Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА И РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИНА В ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Григорьев Тимофей Александрович

ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА И РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИНА В ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 — патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 КОЯ 2011

Челябинск - 2011

4858314

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, на кафедре патологической физиологии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук ОСИКОВ Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

ДОЛГИХ Владимир Терентьевич БАЗАРНЫЙ Владимир Викторович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет» имени Н.И.Пирогова Минздравсоцразви-тия России (г. Москва)

Защита диссертации состоится » УллэЦЬ

.02 пг

2011 года в ... часов на заседании диссертационного совета Д.208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Автореферат разослан «\ч ».

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор ТИШЕВСКАЯ Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Количество больных с синдромом хронической почечной недостаточности (ХПН) ежегодно увеличивается в связи с ростом заболеваемости нефропа-тиями различной природы, артериальной гипертензией, сахарным диабетом, атеросклерозом, учащением сосудистых поражений почек, общим старением населения, а также значительным прогрессом в области заместительной почечной терапии, увеличением ее доступности и расширением объемов (Тареева И.Е., 2000; Шейман Д.А., 2002; Бикбов Б.Т., Томилина H.A., 2009). По данным регистра Российского диализного общества, число больных ХПН, получающих заместительную терапию, составило в 2007 г. 142,3 на 1 млн. населения.

Одним из проявлений патологической реактивности при ХПН являются нарушения в системе гемостаза, которые могут проявляться как геморрагическими, так и тромбэмболическими осложнениями (Eberst М.Е. et al., 1994; То A.C. et al., 2007), включая такие социально значимые как повышенный риск развития инсульта, атеросклероза, гематом, гемартрозов и др. (Sanchez Perales М.С. et al., 2002; Holden R.M. et al., 2008). По данным The US Renal Data System, у 15,1% пациентов ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается инсульт, тогда как в общей популяции этот показатель равен 2,6%, смертность при этом составляет соответственно 74 % и 28 % (Khella S.L., 2008; Reinecke Н. et al., 2009). Частота развития кровотечений у больных ХПН может достигать более 12 % на 1 пациент-год (Foley R.N. et al., 2005).

Обширный массив сообщений по нарушению системы гемостаза при ХПН в основном посвящен дисфункции тромбоцитов и эндотелия. Однако противоречивость представленных данных препятствует пониманию участия нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза в единой концепции патогенеза гемостазиологических нарушений при ХПН. Неоднозначно трактуются при ХПН изменения количества тромбоцитов (Diaz-Ricart М. et al., 2000; Neiva T.J.C. et al., 2002), их функциональной активности (Viener A. et al.,1986; Brophy D.F. et al., 2007; Ho S.J. et al., 2008), функционального состояния эндотелиоци-тов (Kim S.W. et al., 2000; Gomez-Fernandez P. et al., 2005; Silva A.M. et al., 2008). К сожалению, до сих пор не достигнуто консенсуса в понимании патогенеза тромбоцитопатии при уремии. Заслуживают внимания сведения о роли анемии (Kravvczyk W. et al., 1994), нарушениях взаимодействия тромбоцитов с фактором фон Виллебранда и др. компонентами сосудистой стенки (Ballow А. et al., 2005), неоднозначных изменениях экспрессии тромбоцитарных рецепторов (Brzösko S. et al., 2002; Moal V. et al., 2003). Отсутствуют данные о роли тромбоцитарно-клеточных коопераций в крови в патогенезе нарушений гемостаза при ХПН. Сведения по изменению коагуляционного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, малочисленны в виду известных трудностей его оценки, в этом отношении перспективными являются исследования при экспериментальном моделировании ХПН. Значимость исследований гемостаза при ХПН подчеркивает тот факт, что факторы системы гемостаза одно-

временно являются компонентами других регуляторных систем организма или вмешиваются в их функционирование, что позволяет рассматривать гемостаз как мультипотентую систему регуляции гомеостаза, несущую значительную часть аллостатической нагрузки при патологии, в том числе при ХПН (Costa Е. et al., 2008; McEwen B.S. et al., 2010,2011).

