Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Свободно-радикальное окисление, дисфункция и дизрегуляция клеток крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе

Ахматов Владимир Юрьевич

СЮ344ВВ 12 СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ДИСФУНКЦИЯ И ДИЗРЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОК КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ГЕМОДИАЛИЗЕ

14 00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 СЕН 2008

Челябинск - 2008

003446812

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ" на кафедре патофизиологии

Научный руководитель-

доктор медицинских наук,

профессор КРИВОХИЖИНА Людмила Владимировна

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук,

профессор ДОЛГИХ Владимир Терентьевич

доктор медицинских наук,

профессор ГУРЕВИЧ Константин Яковлевич

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Российскии государственный медицинский университет Росздрава» (г Москва)

Защита диссертации состоится ^ ^ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208 117 02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» (454092, г Челябинск, ул Воровского, 64)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Росздрава (454092, г Челябинск, ул Воровского, 64)

Автореферат разослан « ^ »¿^-ит^ Г?Р 9 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Тишевская Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

На 1 млн населения в развитых странах приходится 200-250 больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН), из них 70 - 80 человек ежегодно умирают Такие тяжелые поражения почек развиваются в трудоспособном возрасте у женщин до 40 лет, у мужчин после 40 лет (Шейман Д А, 2002) Патофизиологические проявления терминальной ХПН разнообразны, включают нарушения водно-электролитного, кислотно-основного, липидного, белкового, углеводного обменов, кроветворения, гемостаза, терморегуляции, гормональной регуляции, гемодинамики, развитие гипоксии, синдрома эндогенной интоксикации В 100% случаев у больных терминальной ХПН развиваются анемия, гиперволемическая или ренинзависимая гипертония, сердечно-сосудистые нарушения, которые являются наиболее частой причиной смерти у больных ХПН (Шугушев XX и др , 2003), в 24-60% случаев развиваются инфекционные осложнения, что значительно ухудшает прогноз заболевания и реабилитацию больных Основой инфекционных осложнений является вторичный иммунодефицит, прогрессирующий по мере ухудшения деятельности почек (Гринштейн Ю И и др , 1993, Емец В И и др , 1980, Филипцев П Л , 1988, Сочнев А М и др , 1989) Наиболее распространенное лечение данной категории больных -гемодиализ или перитонеальный диализ Но диализная терапия имеет свои показания, противопоказания и осложнения Указывается, что у больных получающих ге-модиализную терапию ИБС развивается в 3-10 раз чаще, чем у больных ХПН без диализа, отмечается наличие аритмии, гипотонии или «синдиализной» гипертонии (Багрий АЭ , 1998, Шугушев XX и др , 2003) Для ХПН характерно развитие синдрома нарушенного равновесия (Громов А Е и др , 1982), когда исчезает структурная и функциональная взаимосвязь между клетками крови и жидкой частью, усугубляемая гемодиализной терапий Наличие синдрома эндогенной интоксикации обусловливает развитие клеточной дисфункции, в том числе и нарушение экспрессии регуляторных цитокинов Кроме того, сама процедура гемодиализа может вызвать или усилить проявления клеточной дисфункции и дизрегуляции

Нарушение функции эндотелиоцитов, клеток крови и дизрегуляция может вносить определенный вклад в клинические проявления ХПН, в частности, развитие гипертонии и гипотонии, атеросклероза, ИБС, инфекционных осложнений, нарушение гемостаза, формирование анемии Знание новых механизмов развития терминаль-

ной ХПН у пациентов, находящихся на гемодиализе, будет способствовать улучшению технологий лечения, сохранению и улучшению качества жизни больных Все вышеизложенное определяет актуальность и цель исследования

Цель исследования Установить наличие, проявления и некоторые механизмы дисфункции и диз-регуляции клеток крови у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

Задачи исследования

1 Исследовать интенсивность свободно-радикальных процессов в жидкой части и клетках крови у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

2 Исследовать образование метаболитов оксида азота у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

3 Исследовать агрегацию тромбоцитов, деформабильность и агрегацию эритроцитов, электрический заряд и электрофоретическую подвижность клеток крови, межклеточные взаимодействия у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

4 Исследовать содержание железа, насыщение трансферрина, содержание ферритина у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

5 Исследовать содержание эритропоэтина, интерлейкинов ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4 у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

6 Исследовать активность системы комплемента у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа

Научная новизна исследования Впервые показано, что у больных терминальной хронической почечной недостаточностью на фоне окислительного напряжения в организме гемодиализ еще более увеличивает активность этого процесса После гемодиализа возрастает спонтанная хемилюминесценция крови, количество конечных продуктов ПОЛ, концентрация нитритов и нитратов Выраженность процессов СРО связана со сроком ХПН и количеством гемодиализов Характерно усиление свободно-радикальных процессов в додиализный период в эритроцитах и тромбоцитах Гемодиализ активирует СРО в тромбоцитах, но снижает в эритроцитах Для больных с ХПН характерна дисфункция

клеток крови нарушение деформабильности и агрегации эритроцитов, агрегации тромбоцитов, заряда и электрофоретической подвижности всех клеток крови, межклеточных контактов Гемодиализ способствует возрастанию дисфункции тромбоцитов, восстановлению функции эритроцитов У обследованной категории больных не отмечено нарушений в обмене железа, но диализ способствует снижению феррити-на и у 40% его концентрация находится в пределах 18-32 мкг/л Впервые установлено, что у больных ХПН содержание ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4 отлично от их количественного представительства в норме Гемодиализ приводит к снижению уровня ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-4, не изменяет содержание ИЛ-2, активирует сниженную до диализа активность комплемента

Теоретическая и практическая значимость исследования Выявление новых частных и общих проявлений, механизмов дисфункции и дизрегуляции клеток крови при терминальной ХПН имеет большое значение для развития патофизиологии почек Патофизиологические и клинические проявления у больных ХПН, находящихся на гемодиализе в определенной мере обусловлены самой процедурой гемодиализа Гемодиализная процедура, с одной стороны, способствует удалению уремических токсинов из организма, с другой - неоднозначно влияет на функциональное состояние клеток, цитокиновый профиль, содержание ферри-тина, активность комплемента, усиливает свободно-радикальное окисление в крови Изменение цитокинового профиля до и после гемодиализа может быть одной из причин развития анемии, вторичного иммунодефицита у данной категории больных Полученные результаты важны для развития медицины, патофизиологии, нефрологии и могут быть использованы в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов Практическое значение работы состоит в том, что дано патогенетическое обоснование необходимости внедрения новых медицинских технологий с целью коррекции свободно-радикального окисления, клеточной дисфункции и дизрегуляции у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе Методы исследования хемилюми-несценции плазмы и клеток крови позволяют объективно оценивать интенсивность окислительного напряжения у больных хронической почечной недостаточностью и эффективность процедуры гемодиализа

Основные положения, выносимые на защиту

1 У больных в додиализный период активированы процессы свободно-радикального окисления Процедура гемодиализа способствует еще большей активации этого процесса

2 У больных терминальной хронической почечной недостаточностью установлена дисфункция клеток крови, проявляющаяся активацией СРО в тромбоцитах и эритроцитах, нарушением агрегации тромбоцитов, снижением деформабильно-сти эритроцитов, снижением электрофоретической подвижности клеток крови Гемодиализ приводит к еще большему нарушению функции тромбоцитов, способствует восстановлению функции эритроцитов и заряда клеток крови

3 Дизрегуляция у больных терминальной хронической почечной недостаточностью подтверждается изменением представительства ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-2, отсутствием повышения эритропоэтина при наличии выраженной анемии Гемодиализ проводит к снижению ИЛ-1, ИЛ-З и ИЛ-4, ферритина и активации комплемента

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для кандидатских диссертаций

Апробация работы Основные положения диссертации представлены на VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2007), V итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2007), международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007), научно-практической конференции, посвященной 69-летию Челябинской областной клинической больницы «Актуальные проблемы практической медицины» (Челябинск, 2007)

Внедрение результатов исследования Результаты исследования внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология почек», «Патофизиология системы крови», «Биохимия крови», «Биохимия мочи», «Регуляция водно-солевого обмена» в ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава», ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Росздрава» Методы исследования

эритроцитов внедрены в научную работу кафедры патофизиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» и в практику отделения диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница» Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 163 страницах, содержит 34 таблицы и 15 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Список литературы включает 307 источников (77 отечественных и 230 зарубежных)

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Обследовано 80 больных с терминальной почечной недостаточностью в возрасте от 23 лет до 61 года (средний возраст 45,72±2,06 лет) Из них 41 женщина и 39 мужчин Основными причинами ХПН явились хронический пиелонефрит (35%), хронический гломерулонефрит (40%), артериальная гипертензия (8%), поликистоз почек (7%), амилоидоз почек (7%), сахарный диабет (3%) Стаж заболевания составил от 1 до 14 лет (в среднем 4,44±0,55 лет) Критерий включения больных - терминальная хроническая почечная недостаточность Критерии исключения - наличие гепатита, ВИЧ-инфекции, острых воспалительных заболеваний

Все больные 2 раза в неделю получали гемодиализную терапию в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница» на аппаратах 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» в течение 5 часов Диализаторы полисульфоновые фирмы «Fresenius» F7HPS или F8HPS Объемная скорость кровотока - 300 мл/мин -350 мл/мин Количество диализов у обследуемых - от 162 до 1360 (в среднем 438±52) Величина диализной дозы Kt/V составила от 0,89 мл/мин до 2,06 мл/мин (в среднем 1,42±0,08 мл/мин) Кровь для исследований брали из артериального колена артерио-венозной фистулы до и после сеанса гемодиализа Мочу у пациентов собирали непосредственно до и сразу после гемодиализа Группой контроля служили 75 практически здоровых людей - кадровых доноров областной станции переливания крови

Гематологические методы Количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами АДФ-индуцированную аг-

регацию тромбоцитов определяли турбидиметрическим методом Борна в модификации Люсова ВА и др (Люсов В А, 1976, Born G V R, 1962) Эритроцитарно-тромбоцитарные взаимодействия исследовали в суспензии эритроцитов и тромбоцитов О величине поверхностного заряда эритроцитов судили на основании показателей агрегации эритроцитов, индуцированной альциановым голубым по (Bernard AM et al, 1988, Halbhuber К J et al, 1977) Деформабильность эритроцитов исследовали на эктацитометре (Bessis M et al ,1980, Сторожок А Г и др , 1997) Использован полупроводниковый лазер LDM 635 3 S 5 (ООО НТЦ «Лазерные технологии», г Новосибирск) Элекгрофоретическую подвижность и плотность поверхностного электрического заряда клеток крови определяли по микрометоду (С С Храмоненко, 1974), с измерением скорости перемещения клеток в электрическом поле

