2 6.3 6.6 20

11 1 169 4,2 8300 207 8131 203 3.2 6.4 13 -

12 1 682 23 20631 688 19949 665 2.8 6.1 15. -

13 3 1812 121 23687 1579 21875 1458 2.71 6.2 7.2 22

14 3 1500 57.7 8687. 334 7187 276 2. 81 6.2 7.0 22

15 2 937 45.8 11750 587.5 10813 540 1.54 - 24 48

16 . 2 125 7.4 620 36.5 495 29 2.4 - 14 34

17 1 312 9.4 1562 47 1250 38 2.9 - 16 26

!8 3 3125 312.5 80562 8056 77437 7744 1.9 - 2 18

Ы 30.1 397 355 2. 61

+ + + + +

ш 9.1 183 98 0.12

Доноры 144.2 3.23 1743. 4 36.9 35 3.3

+ +' + + +

9.6 1.8 391.2 7. 4 19.1 0.3

На основании анализа результатов комплексного исследования можно заключить следующее:

1. Более чем у половины больных АФ (55% случаев) увеличена спонтанная продукция АФК лейкоцитами крови по сравнению с аналогичными показателями у здоровых людей в 4-20 раз.

2. Стимулированная ХЛ у 7 детей (38%) очень высока, у 8 (44%) - не превышает донорские показатели и у 3-х (18%) -значительно ниже, чем у здоровых детей.

3. Показатели активности СОД, исследованные у 16 больных

АФ, оказались снижены у всех в среднем на 25,4% (от 61% до 19%). Активность каталазы также снижена - в 9 из 13 исследований (70% случаев).

У 13 детей, у которых исследовался обмен железа, было повышено содержание свободного железа в сыворотке (33-48мг/мл), ферритин сыворотки также нерезко повышен (270-1708 ммоль/л) у 75% детей.

Мы провели анализ возможных корреляций показателей сво-боднорадикальной продукций лейкоцитами крови и особенностей течения болезни ( выраженность соматических аномалий, возраст манифестации болезни, длительность ее течения к моменту обследования, тяжесть аплазии). Не выявлено связи между величиной спонтанной (с ХЛ) и активированной ХЛ (аХЛ) лейкоцитов и клиническими проявлениями болезни: в группах с низкими и с высокими значениями продукции АФК были больные с тяжелым и с относительно легким течением болезни, с наличием минимальных ("кофейные пятна", особенности лицевого скелета, роста волос) и резко выраженных ( аномалии мочеполовой системы, пороки сердца, отсутствие пальцев ) соматических аномалий и стигы. Также отсутствует корреляция продолжительности болезни от манифестации аплазии до момента обследования и величины спонтанной ХЛ, но с показателем активации выявляется среднесиль-ная обратная связь (г«-0,35).Имеется средней напряженности отрицательная корреляция длительности течения болезни от манифестации до момента обследования и величины ХЛ. рассчитанной на 1 нейтрофил - спонтанной и активированной: г-(-0,37) (-0,33).

Выраженность аномалий не коррелирует с количеством (в %) аберрантных клеток (г-0,19), но имеется значимая положительная корреляционная связь с инициальной способностью клеток крови (суммарной) к продукции АФК (г-0,58).

Показатель активации ( суммарный) среднесильно' коррелирует с тяжестью проявлений аплазии гемопоэза (г-0,31) и с активностью эритроцитарной СОД (г-0,46).

Показатель активации на 1 гранулоцит значимо связан с величиной спонтанной продукции на 1 гранулоцит :г-0,57, чего нет у обследованных здоровых людей.

Представленные коэффициенты корреляции можно интерпретировать как свидетельство сложной роли АФК в развитии синдро-мокомплекса АФ. Например, не просто высокая продукция CP отмечается у • больных, но ваяна величина спонтанной продукции, которая имеет прямое отношение к показателю количества выявляемых аберрантных клеток. Интересен факт прямой связи величины активированной ХЛ и активности СОД, тогда как логичны обратные отношения. Это может служить подтверждением того, что в исследуемых клетках продуцируются CP, не ингибируемые СОД, то есть преимущественно не супероксид.

У 7 больных исследование хромосомных аберраций проведено с использованием митомицина С. Чувствительность клеток к его действию ( степень увеличения числа аберрантных клеток) оказалась связана с выраженностью у больного соматических аномалий (г-0,45) и с тяжестью проявлений аплазии гемопоэза (г-0.52). Увеличение числа аберрантных клеток прямо коррелирует с величиной активации ХЛ (г-0,84).

Возможно, что сХЛ и аХЛ реализуются у больных АФ по одним механизмам, о чем свидетельствует факт положительной корреляции величины исходных показателей с коэффициентом активации. У здоровых доноров такой корреляции нет и можно предполагать различие механизмов, обуславливающих сХЛ и аХЛ в нормальной физиологической ситуации.

Чтобы определить спектр А®, продуцируемых лейкоцитами больных АФ, при измерении аХЛ использовали различные ингибиторы и фотосенсибилизаторы, в результате чего установлена преимущественная продукция высокотоксичного гидроксильного радикала по сравнению с супероксидом ; у доноров добавление СОД (10 мкг/мл) шгибирует ХЛ на 40%, у больных АФ добавление экзогенной СОД мало влияло на интенсивность свечения. Наиболее эффективными ингибиторами ХЛ лейкоцитов больных АФ in vitro были маннитол и рутин (рис. 5). При использовании среды с люцегинином свечение лейкоцитов, шггивированных латексом, крайне низкое (люцигенин-люминисцентный' индикатор, чувствительный к супероксиду). Таким образом,- среди АФК, продуцируемых лейкоцитами больных АФ, увеличена доля гидроксильного радикала

-. 36 -

В каждом случае выявленные изменения выражены в разной степени, они являются результатом функционирования многофакторной системы, например, величина продукции ОН»клеткой зависит от активности ферментов окислительного каскада, нагрузки железом, активности АО ферментов и др.

В целом, у больных АФ значительно изменен характер продукции АФК клетками крови ( количественно и качественно); механизмы, лежащие в основе этого явления, не расшифрованы. На основании анализа комплекса результатов обследования представительной группы больных можно заключить, что наиболее неблагоприятно для прогноза АФ сочетание высокой спонтанной и низкой активированной ХЛ лейкоцитов крови, что свидетельствует о глубоких нарушениях клеточного метаболизма и сочетается с выраженностью соматических аномалий.

При обследовании в динамике с интервалом 9 и 15 месяцев 2 больных, не получавших лечения ( отказ родителей), определены практически идентичные показатели активации ХЛ латексом на 1 клетку ( 6 и 4 ед. в одном случае и 2,8 и 3 ед. - в другом) и активности СОД эритроцитов.

Поскольку мы полагаем, что описанный феномен может играть существенную роль в патогенезе АФ- наследственной болезни, представляется важным исследовать аналогичные параметры у .близких родственников больных АФ.

Обследовано 11 родственников семи больных АФ: 4 отца, 5 матерей и 2 сиблинга - с определением показателей окислительного метаболизма (таблица 7).

В 3 семьях, где обследовано оба родителя, выявлено или снижение активности СОД эритроцитов при нормальной величине ХЛ лейкоцитов, или высокая активность спонтанного свечения при нормальной активности СОД - у одного из них; в одной семье (сл. 17) снижена активность СОД эритроцитов у матери и у сестры 3 лет без увеличения ХЛ; у сестры в крови выявлено 4Х клеток со спонтанными хромосомными аберрациями, что несколько превышает норму ( проба с Шс не проведена).

I

§\й | „ ... ч 2

\ I

I I

I

Рж. 5. Действие "ловупек" и ингибиторов на продукция АФК при АФ и в корме; показатели аХй.

оровые дети

□ - больные егекноЯ Явнкоии

1. ХЛ без ингибитора '2. + СОД

3. + машштол

4. -"-"- + рутин

- за -

Таблица 7.

Показатели ХЛ лейкоцитов и активности СОД и каталази эритроцитов крови у родственников больных аф

N |Родство ХЛ тУ/106 клеток 1 сод КАТ

слу- | покв/ ед.

