Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Патогенез изменений иммунного статуса и роль эритропоэтина в их коррекции при хронической почечной недостаточности

На правах рукописи

Агеев Юрий Иванович

ПАТОГЕНЕЗ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА „И РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИНА В ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2015

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, ТЕЛЕШЕВА Лариса Федоровна

профессор

доктор медицинских наук, ОСИКОВ Михаил Владимирович

профессор

Официальные оппоненты:

Симбирцев Андрей Семенович доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства России, директор

Гвозденко Татьяна Александровна доктор медицинских наук, Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения Владивостокский филиал, директор

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины», г. Санкт Петербург

¿¿О

Защита диссертации состоится «^о » _ 2015 года в Ж?часов на

заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64) и на сайте www.chelsma.ru

Автореферат разослан ^ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Шишкова Юлия Сергеевна

I РОСГ.ИИС'.КЛЯ 1 ОСУЦЛРСЛВПШАЯ БИБЛИОТЕКА ?015

ТТьШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЩССЕРТАЦИИ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Синдром хронической почечной недостаточности (ХПН) является важной проблемой современного здравоохранения, с ним связаны негативные последствия для здоровья и высокие затраты на оказание медицинской помощи По данным Российского регистра заместительной почечной терапии на начало 2012 г. количество больных ХПН, получающих заместительную терапию, составило 28548 человек, или 199,6 на 1 млн. населения (Бикбов Б.Т., Томилина H.A. Заместительная почечная терапия больных с ХПН в РФ в 1998-2011 гг // Нефрология и диализ. 2014. № 1. С. 11-127.).

При ХПН наблюдаются, глобальные изменения гомеостаза, приводящие к широкому спектру осложнений, определяющих качество и продолжительность жизни больных, эффективность терапии. Ключевое место в структуре осложнений занимают заболевания инфекционного, воспалительного генеза, атеросклероз-обусловленная патология. По данным Российского регистра заместительной почечной терапии, они встречаются более чем у 47% больных ХПН. В структуре летальности инфекционные осложнения занимают 2 место после кардиоваскулярной патологии. Патогенез сердечно-сосудистой, инфекционной патологии, заболеваний воспалительного генеза у данной категории больных связан с дисфункцией иммунной системы из-за изменения количества, функциональной активности, кооперации между иммунокомпетентными клетками (Betjes M.G. Immune cell dysfunction and inflammation in end-stage renal disease // Nat. Rev. Nephrol. 2013. Vol. 5. P. 255-265.

Патогенез изменений иммунного статуса при ХГ1Н до конца не изучен. В литературе представлены обширные, зачастую противоречивые данные о состоянии врожденног о и адаптивного иммунитета, регуляции иммунного ответа (Effect of uremia on structure and function of immune system i N.D. Vaziri [et al.] // J. Ren. Nutr. 2012. Vol. 1. P. 149-156.; Cohen G„ Hörl W.H. Immune Dysfunction in Uremia-An Update // Toxins (Basel). 2012. Vol. 24, № 4(11). P. 962-990.). На роль ведущих патогенетических факторов изменения иммунного статуса претендуют гиперазотемия и накопление продуктов метаболизма в крови, активация процессов свободно-радикального окисления (СРО), гиперпарагиреоз, нарушение фосфорно-кальцисвого обмена, обмена железа и др. (Uremia causcs premature ageing of the T cell compartment in end-stage renal disease patients / R.W. Meijers [et al.] // Immun Ageing. 2012. Vol. 9, № 1. P. 19.; Musial K., Zwoliñska D. New markers of apoptosis in children on chronic dialysis // Apoptosis. 2013. Vol. 1. P. 77-84.). He достигнуто консенсуса в понимании причинно-следственных связей при изменении иммунного статуса с участием указанных факторов. Широкий спектр показателей иммунного статуса не позволяет проводить мониторинг его изменения для раннего выявления, профилактики и контроля терапии осложнений инфекционного и воспалительного генеза, в этой связи видится необходимым определить наиболее значимые в прогностическом плане показатели!

В качестве средств коррекции иммунного статуса при ХПН интерес вызывают регуляторы гомеостаза эндогенного происхождения, в частности

эритропоэтин (ЭПО). ЭГЮ в настоящее время уже не рассматривается только как фактор, стимулирующий эритропоэз (Non-erythropoietic erythropoietin derivatives protect from light-induced and genetic photoreceptor degeneration / P. Colella [et al.] // Hum. Mol. Genet. 2011. Vpl. 20. P. 2251-2262; Захаров Ю.М. Цитопротекторные функции эритропоэтина // Клин, нефрология. 2009. № 1. С. 16-21.). Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о мультитропных эффектах этого гликопрртеина (Kim Y.J., Jung Y.W. Systemic injection of recombinant human erythropoietin after focal cerebral ischemia enhances oligodendroglial and endothelial progenitor cells in rat brain // Anat. Cell. Biol. 2010. Vol. 43, № 2. P. 140-149.; Lawler P.R., Filion K.B., Eisenberg M.J. Correcting Anemia in Heart Failure: The Efficacy and Safety of Erythropoiesis-Stimulating Agents // J. Card. Fail. 2010. Vol. 16. P. 649-658.; Осиков M.B. Влияние эритропоэтина на процессы свободно-радикального окисления и экспрессию гликопротеинов в тромбоцитах при хронической почечной недостаточности // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2014. Т. 157, № 1. С. 30-33.). Нами высказаны предположения о связи изменений иммунного статуса при Х1Ш со снижением продукции ЭПО, о наличии иммунотропных эффектов ЭПО при ХПН. Предпосылками для формулировки гипотез явились единичные данные об иммунотропных эффектах ЭПО в эксперименте при инфекционных заболеваниях (Erythropoietin and autoimmune neuroinflammation: lessons from experimental autoimmune encephalomyelitis and experimental autoimmune neuritis / T. Shin [et al.] // Anat. Cell Biol. 2012. Vol.45, № 4. P. 215220.). В 2011-2013 гг. впервые были опубликованы данные об экспрессии гена ЭПО в Т- и В-лимфоцитах, моноцитах, нейтрофилах, дендритных клетках человека (Changes in the Expression of Transcription Factors Involved in Modulating the Expression of FPO-R in Activated Human CD4-Positive Lymphocytes / K.A. Lisowska [et al.] // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 4. P. 0060326. DOI: 10.1371).

Цель исследования

Выявить новые аспекты патогенеза изменений иммунного статуса и установить возможную роль эритропоэтина в их коррекции при хронической почечной недостаточности в клинических и экспериментальных условиях.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние врожденного и адаптивного иммунитета, а также определить прогностическую значимость оценки иммунного статуса у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

2. Исследовать состояние врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

3. Изучить роль отдельных цитокинов (ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-у, ФНО-а) и эритропоэтина, азотемии, процессов свободно-радикального окислсния в крови, гибели лимфоцитов периферической крови в формировании изменений иммунного статуса при хронической почечпой недостаточности.