Биохимические методы Сывороточное железо определяли калориметрическим методом с хромазуроном фирмы «Human» (Германия) на аппарате «Rayto RT 1904 С» (США) Ферритин определяли методом ИФА с реактивами фирмы «Veda, 4АВ» на аппарате «Linge» (Германия) Концентрацию мочевины и креатинина в сыворотке определяли соответственно энзиматическим колориметрическим методом и кинетическим методом без депротеинизации на аппарате «Roki-6T» (СПб) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия) Концентрацию в сыворотке холестерина, триглицеридов, липопротеидов оценивали фотокалориметрическим методом на аппарате «Flexor Е» Vitalab (Нидерланды) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия) Уровень продукции эндогенного оксида азота оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов NO (NOz) с помощью реакции Griess по методу (Емченко H Л и др , 1994) в модификации Коробейниковой Э H Результат выражали в мкмоль/л

Хемилюминесцентные методы Регистрацию хемилюминесценции (ХЛ) осуществляли на аппарате «ХЛ-003» (Фархутдинов Р Р и др, 1998) Исследовали ХЛ плазмы (спонтанную и индуцированную двухвалентным железом), эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, мочи Для усиления свечения клеток применяли раствор люминола («Реахим», чда) в диметилсульфоксиде в конечной концентрации 1-10"8 M Иммунологические методы Уровень общей активности комплемента в плазме определяли методом титрования по 50 % гемолизу (Кэбот, Э и др, 1968, Резникова Л С, 1967) Содержание интерлейкинов ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4 определяли методом иммуноферментного анализа на «Multiscan plus» («Labsystems», Фин-

ляндия) с использованием тест-систем фирмы «Протеиновый контур» (ГНЦ НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) и фирмы «Цитокин» (ГНЦ НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург)

Статистические методы Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6 0» (Гланц С ,1999, Реброва О Ю , 2006) Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием параметрических (t - критерий Стьюден-та, парный t - критерий Стьюдента, F - точный критерий Фишера) и непараметрических критериев U - критерий Манна-Уитни, WW - критерий Вальда-Вольфовитца, КС - критерий Колмогорова-Смирнова, W- парный критерий Вилкоксона Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициенты корреляции Пирсона (г), Спирмена (R), Тау-Кэнделла (ТК) Отличия считали статистически значимыми при р<0,05

Результаты исследования и их обсуждение 1 Состояние процессов свободно-радикального окисления у больных ХПН, находящихся на гемодиализе

У больных терминальной хронической почечной недостаточностью активируются процессы свободно-радикального окисления, что подтверждается возрастанием индуцированной хемилюминесценции сыворотки крови, повышением конечных метаболитов ПОЛ в крови (табл 1) Компенсаторное повышение активности антиокислительных ферментов (Кривохижина Л В , Солодовникова О А , 2003) обеспечивает сохранение спонтанной светимости сыворотки крови на уровне контрольных значений

Таблица 1

Показатели свободно-радикального окисления в плазме у больных ХПН (M±m, s)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=13 Группа 2 (до диализа) п=25 Группа 3 (после диализа) п=25

СС, у е • мин 0,93±0,03, 0,12 1,50±0,09, 0,45* (КС) 1,23±0,06, 0,29*"(КС)

СпС, у е 0,13±0,02, 0,08 0,13±0,02, 0,10 0,10±0,02, 0,07

БВ, у е 1,49±0,28, 1,04 3,95±0,20, 1,01*(КС) 3,34±0,14, 0,72*** (КС)

МДА, нмоль/л 3,7±0,1 4,8±0,2 *(КС) 5,89±0,25 **(КС)

ШО, мкмоль/л 0 0,20±0,01 0,30±0,01**(КС)

Примечание Здесь и далее * - достоверные (р<0,05) отличия с группой 1, ** -с группой 2 по ^критерию, Т - парному критерию, II - критерию Манна-Уитни, WW-критерию Вальда-Вольфовитца, КС - критерию Колмогорова-Смирнова

Процедура гемодиализа достоверно снижает светосумму свечения и быструю вспышку в сыворотке крови, которые все же остаются выше значений контрольной

группы Снижение у больных активных кислородных метаболитов при гемодилизе, вероятнее всего, обусловлено их адекватным выведением, эффективной работой ферментативной антиокислительной защиты, а не снижением их продукции, так как после гемодиализа в крови возрастает количество конечных продуктов ПОЛ - Шиф-фовых оснований

В роли активаторов СРО могут выступать гипоксия, свободные металлы переменной валентности, хроническое воспаление, эндогенные токсины, сама процедура гемодиализа Действительно, имеется прямая корреляционная зависимость (г-0,62, р=0,002) между быстрой вспышкой (БВ), характеризующей накопление пере-кисных продуктов в крови, и КТЛ/ Выраженность свободнорадикального напряжения в крови связана со сроком ХПН и количеством гемодиализов Это подтверждается коэффициентом корреляции между светосуммой свечения (СС) и сроком ХПН (г-0,58, р=0,005), количеством гемодиализов (г-0,58, р=0,005)

Диализные больные подвержены воздействию ряда факторов, которые как стимулируют, так и ингибируют продукцию N0 Контакт крови с мембраной диализатора приводит к высвобождению цитокинов, регулирующих уровень оксида азота (Sarkar SR et а!, 2004), активации клеток крови - тромбоцитов и лейкоцитов, функция которых сопряжена с синтезом NO У больных терминальной ХПН уровень нитрита и нитрата в додиализный период повышен (табл 2)

Таблица 2

Влияние гемодиализа на содержание продуктов NOy больных ХПН (M±m, s)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=15 Группа 2 (до диализа) п=18 Группа 3 (после диализа) п=18

N0*2 мкмоль/л 3,40±0,22, 0,65 5,38±0,62, 2,61 *(Т) 8,43 ± 0,79, 3,39 * ** (Т)

ЫОз мкмоль/л 11,01 ±0,66, 1,97 16,99±1,34, 5,68 *(U) 18,94 ±1,51,6,39 *(U)

N0 х мкмоль/л 14,39±0,69, 2,07 21,69±1,76, 7,47 *(U) 27,36 ±1,99, 8,44 *(U) **(Т)

Гемодиализная процедура способствует еще большему повышению нитритов и нитратов в крови Их количественное представительство зависимо от двух факторов интенсивности продукции и скорости их выведения из организма при гемодиализе Количество пациентов с нормальным уровнем суммарного представительства метаболитов оксида азота после диализа снизилось с 22,2 % (до диализа) до 5,5% Цитотоксичность N0 зависит от его концентрации, возрастает при ацидозах, окислительном стрессе, вызывает иммуносупрессию и ингибирует пролиферацию клеток костного мозга, что может быть одной из причин анемии при хронической почечной

недостаточности (Punjabi С J et al, 1992) Установлена достоверная отрицательная корреляционная связь между количеством нитритов и эритроцитами (г= - 0,484, р = 0,04)

Повышение метаболитов оксида азота может быть компенсаторным ответом эндотелиальных клеток на вторичную артериальную гипертензию, которая отмечается в нашем исследовании у 84% больных терминальной ХПН Примерно у 10% больных во время сеанса гемодиализа возникает гипотония, которую провоцируют гиповолемия, недостаточно биосовместимые мембраны, гипонатриевый диализи-рующий раствор (Николаев А Ю , 1990, Рябов С И , 1997) Можно предположить, что причиной острой гипотонии может быть возрастание концентрации оксида азота во время гемодиализа Повышение метаболитов оксида азота в постдиализный период может быть результатом активации тромбоцитов и лейкоцитов, мощных его продуцентов, в результате контакта с диализной мембраной Активация клеток крови в результате гемодиализа подтверждается возрастанием более чем в 8 раз спонтанной хемилюминесценции крови (до диализа 0,33 ± 0,08 уе , после диализа 2,66 ± 0,70 у е ) Для больных ХПН в додиализный период характерна активация СРО в тромбоцитах, проявляющаяся повышением спонтанного свечения, амплитуды медленной вспышки и интегрального индекса-светосуммы свечения, укорочением латентного периода медленной вспышки {табл 3) Гемодиализ еще более активирует тромбоциты светосумма свечения возрастает более чем в 2,5 раза, активируется быстрая вспышка

Таблица 3

Влияние гемодиализа на показатели ХЛ тромбоцитов у больных ХПН (M±m, s)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=11 Группа 2 (до диализа) п=25 Группа 3 (после диализа) п=25

Спонтанная светимость у е 0,12±0,027, 0,089 0,29±0,06, 0,25 *(U) 0,80±0,27,1 09 *(U)**(T)

Амплитуда быстрой вел у е 1,96±0,23, 0,77 2,74±0,79, 3,27 8,64±2,60, 10,55 * (WW)" (Т)

Амплитуда медленной всп у е 2,82±0,38, 1,27 5,09±1,34, 5,50 *(U) 11,18±3,06, 12,26 * (WW) "(Т)

Светосумма, у е мин 15,27 ±1,59, 0,9 26,94±6,5, 26,9 70,5±20,05, 80,2 * (WW)" (Т)

Длительность АБВ, мин 1,11 ±0,05, 0,16 1,10±0,12, 0,50 *(WW) 1,02±0,04, 0,18

Длительность быстрой всп, мин 2,57±0,13, 0,45 2,05±0,34, 1,43 *(WW) 1,73±0,17, 0,69 *(U)

Лат период медленной всп , мин 0,83±0,07, 0,233 0,39±0,04, 0,20 *(WW) 0,49±0,12, 0,48 *(U)

Для терминальной ХПН характерно развитие анемии мультифакторного генеза Одним из механизмов развития анемии при терминальной ХПН является укорочение срока жизни эритроцитов, обусловленное активацией свободно-радикальных процессов в мембранах эритроцитов, что доказывается повышением спонтанной светимости эритроцитов, светосуммой свечения и максимальной светимости (табл 4) Гемодиализ приводит к понижению всех показателей хемилюминесценции эритроцитов, которые все же остаются выше контрольных значений Снижение свободно-радикальных процессов в эритроцитах в результате гемодиализа позволяет выделить дополнительный механизм повышения резистентности эритроцитов у больных терминальной ХПН после диализа

Таблица 4

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=11 Группа 2 (до диализа) п=25 Группа 3 (после диализа) п=25

Светосумма, у е мин 5,93±0,5, 1,70 32,03±5,39, 26,98 •(и) 13,06±2,90, 14,69 * (К-Э) ** (Т)