чая б/а ЬаЬех | лг НЬ .1

1 ' ' Всего ,1 нф Всего 1 Нф 1 1

2 | отец --- — — | 3.6 13.6

I мать 5662 90 6175 98 | 3.6 14

12 | отец ---- — 2285 — 1 3.1 14.5

| мать 4094 63 9509 146 | 4.3 14.5

4 | отец 44 0.8 2076 35 | 2.7 8.7

15 I мать 9000 134 41937 625 | 2.7 нд

16 | мать 500 8 2937 47 | 3.4 —

17 I отец 62 1 500 8 | 3.4 —

| мать 187 3.1 937 62.5 | 2.9 —

|цестра 125 2.4 375 7.4 | 2.9 —

.7 I сестра 2126 35.4 17000 283. | — 1 —

Доноры 144+9. 6 3.2+1. 1743+391 36. 9+7,4|3. 3+0.3 1 14.1+2. *

У отца мальчика (слуг;..Л 4) с очень тяжелым течением болезни выявлено значительное снижение активности СОД и катала-зы в эритроцитах при средней величине показателей ХЛ лейкоцитов; лейкоциты крови матери в другой семье дали очень высокий ХЛ-ответ при сниженной активности СОД эритроцитов, но спектр продуцируемых АФК отличался от выявляемого при АФ - превалировал 01( у девочки лейкоциты продуцировали преимущественно ОН* ).Это показано методом с использованием окисления дезокси-рибоэы (ДОР): в присутствии клеток, активированных форболовым эфиром, ДОР окисляет только ОН'. Лейкоциты больной при акти-

вации увеличивали окисление ДО? на 30%, клепт» матери не изменяли показателя окисления.

Таким образом, если у белы«« А£> ткется нарушение и характера продукции АФК ( качественные и/или кслпчест.ченные) • и состояния АО защиты, то у гематологически клинически здоровых членов ьсех обследованных семей отмечен какой-то один дефект при нормальных других исследованных яе»{азатслях: из 10 человек у 5 оказалась сниженной атоизность эритродатарной СОД (на 12-23% по сравнен«» с л отсрочил доаэатшш) и у Б обнаружь lia вксосая аотивкссть спогглшкой продукции АФК гранулоцитз-мк. Полученные факты свидетельствуют в пользу предположения о возмошости наследования особенностей состояния окислительно! системы,что требует дальнейшего направленного попуопгаскного изучении.

Результаты исследования со.-даряннпя клеток-предсествениктоа грану^оцитоя и ка!фофагов и фябробластов в костном козго больных А5 (ii. vitro).

Аплазия гемопозза при АФ результат поршкт'я костно-моз-говых клеток- предшественников ( галичественныЛ и lanecTEcr!-ный?), уровень его, поводимому, высока ( стволовые и полустволовые клетки). Содержание кяетск-предастпенников з костном мозге у больных А$ резко снижаю ( F. £lmcve, V. Swift, 1976, Е. Leonard et al.» 198S).

Мы определяли количественные и качествен«!« характеристики клеток-яредЕестгенлккоз гранулоцитов и макрофагов (FOE-ГШ и Фибропластов (КОЕ-ф) у больных АФ при раздай условиях культивирования и проводили анализ полученных результатов с учетом клинических показателей лечения больных. Tait как предыдущие исследования по1сазалн значп^оггь свободнорадикаль-ны/С механизмов в патогенезе АФ, мы считали внтерескьм изучить влияние условий культивирования костного к»зга с позиции уа-гибировакия содержания AÎS в культуральноЛ среде.

Экспериментальная чгдтъ работы выполнена в лаборатории регуляции гекопозга I-Cfl £Г зав. лаб. к. м. н. II. R Замарасвой и

- 40 -

ст. и. сотр. к. о. н. Е. Ю. Осиновой.

Культивадование костного шзга проводилось без добавления фидера ( спонтанный росл1; и с фидером ( фидерный рост). Определяли общее количество К02-ГН и КОЕф в расчете на 10 клеток культивируемой клеточной суспензия и на 1 мкл костного мозга - эффективность клонирования (ЭК); соотношение колоний и кластеров (ГМ предшественники) и величину колоний ( предшественники фибробластов), что позволяет судить о пролифера-тивном потенциале ( ЙП) растудах в данных кудьтуральних условиях клеток. КОЕ-ГМ исследованы у 9 детей, КОЕф - у 8; результаты представлены в таблице 8.

У всех детей с АФ имеется резкое снижение эффективности клонирования в стандартных условиях без фидера и в присутствии ростовых факторов ( фидер ); при иаличии роста ГУ предшественников определяется подавляющее преобладание кластеров ( низкая пролиферативная способность). ЭК КОЕф также снижена, образуют колонии предшественники с высоким пролиферативным потенциалом. Добавление фидера незначительно улучшает ЭК.

Проведен эксперимент по оценке влияния добавления АО в среду при культивировании фибробластов. Использовали АО с известным механизмом ингибировшшя АФК : СОД (10 мкг/мл), рутин 10 ^М/ыл, каталазу 25 мкг/мл, маннитол Ю М/мл. Опыт проводили .в культурах с Фидером в 2-х ре »шах: с добавлением АО с начала культивирования ( суспензия неприлипающих клеток) с последующим удалением через 24 часа со сменой среды - 1-ый вариант; 2-ой вариант - с добавлением АО начиная с 24-го часа, после смены среды и удаления неприляпших клеток. Это д$шт возможность не просто оценить значение снижения содержания АФК для жизнеспособности КОЕф. но и предполагать возможные их источ-. ники ( фракция неприлипающих ¡меток, сами фибробласты ?) и значение АФК на разных этапах роста КОЕф (первые 24 чаоа -прилипание, затем - выживание и пролиферация -?).

Параллельно проведен контроль - культивирование в аналогичных условиях клеток костного мозга детей без патологии системы крови. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 8.

Эффективность клонирования и пролиферативнъй

потенциал КОЕ-ГМ и КОЕф костного шзга больных АО при культивировании в стандартных условиях с фидером и без фидера

N | КОЕ-га КСЕ-ф

1 ....... Клинич Эффект

сл. | ЭК на Ко.л/кл ЗК на ПП состоя терапии

| 105кл. 1 10 кл. ние

спонт фид. спонт фид. III 1 спонт|фид. 1 спонт! фид. 1

9. 11.51 0 0/1.5 - — 1 " -- 1 " ср. тяж част, ул

10. 1 0 |89 - 7/82 класт|кл. —- 1 тяж. без эф.

11. |1.0|6.0 0/1 1.5/4.5 — I 22 — 11.0 ср. тяж ремиссия

12. |30 |8. 5 0/30 076,5 кластеры- -- 1 " удовл. ремиссия

13. |1.0|3.0 0/1 .5/1.5 28.5 I 26 1.95 12.85 ср. тяж улучи.

14 |1.0|2.5 0/1 2.5/0 11 | 16 2. 68 12.24 ср.тяж улучш

15. | 0 |6.0 -- 0/6 12 | 29 1.0 |2.19 тяж. улучи.

16. |1.5|1.5 С/1.5 0/1.5 5.5 117.5 1.54 12.17 тяж. част, ул

18. |7.5|18 0/7.5 11/7 23.5 159.5 1.04 |1. 35 тяж. улучи.

Зд. 87.7 49.5/ 157.1 11.7-

+ 37. 5- 1 ± 1-2.5 -

доноры 8.3 1.3 1 4.1 1

^ кол - колонии; кл - кластеры.

Таблица 9.

ЭКф и ВД> при культивировании костного мозга с добавлением АО

N АО Добавл. АО первые 24 часа | Добавл. АО с 24-го 1 часа

слу больной контроль | больной | 1 1 контроль

чая ЭКф | 1 пп ЭКф п п 1 ЭКф | 1 1 пп | 1 ЭКф | 1 пп

без 26 | 2,85 11 2,37 | 26 | 2,8 5| 11 1 2,37

СОД 54 | 1,94 9,6 2,25 1 58 | 2,0 8| - 1 -

13 кат. 54 | 2,07 6,0 2,59 1 53 | 2,0 4| 6.0 1 2,16

рутин рыхлыйыоносл. 6,0 2,59 1 — 1 1 — 1 —

НДГА 50,5 | 1 1,75 6,5 2,75 1 56,| 1 ! 1.0 2| 1 5.5 | 1 1,89

без 16,0 | 2,24 11 2,37 1 16 | 2,2 4| 11 1 2,37

СОД 35 | 2,04 9,5 2,25 1 8,01 1.2 5| 9.51 2,25

14 кат. НД | КД 1 1 1 1

рут. 37 | 2,00 6,0 2,59 1 1 1 1

НДГА НД | 1 НД 4 • 1 1 : 1 1 1 ! 1

без 29 | 2,19 50 2,56 1 29 | 2,19 1 50 1 2,45

СОД 1 |сливной очень 28,5| 2,22

15 кат. 1 |рост высок 49 | 2,6

рутин н е т ¡анп ы X I крупных кол. 44 ! 2.43

НДГА I 1 1 62,51 I 1 2,09 ! 55 | 2,31

без 17,5 | 2,17 66 2,6 1 17,5| 2,17 | 36 |* 2.6

СОД 13,5 | 1,56 52,5 1.7 | 24 1 2,07 | 67 | 1,86

16 кат. нет) да ных - I 9.5 | 1,05 | 49 | 1,19 .