4. Исследовать влияние эритропоэтина на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

5. Изучить влияние эритропоэтина на показатели азотемии, свободно-радикального окисления, гибели лимфоцитов в периферической крови при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

Методология и методы исследования

Методология исследования базировалась на позициях диалектического материализма (Давыдовский И.В. Общая патология человека. М.: Медгиз, 1961. 504 е.; Саркисов Д.С., Пальцев М.А., Хитров Н.К. Общая патология человека. -М.: Медицина, 1995. 272 е.; Шевченко Ю.Л. Философия медицины. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2004. 480 е.). Методом сплошной выборки с учетом критериев включения и исключения отобрано 37 больных с XIIH, получающих гемодиапизную терапию и 24 клинически здоровых человека. Организация исследования одобрена этическим комитетом ГОУ ВПО ЧелГМА Минздрава России (протокол № 4 от 05.04.2012 г.).

Экспериментальные исследования выполнены на 195 белых нелинейных крысах массой 220-240 г. в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельсинской Декларации ВОЗ (1997). Моделирование ХПН осуществляли путем субтотальной нефрэктомии по методу Шуркалина Б.К. и соавт. в модификации Santos L.S. et al. и Hai-Chun Yang et al. (Шуркалин Б.К., Горский В.А., Фаллер А.П. Руководство по экспериментальной хирургии. — М.: Атмосфера, 2010. 176 с. Surgical reduction of the renal mass in rats: morphologic and functional analysis on the remnant kidney / L.S. Santos [et al.] // Acta Cir Bras. 2006. Vol. 21, №4. P. 252-257.; Yang H., Zuo Y, Fogo A.B. Models of chronic kidney disease // Drug Discov Today Dis Models. 2010. Vol. 7, №1-2. P. 1319.). Опытной группе вводили рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Эпокрин» (МНН: эпоэтин альфа, ГНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург). Для экспериментов in vitro использована цельная кровь 24 клинически здоровых людей - добровольцев, 37 больных с ХПН, находящихся на гемодиализе. Для достижения цели и решения поставленных задач исследования использованы следующие методы: клинические, иммунологические, биохимические, статистические, экспериментальное моделирование.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Достоверность результатов работы, правомочность основных положений и выводов основаны на достаточном числе наблюдений клинического и экспериментального фрагмента работы, полноте и широте литературно-библиографической справки, использовании современных методов статистической обработки материалов исследования с использованием профамм «Statistica 10.0 for Windows».

Основные положения диссертации представлены на III Международной (Х-ой итоговой) паучно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2012); Юбилейной 70-й научно-практической конференции молодых

ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2012); XVIII Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); II международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» (Челябинск, 2012); V Международной (ХП-ой итоговой) научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ЮГМУ (Челябинск, 2014); Научно-практической конференции, посвященной 40-летию ФГУП «Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России (Санкт-Петербург, 2014); IX Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г. Челябинске» (Челябинск, 2014); XI Уральском съезде иммунологов (Екатеринбург, 2014). Предварительная экспертиза диссертации проведена на расширенном заседании кафедр микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии, нормальной физиологии, биологической химии, Научно-исследовательского института иммунологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России.

Исследование выполнено на кафедре патологической физиологии, на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку, рабочей гипотезы, формулирование цели и задач, разработка дизайна исследования, анализ современной отечественной и зарубежной литературы и интерпретация экспериментальных данных, выполнены при личном участии автора на всех этапах исследования. Иммунологические, биохимические исследования выполнены автором лично при участии научных сотрудников Центральной научно-исследовательской лаборатории и Научно-исследовательского института иммунологии ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России.

Получение и интерпретация данных больных с ХИН проводились на базе отделения диализа ГБУ3 «Челябинская областная клиническая больница» с 2011 по 2013 гг. Статистическая обработка данных, интерпретация, анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на международных и всероссийских конференциях осуществлялись соискателем лично.

Положения, выносимые на защиту

1. При хронической почечной недостаточности наблюдаются активация поглотительной способности, кислород-зависимого метаболизма и лизосомалыюй активности нейтрофилов, снижение функционального резерва нейтрофилов периферической крови, повышение концентрации ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а, лимфоцитопения за счет снижения количества СБЗ+, СВ41-■, СБ81, СБ 16+, С020+, угнетение ТЫ- и ТЬ2-зависимого иммунного ответа. Прогностически значимыми показателями иммунитета для развития осложнений у больных хронической почечной недостаточностью выступают: общее количество лейкоцитов, нейтрофилов, лизосомольная

активность нейтрофилов, уровень СЗ компонента комплемента в сыворотке, количество CD3+ лимфоцитов, концентрация в сыворотке Ig М, Ig G, ИФН-у.

2. Факторами патогенеза изменений иммунного статуса при хронической почечной недостаточности выступают повышение концентрации ИЛ-2, ИФН-у, 'ГНФ-а, накопление продуктов метаболизма, активация процессов свободно-радикального окисления, гибель лимфоцитов путем некроза и апоптоза в периферической крови.

3. Применение эритропоэтина при экспериментальной хронической почечной недостаточности частично или полностью восстанавливает количественный состав лейкоцитов и функциональную активность нейтрофилов периферической крови, показатели Till- и Th2-зависимого иммунного ответа; механизм иммунотропного действия эритропоэтина связан с дезинтоксикационным, ПОЛ-ограничивающим и снижающим гибель лимфоцитов крови эффектами.

Научная новизна

Продемонстрировано, что изменения иммунного статуса у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и при экспериментальном моделировании ХГ1Н выражаются в активации врожденного иммунитета и депрессии адаптивного иммунитета. Впервые установлено, что прогностически значимыми показателями иммунного статуса для развития осложнений инфекционного и воспалительного генеза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, выступают количество в крови лейкоцитов, нейтрофилов, лизосомапьная активность нейтрофилов, уровень СЗ компонента комплемента, количество CD3+ лимфоцитов, Ig М и G, ИФН-у в сыворотке. Впервые представлены данные, уточняющие патогенез изменений иммунного статуса при ХПН, в том числе повышение концентрации в сыворотке ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а, накопление веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме, в эритроцитах и в лимфоцитах, повышение концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы и первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта лимфоцитов, снижение активности СОД и каталазы в плазме, активация гибели лимфоцитов путем некроза и апоптоза. Впервые в экспериментальных условиях in vivo показано, что ЭПО при ХПН полностью или частично восстанавливает врожденный и адаптивный иммунитет1 по показателям количественного состава лейкоцитов в крови, поглотительной способности и кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов, Thl- и ТЬ2-зависимого иммунного ответа. Впервые представлены данные, уточняющие механизм иммунотропных эффектов ЭПО при ХПН в связи со снижением концентрации продуктов метаболизма в крови, первичных и конечных продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах, ограничением гибели лимфоцитов в крови путем некроза и апоптоза. Впервые в условиях in vitro показано, что ЭПО стимулирует функциональную активность изолированных интактных нейтрофилов и дозо-зависимо в диапазоне концентраций от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л ограничивает гибель лимфоцитов, полученных от больных ХПН.