Спонтанная светимость у е 0,36±0,04, 0,14 1,47±0,33, 1,34 0,68±0,11, 0,49 * (К-Э) ** (Т)

Максимальная светимость, у е 0,98±0,08, 0,28 5,89±1,47, 7,4 1,99±0,43, 2,17 * (К-Э) ** (Т)

На фоне активации свободно-радикальных процессов в организме при ХПН нарушено выведение либо образование активных кислородных метаболитов в почках, что подтверждается снижением хемилюминесценции мочи (табл 5) Светосум-ма свечения мочи в два раза ниже относительно контроля, снижена спонтанная светимость и быстрая вспышка Существует представление, что уменьшение ХЛ мочи связано с наличием в ней молекул средней молекулярной массы (Фархутдинов Р Р , 1996)

Таблица 5

Влияние гемодиализа на ХЛ мочи у больных ХПН (М±т, э)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=10 Группа 2 (до диализа) п=10 Группа 3 (после диализа) п=10

СС, у е *мин 11,51 ±0,99, 3,15 5,98 ±1,70, 4,50 * 14,36±2,6, 6,88 ** (и)

СпС, у е 0,49±0,12, 0,39 0,084±0,03, 0,09 * 0,28±0,08, 6,88 ** (и)

БВ, у е 14,01 ±1,63, 5,15 4,84±0,90, 2,60 * 9,20 ± 2,02, 5,35

Гемодиализ способствует повышению хемилюминесценции мочи за счет улучшения деятельности почек либо за счет удаления из организма веществ средней и низкой молекулярной массы

2 Дисфункция клеток крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе

У больных терминальной ХПН установлено нарушение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (табл 6) Снижена амплитуда, время, скорость первой волны агрегации, амплитуда и скорость второй волны агрегации, что в совокупности приводит к снижению максимальной амплитуды и скорости агрегации Гемодиализ приводит к еще большему нарушению функции тромбоцитов, возможно, за счет процесса секреции при контакте с диализной мембраной Снижается амплитуда, скорость 1-й волны агрегации, время 2-й волны агрегации Таким образом, гемодиализ в большей мере нарушал рецепцию тромбоцитов на внешние сигналы

Таблица 6

Влияние гемодиализа на показатели агрегации тромбоцитов (М±т, э)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=12 Группа 2 (до диализа) л=25 Группа 3 (после диализа) п=25

МА, % 29,02±2,57, 8,52 18,99±1,44, 7,19* 16,23±1,23, 6,17* **(\ЛМ/)

ВА, мин 8,09±0,51, 1,71 8,57±0,53, 2,66 7,72±0,44, 2,22

СА, %/мин 3,62±0,25, 0,84 2,31±0,17, 0,87* 2,13±0,14, 0,71 * (и)

А-|, % 24,46±2,26, 7,48 15,29±1,19, 5,98* 12,21 ±1,01, 5,05* ** (\ЛЛЛ/)

В<|, мин 4,06±0,20, 0,67 3,55±0,19, 0,97* 3,58±0,28, 1,38

С1, %/мин 6,07±0,55, 1,84 4,44±0,38, 1,92 3,66±0,30, 1,52 *

А2, % 4,55±0,39, 1,32 3,59±0,33, 1,65* 3,60±0,38, 1,91 *

Вг, мин 4,03±0,43, 1,42 5,02±0,42, 2,10 4,13±0,30, 1,52 **(Т)

С2, %/мин 1,17±0,07, 0,22 0,78±0,06, 0,30 * 0,85±0,06, 0,28 *

В основе снижения агрегации тромбоцитов может быть увеличение в крови оксида азота Обнаружена слабая, отрицательная связь (г= -0,4, р<0,05) между максимальной амплитудой агрегации и суммой нитритов и нитратов до диализа Функции тромбоцитов связаны с процессами СРО в них, что доказывается положительной связью малой силы между скоростью второй волны агрегации и ХЛ медленной вспышки (Р?=0,4, р=0,037) Количество связей значительно возрастало после гемодиализа Эти связи были отрицательны, так как при снижении агрегационной способности тромбоцитов ХЛ пластинок возрастала Достоверные отрицательные зависимости (г от -0,4 до -0,6) были между максимальной амплитудой, временем агрегации и всеми параметрами хемилюминесценции тромбоцитов - спонтанной светимостью, быстрой и медленной вспышкой

Деформабильность эритроцитов у больных ХПН при всех напряжениях сдвига была статистически значимо ниже, чем в группе контроля (табл 7) Деформабильность эритроцитов имела отрицательную связь со сроком ХПН и количеством гемодиализов (г=-0,56, р=0,018, г=-0,51, р=0,038) Гемодиализ в 100 % случаев повышал деформабильность эритроцитов до уровня нормальных значений

Таблица 7

Деформабильность эритроцитов при терминальной почечной недостаточности __до и после гемодиализа (M±m, s)_

Группы / напряжение сдвига, Н/м2 Группа 1 (контроль) п=17 Группа 2 (до диализа) п=17 Группа 3 (после диализа) п=17

10,5 0,17±0,01, 0,01 0,101 ±0,011,0,045 * 0,19±0,01,0,02 * **

15,75 0,24±0,02, 0,04 0,19±0,02, 0,09 *(U) 0,249±0,013, 0,044 " (КС)

28 0,27±0,01, 0,01 0,189±0,009, 0,037 * 0,276±0,003, 0,009 **

36,75 0,303±0,004, 0,007 0,207±0,009, 0,040 * 0,298±0,004, 0,013 "(U)

47,25 0,31±0,01, 0,02 0,205±0,008, 0,035 *(U) 0,315±0,004, 0,013 **(U)

Деформабильность клеток зависит от функционального состояния клеточных мембран и, следовательно, связана с определенным уровнем свободно-радикальных процессов в мембранах У больных ХПН до гемодиализа между деформабиль-ностью и спонтанной хемилюминесценцией эритроцитов установлены достоверные положительные связи при напряжениях сдвига 28 Н/м2 и 47,25 Н/м2 (г=0,84 и г=0,59 соответственно) Гемодиализ, восстанавливая деформабильность, нарушает связи со спонтанной хемилюминесценцией эритроцитов

У больных ХПН снижены электрический заряд и электрофоретическая подвижность эритроцитов и тромбоцитов (табл 8, 9) У лейкоцитов проявляется лишь тенденция к снижению этих показателей

Таблица 8

Электрофоретическая подвижность клеток крови у больных ХПН до и после гемо-__диализа (М±т, э)__

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=11 Группа 2 (до диализа) п=15 Группа 3 (после диализа) п=18

эритроциты 1,3±0,06, 0,17 0,87±0,05, 0,19* (КС) 1,13±0,05, 0,22"* (U)

лейкоциты 0,45±0,045, 0,11 0,34±0,03, 0,13 0,35±0,02, 0,11

тромбоциты 5,34±0,15, 0,4 4,13±0,3, 1,16* (КС) 4,3±0,26, 1,12 *(U)

Гемодиализная процедура способствует некоторому восстановлению элек-трофоретической подвижности клеток крови, которые все же остаются ниже значений в контрольной группе Эритроциты с уменьшенным поверхностным электрическим зарядом, проходя через капилляры, соприкасаются друг с другом В результате увеличивается разрушение неполноценных эритроцитов

Таблица 9

Поверхностный заряд клеток крови у больных ХПН до и после гемодиализа (M±m, s)

Группы / Показатели Группа 1 (контроль) п=11 Группа 2 (до диализа) п=15 Группа 3 (после диализа) п=18

эритроциты 3470±172,36, 456,02 2438±134,2 519,77 * (U) 2966±143,3, 607,99 * ** (U)

лейкоциты 2929±295,66, 783,05 2253±234,98, 910,86 2280±170,16, 721,95

тромбоциты 9596±277,5, 734,22 7206±542,18, 2099,86 * (U) 7721 ±474,91, 204,89 *(U)

Заряд на поверхности клеток определяет способность к агрегации Установлено, что при ХПН в общей группе повышено время и снижена скорость агрегации эритроцитов (табл 10) Снижение этих параметров обусловлено первой волной агрегации эритроцитов, т е повышено время и снижена скорость образования мелких двумерных агрегатов, что указывает на уменьшение содержания сиаловых кислот в мембране эритроцитов у больных ХПН Максимальная амплитуда и скорость агрегации эритроцитов связаны с содержанием креатинина (положительная связь малой силы) Кроме того, время агрегации связано с количеством холестерина (г=0,45, р=0,035) Амплитуда второй волны агрегации связана с количеством эритроцитов (г=0,58, р=0,005) и соответственно с гемоглобином (г=0,43, р=0,05) Скорость второй

волны агрегации имеет связь с эритроцитами (г=0,52, р=0,013)

Таблица 10

Влияние гемодиализа на показатели агрегации эритроцитов у больных ХПН ( M±m, s)

Показатели Группа 1 (контроль) п=9 Группа 2 (до диализа) п=25 Группа 3 (после диализа) п=25

МА, % 45,70±1,15, 3,46 42,44±1,55, 7,76 42,99±2,19, 10,94

ВА, мин 21,11 ±0,88, 2,63 26,84±0,85, 4,26*(U) 28,65±0,92, 4,59 * (U)

CA, %/мин 2,19±0,12, 0,37 1,61 ±0,08, 0,41 *(U) 1,51±0,08, 0,39*

А,, % 39,76±1,52, 4,55 35,22±1,63, 8,16 36,43±2,11, 10,53

Bi, мин 10,88±0,64, 1,91 15,42±0,71, 3,54*(U) 17,73±0,68, 3,38 * ** (U)

C-i, %/мин 3,75±0,25, 0,75 2,37±0,14, 0,72 * (U) 2,74±0,68, 3,42 * (U)

А2, % 5,92±0,64, 1,91 7,22±0,74, 3,71 6,57±0,52, 2,61

Вг, мин 10,23±0,83, 2,49 11,41 ±0,69, 3,45 10,89±0,63, 3,14

С2, %/мин 0,60±0,07, 0,20 0,61 ±0,04, 0,19 0,62±0,05, 0,25

Гемодиализ не вызывает значительных изменений агрегации Достоверно увеличивается лишь время первой волны агрегации После гемодиализа исчезают старые и формируются новые связи малой силы между скоростью агрегации и гемоглобином (г=0,32, р=0,03), скоростью первой волны и триглицеридами (г=0,3, р=0,04) У больных ХПН нарушены межклеточные взаимодействия (эритроцитарно-тромбоцитарные), которые восстанавливает гемодиализная процедура (табл 11) Нарушение межклеточных взаимодействий связано с длительностью терминальной ХПН и количеством гемодиализных процедур (К=0,51, р=0,009,1^=0,57, р=0,003)