рутин 22 | 1,81 49 2,22 1 20 | 1.4 | 53 \ 1,84

НДГА 21 1 . .1. 1.9 51 1,93 1 23 | .1 ! 1.66 | _ 1. 45.5! 1 1.7

В присутствии АО улучшаются показатели ЭКф, достоверной разницы при различных режимах не выявляется. При увеличении числа КОЕф несколько снижается ПП; ни в одном случае в контроле - в отличие от больных-не било повышения ЭКф в присутствии АО. Коэффициент увеличения числа КОЕф не везде одинаково значим; наименьший эффект АО оказали в случаях 14 и 16, где способность лейкоцитов крови к продукции АФК была снипена(табл , 6); у этих больных не удалось получить быстрого выроненного ответа на стандартную терапию.

Немногочисленность экспериментов не позволяет делать обобщающих заключений за исключением того, что элиминация А® кз культуральной системы улучвает способность КОЕф к выживанию у больных АФ, тогда как в контроле зтот эффект отсутвовая.

Значение АФК для состояния костномозгового кроветворения больных АФ требует дальнейшей расшифровки.

Экспериментальные и клинические данные обследования больных АФ дают основания для следующих заключений:

1) В лейкоцитах крови больных АФ нарушены закономерности продукции АФК - количественные и качественные: клетки без стимуляции продуцируют большие количества АФК,( спонтанная ХЛ), преимущественно- высокореактогенный ОН• , при сниже»гой активности ферментов алтиоксидантной защиты в эритроцитах.

2) Выраженность соматических аномалий, не будучи связал-'ной с количеством аберрантных клеток в популяции, прямо кор-

релирирует со спонтанной способностью лейкоцитов к продукции АФК (г=0,31), а степень выраженности аплазии кроветворения -с показателем активации радикальной продукции ( суммарно) в условиях стимуляции (г-0,31).Чем дальше период от появления симптомов гипоплазии до момента обследования, тем ниже оказывается способность лейкоцитов к активации продукции АФК . (Г--0.35).

3) У близких родственников больных АФ выявляются отдельные нарушения окислительного обмена клеток крови (-■или высокая продукция радикальных продуктов, или снижение активности АО ферментов).

4) Способность к образованию колоний из клеток-предшественников костного мозга больных АФ (ГМ и фибробластов) в

стандартных условиях культивирования резко снижена ( и остается таковой в ремиссии), выявляется преимущественно кластерный тип роста. Изменение культуральной среды добавлением ан-тиоксидантов улучшает эффективность клонирования фибробластов.

Таким образом, получены свидетельства связи синдромоком-плекса АФ ( с постепенным развитием аплазии гемопоэза) с наследуемыми особенностями состояния окислительно-восстановительного обмена; выявленные закономерности дают основание использовать антиоксидантную терапию для направленной терапевтической коррекции и поддержания состояния ремиссии у больных АФ.

IV. Продукция АФК лейкоцитами крови у детей, живущих в условиях радиационного загрязнения

Химические изменения биомолекул под воздействием ионизирующей радиации могут быть следствием прямого и непрямого действия. Непрямое, действие радиации - результат образования свободнорадикальных соединений, главным образом из воды: Н^О —> ОН-, Н», ëaq, Н^, Н^. В аэробных условиях идет образование супероксида:' 0^+ ёач-->0^ .

Большая одномоментная доза облучения вызывает массивную деструкцию (снеток, в° основном, активно проллферирующих, с развитием острой и хронической лучевой болезни. Еизкодозовое облучение - экзо- или эндогенное - не приводит к лучевой болезни, но обуславливает образование избытка АСЕ; какой эффект может дать гиперпродукция высокоактивных радикальных соединений - зависит от многих факторов. Большое значение имеет характер инкорпорированных радионуклидов, локализация их в организме, состояние антиоксидантной зашиты.

В результате аварии на ЧАЗС огромные массы людей- более 4-х миллионов человек, в том числе более 1,2 млн. детей - ока-', залксь живущими в условиях действия невысоких доз радиации из-за присутствия экзо-зндогенних радионуклидов - иода 131, изотопов стронция - 90, цезия 134 и 137, плутония 239-240.

Дети высоко чувствительны к лучевой нагрузке из-за ак-

тивного роста тканей( большой пролиферируюший пул), отсутствия жесткой сбалансированности регуляторных и защитных механизмов, напряженности иммунитета Какие изменения могут развиваться у детей в условиях • постоянно повышенной продукции АФК - известно мало, описаны общие феномены, такие как нарушения иммунных реакций, эндокринные расстройства (HR Филиппин, И. Т. Петоян 1988г.) Учитывая мутагенное действие АФК можно ожидать увеличения риска развития заболеваний, связанных с повреждением клеточного генома, в частности,- злокачественных опухолей.

Появление хромосомных аббераций вследствие действия ионизирующей радиации хорошо известны. Около 1/3 повреждений ДНК происходит вследствие прямого действия радиации, а остальные вызваны действием СР. Генерация СР может привести к формированию вторичного- кластогенного материала или кпасто-генных факторов (КФ),которые освобождаются облученными клетками (I. Emerit ,1990). Их образование и последующее действие на необлученные клетки можно профилактировать с помощью АО, в частности, COD. КФ персистируют через много лет после облучения и могут вызывать эффект такой же, как облучение (G. В. Faguet et aL, 1984). Считается, что КФ - это б помарке ;>н прооксидантного состояния, они могут быть причиной окислительных повреждений на расстоянии от места генерации АФК; высокий уровень развития злокачественных заболеваний после облучения может быть связан с повторными повреждениями ДНК кластогенным фактором (I.Emerit .,1990).

Состояние гемопоэтической системы у детей, живущих в условиях повышенной радиации, исследовано мало и в основе носит эпидемиологический характер.

При обследовании детей, живущих в условиях радиационного загрязнения, мы ставили следующие задачи: 1) определить показатели продукции АФК клетками крови; 2) исследовать состояние антиоксидантной защиты; 3) выявить возможные корреляции между обнаруженными изменениями С если таковые будут) с дозой инкорпорированной радиоактивности. В результате мы хотели определить возможные факторы риска развития патологических состояний в условиях действия малых доз радиации ( экзо- и эндо-

- 46 -

генной) и пути их профилактирования.

Обследованы 2 группы детей, живущих на территориях, загрязненных радиоактивными соединениями в результате аварии на ЧАЭС.

1 группа детей обследована через год после аварии, дети постоянно жили в экологически неблагоприятных условиях второй зоны радиации (5 -15 Ки на км. в год) что в принципе не дает высокой суммарной дозы. Дети были направлены на стационарное обследование, т.к. при диспансерном наблюдении у них были выявлены изменения в анализах периферической крови ( в основном, умеренная тромбоцитопения или лейкопения).

2 группа - дети, проживающие в тех же условиях, которые обратились за консультативной помощью в гематологическое отделение РКДБ с различными жалобами в 1991-1992 гг. - т. е. через пять лет после аварии.

Результаты обследования детей 1 группы ( через год после аварии)

Группу составили 28 детей в возрасте от 4 до 14 лет.

Обследование включало:

- клинический осмотр с исследованием состояния нервномы-шечного аппарата, сердечно-сосудистой системы, щитовидной железы.

- дозиметрический контроль по цезию 137;

- контроль состояния гемопозза: анализы периферической крови в динамике, характеристика костного мозга, изучение содержания грануломоноцитарных предшественников, популяционного состава лимфоцитов в костном мозге и крови,оценка фагоцитарной функции нейтрофилов и моноцитов крови, цитохимическая оценка лимфоцитов крови с использованием стандартного набора реакций плюс активность ферментов аэробного окисления ( сук-цинатдегидрогеназы -СДГ) и анаэробного гликолиза (лактадегид-рагиназы).

Оценивали способность лейкоцитов крови и костного мозга к продукции АФК - спонтанной и стимулированной S1O2. и СопА, а также активность антиоксидантных ферментов (COD и каталазы)

эритроцитов крови. Проведен корреляционный анализ взаимосвязанности полученных характеристик.