Теоретическая и практическая значимость работы

В ходе проведенного исследования уточнены закономерности формирования иммунореактивности в терминальную стадию ХПН. Показано, что активация врожденного иммунитета и депрессия адаптивного иммунитета при ХПН обусловлены повышением концентрации в сыворотке ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а, гиперазотемией и накоплением продуктов метаболизма в крови, активацией процессов свободно-радикального окисления в плазме и в лимфоцитах, гибелью лимфоцитов в периферической крови путем некроза и апоптоза. Результаты работы позволили продемонстрировать регуляторное влияние ЭПО на иммунный статус при ХПН и установить некоторые механизмы иммунотропного действия ЭПО, включая дезинтоксикационный, ПОЛ-ограничивающий и снижающий гибель лимфоцитов в крови. С целью совершенствования диагностики, профилактики и терапии осложнений инфекционного и воспалительного генеза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, могут быть использованы выявленные прогностически значимые показатели иммунного статуса такие как общее число лейкоцитов, нейтрофилов, лизосомальная активность нейтрофилов, уровень СЗ компонента комплемента, количество СОЗ+ лимфоцитов, содержание иммуноглобулинов М и О и ИФН-у в сыворотке. Полученные результаты могут быть использованы в практической работе нефрологов, клинических иммунологов, аллергологов, а также в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Полученные сведения об иммунотропных эффектах эритропоэтииа при ХПН являются предпосылкой, для проведения дальнейших исследований по расширению показаний для его клинического применения.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Метод мониторинга иммунного статуса у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, внедрен в практику работы отделения диализа ГБУЗ «Челябинской областной клинической больницы».

Публикации

Соискатель имеет 21 опубликованную работу по теме диссертации общим объемом 3,99 печатных листов, в том числе 11 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданиях для опубликования осповных научных результатов диссертации. Соискателем опубликованы 4 работы в материалах всероссийских и международных конференций, имеется 3 публикации в электронных научных изданиях и 3 статьи в других научных журналах и изданиях.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 202 страницах, содержит 49 таблиц и 3 рисунка; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 438 источников (44 - отечественных и 394 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ -

Материалы и методы исследования

Дизайн клинического фрагмента работы представлен на схеме (рисунок 1).

Рисунок 1 - Дизайн клинического фрагмента работы

Проведено краткосрочное, трехмесячное, открытое, проспективное исследование клинического и иммунного статуса у больных с ХПН, находящихся на гемодиализе. Первоначально в исследование включено 144 пациентов с TXIIH, получающих заместительную почечную терапию в ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Отбор больных проводился согласно критериям включения и исключения. Критерий включения: больные с ХПН (мужчины и женщины), получающие гемодиализ 3 раза в неделю по 4 часа на аппаратах 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия). Критерии исключения: I) больные с ХПН, получающие гемодиализ более 3 раз и менее 3 раз в неделю; 2) больные с ХПН после траненлантации почки с возвратом на лечение гемодиализом; 3) наличие на момент исследования гнойно-септических осложнений; 4) наличие увеличенных лимфатических узлов любой локализации; 5) больные, принимающие глюкокортикостероиднуто и/или цитостагическую терапию; 6) наличие подтвержденных онкологических заболеваний; 7) наличие ВИЧ, гепатита

С, гепатита В; 8) наличие аллергических реакций; 9) наличие аутоиммунных заболеваний. После рандомизации в исследование включено 37 человек, в т.ч. 22 женщины и 15 мужчин. Группа I (п=24) представлена клинически здоровыми людьми, не имеющими соматической патологии, сопоставимыми по полу и возрасту с основными группами. Основные группы (группа II и группа 1П) представлены больными с ХПН, находящимися на постоянном лечении гемодиализом. Исследования проводились до процедуры гемодиализа — группа II (п=37) и после процедуры гемодиализа — группа III (п=37). Все больные с ХПН получали терапию ЭПО в составе препарата «Эпокрин» (международное непатентованное название: эпоэтин альфа, ГНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург) с целью коррекции анемии.

Экспериментальная модель ХПН у крыс создавалась двухэтапной оперативной резекцией 5/6 почечной ткани по методу Шуркалина Б.К. и соавт. ХПН развивалась на 21 сутки, для верификации определяли концентрацию в сыворотке креатинина, мочевины. Для исследования иммунотропных эффектов ЭПО при ХПН 195 белых нелинейных крыс были случайным образом разделены на 3 группы: группа I -ложнооперированные (п=64); группа II — ХПН (п=66); группа ITI - ХПН + ЭПО (п=65). Животным III группы с 21 суток внутрибрюшинно, ежедневно вводили рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Эпокрин» в дозе 100 ME/кг массы тела в течение 9 дней. Животным I и II групп вводили эквиобъемное количество физиологического раствора. Исследования проводили на 30 сутки.

Эксперименты в условиях in vitro. Проведены с использованием крови 24 клинически здоровых людей добровольцев, 37 больных с ХПН. Исследовали: 1) влияние креатинина на функциональную активность нейтрофилов; 2) влияние ЭПО на функциональную активность нейтрофилов; 3) влияние ЭПО на гибель лимфоцитов, полученных от больных с ХПН; 4) влияние плазмы больных с ХПН на гибель лимфоцитов здоровых людей; 5) влияние ЭПО на гибель лимфоцитов здоровых людей. Крсатинин использовали в концентрации 1 ммоль/л, ЭПО в концентрациях 30 МЕ/л; 15 МЕ/л; 7,5 МЕ/л; 3,75 МЕ/л; 1,88 МЕ/л.

Клинические методы исследования. Всем больным с ХПН, проведено комплексное клиническое обследование, по показаниям - ультразвуковые, эндоскопические, рентгенологические, гистологические, бактериологические и другие методы исследования.

Иммунологические методы исследования. Количество лейкоцитов в крови и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами. Поглотительную способность лейкоцитов исследовали с частицами монодисперсного полистирольного латекса, учитывали активность, интенсивность фагоцитоза и фагоцитарное число (Фрейдпин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека. Л.. 1986. 37 е.). Кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов исследовали, учитывая интенсивность восстановления нитросинего тетразолия (HCT) в диформазан в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте и расчетом функционального резерва клеток (Маянский А.Н., Виксман М.К. Способы оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления

нитросинего тетразолия: метод, рек. Казань, 1979. И е.). Лизосомапьную активность нейтрофилов определяли с раствором акридинового оранжевого (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека. Л., 1986. 37 е.). Концентрацию компонентов комплемента СЗ и С5 исследовали методом ИФА. Концентрацию в сыворотке интерлейкина (ИЛ)-1 бета, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, интерферона (ИФН)-гамма, туморнекротического фактора (ТНФ)-альфа, ЭПО проводили на иммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с применением тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск). Популяционный и субпопуляционный спектр лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD1 lb+, CD 16+, CD22+, CD25+, CD95+, HLA-DR+) определяли методом непрямой иммунофлюорссценции с использованием моноклонапьных антител НИИ «Препарат» (Н. Новгород). Концентрацию иммуноглобулинов Ig A, Ig М, Ig G в сыворотке оценивали с помощью иммуноферментного анализа с гест-системами «Вектор-Бест» (Новосибирск) на «Personal LAB» (Италия). Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антигелообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аплогенными эритроцитами. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аплогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский [и др.]. Челябинск : Изд-во ЧелГПУ, 2000. 167 е.). Гибель лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США).