Таблица 11

Эритроцитарно-тромбоцитарные взаимодействия у больных ХПН (М+т, э)

Группы / коаг-регаты, 109/л Группа 1 (контроль) п=11 Группа 2 (до диализа) п=25 Группа 3 (после диализа) п=25

Малые 109,82±8,15, 27,04 76,84±8,08, 40,38 * (и) 96,68±9,28, 46,42 " (Щ

Большие 10,73±1,87, 6,19 7,48±1,19, 5,99 9,24±1,49, 7,48

Всего 120,55±9,55, 31,67 84,32±9,12, 45,61 * (и) 105,92±10,54, 52,71 **(№/)

3 Дизрегуляция клеток крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе

Патогенез анемии у больных ХПН связан с абсолютным или относительным дефицитом эритропоэтина (ЭПО) Установлено, что содержание ЭПО в крови больных с ХПН, находящихся на гемодиализе, не имеет достоверных отличий от контрольной группы У здоровых людей составляет 10,7±2,25 МЕ/мл, у больных с ХПН 7,8±1,82 МЕ/мл По данным литературы, нормальная сывороточная концентрация ЭПО составляет от 10 до 30 МЕ/мл При гипоксии и анемии здоровые почки должны продуцировать больше ЭПО и его плазменная концентрация должна быть более 25 МЕ/мл Следовательно, содержание ЭПО у больных низкое относительно выраженности анемии

У больных ХПН на гемодиализе запасы железа постепенно истощаются в результате дополнительных кровопотерь и недостаточного его всасывания По результатам наших исследований, у больных ХПН в целом содержание железа не выходит за рамки нормальных значений, но у 48% больных снижено содержание железа в крови Концентрация железа в этой группе больных составляет от 3,9 до 8,5 мкмоль/л Для оценки обмена железа используют показатель насыщения трансфер-рина В наших исследованиях % насыщения трансферрина 37,5±1,9, что ниже относительно контроля, но не выходит за рамки значений, принятых для больных ХПН Уровень запасов железа в организме может быть оценен измерением концентрации ферритина сыворотки крови В среднем содержание ферритина у больных не выходит за рамки контрольных значений После диализа содержание ферритина снижается - у 40% больных его концентрация составляет от 18 до 32 мг/мл При уровне ферритина 30-100 мкг/л следует предполагать дефицит железа Соответственно концентрации ферритина (100 мкг/л до 150 мкг/л) пограничный уровень запасов железа отмечается у 60% больных ХПН У больных ХПН уровень ферритина не связан с количеством железа в крови У больных ХПН обнаруживается достоверная связь слабой силы лишь между ферритином, количеством эритроцитов и гемоглобином (г=0,5, р<0,05, г=0,49, р<0,05 соответственно), связь высокой силы между гемоглобином, эритроцитами и содержанием железа (г=0,89, р<0,05, г=0,86, р=0,059)

У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, изменяется концентрация ци-токинов в сыворотке (табл 12) Содержание ИЛ-1 у больных с ХПН несколько повышено, но достоверно не отличается от контроля ИЛ-1 снижается после процедуры гемодиализа и становится аналогичным контролю Из этого факта может следовать

два вывода 1) обследуемая группа пациентов не имеет воспалительных заболеваний, 2) установленная раннее функциональная активация лейкоцитов при контакте с диализной мембраной (Кривохижина Л В, Солодовникова О А, 2003) не сопровождается увеличением продукции этого цитокина

Таблица 12

Содержание цитокинов в крови больных с ХПН (M±m, s)_

Группы / ци-токины, пг/мл Группа 1 (контроль) п=10 Группа 2 (до диализа) п=20 Группа 3 (после диализа) п=20

ИЛ-1 8,58±1,67, 5,3 9,77±1,33, 5,94 8,45±1,85, 8,3**

ИЛ-2 20,3±6,57, 20,8 9,32± 1,36, 6,10* (и) 9,1±1,89, 8,5* (и)

ИЛ-3 62,0±13,64, 43,1 260,3±74,17, 331,7* (КС) 32,9±12,83, 57,4*** (и)

ИЛ-4 1,62±0,12, 0,40 2,28± 0,18, 0,8* 1,24±0,13, 0,58 **

Количество ИЛ-2 снижено по сравнению с контролем и не изменяется под влиянием гемодиализной терапии На основании снижения этого регуляторного цитокина можно предполагать нарушение клеточного звена иммунитета у данной категории больных и дисфункцию Т-хелперов, так как они являются основными продуцентами ИЛ-2 Эти изменения в иммунореактивности, по мнению ряда исследователей, являются характерными для уремических больных, находящихся на лечении программным гемодиализом (Сочнев АМ и др, 1981) Среди всех цитокинов особенно велики различия в количественном представительстве ИЛ-3 Количество ИЛ-3 до диализа в 4 раза выше, чем в контроле После процедуры гемодилиза его содержание в крови понижается примерно в 7 раз и становится значительно ниже значений в контроле Повышение концентрации ИЛ-3 можно рассматривать в качестве компенсаторной реакции в ответ на угнетение эритроидной продукции в костном мозге, дефицит или дисфункцию ЭПО, действие гемодиализной терапии

У больных терминальной ХПН концентрация ИЛ-4 повышена Снижение ИЛ-4 после диализа наблюдается только относительно его исходного уровня, а не относительно контрольных значений Повышение ИЛ-4 в додиализный период можно рассматривать в качестве компенсации на анемию ИЛ-3 и ИЛ-4 рассматривают в качестве неспецифических факторов, поддерживающих самообновление и пролиферацию КОЕ-ГММЭ и бипотентных кроветворных клеток (Захаров Ю М , 2003, Гуревич К Я , 2004) Кроме того, в условиях анемии при нормальном его содержании в крови может быть относительный дефицит ИЛ-4 У больных ХПН не получена корреляция между цитокинами и количеством клеток крови и их функциональной активностью, что может являться косвенным доказательством дизрегуляции Среди всех клеток крови снижение количественного представительства имеется только у эритроцитов

Таким образом, в основе генеза анемии при ХПН может лежать не только абсолютный или относительный дефицит ЭПО, но также и вторичный абсолютный или относительный недостаток ИЛ-3 и ИЛ-4, вызванный процедурой гемодиализа Полученные результате представлены на интегральной схеме (рис 1)

Рис 1 Механизмы развития дисфункции и дизрегуляции клеток у больных ХПН, находящихся на гемодиализе

Сплошные линии обозначают увеличение показателей, штриховые - снижение

19

ВЫВОДЫ

1 У больных терминальной хронической почечной недостаточностью активированы процессы свободно-радикального окисления, снижена хемилюминесценция мочи Выраженность процессов свободно-радикального окисления в крови связана со сроком хронической почечной недостаточности и количеством гемодиализов

2 Процедура гемодиализа активирует свободно-радикальне окисление повышает более чем в 8 раз спонтанную хемилюминесценцию крови и количество конечных продуктов ПОЛ, в тоже время достоверно снижает индуцированную хемилюминесценцию сыворотки крови, которая все же остается выше значений контрольной группы Гемодиализ способствует повышению хемилюминесценции мочи

3 Уровень нитрита и нитрата относительно контрольной группы повышен, гемо-диализная процедура способствует еще большему повышению нитритов и нитратов в крови

4 Для больных хронической почечной недостаточностью в додиализный период характерна активация процессов свободно-радикального окисления в тромбоцитах и в эритроцитах Гемодиализ еще более активирует свободно-радикальное окисление в тромбоцитах, снижает его интенсивность в эритроцитах, но не до уровня нормальных значений

5 У больных терминальной хронической почечной недостаточностью установлена дисфункция клеток крови нарушена АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов, снижена деформабильность эритроцитов, нарушена агрегация эритроцитов, снижены электрический заряд и электрофоретическая подвижность клеток крови Гемодиализ приводит к еще большему нарушению функции тромбоцитов, в 100% случаев восстанавливает деформабильность, агрегацию эритроцитов, способствует нормализации электрофоретической подвижности и электрическому заряду клеток крови, но не до уровня значений контрольной группы

6 При терминальной хронической почечной недостаточности нарушены межклеточные взаимодействия (эритроцитарно-тромбоцитарные), которые частично восстанавливает гемодиализная процедура Нарушение межклеточных взаимодействий связано с длительностью терминальной хронической почечной недостаточности и количеством гемодиализных процедур (Р?=0,51, р=0,009, Р=0,57, р=0,003)

7 Содержание железа у больных хронической почечной недостаточностью в крови не выходит за рамки нормальных значений - 13,63+2,07 мкмоль/л, но у 48% больных его концентрация снижена и находится в пределах от 3,9 до 8,5 мкмоль/л

Насыщение трансферрина 37,5±1,9%, что ниже относительно контроля, но не выходит за рамки значений, принятых для больных ХПН Пограничный уровень запасов железа соответственно концентрации ферритина (100 мкг/л -150 мкг/л) отмечается у 60% больных

8 Содержание ферритина у больных хронической почечной недостаточностью не выходит за рамки нормальных значений и составляет 231,6±69,2 мкг/л После диализа содержание ферритина снижается и у 40% его концентрация в пределах 1832 мкг/л

9 У больных хронической почечной недостаточностью до диализа относительно контрольной группы повышено содержание ИЛ-3 (в 4,2 раза), ИЛ-4 (в 1,4 раза), снижено - ИЛ-2 (в 2 раза), нет изменений ИЛ-1 Гемодиализ приводит к снижению содержания ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-4, не изменяет ИЛ-2 В результате после диализа снижены относительно контроля ИЛ-2 (на 55,2%) и ИЛ-3 (на 47%)

10 У больных хронической почечной недостаточностью до диализа снижены общая активность СН50 и активность С1, С4 компонентов комплемента Гемодиализная процедура восстанавливает активность С1 и С4 компонентов комплемента, активирует СН50, которая превышает значения контрольной группы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Осиков, М В Деформабильность эритроцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М В Осиков, В Ю Ах-матов II Материалы VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» - Москва Изд-во РУДН, 2006 - С 385

2 Ахматов, В Ю Содержание интерлейкинов-1,2,3,4 у больных хронической почечной недостаточностью / В Ю Ахматов, М В Осиков, Л В Кривохижина II Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней традиционные и психосоматические подходы» - Челябинск, 2007 - С 14-16

3 Осиков, М В Показатели неспецифической резистентности у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе М В Осиков, В Ю Ахматов // Материалы V-ой итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА - Челябинск изд-во «ЧелГМА», 2007 - С 48-50