Значимой патологии в состоянии детей не обнаружено. Имеющиеся отклонения: хронический тонзиллит, гельминтозы, эутире-оидный зоб - на уровне детской заболеваемости. При радиометрии у 8 детей не выявлено инкорпорации цезия 137, у 20 - обнаружен цезий 137 в небольших количествах - от 0,02 до 0,2 Ки. Достоверно судить о наличии инкорпорированных радионуклидов по этим результатам нельзя, т. к. определена активность только одного изотопа цезия.

В повторных анализах крови отмечена тенденция к лейкопении у половины детей и почти у всех - к лимфопении. В двух случаях было умеренное снижение числа тромбоцитов (105 и 140 х 109/л). При исследовании костного мозга у 2 детей выявлено снижение клеточности ниже 50*10 9/л, у одной девочки это сочеталось с лейкопенией и нейтропенией, но клинически она. была здорова В миелограммах у 10 детей несколько увеличено относительное содержание лимфоцитов ( больше 25 X), а среди них -с гранулярным характером ШИК-реакции. Другие более тонкие исследования патологии не выявили.

Активность СОД эритроцитов колебалась от нормальных величин -3,2-3.5 МЕ/мгНЬ - до низких - 2,0-2,4 МЕ/мг НЬ, активность каталазы была нормальной - 15-17 ед.

Результаты исследования ХЛ клеток крови представлены в таблице 10 - раздельно по всей группе и для детей с наличием инкорпорации цезия 137 и при отрицательном результате по этому тесту.

Мы провели подсчет показателей ХЛ лейкоцитов крови без активатора и ответ на стимуляцию SiO^- суммарно и в пересчете на 1 нейтрофил - по всей группе в целом (п-28) и с учетом результатов Дозиметрии: рассчитанная доза Cs-137 от 0,1 до 0,2 шКи ( подгруппа А-7 человек),0,02 - 0,08 тКи (В - 13 человек) и 0 (подгруппа С - 8 человек). Индивидуальные колебания значительны, достоверной корреляции показателей ХЛ с выявленными изменениями в анализах крови отметить не удалось, за исключением значимой.положительной корреляции интенсивности ХЛ лейкоцитов крови в ответ на S1O2 с активностью в них СДГ

(г-0,45), что подтверждает известный факт участия митохондри-альных ферментов в активации аэробного окисления.

Значимых корреляций между выявленной дозой радионуклидов и показателями продукции АФК клетками крови в описываемых группах не найдено.

Интерпрпретировать эти результаты сложно из-за некорректного проведения дозиметрии и отсутствия правильного расчета поглощенной дозы.

Таблица 10.

ХЛ лейкоцитов крови детей, живущих в условиях действия малых доз радиации, (группа 1)

ХЛ Ш на 10& клеток

Иссле- Доза Число | б/а

дуемая в детей | Ш-т М+гп

группа шкКи 1.

1 всего | на | всего | на

1 1 1 1 1нф 1 1 1 1нф

1 а 0,1-0,2 7 1 194,3 | 3,17 | 2690,3 | 51,9

±54, | +0,6 | +1242,5 | +17,8

1 Ь 0,02- 13 | 257,0 | 5.1 1 2425,2 | 44,5

0,08 1 +73,8 | +0,72 | +449,9 | +8,7

1 с 0 8 | 265,9 | 5,1 I 2184,7 | 49,3

1 +104,51 1 +2>1 | +1087,2 | 1 +19,3

всего - 28 | 243,9 | 3,8 | 2549,7 | 49,8

1 1 +46,1 | +0,7 | +451,8 | 17,9

Доноры - . 13 | 144, | 3,2 | 3983,3 | 77,7

1 +9,6 I 1 +1,8 | +822, 8| 1 +20,4

г (доза - сХЛ БЮгна 1 нф)- 0,25; доза - сХЛ БШ2 суш.-0,18 г (ХЛ б/а 1кл-активация 1кл)«0,67; доза - аХЛ БЮ^сумм.-0,21

- 49 -

Обращает на себя внийание следущее:

1. более выраженный разброс всех рассчитанных показателей в обследуемой группе - по сравнению с донорами: диапозон показателей спонтанной ХЛ (суммарно в лейковзвеси) от 40 до 987 ед., активированной- от 184 до 8165 ед. ( у доноров сХЛ -30129 ед. , аХЛ - 963 -8574 ед.);

2. более высокая выработка лейкоцитами крови АФК без добавления активатора сХЛ: 243,9 по сравнению с 144,2 - у доноров, суммарно (р<0,05 ), а также в пересчете на 1 нейтрофил: 3,8 по сравнению с 3,2 у доноров;

3. более низкая, чем у здоровых доноров, активация показателей ХЛ в ответ на стимуляцию как суммарная, так и в пересчете на 1 нейтрофил: 2305,8 против 3540,1 (р<0,05) и 45,7 против 94,0 (р=0,03);

4. наличие достоверной положительной корреляции между исходной активностью ХЛ на 1 клетку и приростом ее в ответ на БЮ^: г-0,67. Других значимых корреляций исследованных лабораторных показателей не выявлено.

Таким образом, у описываемой группы детей определена более высокая спонтанная продукция АФК и сниженная потенциальная способность к активации этого процесса, возможно, как результат постоянного напряжения систем продукции АФК. Можно думать, что у этих детей механизмы спонтанного и активированного образования АФК различны ( или образуются разные АФК) -т. к. при высокой сХЛ и низком "приросте" из-за этого ( в целом) при индивидуальном анализе способность к активации коррелирует с величиной сХЛ. Данная ситуация аналогична наблюдаемой у больных АФ.

Возможно, что такое состояние защитных функций нейтрофи-лов может служить причиной сниженной толерантности детей к бактериально-вирусным I нфекциям, частой заболеваемости, наличия выявляемых у них очагов хронической инфекции.

У 4-х детей этой группы ( 14,3%) определена чрезвычайно высокая активированная продукция АФК клетками крови, значительно превышающая максимальные показатели у доноров. Можно предполагать, что дети с такой характеристикой окислительного обмена лейкоцитов могут быть отнесены в группу риска развития

"свободнорадикальной". патологии, требуют углубленного обследования ( включая онтогенетический анализ) и динамического наблюдения и нуждаются в медикаментозной коррекции антиокси-дантными препаратами направленного действия.

Результаты обследования 2-ой группы детей (через 5 лет после аварии).

Мы обследовали также 25 человек (21 ребенка и 4 взрослых) , которые обращались за консультативной помощью в гематологическое отделение РКДБ по поводу разных причин: изменения в анализах крови ( лимфоцитоз, эозинофилия, тромбоцитопэния); лимфаденопатия, наличие очагов инфекции, частые простудные заболевания. Эти дети также имели высокий риск длительного действия малых доз радиации, поскольку проживали в экологически неблагополучных районах (1-2 зона радиоактивного загрязнения).

Некоторые дети обследованы вместе с членами семьи. Подсчитаны возможные дозы облучения в зависимости от места жительства ( от 1 до 15 Ки/км2 в год), однако дополнительная дозовая нагрузка определена не у всех детей ( иэ-эа технических трудностей).

Обследование включало: оценку клинического состояния, гематологических показателей,показателей обдана железа, характера продукции АФК лейкоцитами крови с использованием различных ингибиторов, состояния АО защиты ( активность СОД, ГР, ГП, содержание глкггатиона, гаптоглобина, церулоплазмина и АО активность плазмы крови). У 18 детей проведено определение содержания кластогенного фактора (КФ) по оригинальной методике проф. I.Emerit (1990).

Показатели ХЛ у этих детей определяли после однократногос отмывания лейкаконцентрата и выражали в единицах LKB на 10"1 клеток; в качестве активатора использовали latex. Сравнение, этих показателей с ранее полученными провести было не вполне корректно из-за невозможности точного количественного пересчета ( использование другого метода измерения и другого прибора). Кроме того, если в 1-ой группе были практически здоро-

вые дети, то во 2-ой - таких было всего 11 детей и 4-о взрослых, остальные 9 человек имели различную патологию-. 1 девочка- острый миелолейкоз (М2), 1 девочка- ревматоидный артрит, у 2-х детей была троыбоцитопения в анализах крови, 2 детей обследованы по поводу лимфаденопатии, у 1-го мальчика- хронический тиреоидит.

Результаты обследования, проведенного до начала какой-либо терапии, представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Показатели ХЛ лейкоцитов, состояния антиоксидантной системы у детей, проживающих в условиях малых доз радиации.