Биохимические методы исследования. Определение веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ) в плазме, в лимфоцитах, в эритроцитах проводили на спектрофотометре «СС - 104» (Россия) при длине волны 210 нм (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. Т. 1. - Мн.: Беларусь, 2000. С. 347-351.). Концентрацию мочевины, мочевой кислоты и креатинина в сыворотке определяли на анализаторе «Analelte» (США) с применением тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск). Уровень продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах определяли спектрофотометрически раздельно в гептановой и в изопропанолыюй фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептаи-изопропанольных экстрактах крови // Вопр. мед. химии. 1989. Т. 35, №1. С. 127131.; Спектрофотометричсское определение конечных продуктов ПОЛ / LÍ.H. Львовская [и др.] // Вопр. мед. химии. 1991. № 4. С. 92-93.). Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) - Е2з2/Е22п (относительное содержание диеновых копьюгатов - ДК), Е27В/Е22о (уровень кетодиенов и сопряженных гриенов - КД и СТ) и (уровень оснований Шиффа - ШО). О состоянии

антиоксидантной защиты судили по активности СОД в сыворотке (Чевари С., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело. 1985. №11. С. 678-681.)

и каталазы в сыворотке и в эритроцитах (Коралюк М.А., Майорова И.Г. Определение активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.).

Статистические методы исследования. Результаты обрабатывали с использованием программ «Statistica 10.0 for Windows». Характеристика выборок представлена в формате «М±ш», где М-среднее арифметическое значение признака, ш-стандартная ошибка среднего. Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, для проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий — критерий Левена. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна-Уитни (LT), Вальда-Вольфовитца (WW), Крускела-Уоллиса. Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали значимыми при р<0,05. Для изучения связи между наличием осложнений у больного с XI1H и показателями иммунного статуса использован регрессионный анализ и метод построения деревьев классификации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение иммунного ста туса и прогностическая значимость оценки иммунитета при ХПН

У больных ХПН до гемодиализа общее количество лейкоцитов снижается преимущественно за счет лимфоцитов (в среднем на 68,6% от значений в контрольной группе), а также моноцитов (в среднем на 20,4%), количество фагоцитирующих клеток значимо не изменяется. Изменение общего количества лейкоцитов и моноцитов в крови не выходит за пределы допустимых референсных значений. Увеличение количества лейкоцитов после гемодиализа является отражением гемоконцентрации. У больных ХПН наблюдается активация клеточных факторов врожденного иммунитета и повышение концентрации СЗ компонента комплемента в сыворотке (таблица 1). Повышается кислород-зависимый метаболизм, лизосомальная активность нейтрофилов, снижается функциональный резерв нейтрофилов в крови.

Таблица 1 - Показатели врожденного иммунитета у больных ХПН, (М*т)

Группы / Показатели Группа 1 Контроль (п=24) Группа 2 ХПН до диализа (п=37) Группа 3 ХПН после диализа (п-37)

Активность фагоцитоза, % 49,33±2,14 47,49*2,54 46,22*2,11

Интенсивность фагоцитоза, у.е. 1,30*0,09 1,24*0,10 1,17*0,09

Фагоцитарное число, у.е. 2,69*0,19 2,50±0,12 2,47*0,13

НСТ-тест с понт., акт-ть, % 19,00±2,60 28,41 ±1,76* 28,54*1,99*

НСТ-тест спонт., инт-ть, у.е. 0,35±0,05 0,46*0,04 * 0,47*0,04 *

НСТ-тест инд., акт-ть, % 27,67*2,73 23,65*2,01 25,84*1,72

НСТ-тест инд., инт-ть, у.е. 0,47±0,05 0,36*0,04 0,42*0,03

Функц. резерв (акт-ть НСТ-теста) 1,46*0,1 1 0,83±0,06 * 0,91*0,07*

Функц. резерв (инт-ть НСТ-теста) 1,34±0,09 0,78*0,04 * 0,89*0,05 *

Лизосомальная активность, у.е. 241,17±9,53 304,85*11,82 * 302,79*13,91 ♦

СЗ, ед. эфф. мол./мл 0,76*0,02 0,89*0,03 * 0,88*0,02 *

С5, ед. эфф. мол./мл 0,10*0,01 0,12*0,03 0,13*0,03

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой 1, # - с группой 2.

При исследовании адаптивного иммунитета у больных ХПН выявлено снижение абсолютного количества эффекторов клеточного (СОЗ+, СБ4+, С08+) и гуморального (СЭ20+) иммунитета, >ЛС-клеток (С016+), снижение количества лимфоцитов, несущих маркеры ранней (СБ25+) и поздней (НЬА-В11+) активации, готовности к апоптоэу (СБ95+) (таблица 2).

Таблица 2 - Популяционный спектр лимфоцитов в крови у больных ХПН, (М+т)

Группы / показатели Группа 1 Контроль (п=24) Группа 2 ХПН до диализа (п=37) Группа 3 ХПН после диализа (п=37)

СОЗ+, • 10'/л 1,25±0,07 0,34+0,03 * 0,55+0,07 *

Сй4+, • Ю'/л 0,89+0,04 0,25+0,03 * 0,38+0,05 *

СЭ8+, • Ю'/л 0,74+0,05 0,18+0,02* 0,29+0,03 » #

СОПЬ+, • 10'7л 0,39+0,04 0,13+0,02 * 0,17+0,02 *

СО 16+, • Ю'/л 0,45+0,05 0,11+0,01 * 0,17±0,02 •

С020+, • 10% 0,43+0,03 0,11+0,01 * 0.16+0,02 *

С025+, • Ю'/л 0,28+0,02 0,09+0,01 * 0,14+0,02 * #

НЬА-01М-, • 10'/л 0,39+0,04 0,08±0,01 * 0,16+0,03 * #

СЭ95+, • 10'/л 0,49+0,06 0,17+0,02 * 0,26+0,04 *

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой 1, # - с группой 2.

Концентрация иммуноглобулинов А, М, й в сыворотке не выходит за границы референсных значений. У больных ХПН до процедуры гемодиализа повышается концентрация в сыворотке ИЛ-1(1, ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а. Концентрация ИЛ-1р не выходит за пределы диапазона референсных значений (таблица 3). Процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на уровень исследуемых цитокинов в сыворотке. Концентрация ЭПО в сыворотке у больных ХПН не отличается от 1руппы контроля.

Таблица 3 - Содержание цитокинов и ЭПО в плазме у больных ХПН, (М+т)

Группы / показатели Группа 1 Контроль (п=20) Группа 2 ХПН до диализа (п=30) Группа 3 ХПН после диализа (п=30)

ИЛ-1Р, пг/мл 2,41+0,26 4,82+0,96 * 5,49+1,48

ИЛ-2, пг/мл 2,40+0,15 11,46±0,93 * 13,28+1,17 *

ИЛ-4, пг/мл 1,36+0,08 1,56+0,29 1,45+0,07

ИЛ-10, пг/мл 3,92+0,31 4,62+0,67 5,04+0,46

ИФН-у, пг/мл 10,06+0,63 29,46+2,11 ♦ 28,24+2,68 *

ТНФ-а, пг/мл 1,40+0,12 8,96+0,57 * 9,18+0,86*

ЭПО, мМЕ/мл 19,16+0,86 32,41+6,39 31,77+7,33

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой 1.