4 Ахматов, В Ю Влияние гемодиализа на функциональное состояние тромбоцитов у больных хронической почечной недостаточностью / В Ю Ахматов,

M В Осиков, il В Кривохижина // Материалы международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» - Ярославль Изд-во ЯГПУ им К Д Ушинского, 2007 - С 134

5 Осиков, M В Функциональное состояние эритроцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / M В Осиков, В Ю Ахматов, Л В Кривохижина // Материалы международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» - Ярославль Изд-во ЯГПУ им КД Ушинского, 2007 -С 166

6 Osikov, M V Platelet dysfunction in chronic renal failure / Osikov M V, Knvohizhina LV, Akhmatov V Ju // The International Journal of Artificial Organs - 2007 -Vol 30, №8 - P 188

7 Осиков, M В Влияние гемодиализа на неспецифическую резистентность у больных хронической почечной недостаточностью / M В Осиков, В Ю Ахматов, Л В Кривохижина//Омский научный вестник -2007 -№3(61) - С 302303

8 Ахматов, В Ю К механизму дисфункции эритроцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на диализе / В Ю Ахматов, M В Осиков, Л В Кривохижина // Нефрология и диализ -2007 - № 3 - С 276 - 277

9 Ахматов, В Ю Оксидативный стресс у больных хронической почечной недостаточностью / В Ю Ахматов, К В Ахматов, M В Осиков, Л В Кривохижина // Актуальные проблемы практической медицины материалы науч -практ конф , поев 69-летию Челяб Обл кпинич больницы - Челябинск Издательство ООО «РЕКПОЛ», 2007 - С 250 - 251

10 Ахматов, В Ю К вопросу о дисфункции эндотелия у больных хронической почечной недостаточностью/ В Ю Ахматов, К В Ахматов, M В Осиков, Л В Кривохижина // Актуальные проблемы практической медицины материалы науч -практ конф , поев 69-летию Челяб Обл клинич больницы - Челябинск Издательство ООО «РЕКПОЛ», 2007 - С 251 -252

11 Осиков, M В Влияние гемодиализа на процессы свободно-радикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью/ M В Осиков, В Ю Ахматов, Л В Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура» -2007 -№16(88) - С 95-97

12 Осиков, M В К патогенезу дисфункции тромбоцитов при уремии / M В Осиков, В Ю. Ахматов, Л В Кривохижина // Уральский медицинский журнал - 2007 -№9(37) - С 83-87

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ аденозиндифосфат

АОА антиокислительная активность

АФК активные формы кислорода

БВ быстрая вспышка

ВА время агрегации

ИБС ишемическая болезнь сердца

ИЛ интерлейкин

И ФА иммуноферментный анализ

МА максимальная амплитуда

МДА малоновый диальдегид

ПОЛ перекисное окисление липидов

СА скорость агрегации

СпС спонтанная светимость

СРО свободнорадикальное окисление

сс светосумма

хл хемилюминесценция

ХПН хроническая почечная недостаточность

шо шиффовы основания

эпо эритропоэтин

этк эритроцитарно-тромбоцитарные коагрегаты

На правах рукописи

Ахматов Владимир Юрьевич

СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ДИСФУНКЦИЯ И ДИЗРЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОК КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ, НАХОДЯЩИХСЯ НА ГЕМОДИАЛИЗЕ

14 00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2008

Отпечатано Челябинск, типография СтандАРТ

г. Челябинск, ул. Рылеева, 10 телефон 268-17-13

Подписано в печать 15 07 2008г Формат 60x84 1/16 Объем 1,00 уел и л Тираж 100 эк^ Зак №412

Актуальность темы

На 1 млн. населения в развитых странах приходится 200-250 больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН), из них 70 - 80 человек ежегодно умирают. Такие тяжелые поражения почек развиваются в трудоспособном возрасте у женщин до 40 лет, у мужчин после 40 лет (71). Патофизиологические проявления терминальной ХПН разнообразны, включают нарушения водно-электролитного, кислотно-основного, липидного, белкового, углеводного обменов, кроветворения, гемостаза, терморегуляции, гормональной регуляции, гемодинамики, развитие гипоксии, синдрома эндогенной интоксикации. В 100% случаев у больных терминальной ХПН развиваются анемия, гиперволемическая или ренинзависимая гипертония, сердечно-сосудистые нарушения, которые являются наиболее частой причиной смерти у больных ХПН (77), в 24-60% случаев развиваются инфекционные осложнения, что значительно ухудшает прогноз заболевания и реабилитацию больных. Основой инфекционных осложнений является вторичный иммунодефицит, прогрессирующий по мере ухудшения деятельности почек (9, 18, 67, 59).

Наиболее распространенное лечение данной категории больных -гемодиализ или перитонеальный диализ. Но диализная терапия имеет свои показания, противопоказания и осложнения. Указывается, что у больных получающих гемодиализную терапию ИБС развивается в 3-10 раз чаще, чем у больных ХПН без диализа; отмечается наличие аритмии, гипотонии или «синдиализной» гипертонии (2, 77). Для ХПН характерно развитие синдрома нарушенного равновесия (12), когда исчезает структурная и функциональная взаимосвязь между клетками крови и жидкой частью, усугубляемая гемодиализной терапий. Наличие синдрома эндогенной интоксикации обусловливает развитие клеточной дисфункции, в том числе и нарушение экспрессии регуляторных цитокинов. Кроме того, сама процедура гемодиализа может вызвать или усилить проявления клеточной дисфункции и дизрегуляции.

Нарушение функции эндотелиоцитов, клеток крови и дизрегуляция может вносить определенный вклад в клинические проявления ХПН, в частности, развитие гипертонии и гипотонии, атеросклероза, ИБС, инфекционных осложнений, нарушение гемостаза, формирование анемии. Знание новых механизмов развития терминальной ХПН у пациентов, находящихся на гемодиализе, будет способствовать улучшению технологий лечения, сохранению и улучшению качества жизни больных. Все выше изложенное определяет актуальность и цель исследования.

Цель исследования

Установить наличие, проявления и некоторые механизмы дисфункции и диерегуляции клеток крови у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

Задачи исследования

1. Исследовать интенсивность свободно-радикальных процессов в жидкой части и клетках крови у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

2. Исследовать образование метаболитов оксида азота у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

3. Исследовать агрегацию тромбоцитов, деформабильность и агрегацию эритроцитов, электрический заряд и электрофоретическую подвижность клеток крови, межклеточные взаимодействия у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

4. Исследовать содержание железа, насыщение трансферрина, содержание ферритина у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

5. Исследовать содержание эритропоэтина, интерлейкинов-ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4 у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

6. Исследовать активность системы комплемента у больных терминальной хронической почечной недостаточностью до и после процедуры гемодиализа.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что у больных терминальной хронической почечной недостаточностью, на фоне окислительного напряжения, в организме гемодиализ еще более увеличивает активность этого процесса. После гемодиализа возрастает спонтанная хемилюминесценция крови, количество конечных продуктов ПОЛ, концентрация нитритов и нитратов. Выраженность процессов СРО связана со сроком ХПН и количеством гемодиализов. Характерно усиление свободно-радикальных процессов в додиализный период в эритроцитах и тромбоцитах. Гемодиализ активирует СРО в тромбоцитах, но снижает в эритроцитах. Для больных с ХПН характерна дисфункция клеток крови: нарушение деформабильности и агрегации эритроцитов, агрегации тромбоцитов, заряда и электрофоретической подвижности всех клеток крови, межклеточных контактов. Гемодиализ способствует возрастанию дисфункции тромбоцитов, восстановлению функции эритроцитов. У обследованной категории больных не отмечено нарушений в обмене железа, но диализ способствует снижению ферритина и у 40% его концентрация в пределах 18-32 мкг/л. Впервые установлено, что у больных ХПН содержание ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4 отлично от их количественного представительства в норме. Гемодиализ приводит к снижению уровня ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-4, не изменяет содержание ИЛ-2; активирует сниженную до диализа активность комплемента.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Выявление новых частных и общих проявлений, механизмов дисфункции и дисрегуляции клеток крови при терминальной ХПН имеет большое значение для развития патофизиологии почек. Патофизиологические и клинические проявления у больных ХПН, находящихся на гемодиализе в определенной мере обусловлены самой процедурой гемодиализа. Гемодиализная процедура, с одной стороны, способствует удалению уремических токсинов из организма, с другой — неоднозначно влияет на функциональное состояние клеток, цитокиновый профиль, содержание ферритина, активность комплемента, усиливает свободно-радикальное окисление в крови. Изменение цитокинового профиля до и после гемодиализа может быть одной из причин развития анемии, вторичного иммунодефицита у данной категории больных. Полученные результаты важны для развития медицины, патофизиологии, нефрологии и могут быть использованы в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Практическое значение работы состоит в том, что дано патогенетическое обоснование необходимости внедрения новых медицинских технологий с целью коррекции свободно-радикального окисления, клеточной дисфункции и дисрегуляции у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе. Методы исследования хемилюминесценции плазмы и клеток крови позволяют объективно оценивать интенсивность окислительного напряжения у больных хронической почечной недостаточностью и эффективность процедуры гемодиализа.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных в додиализный период активированы процессы свободно-радикального окисления. Процедура гемодиализа способствует еще большей активации этого процесса.

2. У больных терминальной хронической почечной недостаточностью установлена дисфункция клеток крови, проявляющаяся активацией СРО в тромбоцитах и эритроцитах, нарушением агрегации тромбоцитов; снижением деформабильности эритроцитов; снижением электрофоретической подвижности клеток крови. Гемодиализ приводит к еще большему нарушению функции тромбоцитов, способствует восстановлению функции эритроцитов и заряда клеток крови.

3. Дисрегуляция у больных терминальной хронической почечной недостаточностью подтверждается изменением представительства ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-2; отсутствием повышения эритропоэтина при наличии выраженной анемии. Гемодиализ проводит к снижению ИЛ-1, ИЛ-3 и ИЛ-4, ферритина и активации комплемента.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на VII Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы внутренних болезней: традиционные и психосоматические подходы» (Челябинск, 2007); V итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2007); международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007); научно-практической конференции, посвященной 69-летию Челябинской областной клинической больницы «Актуальные проблемы практической медицины: материалы (Челябинск, 2007).

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология почек», «Патофизиология системы крови», «Биохимия крови», «Биохимия мочи», «Регуляция водно-солевого обмена», в ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава», ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Росздрава». Методы исследования эритроцитов внедрены в научную работу кафедры патофизиологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» и в практику отделения диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница».