Перспективным подходом к коррекции нарушений системы гемостаза при ХПН является расшифровка механизмов ее эндогенной регуляции. В этом отношении неподдельный интерес вызывает эритропоэгин (ЭПО) как средство базисной терапии при ХПН, плейотропные эффекты которого в последние годы являются объектом пристального внимания исследователей во многих странах мира. Установлены нейро- и кардиопротекторные свойства ЭПО, его влияние на аффективный статус, сосудистый тонус и пролиферацию эндотелиоцитов, связанные с антиапоптическим, пролиферацию стимулирующим, антигипокси-ческим и др. действиями (Осиков М.В. и др., 2010; Kang Y.J. et al., 2010; Kim M.S. et al., 2010; Brissaud О. et al., 2010; Nairz M., et al., 2011). Плейотропные эффекты ЭПО реализуются за счет наличия специфических рецепторов на нейронах, кардиомиоцитах, эндотелиоцитах и гладкомышечных клетках, эпителии почечных канальцев и др. клетках (Захаров Ю.М., 2007, 2009; Lappin Т., 2003; Miskowiak К. et al., 2007). Остаются малоизученными эффекты ЭПО на функцию тромбоцитов, эндотелиоцитов, систем плазменного протеолиза, участвующих в гемостазе. Исследование и уточнение механизмов нарушений системы гемостаза при ХПН, а также расшифровка гемостазиологических эффектов ЭПО заслуживают особого внимания и представляются весьма актуальными.

Цель работы

В клинических и экспериментальных условиях исследовать ведущие механизмы нарушений гемостаза при хронической почечной недостаточности и установить патогенетическую роль эритропоэтина в их коррекции.

Задачи исследования

1. Исследовать с учетом индивидуальной реактивности выраженность нарушений гемостаза, количество, функциональную активность тромбоцитов и эндотелиоцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

2. Оценить роль процессов свободно-радикального окисления, нитроксидер-гических процессов, азотемии, экспрессии рецепторов тромбоцитов и тромбоцигарно-клеточных взаимодействий в крови в патогенезе нарушений гемостаза у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

3. Изучить состояние систем плазменного протеолиза, участвующих в гемостазе, при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

4. Исследовать в экспериментальных условиях in vitro влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов и плазменных протеоли-тических систем, участвующих в гемостазе.

5. Изучить влияние эритропоэтина на выраженность геморрагического синдрома и состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

6. Изучить влияние эритропоэтина на состояние систем плазменного протео-лиза, участвующих в гемостазе, при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

7. Исследовать влияние эритропоэтина при хронической почечной недостаточности на экспрессию рецепторов тромбоцитов и тромбоцитарно-клеточные взаимодействия в крови, выраженность процессов свободно-радикального окисления и азотемии.

Научная новизна исследования

Впервые продемонстрировано, что в патогенезе геморрагического синдрома у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, имеют значение анемия, тромбоцитопения, тромбоцитопатия и эндотелиальная дисфункция. Выраженность геморрагического синдрома у больных хронической почечной недостаточностью не зависит от нозологического профиля непосредственной причины хронической почечной недостаточности, стажа гемодиализа, возраста и пола больных. Впервые приведены данные о роли в патогенезе тромбоцитопатии у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, процессов свободно-радикального окисления в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, выраженности азотемии, изменений тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови и экспрессии тромбоцитарных рецепторов ОрШ, йрНЬ-Ша. Показано, что при экспериментальной хронической почечной недостаточности изменения активности систем плазменного протеолиза, участвующих в гемо-коагуляции, включают активацию системы фибринообразования и снижение активности противосвертывающей системы крови и впервые продемонстрировано, что эритропоэтин частично восстанавливает активность данных систем. Впервые установлен протекторный эффект эритропоэтина на систему гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности, презентируемый снижением выраженности геморрагического синдрома и связанный с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. Впервые продемонстрирован механизм гемостазиологических эффектов эритропоэтина при хронической почечной недостаточности, определяемый не только его антианемическим действием, но и ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным влияниями.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Результаты проведенного исследования позволили вскрыть некоторые механизмы нарушений системы гемостаза, а также определить оптимальные точки приложения патогенетической терапии при хронической почечной недостаточности. В частности, установлено, что геморрагический синдром но пе-