(2-я группа) (М + ш)

ХЛ в услов. ед на 10^" клеток

группа б/а Ьа^ | 1

Всего 1нф Всего|1нф | СОД |глют. | ГР |ГП |А0А КФ

I 1 1 (условные единицы) | 1 (X)

II а п-12 21,3 ■18,5 0,9 5.6 9|,4 | 29,4 | §.73| 1.32| 1 1.3б| 0,05| 85,7| 109 16.7| 3§,1 1 I 112 |70,1 | 2* 125,7 1 1 10,6 2,52

II Ь п- 9 28,4 13,9 0,52 0,32 290,7| 59,0 | 4.3| 2.2| 1 1,241 0,2 | 87,2) 9|.4 11,7| 48,1 1 1 87 |5£,6 1 11,7132,1 1 1 12,1 2",26

II п-21 2,4,1 7~,3 9.6 0.4 193,9| 59.11 4.11 3,0| 1 1.32| 5.03| 85,3| 114 14,2| 10.1 1 | 109 |63,9 | 2В,5|31.5 1 1 10.6? 2,8

Доноры 15,21 - 253 -1 1.5±| 85 -± | 70- | 70- |70- ,2-

п-12 2.1 - 28,6 | 1 0,5 | 13,0 | 150 1 | 170 |30 1 • 1 4

II а - дети в состоянии практического здоровья;

II Ь - дети с наличием сформировавшейся патологии.

- 52 -Значимые корреляции: г ( исходная ХЛ в расчете на 1 клетку - увеличение ХЛ на fat на 1 клетку) « 0,69 ( по всей группе в целом) г- (ХЛ на Lat суммарно - акт. ГП) =-0,67- по всей группе.

Анализ результатов, полученных у этих детей, проведен ке в сравнении с предыдущей группой, а самостоятельно, с учетом других методических возможностей - более подробного изучения состояния антиоксидантной защиты и присутствия в их крови кластогенного фактора

Других значимых корреляций нет, также как нет достоверных различий между группами по показателям сХЛ, активности СОД,ГП, величине,Ш, величина аХЛ была выше у детей с заболеваниями системы гемопозза, что сочеталось с более низкой активностью ГП ( основного фермента, участвующего в реакции образования ОН*).

На основании анализа представленных результатов можно констатировать следующее:

1. Как и в первой группе, у этих детей выявляется значительный разброс величины ХЛ при сравнительной однородности показателей состояния АО защиты.

2. У 11 из 18 обследованных данным методом лиц определяется кластогенный фактор в плазме крови (в 61% случаев).

3. Увеличение продукции АФК лейкоцитами в ответ на стимуляцию коррелирует с исходными показателями ХЛ этих клеток.

4. Из изученных показателей АО защиты наиболее информативной является активность ГП. Она достоверно (р<0,05) нкме во IIb подгруппе и коррелирует с высокими .показателями ХЛ

Таким образом, у детей, долго живущих в условиях действия малых доз радиации ( 5 лет), отмечены те же закономерности, что и у детей 1-ой группы.

В отсутствие выраженной сформированной патологии сшгаэна способность к активации процесса, при патологии - резко позы- . шека CP продукция при снижении АО защити.

Судить о том. что первично по отношению друг к другу -продукция АФК или болезнь - в настоящее время не представляется возможным, однако выявление высокого содержания КФ у (¿с-

лее половины обследованных позволяет сделать вывод о патогенетическом значении активации свободнорадикальных процессов в условиях действия палых доз радиации.

V. Исследование способности к продукции АФК клетками крови и костного мозга при лейкозах У детей.

В фундаментальных исследованиях лейкозньи клеток показано, что, несмотря на признаки анаплазии, они сохранают основные свойства нормальных аналогов, т.е. ыиелоидные клетки содержат набор липидов, пероксидаз и оксидаз - количество их колеблется в широком диапозоне, а лимфоидные несут специфические антигенные маркеры, характеризующие их принадлежность к популяции (G. Hayhoe, 1983).

В последние годы появились публикации о так называемых " бнфенотипических" или "гибридных" вариантах острого лейкоза (ОЛ) более оправдан термин "mixed imaged" (М.)"смешанноли-нейные". Властные клетки в этих случаях имеют антигенные маркеры лимфоидных и миелоидных линий - в разных сочетаниях. По данным разных исследователей такие лейкозы составляют от 15 до 40Z среди всех ОЛ. Критерии диагностики ML ОЛ четко не определены, учитываются цитохимические, цитоиммунологические и цитогенетические параметры бластных клеток. ХЛанализ лейкоз-ных клеток не проводился, их способность к продукции АФК не исследована Эта характеристика клетки отражает специфические функциональные ее свойства, что может иметь теоретическое в практическое значение, в связи с чем мы обследовали группу детей с лейкозами в возрасте от б месяцев до 14 лет. Материалом исследования служили лейкозные клетки костного мозга и мононуклеары крови, значительную часть которых также составляли бластные клетки ( в единичных случаях ОЛЛ в крови выявлялись лимфоциты с нормальными иммунологическими характеристиками, что возможно на ранних этапах болезни). Обследование детей проводилось в момент диагностической костномозговой пункции до начата лечения.

ПОКАЗАТЕЛИ ХЛ-ОТВЕТА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ У БОЛЬНЫХ С НЕЛЮЙОБЛАСТНЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ (НЛ).

Обследовано 9 детей с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) и 2 с хроническим миелолейкозом. Варианты ОМЛ выделены по РАВ-классификации на основании морфоцитохимичес»сих характеристик лейкозних клеток. Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12.

Показатели активированной ХЛ клеток костного мозга и крови у детей с миелолейкозом ( на 106клеток).

_Костный мозг_Кровь_

ВариантЧисло Хбласт ХЛ Хбластов ХЛ

mV/10 клеток mV/10 клеток

(АЛ боль +грану- SiO^ СопА ' +грану- Siojj. СопА-них лоциты всего на лоциты всего на 1 кл 1 кл

M+in 6 97,2 ±0,4 1220^ +423,4 12.9 293,3 81,2 +4,64+203,9 +5,2 4411,2 54,2 916,7 +2175,4 +26,0+413,2

М.5* M+m 3 100 144,7 +55,6 1,4 85,7 81,7/4,3 475,7 6,25 168,3 +0,6 +5,7 +17,2/4,1+289,6 +4,1 +133,4

ХУЛ 2 100 1565,0 - >1200 92 2804,5 - 1048,0 л

Всего И - 901 8.6 324,9 -+295.3 +3,5 +157.7 - 2909,5 36,2 694.4 +1206,3+17,9 +259,6

6877,5 + 2028,5

- 55 -

При анализе результатов учитывали клеточный состав субстрата, сделач перерасчет показателей ХЛ на 1 клетку коллоидного ряда В юмент обследования у всех больных была практически тотальная бластная метаплазия костного мозга, в крови состав клеток был не столь однороден, бласты составляли от 57 до 97 Z, всегда присутствовали зрелые гранулоциты и лимфоциты. Больные ХУЛ обследованы в хронической фазе, бластнне формы в костном мозге не превышай 5-10%, определялись все клетки гранудоцитарного ряда Представленные значения ХЛ-ответа с расчетом на 1 клетку ( с нелимфоидными характеристика)«!) носят относительный характер, но дают возможность сравнения полученных данных.

Исследование способности лейкозных клеток к образованию АФК в стандартных условиях показало, что:

1. Лейкозные миелоидные клетки продуцируют АФК. в ответ на сенсибилизацию в количествах, сравнимых с нормальными гра-нулоцитами.

2. У детей с Кб вариантом ОНЛ интенсивность ХЛ-ответа наименьшая, что согласуется с низкой активностью в этих клетках МП и низким содержанием липидов.

3. При ХШ1 - показатели ХЛ ниже, чем в гранулоцитах доноров, однако для вывода о меньшей активности процессов "дыхательного взрыва" в гранулоцитах при ХЫЛ недостаточно экспериментальных данных, необходима высокая техника выделения клеток.

4. Активность ХЛ-ответа клеток костного мозга в исследуемых случаях всегда ниже, чем в крови.

ПОКАЗАТЕЛИ ХЛ-ОТВЕТА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ОЛЛ.

Обследовано 55 детей, больных ОЛЛ, в 1-0« остром периоде до начала лечения. Диагноз поставлен на основании цитохимических исследований лейкозных клеток костного мозга; у 47 детей проведено цитоиммунологическое тестирование с определением варианта ОЛЛ. Одновременное исследование ХЛ-ответа клеток костного мозга и крови сделано у 38 детей, только крови - у

17 ( случаи с высоким лейкоцитозом и бластемией). Полученные результаты проанализированы со следующих позиций:

1. количественные показатели ХЛ-ответа лимфоидных лей-козных клеток - в целом по группе больных;

2. возможные корреляции с цитоиммунологическими маркерами;

3. возможные корреляции с течением болезни, т. е. прогностическое значение изучаемых клеточных характеристик.