У всех больных с терминальной стадией ХПН, зафиксировано наличие инфекционной и/или воспалительной патологии. В период наблюдения зарегистрированы новые заболевания инфекционно-воспалительного генеза. Наиболее часто встречались заболевания органов дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы, а также их сочетания. Для изучения значимости оценки иммунного статуса и прогнозирования развития указанной патологии у больных ХПН была сформирована группа больных с 3 и более заболеваниями инфекционного или воспалительного генеза, другие больные

составили группу с 1-2 заболеваниями. По результатам регрессионного анализа, в наибольшей степени риск возникновения заболеваний инфекционного или воспалительного генеза у больных с ХПН ассоциирован со снижением количества лейкоцитов, увеличением содержания СЗ фрагмента комплемента в сыворотке, лизосомальной активности нейтрофилов, снижением концентрации ^ М, ИФН-у в сыворотке. Не обнаружено независимого влияния ЭПО на возникновение осложнений инфекционного и воспалительного генеза. С использованием метода деревьев классификации установлено, что у пациента с терминальной стадией ХПН имеются множественные (3 и более) локусы инфекционного или воспалительного поражения тканей при содержании нейтрофилов ниже 5,9*109/л; концентрации ИФН-у в сыворотке ниже 29,46 пг/мл; концентрации ^ в ниже 19,8 г/л; содержании СОЗ+ лимфоцитов ниже 77,5%. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование показателей иммунограммы - общего количества лейкоцитов, нейтрофилов, лизосомальной активности нейтрофилов, уровня СЗ компонента комплемента в сыворотке, количества СЭЗ+ лимфоцитов, содержание в сыворотке ^ М, íg в, ИНФ-у для прогноза возникновения новых заболеваний инфекционного или воспалительного генеза.

При экспериментальной ХПН в крови увеличивается количество нейтрофилов, снижается количество лимфоцитов, общее количество лейкоцитов не изменяется. Активация фагоцитирующих клеток в крови презентируется увеличением поглотительной способности и кислород-зависимого метаболизма, снижением функционального резерва нейтрофилов (таблица 5). Угнетается ТЫ- и Т112-зависимый иммунный ответ по показателям реакции ГЗТ, абсолютному и относительному количеству АОК в селезенке (таблица 4).

Таблица 4 - Влияние ЭПО на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной ХПН, (М±т)

Группы / Показатели Группа I Л/опериров. (п=!9) Группа 2 ХПН (4=15) Группа 3 ХПН н ЭПО (п=29)

Активность фагоцитоза, % 32,37±2,01 45,20*3,05 * 41,21*2,16*

Интенсивность фагоцитоза, у.е. 0,65*0,05 1,25*0,20 * 0,93*0,09 * #

Фагоцитарное число, у с. 2,21*0,09 3,60*0,29 * 2,34*0,17 * #

НСТ-тест спонт., активность, % 8,67*1,69 18,00*2,29 * 12,10*1,47 Н

НСТ-тсст спонт., индекс, у.е. 0,14*0,03 0,29*0,05 * 0,16*0,03 и

НСТ-тест инд., активность, % 15,05*2,79 20,36*1,83 15,26*1,08

НСТ-тест инд., индекс, у.е. 0,19*0,04 0,28*0,03 * 0,18*0,02

Функц. резерв (акт-ть НСТ-теста) 1,74*0,08 1,13*0,06 * 1,26*0,07*

Функц. резерв (инт-ть ПСТ-теста) 1,36*0,04 0,97*0,05 * 1,13*0,06 *

ГЗТ, мл 0,48*0,07 0,26*0,04 ♦ 0,40*0,04 №

АОК, 101 597,06*140,28 257,17*59,54 ♦ 955,76*167,67 #

АОК, / Ю6ЯСК 536,07*177,32 154,16*65,65 * 967,97*317,80 #

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с |руппой I л/опериров., # - с группой 2 ХИН.

Патогенез изменений иммунного статуса при ХПН

С учетом данных литературы и собственных результатов высказано предположение о ключевой роли в патогенезе изменения иммунного статуса при ХПН следующих факторов: 1) концентрации ключевых иммунорегуляторных цитокинов и ЭПО в крови; 2) метаболитов, накапливающихся в крови, в связи с утратой функции почек; 3) процессов свободно-радикального окисления в плазме и в лимфоцитах; 4) гибели лимфоцитов.

Установлено, что повышение концентрации в крови провосналительных цитокинов (ИЛ-2, ТНФ-а, ИФН-у) вносит определенный вклад в активацию функциональной активности нейтрофилов в крови: положительная слабая статистически значимая связь между показателями спонтанного и индуцированного НСТ-теста и концентрацией ИЛ-1Р, ТНФ-а, ИФН-у. Повышение уровня ТНФ-а в крови может быть фактором активации гибели лимфоцитов и снижения их количества в крови. Количество СОЗ+, СП8+, СЭ20+ клеток имеет обратную слабой силы связь с концентрацией ТНФ-а в сыворотке. Повышение концентрации ИЛ-2 и ИФН-у в сыворотке у больных ХПН может рассматриваться как компенсаторный ответ на дефицит 'Г-клеточного звена иммунитета и др. факторы в условиях вторичного иммунодефицита. В целом, результаты констатируют дисбаланс в системе ТЫ/ТЬ2 -- зависимых цитокинов с поляризацией в сторону цитокинов ТЫ-зависимого пути иммунного ответа (ИЛ-2 и ИФН-у). Нами не обнаружено значимых связей между концентрацией ЭПО в сыворотке и показателями иммунитета. Полагаем, что это связано с критическим снижением продукции эндогенного ЭПО у больных с ХПН и включением в базисную терапию препаратов ЭПО, в связи с чем присутствие в сыворотке у больных ХПН ЭПО преимущественно обусловлено его экзогенной формой.

Азотемия вносит вклад в изменение количества и функциональной активности иммунокомпегентных клеток при ХПН. До процедуры гемодиализа концентрация креатинина в сыворотке повышается в 25,1 раза, мочевины - в 3,5 раза от средних значений в контрольной группе. По данным корреляционного анализа, НСТ-тест и лизосомальная активность нейтрофилов нарастают по мере повышения концентрации креатинина в сыворотке; общее количество лимфоцитов, в т.ч. СЮ8+, в крови снижается по мере повышения концентрации креатинина и мочевины в сыворотке; количество СОЗ+, СП4> клегок уменьшается по мере повышения концентрации креатинина. В экспериментальных условиях т добавление креатинина в концентрации, наблюдаемой в среднем у больных ХПН, к интактным нейтрофилам повышает кислород-зависимый метаболизм по показателю интенсивности спонтанного НСТ-теста. При экспериментальной ХПН повышается концентрация мочевины и креатинина в плазме, происходит накопление ВНСММ в плазме, в эритроцитах и в лимфоцитах. Поглотительная способность и кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов в крови нарастают по мере повышения концентрации ВНСММ в плазме, в эритроцитах. Выраженность ТЫ-зависимого, но не ТЬ2-зависимого иммунного ответа снижается по мере повышения концентрации ВНСММ в плазме, в эритроцитах и в лимфоцитах периферической крови.