техиально-пятнистому типу, развивающийся у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, обусловлен тромбоцитопени-ей, тромбоцитопатией и дисфункцией эндотелия. Существенно дополнены некоторые представления о патогенезе тромбоцитопатии у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, связанные с развитием окислительного стресса в плазме и в самих тромбоцитах, азотемии, влиянием нитроксидергических процессов, тромбоцитарно-лейкоцитарных и тром-боцитарно-эритроцитарных взаимодействий в крови, экспрессией тромбоци-тарных рецепторов Ор1Ь, <ЗрПЬ-П1а. Дополнены имеющиеся представления об изменении активности коагуляционного гемостаза при хронической почечной недостаточности. Результаты проведенного исследования позволили установить некоторые механизмы влияния эритропоэтина на сосудистое, клеточное и плазменное звенья гемостаза при хронической почечной недостаточности и расширить имеющиеся сведения о роли эритропоэтина в эндогенной регуляции гомеостаза. Полученные результаты важны для развития медицины, патофизиологии, нефрологии, гемостазиологии и могут быть использованы в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Полученные сведения о гемостазиологических эффектах существенно дополняют имеющиеся представления о плейотропном действии эритропоэтина и являются предпосылкой для проведения дальнейших исследований по расширению показаний для его клинического применения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности развивается геморрагический синдром, патогенез которого связан с развитием анемии, тромбоцитопении, тромбоцитопатии и дисфункции эндотелия, его выраженность нарастает по мере активации процессов свободно-радикального окисления в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, прироста азотемии, изменений тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови.

2. При экспериментальной хронической почечной недостаточности изменения коагуляционного гемостаза презентируются активацией системы фиб-ринообразования и подавлением активности противосвертывающей системы крови; эритропоэтин частично восстанавливает активность плазменных протеолитических систем, участвующих в гемокоагуляции.

3. Применение эритропоэтина у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности снижает выраженность геморрагического синдрома в связи с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. Механизм гемостазиологических эффектов эритропоэтина при хронической почечной недостаточности реализуется за счет антианемического, ПОЛ-ограничивающего и дезинтоксикационного действия.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2010); II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2011); V Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиологшг и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011); 8-ой международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (от ангиогенеза до центрального кровообращения) (Ярославль, 2011); научно-практической конференции «Хроническая болезнь почек — этапы заместительной почечной терапии» (Челябинск, 2011); третьей международной телеконференции (Томск, 2011).

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в преподавание патофизиологии в разделе «Патофизиология гемостаза» в ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Методы исследования тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови внедрены в научную работу кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в практику отделений диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница», ГУЗ «Свердловская областная клиническая больница №1».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 246 страницах, содержит 60 таблиц и 44 рисунка; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 374 источника (73-отечественных и 301 - зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Дизайн клинического фрагмента работы представлен на схеме (рис. 1). Проведено краткосрочное, открытое, проспективное клиническое исследование гемостазиологических эффектов ЭПО у больных ХПН, находящихся на гемодиализе. План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (BMA) последнего пересмотра (Сеул, 2008), с учетом разъясняющего примечания к параграфу 29, внесенного Ге-

неральной Ассамблеей BMA (Вашингтон, 2002) и был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России (протокол №4 от 19.03.2010 г.). В исследование было включено 160 больных с ХПН, находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница». От всех больных было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании.

I этап: 160 больных ХПН в отделении диализа ГМЛПУЗ ЧОКБ-» огбор в соответствии с критериями включения и исключения —► 62 больных ХПН —»формирование основных 1руш1 < группа 1 - клинически здоровые добровольцы - доноры областной станции переливания крови (п=25)

основные группы: группа 11 - больные ХПН, не принимающие ЭПО, до процедуры гемодиализа (п=24); группа Ш - больные ХПН, не принимающие ЭПО, после процедуры гемодиализа (и-24); группа IV - больные ХПН, принимающие ЭПО, до процедуры гемодиализа (п=38); группа V - больные ХПН, принимающие ЭПО, после процедуры гемодиализа (п-38)

■ г

методы: - клинические; гематологические; гемостазиологические; биохимические; иммунологические; статистические

П этап:обследование пациентов

определение характера распределения и равенства дисперсий признаков в труппах; оценка значимости изменений признаков; анализ связи между признаками; факторный анализ вклада процедуры диализа в изменение исследуемых показателей