У большинства больных ОЛЛ выявляется низкая активность ХЛ-ответа лейкозкых клеток костного мозга и крови, в костном мозге показатели почти всегда ниже, чем в крови. На основании сравнения с результатами обследования лимфоидных клеток крови здоровых людей (таблица 1) условно можно подразделить показатели ХЛ у больных ОЛЛ на низкие ( от О до 50 ед.), средние (50-100) и высокие - > 150. Представлять средние значения по всей группе некорректно,т. к. существуют значительные индивидуальные колебания показателей, при этом в каждом случае отклонений они могут быть объяснены разными причинами. Сгруппировав больных по принципу показателей ХЛ-ответ^. на ЗЮ^клеток костного мозга и крови, мы получили-результаты, представленные в таблице 13. Больные в таблице сгруппированы на основании показателей ХЛ клеток костного мозга и крови - низких, средних и высоких- в 5 групп.

В 78,2% случаев» обследованных больных ОЛЛ определены низкие показатели XJI в костном мозге, что моето считать типичным для лейкоэных лимфоидных клеток ( рис. 6)..

При анализе особенностей клеток с высокой ХЛ можно объяснить эти результаты за счет следующих причин:

1) примесь гранулоцитов морфологически на мазках ( от 10 до 207.) в исследуемой суспензии - у 3-х больных ( 3 группа);

2) наличие 17% клеток с гранулоцитарными антигенами среди бластных клеток костного мозга ( иммунотипирование )- в одном * случае ( 4 группа), что заставило изменить диагноз иа ОМЛ (Мо). Ear в 2-х случаях ( 3 и 5 группы) по данным цитоимаг/но-логических характеристик бластов можно предположить бифеноти-пический вариант ОЛ. Но есть несколько случаев ОЛЛ, где четко не прослеживается гранулоцитарная добавка или наличие грану-

Таблица 13

Показатели ХЛ лимфоидных клеток костного мозга и крови у больных ОЛЛ ( всего 55 детей)

Группа ХЛ Si0_2. mV | на 10® клеток | Z от всех больных ОЛЛ

кост. м. кр. 1 1

1 Низкая вели- . чина ХЛ в к. м . и крови п=29 33.3 10,5 п-32 | 40.6 | 5.2 | 1 58.2 | 1 78.2

II Низкая величина ХЛ в к. м. • средняя в крови п-7 34.1 15; 0 п-11 | 175,8 | 26,2 | 1 20 I 1 1

III Средневы-сокая величина ХЛ в к. м. и кр. п=5 120,6 43,7 П-7 | 380,7 | 83,85 | 1 12.7

IV Шсокая величина ХЛ в к. м (> чем в крови) п=4 400->50000 П-4 | 247,25 | 44.7 | 1 7.2

У Шсокая величина ХЛ в крови (к. м. -нет данных - Л="1 | 2250,0 | 1 1 1.8

Рис. 6. Кинетика активированной ХЛ клеток костного мозга

у больных ОЛЛ

ло-мокоцитарных антигенов в исследуемой суспензии и течение болезни было типично для лимфобласткой формы лейкоза,при необычно высокой аХЯ бласткьж клеток. У 3-х из 4-х больных 4 группы при достоверно более высокой ХЛ клеток костного мозга по сравнению о кровью,- лейкозные клетки имели содаоп-положительный иммунофенотш с высоким содержанием гранудярно расположенного гликогена (PAS-реакция), что характеризует их как лимфобласты. При ТЭЫ в этих клетках обиаруяэна необычная способность образовывать фагоссмы (рис.7). Проведен подсчет относительного количества меток с фагосомамк и количества митохондрий на метку ( таблица 14).

Таблица 14.

Содержание митохондрий и относительное количество фагосомосодержащих клеток при ОЛЛ

Хвариант Лимфоциты о-олл СД + т-олл

\олл • крови ( к. м.) ОЛЛ ( К.М.)

Пока \ доноров (к. м.)

затель

Митохондрии 5,6 5,8 8,7 6.7

на 1клетку

Фагосомо-

содердащие ед. 2,0 35,2 3,0

клетки( %)

ХЛ на БЮ2. нд 41,45 > 1000 11,9

клеток к. м.

г ( число митохондрий -% фагосомосодериащих

клеток) - 0,96г ( число митохондрий - аХЛ)- 0,92 г ( ХЛ -• число фагосомосодержащих клеток)-О,99 Кинетика ХЛ-ответа на БЮ больной М-й, представленная на рис. 8, типична для гранулоцитарных клеток.

Таким образом, в ряде случаев ОЛЛ (по нашим данным 5-75! от обследованных) определяются необычные лейкозные клетки с четкой лимфоидной цитохимической и цитоиммунологотеской характеристикой и наличием способности к фагоцитозу ("миело- лимфо-идные"?). По течению болезни эти дети не отличались от других случаев ОЛЛ, при неинтенсивных программах терапии' продолжительность жизни составила 1,5 - 2,5 года.

.............. ^

...

г Л" - f-: ¿tf ?

N - w'-A'í-H

VcjtAÖC-

i sí «■.■■•••>/. 'v'. ■ ■ - '-ч-vv$ ,

.. V

vAc ...

Г * - '.и*«»'...

§

fs

«

X

Рис. 7. Лимфобдасты в случае Cerraron-положительного 'ОЛЛ. Видны фагосомы. (Фого ГЗМ предоставлены Иконниковой O.A.)

Рис. в. Кинетика ХЛ б-й с Сотгоп + ОЛЛ.

При анализе связи величины ХЛ-ответа лейкозных клеток с различными цитоиммунологическими показателями четких корреляций не выявлено. Из 48 типированных больных не-Т, не-В-вари-ант определен у 31, соттоп-пололительный у 9, Т-клеточный у 8 человек (использованная панель моноклональных антител недостаточна для более точной диагностики). Наиболее низкая ХЛ определялась в ■ группе Т-клеточного ОЛЛ, наиболее высо-кая-сошшоп-положительного (таблица 15).

Таблица 15.

Распределение больных по активности ХЛ костного мозга (Т- и соттоп+-ОЛЛ)

Величина | Относительное количество больных

ХЛ клеток к. м. |

(510£)тУ/10_кл! Т клеточный ОЛЛ Common-t- -ОЛЛ

Низкая | 62,52 22,22

Средняя | 252 33,32

Высокая | 12,52 44,52

Всего больных! 8 9.

Среди 43 детей с низкой ХЛ костного мозга и крови были случаи О- и Т-клеточного ОЛЛ, с наличием гиперлейкоцитоза и резко выраженного гиперпластического синдрома и лейкопеничес-кие формы без увеличения лимфоидных органов; ремиссия получена у 802 этих больных, средняя продолжителность жизни составила около 1 года ( от 1 месяца до 5 лет), выживаемость более 2 лет отмечена у 152, свыше пяти лет - в 102 случаев. В группе ОЛЛ со средневысокими результатами ХЛ-анализа клеток костного мозга ремиссия получена у 83,32 больных, средняя продолжительность жизни была около 18 месяцев, выживаемость более 5 лет - у 16,72 больных. Таким образом, не было корреляции изученных показателей с особенностями течения болезни и с прогнозом. На уровне тенденции оказалось,что крайние отклонения показателей активированной ХЛ в обе стороны могут быть связаны с большим риском плохого прогноза Действительно, Ъамая низкая активация продукции АФК определена при прогностически неблагоприятном T-0JUL Самую высокую можно ожидать или в случае с. необычными клеточными характеристиками (бифекотип, NK-клетки, "фагосомосодержацие бласты"), или при значительном содержании в костном мозге клеток гранулоцитарного ряда (лим-фома?.). что также ухудшает прогноз. В таких случаях необходи-

мо более тиэтельное исследование характеристик властной популяции с целью уточнения их принадлежности к ряду и необходимости соответствующей коррекции терапии.

VI. Защита от оксидантных повреждений: применение в терапии болезней крови

Участие свободнорадикальных реакций с образованием АФК в развитии патологических состояний определяет необходимость соответствующей коррекции. Если активация сниженной продукции А® - задача сложная и по сей день нерешаемая, то препараты с предполагаемым АО эффектом назначают довольно широко, но не всегда оправданно.