ВЫВОДЫ

1. У больных терминальной хронической почечной недостаточностью активированы процессы свободно-радикального окисления, снижена хемилюминесценция мочи. Выраженность процессов свободно-радикального окисления в крови связана со сроком хронической почечной недостаточности и количеством гемодиализов.

2. Процедура гемодиализа активирует свободно-радикальное окисление: повышает более чем в 8 раз спонтанную хемилюминесценцию крови и количество конечных продуктов ПОЛ, в тоже время достоверно снижает индуцированную хемилюминесценцию сыворотки крови, которая все же остается выше значений контрольной группы. Гемодиализ способствует повышению хемилюминесценции мочи.

3. Уровень нитрита и нитрата относительно контрольной группы повышен, гемодиализная процедура способствует еще большему повышению нитритов и нитратов в крови.

4. Для больных хронической почечной недостаточностью в додиализный период характерна активация процессов свободно-радикального окисления в тромбоцитах и в эритроцитах. Гемодиализ еще более активирует свободно-радикальное окисление в тромбоцитах, снижает его интенсивность в эритроцитах, но не до уровня нормальных значений.

5. У больных терминальной хронической почечной недостаточностью установлена дисфункция клеток крови: нарушена АДФ-индуцированная агрегации тромбоцитов; снижена деформабильность эритроцитов; нарушена агрегация эритроцитов; снижены электрический заряд и электрофоретическая подвижность клеток крови. Гемодиализ приводит к еще большему нарушению функции тромбоцитов; в 100% случаев восстанавливает деформабильность, агрегацию эритроцитов; способствует нормализации электрофоретической подвижности и электрического заряда клеток крови, но не до уровня значений контрольной группы.

При терминальной хронической почечной недостаточности нарушены межклеточные взаимодействия (эритроцитарно-тромбоцитарные), которые частично восстанавливает гемодиализная процедура. Нарушение межклеточных взаимодействий связано с длительностью терминальной хронической почечной недостаточности и количеством гемодиализных процедур (R=0,51, р=0,009; R=0,57, р=0,003).

Содержание железа у больных хронической почечной недостаточностью в крови не выходит за рамки нормальных значений - 13,63+2,07 мкмоль/л, но у 48% больных его концентрация снижена и находится в пределах от 3,9 до 8,5. Насыщение трансферрина 37,5±1,9%, что ниже относительно контроля, но не выходит за рамки значений принятых для больных ХПН. Пограничный уровень запасов железа соответственно концентрации ферритина (100 мьсг/л - 150 мкг/л) отмечается у 60% больных.

Содержание ферритина у больных хронической почечной недостаточностью не выходит за рамки нормальных значений и составляет 231,6±69,2 мкг/л. После диализа содержание ферритина снижается и у 40% его концентрация в пределах 18-32 мкг/л.

9. У больных хронической почечной недостаточностью до диализа относительно контрольной группы повышено содержание ИЛ-3 (в 4,2 раза), ИЛ-4 (в 1,4 раза); снижено - ИЛ-2 (в 2 раза); нет изменений ИЛ-1. Гемодиализ приводит к снижению-ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-4; не изменяет ИЛ-2. В результате после диализа снижены относительно контроля ИЛ-2 (на 55,2%) и ИЛ-3 (на 47%).

10. У больных хронической почечной недостаточностью до диализа снижены общая активность СН5о и активность С1, С4 компонентов комплемента. Гемодиализная процедура восстанавливает активность С1 и С4 компонентов комплемента, активирует СН50, которая превышает значения контрольной группы.

Заключение

У больных терминальной хронической почечной недостаточностью активированы процессы свободно-радикального окисления, что подтверждается возрастанием индуцированной хемилюминесценции сыворотки крови, повышением количества и активности антиокислительных ферментов, повышением конечных метаболитов ПОЛ в крови. Компенсаторное повышение активности антиокислительных ферментов обеспечивает сохранение спонтанной светимости сыворотки крови на уровне контрольных значений.

В результате гемодиализа у 56% больных снижается окислительное напряжение, но не до уровня нормальных значений; у 32% - не изменяется; у 12% - возрастает. Снижение у 56% больных активных кислородных метаболитов после гемодилиза, вероятнее всего, обусловлено их адекватным выведением, эффективной работой ферментативной антиокислительной защиты, а не снижением их продукции, так как после гемодиализа возрастает количество конечных продуктов ПОЛ - Шиффовых оснований. Следствием высокой продукция свободных радикалов, превышающих интенсивность их удаления на фоне истощения ферментативной защиты, будет возрастание окислительного напряжения после диализа, что наблюдается у 12 % больных ХПН. В целом процедура гемодиализа достоверно снижает светосумму свечения и быструю вспышку в сыворотке крови, но которые все же остаются выше значений контрольной группы.

В роли активаторов СРО могут выступать: гипоксия, свободные металлы переменной валентности, хроническое воспаление, эндогенные токсины, сама процедура гемодиализа. При гемодиализе имеется контакт клеток крови с мембраной, что приводит к активации лейкоцитов; тромбоцитов; разрушению менее резистентных эритроцитов и освобождению из них ионов двухвалентного железа. Более того, снижение эндогенной интоксикации приведет к улучшению кислородтранспортной функции эритроцитов, что подтверждается полученным нами фактом восстановления деформабильности эритроцитов, с последующим развитием синдрома подобного реперфузии. Действительно имеется прямая корреляционная зависимость (г-0,62, р = 0,002) между - быстрой вспышкой (БВ - показатель хемилюминесценции сыворотки крови), характеризующей накопление перекисных продуктов в крови, и КТ/У (коэффициентом очищения крови). Выраженность свободно-радикального напряжения в крови связана со сроком ХПН и количеством гемодиализов. Это подтверждается коэффициентом корреляции между светосуммой свечения (СС - показатель хемилюминесценции сыворотки крови) и сроком ХПН (г-58; р=0,005); количеством гемодиализов (г-0,58; р=0,005).

При терминальной хронической почечной недостаточности есть множество условий для реализации синтеза другой реактогенной молекулы — N0". Его синтез усиливается при ацидозах и гипоксии, хроническом воспалении. Больные на гемодиализе подвержены воздействию ряда факторов, которые как стимулируют, так и ингибируют продукцию N0.

У больных терминальной ХПН уровень нитрита и нитрата в до диализный период повышен. Гемодиализная процедура способствует еще большему повышению нитритов и нитратов в крови Количественное представительство метаболитов оксида азота зависимо от двух факторов, интенсивности продукции и скорости выведения из организма при гемодиализе. Индивидуальный анализ выявил, что у 44,4% больных гемодиализ приводит к снижению от исходного уровня суммарного представительства метаболитов оксида азота, в большей мере за счет уменьшения стабильных форм, но все же не доводит их до значений контрольной группы. У 55,6% больных гемодиализ приводит к повышению суммарного представительства метаболитов оксида азота за счет возрастания, как нитритов, так и нитратов, но в большей мере активирует образование нитритов. Количество пациентов с нормальным уровнем суммарного представительства метаболитов оксида азота после диализа снизилось с 22,2 % до 5,5%. Цитотоксическое действие N0' во многом зависит от образования сильного окислителя - пероксинитрита ONOO", появление которого в значительных количествах провоцируется окислительным стрессом. Цитотоксичность сильно возрастает при ацидозах, больших концентрациях и проявляется в отношении собственных клеток и тканей организма; они вызывают иммуносупрессию; ингибируют пролиферацию клеток костного мозга (241), что может быть одной из причин анемии при хронической почечной недостаточности. Установлена достоверная отрицательная корреляционная связь между количеством нитритов и эритроцитами (г=-0,484; р=0,04) и близкая к достоверности отрицательная корреляция между суммой нитритов и нитратов и эритроцитами (г=-0,458; р=0,055).

Повышение метаболитов оксида азота может быть компенсаторным ответом эндотелиальных клеток на вторичную артериальную гипертензию, которая отмечается в нашем исследовании у 84% больных терминальной ХПН. Артериальная гипертония - одно из наиболее частых проявлений ХПН. В 95% - это гиперволемическая гипертония, вызванная задержкой натрия и воды. В 5% случаев — это тяжелая ренинзависимая гипертония (77). У пациентов находящихся на программном диализе отмечаются перепады давления, появляются новые формы гипертоний (синдиализная). Можно предположить, что в основе синдиализной гипертонии может лежать активация тромбоцитов, доказанная в нашем исследовании, с экспрессией мощного вазоконстриктора тромбоксана А2. Примерно у 10% больных во время сеанса гемодиализа возникает гипотония, которую провоцируют гиповолемия, недостаточно биосовместимые мембраны, гипонатриевый диализирующий раствор (49), и как показано в нашем исследовании, возможно, несоответствие между синтезом и удалением вазодилятатора NO.

Увеличение концентрации оксида азота может быть проявлением дисфункции эндотелия, когда нарушается соотношение между сосудистыми констрикторами и дилятаторами. Такой дисбаланс возникает под влиянием различных повреждающих факторов: эндотоксинов, гемодинамической перегрузки, свободных радикалов, цитокинов, гипоксии, дислипопротеинемии, ключевую роль играют процессы свободно-радикального окисления.

Почки являются органом, функция которых зависит от состояния эндотелия. Они содержат 2-2,5 млн. сосудистых клубочков, каждый из которых имеет около 50 капиллярных петель. Почки одновременно - источник синтеза и мишень для воздействия эндотелиальных факторов. В эксперименте на крысах было показано, что введение 1Ч-монометил-Ь-аргинина блокатора синтеза N0 предотвращает развитие гиперфильтрации и геперперфузии почек в ответ на аминкислотную и белковую нагрузку.

Повышение метаболитов оксида азота в постдиализный период может быть результатом активации лейкоцитов, мощных его продуцентов, в результате контакта с диализной мембраной. Активация клеток крови в результате гемодиализа подтверждается возрастанием более чем в 8 раз спонтанной хемилюминесценции крови.

Для больных ХПН в додиализный период характерна активация СРО в тромбоцитах, проявляющаяся в повышение спонтанного свечения, амплитуды медленной вспышки и интегрального индекса светосуммы свечения; укорочения времени начала медленной вспышки. Рецепторное взаимодействие с АДФ у больных не нарушено, но укорочено время быстрой вспышки. Гемодиализ еще более активирует СРО в тромбоцитах: резко возрастает светосумма свечения более чем в 2,5 раза, активируется быстрая вспышка.