Шэтяп. статистическая обработка результатов

IV этап: заключительный обсуждение результатов, формулировка выводов и рекомендаций

Рис 1. Этапы клинического фрагмента работы

Отбор больных для исследования проводили в соответствии с критериями включения и исключения. Критерий включения; больные с терминальной стадией хронической почечной недостаточности. Критерии исключения: 1) декомпенсация со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем; 2) наличие в анамнезе туберкулеза, венерических заболеваний, гепатита, ВИЧ-инфекции, онкологических заболеваний; 3) острые нарушения церебрального кровообращения; 4) острый воспалительный процесс; 5) беременность; 6) уровень гемоглобина ниже 60 г/л; 7) больные с гематологическими заболеваниями и системными васкулитами.

В соответствии с целями и задачами исследования 62 больных ХПН, в т.ч. 32 женщины и 30 мужчин (средний возраст 47,96±1.33 лет) были распределены на 4 основные группы (группы II-V). Основными причинами ХПН явились хронический гломерулонефрит (42 %), хронический пиелонефрит (26 %),

поликиотоз почек (19 %), артериальная гипертензия (6,5 %), сахарный диабет (6,5%). Стаж заболевания составил от 1 года до 13 лет (в среднем 5,1±1,6 лет). Все больные ХПН 3 раза в неделю в течение 4 часов получали гемодиализную терапию в отделении диализа ГМЛПУЗ «Челябинская областная клиническая больница» на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия). Диализаторы «Elisio 190Н» (Nipro, Япония), коэффициент ультрафильтрации 76 мл/час • мм.рт.ст., клиренс: мочевины 199 мл/мин, креатинина 197 мл/мин. Количество сеансов диализа у обследуемых больных -от 105 до 1356 (в среднем 404,6±45,3). Величина диализной дозы Kt/V - от 0,9 мл/мин до 1,45 мл/мин (в среднем 1,24±0,01 мл/мин). Кровь для исследований брали из артериального колена артерио-венозной фистулы до и после сеанса гемодиализа.

Больные IV и V групп дополнительно получали эритропоэтин в составе препарата «Рекормон» (МНИ: эпозтин бэта, «Roche», Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000-4000 МЕ в течение 2 месяцев. Суммарная доза введенного ЭПО составила около 50000 МЕ. Контрольная группа (группа I, п=25) представлена клинически здоровыми добровольцами - донорами областной станции переливания крови г. Челябинска, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами.

Экспериментальный фрагмент работы выполнен на 123 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г., цельной крови 126 клинически здоровых добровольцев и цельной крови 24 больных ХПН, не принимающих ЭПО.

Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.).

Модель хронической почечной недостаточности у крыс создавали путем двухэтапной оперативной резекции 5/6 почечной ткани (Шуркалин Б.К. и др., 2010; Santos L.S. et al., 2006). Терминальная стадия ХПН развивалась через 21 сутки, критериями развития ХПН служили значимое повышение в сыворотке концентрации креатинина (> 60 мкмоль/л), мочевины (> 5 ммоль/л). Для исследования гемостазиологических эффектов ЭПО вводили в форме препарата «Рекормон» внутрибрюшинно, начиная с 21 суток, ежедневно в дозе 100 МЕ/кг массы в течение 9 дней, суммарная доза 900 ME/кг. Контрольной группе лож-нооперированных животных вводили эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 30 сутки.

Модель острой почечной недостаточности создавали подкожным введением в межлопаточную область водного 10 % (масса/объем) раствора хлорида ртути (II) в дозе 5 мг/кг однократно (Черненко Г.П., 1965; Gstraunthaler G. et al., 1983). Для исследования гемостазиологических эффектов ЭПО вводили в

форме препарата «Рекормон» на 5 сутки от индукции ОПН однократно внутри-брюшинно в дозе 5000 ME/кг массы (Johnson, D.W. et al., 2006). Исследования проводили на 6 сутки.

' Применение ЭПО в условиях интактного организма проводили для выяснения независимости от наличия патологии почек гемостазиологических эффектов ЭПО. ЭПО в форме препарата «Рекормон» вводили однократно внутри-брюшинно в дозе 5000 ME/кг массы. Исследования проводили на 2 сутки.