Активация процессов СРО - еще один фактор патогенеза изменений иммунного статуса при ХПН. При экспериментальной ХПН в плазме накапливаются первичные и вторичные продукты ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях; снижается активность СОД и каталазы (таблица 5). В лимфоцитах крови увеличивается содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта.

Таблица 5 - Влияние эритропоэгина на содержание продуктов ПОЛ в плазме и в лимфоцитах и показатели антиоксидаитной защиты в крови при экспериментальной ХПН, (М+гп)______

Показан ели Группа 1 Л/опериров. (п=12) Группа 2 ХПН (п=12) Группа 3 ХПН +ЭПО (п=12)

ДК (г) пл., е.и.о. 0,18+0,04 0,36+0,01 * 0,34+0,05 *

КД и CT (г) пл., е.и.о. 0,013+0,005 0,081+0,011 * 0,086+0,022 *

JLUO (г) пл., е.и.о. 0,047+0,017 0,017+0,005 0,030+0,008

ДК (и) пл., е.и.о. 0,25+0,03 0,39+0,01 * 0,29+0,03 #

КД и CT (и) пл., е.и.о. 0,204+0,011 0,261+0,007 * 0.323+0,083

ШО (и) пл., е.и.о. 0,017+0,005 0,016+0.002 0,009+0,001 #

ДК (г) лц., е.и.о. 0,69+0,09 0,66+0,02 0,76+0,10

КД и С.Т (г) лц., е.и.о. 0,39+0,04 0,36+0.05 0,38+0,05

ШО (г) лц., е.и.о. 0,09+0,02 0,09+0,01 0,14+0,03

ДК (и) лц., е.и.о. 1,33+0,05 8,39+2,58 + 0,93+0,08 * U

КД и CT (и) лц., е.и.о. 0,22+0,03 0,42+0,04 * 0,38+0,03 *

ШО (и) лц., е.и.о. 0,035+0.010 0,13+0,02 * 0,06+0,02 #

СОД плазмы, Ед/мл 1,61+0,07 0,87+0,14 * 1,33+0,14 #

Каталаза плазмы, мкат/л 20,40+0,89 14,38+0,85 * 17,43+0,44 •#

Каталаза эритроцитов, мкат/л 18,78+1,85 13,70+1,11 * 17,37+0,14 U

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой 1 л/опериров., # - с группой 2 ХПН. Содержание продуктов ПОЛ в гептановой (г) и изопропанольной (и) фракции липидного экстракта плазмы (пл.) и лимфоцитов (лц.).

Выраженность Till- и ТЬ2-зависимого иммунного ответа снижается по мере накопления продуктов ПОЛ в лимфоцитах. Полагаем, что это связано с повреждением мембран лимфоцитов в условиях оксидативного стресса, приводящим к инициации гибели путем некроза или апоптоза и как следствие снижению их количества в крови.

У больных ХПН в крови увеличивается количество лимфоцитов с ранними и поздними признаками апоптоза, признаками некроза, снижается количество интактных лимфоцитов. По данным корреляционного анализа, количество в крови у больных с ХПН CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+ клеток снижается по мере увеличения клеток с признаками раннего апоптоза, позднего апоптоза и одновременно некроза, признаками некроза. В экспериментах in vitro установлено, что факторами активации гибели лимфоцитов выступают вещества, находящиеся в плазме крови, т.к. добавление плазмы больных с ХПН к лимфоцитам здоровых людей увеличивает количество клеток с признаками некроза и апоптоза (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние плазмы больных с ХПН на показатели гибели лимфоцитов периферической крови здоровых людей, (М*т)______

Показатели, % клеток Лимфоциты здоровых + плазма здоровых (п=14) Лимфоциты здоровых + плазма больных ХПН (п=14)

Annexin-5-FITC-/7-AAD- 80,83*0,83 81,51*1,54

Annexin-5-FITC+/7-AAD- 19,06±0,82 18,26*1,53

Annexin-5-FITC+/7-AAD+ 0,05±0,01 0,11 ±0,02 *

Annexin-5-FITC - /7-AAD + 0,06*0,01 0,13*0,03 *

Примечание. * - значимые (р<0,05) различия с группой контроля.

При экспериментальной ХПН в периферической крови увеличивается количество лимфоцитов с ранними и поздними признаками апоптоза, признаками некроза (таблица 7).

Таблица 7 - Влияние ЭПО на показатели гибели лимфоцитов при экспериментальной ХПН, (М*т)_______________

Показатели Группа 1 Л/опериров. (п=18) Группа 2 ХПН (п=18) Группа 3 ХПН+ЭПО (п=18)

Annexin-5-FITC-/7-AAD-, % клеток 85,99*1,35 73,51*1,66 * 82,99*0,93 #

Annexin-5-FITC+/7-AAI>-, % клеток 13,02*1,29 23,95*1,22 * 16,46*0,89 * #

Annexin-5-FITC+/7-AAD+, % клеток 0,39*0,09 1,31*0,29* 0,25*0,04 #

Annexin-5-FITC-77-AAD +, % клеток 0,69*0,08 1,23*0,22 * 0,29*0,07 * U

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой 1 л/опериров., # - с группой 2 ХПН.

Механизм иммунотропных эффектов ЭПО при экспериментальной ХПН

Применение ЭПО при экспериментальной ХПН приводит к изменению показателей иммунного статуса. Количественный состав лейкоцитов в крови восстанавливается за счет увеличения представительства лимфоцитов, снижения -нейтрофилов. Полагаем, что ключевым механизмом восстановления количества лимфоцитов в крови выступает ограничение апоптоза клеток.

ЭПО частично восстанавливает функциональную активность нейтрофилов в крови. Снижались поглотительная способность, показатели активности и интенсивности спонтанного НСТ-теста. Такие изменения могут быть следствием снижения количества нейтрофилов в крови, а также обусловлены прямым вмешательством ЭПО в функциональную активность клеток. В экспериментальных условиях in vitro ЭПО в диапазоне концентраций от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л стимулирует поглотительную способность и НСТ-тест нейтрофилов, выделенных из крови клинически здоровых людей. ЭПО при экспериментальной ХПН полностью восстанавливает выраженность Thl- и Th2-зависимого иммунного ответа по показателям ГЗТ и количеству АОК в селезенке.

Механизм иммунотропных эффектов ЭПО при экспериментальной ХПН является многофакторным. По нашим данным, включает, во-первых, снижение уровня азотемии и накопления метаболитов в крови, во-вторых, ограничение процессов свободно-радикального окисления в крови, в-третьих, снижение гибели лимфоцитов в периферической крови.

Применение ЭПО при экспериментальной ХПН приводит к снижению концентрации креатинина (на 13%), ВНСММ в плазме (на 29%), ВНСММ в

лимфоцитах (на 34%). Повышение на правах тенденции содержания ВНСММ в эритроцитах позволяет предположить перераспределение в крови продуктов метаболизма, из плазмы и лимфоцитов они могут перемещаться на поверхность или внутрь эритроцитов, т.к. ЭПО может выступать в роли протектора мембран за счет вмешательства в баланс прооксидантных и антиоксидантных систем. Снижение уровня метаболитов в крови при экспериментальной ХПН может быть связано с прямым нефроцитопротекторным действием ЭПО.