Для терминальной ХПН характерно развитие анемии мультифакторного генеза. Одним из механизмов развития анемии при терминальной ХПН является укорочение срока жизни эритроцитов, возможно, обусловленное активацией свободно-радикальных процессов в мембранах эритроцитов, что доказывается повышением спонтанной светимости эритроцитов, светосуммой свечения и максимальной светимости. Интенсификация перекисного окисления мембранных липидов приводит к образованию сшивок между белками и фосфолипидами, увеличивает степень упорядочности мембранных липидов. При нефропатиях структура эритроцитарной мембраны модифицирована: снижена подвижность ацильных цепей фосфолипидов и увеличена полярность липидного бислоя (5, 10, 44).

Гемодиализ приводит к понижению всех показателей хемилюминесценции эритроцитов, но которые все же остаются выше контрольных значений.

Снижение свободно-радикальных процессов в эритроцитах в результате гемодиализа, позволяет выделить дополнительный механизм повышения резистентности эритроцитов у больных терминальной ХПН после диализа.

На фоне активации свободно-радикальных процессов в организме при ХПН нарушено выведение, либо образование активных кислородных метаболитов в почках, что подтверждается снижением хемилюминесценции мочи. Светосумма свечения мочи в два раза ниже относительно контроля, снижена спонтанная светимость и быстрая вспышка. Существует представление, что уменьшение ХЛ мочи связано с наличием в ней молекул средней молекулярной массы (65). Гемодиализ способствует повышению хемилюминесценции мочи, либо за счет улучшения деятельности почек, либо за счет удаления из организма веществ средней молекулярной массы.

У больных терминальной ХПН установлена дисфункция клеток крови. Характерно нарушение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Снижена амплитуда, время, скорость первой волны агрегации; снижена амплитуда и скорость второй волны агрегации, что в совокупности приводит к снижению максимальной амплитуды и скорости агрегации. Ни один больной не имел превышения амплитуды или скорости агрегации относительно группы контроля. Гемодиализ приводил к еще большему нарушению функции тромбоцитов, возможно за счет процесса секреции при контакте с диализной мембраной. Снижена амплитуда, скорость 1-й волны агрегации; время 2 волны агрегации. Таким образом, гемодиализ в большей мере нарушал рецепцию тромбоцитов на внешние сигналы. Но изменения функции тромбоцитов под влиянием гемодиализа были не однородны. В целом, у 28% больных ХПН гемодиализ привел к повышению амплитуда агрегации, у 68% к снижению, у 4% нет изменений. У 36% больных гемодиализ привел к повышению, у 64% - к снижению времени агрегации тромбоцитов от исходных значений.

Время первой волны агрегации (рецепторное взаимодействие с АДФ, изменение формы тромбоцитов, доступность мест для фибриногена) имело достоверную отрицательную зависимость с числом гемодиализных процедур и сроком терминальной ХПН (г -0,56; -0,63) соответственно. Не обнаружены корреляции отдельных параметров агрегации тромбоцитов до и после диализа с креатинином, мочевиной, KT/V.

В основе снижения агрегации тромбоцитов может быть увеличение в крови оксида азота. Действительно обнаружена слабая, достоверная, отрицательная связь (г-0,4) между максимальной амплитудой агрегации и суммой нитритов и нитратов до диализа. После диализа не зарегистрированы достоверные связи агрегации тромбоцитов с метаболитами оксида азота.

Функции тромбоцитов связаны с процессами в них свободно-радикального окисления. В норме имеется достоверная прямая положительная зависимость средней силы между временем первой волны агрегации XJI быстрой вспышки и светосуммой свечения (г-0,7, р-0,022; г-0,7, р-0,024). У больных терминальной ХПН характер связей был иной. До гемодиализа существовала одна положительная взаимосвязь малой силы между скоростью второй волны агрегации и XJI медленной вспышки (R=0,4; р -0.037). Количество связей значительно возрастало после гемодиализа. Эти связи были отрицательны, так как при снижении агрегационной способности тромбоцитов хемилюминесценция пластинок возрастала. Достоверные отрицательные зависимости были между максимальной амплитудой, временем агрегации и всеми параметрами хемилюминесценции тромбоцитов - спонтанной светимостью, быстрой и медленной вспышкой. Эта зависимость была обусловлена амплитудой и временем первой волны агрегации. Этот диссонанс с одной стороны может быть обусловлен уже произошедшими процессами активации, секреции и истощению функции при контакте тромбоцитов с диализной мембраной, с другой стороны особенностям метаболизма арахидоновой кислоты при патологиях. При патологиях возможно изменение направления метаболизма арахидоновой кислоты с циклооксигеназного на липооксигеназный, поскольку между ферментами этих путей существует конкуренция за субстрат. При невысоком уровне арахидоновой кислоты и активации клеток физиологическими агонистами ее метаболизм осуществляется по циклооксигеназному пути, в результате образуется проагрегантные простагландиновые эндопероксиды и тромбоксан А2. При существенном повышении уровня арахидоновой кислоты адаптивно возрастает активность фермента - липооксигеназы и переход на липооксигеназный путь метаболизма с образованием ингибирующих метаболитов 12-НРЕТЕ, 12-РЕТЕ, а также свободных радикалов, возникающих при гидроперекисном окислении арахидоновой кислоты. Длительность жизни 12-НРЕТЕ, 12-РЕТЕ достигает часа, что значительно выше, чем у лабильных проагрегантных метаболитов циклооксигеназного пути, продолжающегося в течение нескольких минут. Кроме того, высвобождаемые из тромбоцитов метаболиты арахидоновой кислоты, проникая в эндотелиальные клетки, служат источником образования простациклина 12 - антиагреганта и вазодилятатора.

Наиболее вероятно, что именно этот путь метаболизма арахидоновой кислоты представлен при гемодиализной терапии, так как на фоне снижения проагрегантных функций тромбоцитов, усилено образование свободных радикалов, что отражается возрастанием хемилюминесценции тромбоцитов и связи этого процесса с первой волной агрегации тромбоцитов.

Возникал вопрос, насколько связаны между собой показатели тромбоцитарной агреграммы. Показатели агреграммы имеют множество взаимосвязей средней и высокой силы. В частности, в контрольной группе амплитуда агрегации определяется первой волной (г-0,99), а время агрегации — второй волной (г-0,92). Кроме того, амплитуда и время второй волны агрегации связаны между собой (г-0,75).

При терминальной ХПН количество связей возросло. Увеличилось число внутри и межпараметрых зависимостей. Функциональная способность тромбоцитов в условиях перегрузки клеток продуктами интоксикации больше регламентирована временем развития процесса. Особенно много зависимостей стало между временными параметрами и амплитудами агрегации. После гемодиализа количество связей уменьшилось. Но их общая картина по-прежнему отличалась от контроля, не только по силе взаимодействия, но и по характеру взаимодействия. Восстановился характер связей амплитуды второй волны агрегации. Но по-прежнему присутствовала зависимость амплитуды первой волны, максимальной амплитуды и временными параметрами агрегации.

Одним из важных показателей функционального состояния эритроцитов является их способность менять свою форму. Деформабильность эритроцитов оказывает влияние на гемореологию, продолжительность жизни эритроцитов (201), определяет оксигенацию тканей, что иллюстрируется расчетами Н. 8с1ишс1-8с1юпЬет. (260, 261). Деформабильность эритроцитов у больных ХПН при всех напряжениях сдвига была статистически значимо ниже, чем в группе контроля. Деформабильность эритроцитов имела отрицательную связь со сроком ХПН и количеством гемодиализов (г=-0,56, р=0,018; г=-0,51, р=0,038). Гемодиализ в 100 % случаев повышал деформабильность эритроцитов до уровня нормальных значений. Деформабильность клеток зависит от функционального состояния клеточных мембран и, следовательно, связана с определенным уровнем свободно-радикальных процессов в мембранах. В контрольной группе были установлены достоверные положительные связи средней и высокой силы между деформабильностью эритроцитов при напряжении сдвига 10,5; 15,5; 28 и спонтанной светимостью эритроцитов (Я от

0,7 до 0,9). С увеличением напряжения эти связи нарушаются. У больных ХПН до гемодиализа между деформабильностью и спонтанной хемилюминесценцией эритроцитов нет достоверных связей на малых величинах сдвига. Но появляются достоверные связи на больших напряжениях сдвига: 28 и 47,25 (г-0,84 и г-0,59 соответственно). Кроме того, на средних величинах сдвига (15,75, 36,75) установлены отрицательные зависимости между деформабильностью и максимальной светимостью эритроцитов (х=-0,56, г=-0,53 соответственно). Гемодиализ, восстанавливая деформабильность, нарушает связи со спонтанной хемилюминесценцией эритроцитов, при сдвиге 10,5 формируется новая отрицательная связь между деформабильностью и максимальной светимостью эритроцитов. Хемилюминесценция эритроцитов и их деформабильность при ХПН определяются множеством дополнительных факторов, в том числе продуктами интоксикации прооксидантного и антиоксидантного действия, их элиминацией, разрушением и удалением эритроцитов повышенной хрупкости.

Выполнение нормальных функций клетки обеспечивает стабильность электрического заряда клетки. При патологических состояниях электрический заряд клетки может существенно изменяться как в результате изменений физико-химической структуры клеток, так и вследствие нарушения состава клеточной среды. У больных ХПН снижены электрический заряд и электрофоретическая подвижность эритроцитов, тромбоцитов. У лейкоцитов проявляется лишь тенденция к снижению этих показателей. Гемодиализная процедура способствует некоторому восстановлению электрофоретической подвижности клеток крови, но которые все же остаются ниже значений в контрольной группе. Эритроциты с уменьшенным поверхностным электрическим зарядом, проходя через капилляры, соприкасаются друг с другом. В результате увеличивается разрушение неполноценных эритроцитов. Данный механизм может быть дополнительным в общей схеме развития анемии у больных ХПН. Заряд на поверхности клеток определяет способность к агрегации. Установлено, что при ХПН в общей группе повышено время и снижена скорость агрегации эритроцитов. Снижение этих параметров обусловлено первой волной агрегации эритроцитов, т.е. повышено время и снижена скорость образования мелких двумерных агрегатов, что указывает на уменьшение содержания сиаловых кислот в мембране эритроцитов у больных ХПН. Отдельные параметры агрегации эритроцитов связаны с содержанием креатинина. С креатинином имеют положительную связь малой силы максимальная амплитуда и скорость агрегации. Эта связь обусловлена первой волной агрегации. Кроме того, время агрегации связано с количеством холестерина - г=0,45; р=0,035. Амплитуда второй волны агрегации связана с количеством эритроцитов (г=0,58; р=0,005) и соответственно с гемоглобином (1=0,43; р=0,05). Скорость второй волны агрегации имеет связь с эритроцитами (г=0,52; р=0,013). Гемодиализ не вызывает значительных изменений агрегации. Достоверно увеличивается лишь время первой волны агрегации. После гемодиализа исчезают старые и формируются новые связи малой силы между скоростью агрегации и гемоглобином (г=0,32; р=0,03); скоростью первой волны и гемоглобином (г=0,3; р=0,04); скоростью первой волны и триглицеридами (г=0,3; р=0,04).