Определяя тактику АО терапии важно знать роль АФК в патологическом процессе и локализацию требующих "защиты" молекулярных повреждений: например,ингибиторы ПОЛ не предотвратят повреждения ДНК.

Коррекция свободнорадикальных повреждений может преследовать следующие цели:

1.предупредить избыточную продукцию АФК;

2. обезвредить,ингибировать образовавшиеся АФК, если известно, что они оказывают повреждающее действие;

3. репарировать повреждения,обусловленные АФК;

1. Снизить образование АФК рационально в случаях,когда их гиперпродукция клетками имеет этиологическое или патогенетическое значение. Такой эффект можно получить, если подавить взаимодействие стимулирующего клетки к ответу лиганда с рецепторами ( кортикостероиды?, цитостатики?), или предотвращая передачу "сигнала" через мембрану ( блокаторы кальциевых каналов нефедипин, дилтиазем). Снизить активность ферментных систем, участвующих в образовании АФК -ИАОРН-оксидазы, ксан-тиноксидазы. АДА, ЛО, ЦО и др, можно также с помощью корти-костероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, аллопуринола Элиминация катализаторов биохимических реакций, идущих с образованием АФК, может дать АО эффект: такой механизм имеет терапия хелаторами металлов с переменной валентностью. .

- 64 -

2. А® инактивируются с участием специфических ферментов и неферментативных АО. С участием ферментов инактивируется образование наиболее токсичного гидроксильного радикала.

Неферментные АО работают по принципу "ловушек"-быстро реагируют с АФК с образованием менее реактогенных соединений, защищая таким образом высокоуязвимые молекулы. Это- В-каро-тин, витамин А и ретиноевая кислота - "ловушки" О^и 'о^ (G. Burton , К. V. Ingold ,1984), витамин С, витамин Е, глюггати-он и др. тиолсодержащие низкомолекулягные протеины.

3. Некоторые ДНК-репарирующие ферменты такюе можно отнести к АО системе,т. к. они репарируют вызванные действием АФК разрывы ДНК ( экзо- и эндонуклеазы, полимеразы, лигазы).

АО система многокомпонента, перечень биосоединений с АО потенциями постоянно расширяется. К ним относятся и соединения из группы флавоноидов. Хорошим комплексным АО действием обладает витамин Р (рутин) (Афанасьев И.Б. 1989 ).

Учитывая результаты, полученные при обследовании вышеописанных групп детей, доказательства участия АФК в развитии изученных заболеваний, мы использовали препараты с направленным АО действием в лечении детей с болезнями крови при выявлении нарушений в системе продукции АФК.

. Анемия Фанкони

Исследование окислительного обмена больных АФ показало важное значение гиперпродукции АФК в патогенезе этого заболевания. У большинства детей гранулоциты являются постоянным источником CP соединений кислорода, преимущественно ОН», однако в отдельных случаях способность к активации образования АФК снижена, не достигая средних значений, свойственных лейкоцитам здоровых людей; изменен спектр продуцируемых СР. При этом количество лейкоцитов в крови и костном мозге резко снижено именно за счет гранулоцитов. Поэтому корреляция нарушений продукции АФК у больных АФ должна проводиться после соответствующего комплексного обследования, включающего ХЛ-анализ лейкоцитов крови и активность АО ферментов.

Последующая патогенетическая терапия у больных АФ с вн-

сокой cXJI и аХЛ лейкоцитов крови должна быть кошлексной, преследуя цель: 1) уменьшить продукцию АФК; 2) использовать "ловушки" с направленностью на ингибирование ОН' и 3) активизировать репарацию ДНК.

В эксперименте с добавлением в. ХЛ-систему in vitro различных. "ловушек" и ингибиторов с последующей оценкой продукции АФК лейкоцитами больных АФ, получены результаты, представленные на рис. 5. Наибольший ингибирующий эффект оказывают рутин и маннитол.

Рутин также подавляет активность ЛО и является хелатором железа, не обладает токсическим и кумулятивным действием (И.Б. Афанасьев, с соавт., 1988) .Это позволяет использовать рутин для лечения больных АФ.

Ыы назначали рутин в дозе 10-40 mg/кг массы в сутки для постоянного приема 9 детям с АФ. Одна больная получает рутин почти пять лет, 2-е больных - более 1 года, 2-е детей - в течение 5 месяцев; еще четверо детей начали лечение 1-2 месяца назад. Результаты представлены на рис. 9.

Таким образом, при длительном постоянном приеме рутина активация продукции АФК достигает нормальных показателей. Активность СОД и каталазы до и в динамике лечения рутином представлены в таблице 16. Для.сравнения даны результаты обследования в динамике детей с АФ при непостоянном приеме рутина (IIL Ю.) и без лечения (М-о);

Активность СОД в эритроцитах при длительном наблюдении больных без лечения менялась незначительно; при лечении рутином показатели активности ферментов эритроцитов коррелировали с динамикой выраженности анемии и меньше - тромбоцитопении.

При длительном ( более 3 месяцев) лечении рутином в адекватной дозе у детей с АФ улучшились клинико-лабораторные показатели ( исходные значения представлены в таблице 6>. Все пять человек ( случаи 11-15), получающих АО терапию, стали независимы от трансфузий, не получают кортикостероидов. Больная Д. 3. (сл. 12), которая получата монотерапию рутином (200 mg/день) в течение более 3 лет, при последнем обследовании ( 1 год назад) находилась в состоянии клинической ремиссии: девочка выросла, физическое и психическое развитие соответствуют

Рас. 9. Динамика активности ХЛ до и после лечения ругином.

Еозрасту, болеет редко. В анализа:', крови умеренная тромбоцито-пения (55-75 тыс.х 10^/л), легкая анемия (НЬ-105-115 'г/л), лейкоциты 4,5-5,5 х 1С$л при 40-50Х гранулоцктов). При цитсге-нстическом анализе лимфоцитов крови относительное содержанке клеток с типичными хромосомными аберрациями уменьшилось с 15,5?. до 7.7Х.

Таблица 16.

Показатели активности АО ферментов эритроцитов и гемограммы в динамике течения болезни и лечения рутином у больных АФ *'

\Б-Й | М. Е. ГЬэк&ч | сл. 13 сл. 14 Д.З. | сл. 12 | 1 и-0 | Ш.1й сл. 2 | сл. 9 1

СОД • |2.813,6 ¡2,2 1 1 1 2,7|4,0|1.8 1 | 2,8|2,9|2,5| 1 1 1 2,б|2,б|2,7| 3.0 1 1 1

1 .1 1 Кат. 16,4113.6! -НЬ г/л| 46|125 |76 трхшЬм 50Ц20 |81 1 1 1 1 1 16,2114.5 -38 |113|80 ед. |50 |28 1 1 • 1 1 1 15,5 7,7 11, 56| 77|125| 28|190| 72| 1 1 1 1 1 1 9 7.2 6.3 - | -77| 77| 82|126 20| ед| 59|32 1 I I

интервал 6 месяц. 6 месяц. 1 год | 1 9 месяц| 2 года 1

*) -.1-ый столбец в каждом случае включает показатели до

начала лечения.

?а!с;м образом, полученные результаты дают основание использовать рутин для лечения больных АФ с высокой продукцией АФК в качестве основного АО препарата в ремиссии для поддержания стабильного состояния окислительного метаболизма - под контролем показателей анализов крови и ХЛ лейкоцитов. Эффективность терапии связана со временем ее начала относительно появления симптомов аплазии, ее непрерывностью, дозой и качеством используемого препарата

Поскольку у больных АФ с низкой продукцией АЖ спектр их изменен за счет высоКореактогенного гидроксильного радикала, использование для лечения "ловушки" ОН */рутина у них также оправданно и оказывает лечебный эффект. Такую терапию" получает одна больная ( сл. 16), у которой до начала программного лечения отмечалась тяжелая анемия и тромбоцитопения, агранулоци-тоз. Назначение преднизолона ( 1 п^/кг массы) и метандросте-нолона (0,2 т^/кг массы) привело к повышению числа лейкоци-

тов, через 2 месяца лечения в анализах крови оставалась анемия (до 75 г/л), тромбоциты единичные. Через 5 месяцев после присоединения к терапии рутина ( 20ге/кг/день) и снижения дозы преднизолона до 0,2 те/кг массы) у девочки значительно улучшилось состояние, в анализах крови НЬ-98-105г/л ( без ге-мотрансфузий), тромбоциты 40-69x1О/л, лейкоциты 2,5-3,4x10/л при 38-40% гранулоцитов. В настоящее время девочка продолжает получать метандростенолон и рутин.