Установлен ПОЛ-ограничивающий эффект ЭПО при экспериментальной ХПН, проявляющийся в снижении уровня первичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции плазмы и липидного экстракта лимфоцитов крови. ЭПО повышает активность СОД и каталазы в плазме и в эритроцитах. По данным корреляционного анализа, в условиях применения ЭПО содержание первичных продуктов в изопропанольной фракции плазмы снижается по мере повышения активности СОД и каталазы в плазме.

ЭПО при экспериментальной ХПН ограничивает гибель лимфоцитов в периферической крови. Применение ЭПО при ХПН приводит к снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза, увеличению количества интактных клеток. Для подтверждения прямого эффекта ЭПО на выраженность гибели лимфоцитов периферической крови при ХПН проведены эксперименты in vitro. При добавлении ЭПО к лимфоцитам, полученным от больных ХПН, в диапазоне доз от 1,88 МЕ/л до 30,0 МЕ/л ЭПО дозо-зависимо уменьшает количество лимфоцитов с ранними признаками апоптоза, вне зависимости от дозы увеличивает количество лимфоцитов с одновременными признаками позднего апоптоза и признаками некроза (таблица 8).

Таблица 8 - Влияние ЭПО на показатели гибели лимфоцитов больных ХПН, (М+т)

Показатели Annexin-5-F1TC-/7-AAD-, % Annexin-5- FITC+/7-АА&-, % Anncxin-5-FITC+/7-AAD+, % Annexin-5-FITC-/7-AAD+, %

Контроль: Лимфоциты больных с ХПН н физ.р-р 68,33±2,17 31,05+2.12 0,37+0,05 0,29+0,04

+ ЭПО 1,88 МЕ/л 88,45+1,20 * 9,99+0,96 * 1,39+0,28 ♦ 0,17+0,04 *

+ ЭПО 3,75 МЕ/л 90,13+1,43 * 8,46+1,17 * 1,23+0,29 * 0,18+0,04 *

к ЭПО 7,5 МЕ/л 91,37±1,18 * 7,19+0,85 * 1,23+0,32 * 0,21+0,05

+ ЭПО 15 МЕ/л 91,85±1,19 * 6,99+1,06* 0,96+0,17* 0,19+0,02 *

+ ЭПО 30 МЕ/л 92,96+0,96 * 6,23+0,83 * 0,65+0,15 * 0,15+0,04

Примечание: * - значимые (р<0,05) различия с группой контроля.

Полагаем, что увеличение количества лимфоцитов с поздними признаками апоптоза отражает механизм негативной селекции лимфоцитов, вступивших в стадию необратимой гибели. Эффект ЭПО на выраженность апоптоза лимфоцитов проявляется только в отношении уремических, но не интактных лимфоцитов, т.к. добавление ЭПО в различных концентрациях к лимфоцитам здоровых людей не оказывает значимого влияния на выраженность экспрессии маркеров апоптоза и некроза. Предполагаемый механизм изменения иммунного статуса, роль ЭПО в коррекции врожденного и адаптивного иммунитета при ХПН представлены на интегральной схеме (рисунок 2).

Экзогенный ЭПО

Изменение цитокинового профиля в крови фИЛ-2 фИФН-гамма фТНФ-альфа

Активация СРО в крови

фпродукгов ПОЛ в плазме

ф продуктов ПОЛ в лимфоцитах Фактивности СОД Ф активности каталазы

Накопление

метаболитов

в крови

фкреатинина

фмочевины

фВНСММ

^ Апоптоз лимфоцитов

Изменение иммунного статуса при ХПН

Ф адаптивного иммунитета Ф СБЭ+, С04+, С08+, СО 16+, С020+, С025+, Н1.А-1Ж+ в крови Ф ТЫ-зависимого иммунного ответа Ф Независимого иммунного ответа ♦ врожденного иммунитета ф количества фагоцитов в крови ф генерации АФК ф поглотительной способности ф лизосомальной активности

Осложнения инфекционного и воспалительного генеза

Рисунок 2 - Предполагаемый механизм изменения иммунного статуса и роль эритропоэтина в его коррекции при хронической почечной недостаточности. Примечание: Пунктирными стрелками обозначены установленные эффекты эритропоэтина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты клинико-экспериментального исследования позволили, во-первых, оценить иммунный статус у больных с ХПН, а также при экспериментальной ХПН в условиях нивелирования эффектов гемодиапизной терапии, сопутствующих заболеваний и др. факторов, оказывающих влияние на иммунный статус; с использованием методов статистического анализа определить значимые показатели иммунного статуса, позволяющие проводить его мониторинг и прогнозировать вероятность возникновения новых осложнений инфекционного и воспалительного генеза. Во-вторых, уточнен механизм изменения иммунного статуса при ХПН с учетом данных о цитокиновом профиле крови, накоплении продуктов метаболизма в крови, процессах свободно-радикального окисления в плазме и в лимфоцитах и гибели лимфоцитов. Наконец, высказано предположение о связи изменений иммунного статуса со снижением продукции ЭПО при ХПН и исследованы иммунотропные эффекты ЭПО при экспериментальной ХПН. Полученные результаты изменения врожденного и адаптивного иммунитета при ХПН являются предпосылкой для проведения

дальнейших исследований по изучению роли отдельных уремических токсинов, полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов в патогенезе формирования иммунного статуса и клинических последствий его изменения. Установленные иммунотропные эффекты ЭПО при ХПН расширяют имеющиеся представления о его плейотропных свойствах и стимулируют дальнейшие исследования по изучению механизмов участия этого гликопрогеина в регуляции гомеостаза.

ВЫВОДЫ

1. У больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, повышается кислород-зависимый метаболизм, лизосомальная активность нейтрофилов, снижается функциональный резерв нейтрофилов крови, повышается концентрация в сыворотке ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а, развивается лимфоцитопения, в том числе снижается количество CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD 16+, CD25+, HLA-DR+.

2. Прогностически значимыми показателями иммунного статуса для развития осложнений инфекционного и воспалительного генеза у больных с хронической почечной недостаточностью выступают общее количество лейкоцитов, нейтрофилов, лизосомальная активность нейтрофилов, уровень СЗ компонента комплемента в сыворотке, количество CD3+ лимфоцитов, содержание иммуноглобулинов класса М и G, ИФН-у в сыворотке.

3. При экспериментальной хронической почечной недостаточности увеличивается количество нейтрофилов, снижается количество лимфоцитов, увеличивается поглотительная способность и кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов крови, угнетается Thl- и Th2-зависимый иммунный ответ.

4. Патогенез изменений иммунного статуса при хронической почечной недостаточности связан с повышением концентрации в сыворотке ИЛ-2, ИФН-у, ТНФ-а, гиперазотемией, накоплением веществ низкой и средней молекулярной массы в плазме, эритроцитах и лимфоцитах, повышением концентрации продуктов перекисного окисления липидов в плазме и в лимфоцитах, активацией гибели лимфоцитов путем некроза и апоптоза.