Заряд эритроцитов, их способность взаимодействовать друг с другом, зависимы от содержания креатинина, триглицеридов, количества эритроцитов и состояния их клеточных мембран. Время второй волны агрегации эритроцитов в контрольной группе имеет высокую отрицательную связь с показателем спонтанной хемилюминесценции эритроцитов - К=-0,82, р=0,007. У больных ХПН амплитуда и время второй волны агрегации отрицательно связаны со спонтанным свечением эритроцитов (Я=-0,5, р=0,056; Я—О,58, р=0,02) соответственно. После гемодиализа остается единственная отрицательная связь между временем второй волны агрегации эритроцитов и свечением Обнаружено, что в условиях интактного организма тромбоциты взаимодействуют с эритроцитами с образованием коагрегатов. Мы полагаем, что феномен эритроцитарно-тромбоцитарных взаимодействий в крови может отражать трофическую функцию эритроцитов по отношению к кровяным пластинкам. Эритроцитарные мембраны могут выступать в качестве доноров фосфолипидов для тромбоцитов. Показано, что в организме происходит прямой и быстрый обмен между плазменными и тромбоцитарными фосфолипидами с последующим их включением в мембранные липиды (242).

У больных ХПН нарушены межклеточные взаимодействия (эритроцитарно-тромбоцитарные), которые восстанавливает гемодиализная процедура. Нарушение межклеточных взаимодействий связано с длительностью терминальной ХПН и количеством гемодиализных процедур (11=0,51, р=0,009; Я=0,57, р=0,003).

У больных в терминальной стадии ХПН, получающих заместительную гемодиализную терапию, в 100% случаев отмечена выраженная нормохромная анемия с низким содержанием эритроцитов и гемоглобина. При примерно одинаковой длительности ХПН и количестве диализов, наименьшее количество эритроцитов зарегистрировано у больных терминальной ХПН, причиной развития которой был хронический пиелонефрит.

Патогенетическая основа анемии разнообразна, в том числе и абсолютное или относительное снижение в крови содержания эритропоэтина. Установлено, что содержание ЭПО в крови больных с ХПН, находящихся на гемодиализе не имеет достоверных отличий от контрольной группы. У здоровых людей -10,7±2,25 мМед/мл; у больных с ХПН 7,8±1,82 мМед/мл. По данным литературы нормальная сывороточная концентрация ЭПО от 10 до 30 мМед/мл или 1-7 пмоль/л. При гипоксиях и анемиях здоровые почки должны продуцировать больше ЭПО и его плазменная концентрация должна быть более 25 мМед/мл. Следовательно, содержание ЭПО у больных низкое относительно выраженности анемии. Кроме ЭПО важная роль в эритропоэзе принадлежит железу и закономерностям его обмена. У больных на гемодиализе запасы железа постепенно истощаются в результате дополнительных кровопотерь и недостаточного его всасывания. В наших исследованиях в целом у больных ХПН содержание железа не выходит за рамки нормальных значений, но у 48% больных снижено содержание железа в крови. Концентрация железа в этой группе больных составляет от 3,9 до 8,5 мкм/л.

Железо транспортируется трансферрином, связывающим трехвалентное железо. Для оценки обмена железа используют процент насыщения трансферрина. В наших исследованиях процент насыщения трансферрина 37,5±1,9, что ниже относительно контроля, но не выходит за рамки значений для больных ХПН. У больных ХПН рекомендуется поддерживать этот показатель на уровне более 20%, но не более 50%, для исключения перегрузки железом. Сывороточный трансферрин в настоящее время рассматривается в качестве регуляторного белка, так как он стимулятор клеточной пролиферации и ростовой фактор для эритропоэтических клеток и клеток многих опухолей (106, 131,43).

Уровень запасов железа в организме может быть оценен измерением концентрации ферритина сыворотки крови. В среднем содержание ферритина у больных не выходит за рамки контрольных значений. Но группа больных по содержанию ферритина не однородна. У 46,6 % больных содержание ферритина от 22 до 91 мг/мл; у 26,7% - от 122 до 211 мг/мл; у 26,7% - от 521 до 787 мг/мл. У диализных больных с нормальными запасами железа его уровень должен превышать 50-100 мкг/л. После диализа содержание ферритина снижается - у 40% его концентрация от 18 до 32 мг/мл; у 40% - от 112 до 185 мг/мл; у 20% от 300 до 700 мг/мл. При уровне ферритина 30-100мкг/л следует предполагать дефицит железа. Пограничный уровень запасов железа отмечается у 60% больных ХПН соответственно концентрации ферритина от 100 мкг/л до 150 мкг/л. У больных ХПН уровень ферритина не связан с количеством железа в крови. У больных ХПН обнаруживается достоверная связь слабой силы лишь между ферритином, количеством эритроцитов и гемоглобином (г=0,5; р<0,05; г=0,49; р<0,05 соответственно); связь высокой силы между гемоглобином, эритроцитами и содержанием железа (г=0,89, р<0,05; г=0,86, р=0,059).

Развитие анемии, формирование вторичного иммунодефицита, снижение неспецифической резистентности может быть связано у больных ХПН с цитокиновым дисбалансом и дизрегуляцией. Исследовали содержание ростовых интерлейкинов 1, 2, 3, 4.

1Ь-1 (гемопоэтин 1) обладает разнообразной функциональной активностью, действует на кроветворные клетки на разных этапах их созревания, включая стадию полипотентных стволовых клеток. Стимуляция костномозгового кроветворения связана с усилением продукции колониестимулирующих факторов и синергичным с ними усилением пролиферации и дифференцировки клеток различных ростков кроветворения. Обладает ярко выраженным иммуностимулирующим действием, связанным с увеличением функциональной активности лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов. 1Ь-1 усиливает продукцию другого цитокина - 1Ь-2, основного фактора пролиферации Т-киллеров и МК-клеток. 1Ь-3 является полипотентным активатором пролиферации гемопоэтических клеток, обеспечивает поддержание пролиферации стволовых клеток и С034+-предшественников. 1Ь-4 - ростовой фактор для В-лимфоцитов.

Содержание 1Ь-1В у больных с ХПН несколько повышено, но достоверно не отличается от контроля. 1Ь-1 снижается после процедуры гемодиализа и становится аналогичным контролю. Из этого факта следует два вывода, что обследуемая группа пациентов не имеет воспалительных заболеваний и функциональная активация лейкоцитов при контакте с диализной мембраной (30) не сопровождается увеличением продукции этого цитокина. Количество 1Ь-2 снижено по сравнению с контролем и не изменяется под влиянием гемодиализной терапии. На основании снижения этого регуляторного цитокина можно предполагать нарушение клеточного звена иммунитета у данной категории больных и дисфункцию Т-хелперов, так как они являются основными продуцентами 1Ь-2. Действительно в литературе указывается, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе наблюдается значительное снижение абсолютного и относительно количества как общего пула Т лимфоцитов так и Т-хелперов. Эти изменения в иммунореактивности, по мнению ряда исследователей, являются характерными для уремических больных, находящихся на лечении программным гедиализом (59). Более того, указывается и на снижение функции Т-лимфоцитов (17). В динамике развития ХПН в мембранах лимфоцитов развиваются изменения, прогрессирующие по мере ухудшения функции почек. Уменьшается микровязкость липидного слоя Т-лимфоцитов, развивается нестабильность мембран, что приводит к нарушению рецепторной способности и транспортной функции (9).

Среди всех цитокинов особенно велики различия в количественном представительстве 1Ь-3. Согласно анализу средних величин количество 1Ь-3 в 4 раза выше, чем в контроле. После процедуры гемодилиза его содержание в крови понижается примерно в 7 раз и становится значительно ниже значений в контроле. Повышение концентрации 1Ь-3 можно рассматривать в качестве компенсаторной реакции в ответ на: угнетение эритроидной продукции в костном мозге, дефицит или дисфункцию ЭПО, действие гемодиализной терапии через активацию клеток его продуцентов.

У больных терминальной ХПН концентрация 1Ь-4 повышена. Снижение 1Ь-4 после диализа наблюдается только относительно его исходного уровня, а не относительно контрольных значений. Повышение 1Ь-4 в до диализный период можно рассматривать в качестве компенсации на анемию. 1Ь-3 и 1Ь-4 рассматривают в качестве неспецифических факторов, поддерживающих самообновление и пролиферацию КОЕ-ГММЭ и бипотентных кроветворных клеток (25). Кроме того, в условиях анемии при нормальном его содержании в крови может быть относительный дефицит 1Ь-4.

Таким образом, в основе генеза анемии при ХПН может лежать не только абсолютный или относительный дефицит ЭПО, но также и вторичный абсолютный или относительный недостаток ГЬ-З и 1Ь-4, вызванный процедурой гемодиализа.

Существует представление, что клетки крови и ее протеолитические представители составляют единую защитную систему организма функционально связанную между собой. Таким образом, вполне обоснованно выделение у системы комплемента регуляторной роли (31).

Несмотря на отсутствие элиминации комплемента через почки, у больных ХПН снижена активность СН5о и С1-С5 компонентов либо достоверно, либо на правах тенденции. Снижение активности компонентов комплемента может быть связано с несколькими механизмами, а именно, уменьшением синтеза компонентов комплемента в печени в условиях уремии, блокадой активных центров уремическими токсинами, функциональным потреблением комплемента, в том числе, его рецепторным связыванием. Возможно сочетание всех механизмов.

Гемодиализная процедура восстанавливает общую активность комплемента — СН50, которая превышает значения контрольной группы. Активация комплемента по альтернативному пути под влиянием диализной мембраны рассматривается как возможная причина развития нейтропении, легочного лейкостаза и дисфункции лейкоцитов за счет их ингибирования циркулирующими иммунными комплексами (67).

Цитокиновый дисбаланс у больных терминальной ХПН может быть одной из причин развития анемии, вторичного иммунодефицита Инфекционные осложнения у больных ХПН наблюдаются в 24-60% случаев, что ухудшает социальную реабилитацию и прогноз заболевания (9). Нарушения иммунитета более выражены в клеточном звене и не зависят от пола, причины, приведшей к терминальной ХПН, но зависят от продолжительности диализного лечения и типа мембран.