Приведенные данные позволяют оценить положительно эффект АО терапии у детей с АФ и рекомендовать для этой цели рутик. Никаких проявлений токсичности не наблюдали (оценка по шкале токсичности).

Антиокисдантные действие хелаторной терапии.

Многие больные с синдромом анемии различной этиологии гемолитической, апластической - имеют перегрузку тканей соединениями восстановленного железа ( ферритин), у них определяется высокое содержание сывороточного железа и ферритина

Независимо от этиологии, перегрузка клеток и тканей железом - фактор, усиливающий окислительные их повреждения вследстие образования высокотоксичных гидроксильного и фер-рильного радикалов из низкореактогенных О^и Н^О 2.с участием Ре2+ в качестве катализатора-

_3+ я +

О о + Н,0о-—-А; ОН* + 0Н"+ 0_+ Ре"

1 е.

Хелатирование металлов из системы имеет АО действие , конечный эффект лечения хелаторами клинически проявляется в уменьшении симптомов кардиопатии и гепатоза, снижении потребности в трансфузионной терапии у больных с талассемией и анемией Даймонда-Блэкфана (АДБ) (М.С1теУ1оп 1990, В. НаШ*е11, 1991). Мы обследовали группу детей с анемиями различной этиологии ( гемолитическими, АФ) которые имели перегрузку железом и получали лечение хелаторами - с целью сопоставить эффект хелаторов на продукцию АФК лейкоцитами и содержание АО Ферментов в эритроцитах и плазме с оценкой клинического эффекта те-

рапии. Кроме того, обследованы больные с АДБ в динамике при длительном наблюдении, периодически получающие хелаторную терапию - для сравнения показателей параллельного анализа окислительного обмена и обмена железа.

Оценка непосредственного действия хелаторов в ходе терапии проведена у 2 больных с гемоглобинопатией, одного с АФ и 3-х детей с АДБ. Клинико-лабораторные показатели до начала * лечения представлены в таблице 17.

В процессе лечения у больных с патологией строения НЬ (1 и 2) изменения активации образования АФК были однонаправ-ленны- по отношению к содержанию ферритина в крови, более значима корреляция показателей ХЛ и ферритина гемолизата. У больного 3. (АДБ) эта тенденция прослеживалась не столь значимо, а у больной 4 (АФ) при увеличении содержания ферритина в крови показатели ХЛ не увеличивались, изменения были, разнонаправленны.

При гемолитических анемиях, обусловленных нарушениями структуры НЬ, усилена внутриклеточная эндогенная продукция 0£" , и образование ОН«-радикала прямо связано с содержанием Ре ферритина. При АФ 'источник гиперпродукции гидроксила иной (лейкоциты) и вклад реакции, катализируемой ионами железа в

Таблица 17.

Клинико-лабораторные показатели у больных с перегрузкой железа до лечения хелаторами

Б-ые Пол Еоз- Диагноз|НЬ Ц | Тр| Ре|Ферритин|ХЛ (ус. ед)|СОД | | I I Iм/моль/лI На

раст I I I I I_I I I

годы | |10 110 |сыв|сыв. |гем| б/а|1.а1 |ед.

I I л| л| | | | | | 11111111 I

1.Р-0 жен 6|В-таласс|104|3,6|128| 40|5800|175| 21 1 95 |1,4

2.Ф-в муж 13|нестаб. |100|13.3 200 31|326 | 811 36 1478 |3,2

|НЬ-патия| | III I | I |

3. П-в муж. 10| АДБ |63 |5.2|115|41,5 7800 434 7 | 100 Ц.68

4. Н-0 жен 81 АФ- 178 |1,2| 20| 49120841389125 | 188 11.54

этот процесс, по-видимому, не имеет столь большого значения.

Динамика показателей ХЛ лейкоцитов крови и содержания ферритина в сыворотке больной А. К., 10 лет, на протяжении 5 -летнего наблюдения представлены на рис. 10.

Таким образом, хелаторная терапия дает положительный долгосрочный эффект, уменьшая образование АФК, особенно при талассемиях и АДБ. В ходе терапии, однако, повышается содержание Ре-содержащих соединений в крови, что может быть причиной побочных эффектов. Уменьшить риск развития осложнений возможно с помощью назначения одновременного с хелаторами АО с преимущественным связыванием ОН--радикалов ( рутин, тиолсо-держащие соединения).

ееСсрыт

1 ХЛ

вога сооо

4000

2000

- Б

В37

1980 «О^

«ирнлм

(990

Г391 1992 XI? м ЬаЬ

Рис.10. Динамика содержания ферритина и активация ХЛ (1а1ех-зависимой) б-й А.К (АДБ).

Изменения в системе образования АФК, выявленные у детей, живущих в условиях загрязнения радионуклеидами ( высокая продукция лейкоцитами крови вне зависимости от сенсибилизации, истощение механизмов активации), требуют коррекции. С этой целью целесообразно использование "ловушек" ОНЧдля предупреждения повреждения ДНК и мутагенеза, а такте образования КФ); желательно также по возможности репарировать повреждения ДНК, если таковые имеются, и использовать мембранопротекторы и активаторы ионных насосов - при выявлении изменений в этом звене системы (снижение активации ХЛ, задержанная стимуляция). Исходя из теоретических посылок, целесообразно постоянное длительное удаление избытка АФК, вернее - коррекция, что диктует необходимость использовать нетоксичные препараты с .минимальными побочными проявлениями без кумулятивного эффекта. Таким действием обладают рутин и витамин Е, селен, рети-ноиды.. При низкой активации ХЛ, нормальной активности СОД и каталазы есть основания использовать витамин Е. В результате терапии рутином у детей с изменениям! окислительного обмена под влиянием действия малых доз радиации ( 8 человек) снижалась величина спонтанной ХЛ, активированная ХЛ снижалась или повышалась, что не имеет принципиального значения, важно, что соотношения сХЛ и аХЛ становились такими, такие свойственны здоровым людям. В результате изучения закономерностей СР продукции у лиц, подверженных действию малых доз радиации, можно заключить, что именно эти исследования дакгг объективные критерии риска развития серьезной патологии. АО препараты можно рекомендовать с целью их профилактики.

Заключая обзор результатов изучения различных аспектов биологии АФК - в норме и при заболеваниях крови, считаем необходимом! повторить, что АФК являются важнейшими факторами защиты клеток и тканей от инфекций, обеспечивают регуляцию клеточных взаимодействий, но могут быть причиной необратимых клеточных повреждений, ведущих к развитию тяжелейшей патологии - от злокачественных опухолей до аутоиммунных заболеваний. Изучение-СР процессов требует высокого уровня технического обеспечения, комплексного анализа многих факторов, кото-

рые необходимо учитывать для оценки всего явления в целом.

Вмешиваться в эти процессы без знания общих законов явлений не просто бесполезно» но опасно, т. к. может привести к непредсказуемым последствиям.

ВЫВОДЫ:

1. Обнаружено, что при гемолитических анемиях различного генеза (наследственном микросфероцитозе, гемоглобинопатиях, дефиците ферментов эритроцитов) в эритроцитах крови снижена активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, что хорошо коррелирует с выраженностью анемии. Лейкоциты крови генерируют повышенное по сравнению с нормой количество активных форм кислорода.

2. Показано, что у больных анемией Фанкони значительно изменяется по сравнению с нормой продукция активных форм кислорода лейкоцитами крови : в 55% случаев резко повышено спонтанное их образование, в 38% случаев - активированное. У 18% детей с анемией Фанкони снижена способность лейкоцитов к активации, что коррелирует с тяжелым течением болезни. В отличие от здоровых людей при анемии Фанкони в спектре продуцируемых лейкоцитами активных форм кислорода преобладают высокотоксичные гидроксильные радикалы.

3. У клинически здоровых родственников больных анемией Яанкони выявлены нарушения окислительного метаболизма; увеличение образования активных форм кислорода лейкоцитами крови, снижение активности антиоксидантных ферментов, на основании чего предполагается возможность наследования особенностей окислительного обмена.

4. Показано, что у большинства детей, живущих в условиях действия малых доз радиации, увеличена спонтанная и относительно снижена активированная продукция активных форм кислорода лейкоцитакш крови. У 20% обследованных детей способность к активации резко повышена; предложено отнести их в группу риска развития свободнорадикальной патологии.

5. Властные клетки костного мозга и крови при лейкозах сохраняют закономерности продукции активных форм кислорода, характерные для нормальных клеток аналогичной популяционной