5. В экспериментальных условиях in vitro установлена активация гибели лимфоцитов под влиянием плазмы больных с хронической почечной недостаточностью, а также — повышением функциональной активности нейтрофилов под влиянием креатинина.

6. Применение эритропоэтина при экспериментальной хронической почечной недостаточности приводит к полному или частичному восстановлению количественного состава лейкоцитов в крови, поглотительной способности и кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов, Thl- и 'Независимого иммунного ответа.

7. Механизм иммунотропных эффектов эритропоэтина при хронической почечной недостаточности связан со снижением концентрации продуктов метаболизма, первичных и конечных продуктов перекисного окисления липидов в плазме и в лимфоцитах, ограничением гибели лимфоцитов крови путем некроза и апоптоза.

8. В условиях in vitro эритропоэтин в диапазоне концентраций от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л стимулирует функциональную активность изолированных интактных нейтрофилов, дозо-зависимо ограничивает гибель лимфоцитов, полученных от больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При оценке состояния больных с ХПН, находящихся на гемодиализе, рекомендуется дополнительно исследовать общее количество лейкоцитов, количество нейтрофилов, количество CD3+ лимфоцитов в крови, лизосомальную активность нейтрофилов крови, концентрацию СЗ компонента

комплемента, Ig М, Jg G, ИНФ-у в сыворотке для своевременного выявления риска возникновения новых заболеваний инфекционного или воспалительного генеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осиков, М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. - 2011. - Т. 17, № 4. - С. 7-13.

2. Осиков, М.В. Иммунотропныс эффекты эритропоэтина при экспериментальной хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Ю.И. Агеев // Материалы Ш международной (Х-ой итоговой) научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск : изд-во ЧелГМА, 2012.-С. 14-17.

3. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность фагоцитов / М.В. Осиков, Д.В. Алексеев, Ю.И. Агеев // Материалы XVIII межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург : Изд-во СГ16ГМУ, 2012. - С. 9-10.

4. Агеев, Ю.И. Влияние эритропоэтина на выраженность уремической интоксикации при экспериментальной хронической почечной недостаточности / Ю.И. Агеев, О.И. Огнева // Материалы юбилейной 70-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград : Изд-во ВолгГМУ, 2012. - С. 31-32.

5. Осиков, М.В. Хирургическое моделирование хронической почечной недостаточности / М.В: Осиков, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, Д.В. Гринчий // Сборник научных работ II международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» / под ред. А.В. Чукичева. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2012. - С. 189-192.

6. Осиков, М.В. Плейотропные эффекты эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.Ф. Телешева, А.А. Федосов, Ю.И. Агеев, Л.Г. Суровяткина // Фундаментальные исследования. - 2013. - №7, часть 1. - С. 218-224.

7. Осиков, M.B. Состояние врожденного иммунитета у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Ю.И. Агеев, В.Ю. Ахматов // Российский иммунологический журнал. - 2013. - №7(16). - С. 204.

8. Осиков, М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе [Электронный ресурс] / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, A.A. Федосов // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 4. — Режим доступа : www.science-education.ru/110-9973. (дата обращения: 04.09.2013).

9. Осиков, М.В. Патофизиологические аспекты изменения и коррекции врожденного иммунитета при хронической почечной недостаточности (Электронный ресурс] / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, Д.А.Черепанов, A.A. Федосов // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 5. — Режим доступа : www.science-education.ru/lll-9998. (дата обращения: 04.09.2013).

10. Осиков, М.В. Состояние факторов врожденного иммунитета у больных с гиперпаратиреозом и хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, O.A. Гизингер, Д.А. Черепанов, Ю.И. Агеев // Известия высших учебных заведений. Уральский регион.-2013. №5.-С. 139-145.

11. Осиков, М.В. Популяциониый спектр и апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, A.A. Аклесв // Всстн. Челябинской областной клинической больницы. - 2013. -№4. -С. 51-55.

12. Ахматов, В.Ю. Мониторинг иммунного статуса у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе / В.Ю. Ахматов, М.В. Осиков, Ю.И. Агеев // Вестн. Челябинской областной клинической больницы. - 2014. -№3. - С. 27-30.

13. Осиков, М.В. Роль уремической плазмы в активации аноптоза лимфоцитов периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, O.A. Гизингер, A.A. Аклесв, A.A. Федосов // Фундаментальные исследования, - 2014. - № 2. - С. 132-135.

14. Осиков, М.В. Роль апоптоза в изменении количества лейкоцитов в периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, O.A. Гизингер, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, A.A. Аклссв // Южно-Уральский медицинский журнал. - 2014.-№1,-С. 16-19.

15. Осиков, 14.В. Функционирование лейкоцитов и их апошичсскан активность у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, O.A. Гизингер, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, A.A. Аклссв // Врач. - 2014. - № 6.-С. 21-24.

16. Осиков, М.В. Цитокиновый профиль и уровень эритропоэтина в крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев // Цитокины и воспаление. -2014. - Т. 13, № 1. - С. 114.

17. Агеев, Ю.И. Цитокиновый профиль в периферической крови у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе / Ю.И. Агеев, М.В. Осиков // Материалы научно-практической конференции «Основные достижения научных школ ЮУГМУ», посвященной 70-летию Южно-Уральского государственного медицинского универститета. - Челябинск : Изд-во Южно-Уральского государственного медицинского универститета, 2014. - С. 6-7.

18. Агеев, Ю.И. Влияние эритропоэтина на показатели иммунного статуса при экспериментальной хронической почечной недостаточности [Электронный ресурс] / Ю.И. Агеев, М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, A.A. Федосов // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №3. -Режим доступа : www.science-ediication.ru/117-13594 (дата обращения: 21.06.2014).

19. Осиков М.В. Механизм плейотропных эффектов эритропоэтина: фундаментальные и прикладные аспекты / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, К.В. Ахматов, Т.А. Григорьев, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, A.M. Кишкин // Материалы научно-практической конференции «Основные достижения научных школ ЮУГМУ», посвященной 70-летию ЮжноУральского государственного медицинского университета. - Челябинск : Изд-во Южно-Уральского государственного медицинского университета, 2014.-С. 120-124.

20. Осиков, М.В. Прогностическая значимость оценки иммунного статуса у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Ю.И. Агеев, В.Ю. Лебедева // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т. 8 (17), № 3. - С. 573-575.

21. Осиков, М.В. Роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе нарушений иммунитета при экспериментальной хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т.8 (17), № 2 (1). - С. 122-125.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ВНиСММ - вещества средней и низкой молекулярной массы

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

НСТ - нитросиний тетразолий

ПОЛ - псрекисное окисление липидов

СОД - медь, цинк - зависимая супероксиддисмутаза

СРО - свободно - радикальное окисление

ФЧ - фагоцитарное число

15-- 428 1

На правах рукописи

Агеев Юрий Иванович

ПАТОГЕНЕЗ ИЗМЕНЕНИЙ ИММУННОГО СТАТУСА И РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИИА В ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2015

2012477157

Бумага офсетная Отпечатано методом ризографии Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №538 Огпечатано в типографии ООО "Школа эффективной рекламы" г.Челябинск, ул. Курчатова, 1А, тел.: (351)222-44-33

2012477157