Эксперименты в условиях in vitro:

1) оценка влияния креатинина и мочевины на агрегацию тромбоцитов клинически здоровых людей. Использованы концентрации мочевины 30 ммоль/л, креатинина - 1 ммоль/л.

2) оценка гемостазиологических эффектов ЭПО в цельной крови клинически здоровых людей. ЭПО в форме препарата «Рекормон» применяли в концентрациях ЗОМЕ/л; 15 МЕ/л; 7,5 МЕ/л; 3,75 МЕ/л; 1,88 МЕ/л. После добавления ЭПО кровь инкубировали в условиях термостата при температуре 37°С в течение 30 мин. Оценивали показатели коагуляционого и клеточного звеньев гемостаза.

3) оценка влияния ЭПО в указанных выше концентрациях на показатели клеточного гемостаза в цельной крови больных ХПН, не принимающих ЭПО.

Для клинической оценки состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН до и после процедуры гемодиализа использовали манжеточнуго пробу Румпеля - Лееде - Кончаловского и измерение времени кровотечения по Дьюку (Баркаган З.С. и др., 2001).

Гематологические методы. На гематологическом анализаторе фирмы «Orphee» (Япония) волюмометрическим методом определяли основные количественные и морфологические показатели клеток крови. Тромбоцитарно-эритроцитарньте взаимодействия исследовали в суспензии эритроцитов и тромбоцитов, количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов подсчитывали в камере Горяева (Осиков М.В., 2005).

Гемостазиологические методы. Клеточное звено гемостаза оценивали по количественным показателям тромбоцитов, АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на двухканальном лазерном анализаторе «LA-230» (Россия). Регистрировали амплитуду (%), время (мин) и скорость агрегации (%/мин). Сосудистое звено гемостаза оценивали при исследовании концентрации конечных стабильных метаболитов NO (NO.,) в сыворотке и активности фактора фон Виллебранда (vWF) в плазме. Уровень NO* оценивали с помощью реакции Griess (Емченко Н.Л. и др., 1994), результат выражали в мкмоль/л. Для определения активности vWF использована его способность вызывать агглютинацию тромбоцитов в присутствии ристоцетина (НПО «Ренам», Москва), результат выражали в %. Коагуляционное звено гемостаза исследовали по показателям тромбинового времени по Biggs R., Macfarlane R.G., активированного парциального тромбопластинового времени (Баркаган З.С. и др., 2001), протромбино-вого времени, концентрации в плазме фибриногена по Клаусу, активности антитромбина, ХПа-зависимого фибринолиза (Архипов А.Г. и др., 1985). Использованы наборы реагентов фирмы «Технология-Стандарт» (Барнаул).

Биохимические методы. Определение веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ) в плазме проводили после осаждения высокомолекулярных белков фотометрией на спектрофотометре «СС - 104» (Россия) при длине волны 210 нм (Камышников B.C., 2000). Результат выражали г/л. Концентрацию мочевины, мочевой кислоты и креатинина в сыворотке определяли энзиматическим колориметрическим методом и кинетическим методом без де-протеинизации на аппарате «Roki-6T» (Россия, Санкт-Петербург) с использованием реактивов фирмы «Human» (Германия). Уровень продуктов ПОЛ в плазме и обогащенной тромбоцитами плазме определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А. и др., 1989, 2000; Львовская Е.И. и др., 1991). Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) -Е232/Е220 (относительное содержание диеновых коньюгатов - ДК), Елк/Егго (уровень кетодиенов и сопряженных триенов - КД и CT) и Е400/Е220 (уровень оснований Шиффа - ШО). О состоянии антиоксидаптной защиты судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) (С. Чевари и др., 1985) и каталазы сыворотки крови (Коралюк М.А. и др., 1988).

Оценка экспрессии тромбоцитарных рецепторов и тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий выполнялась методом проточной цитомет-рии на цитофлюориметре «FACS Canto-II» (Becton Dickinson, США). Для оценки экспрессии на поверхности тромбоцитов рецепторов Gp Hb/IIIa, Gp IIb, Gp lb-lx использованы соответственно моноклональные антитела CD61+-F1T («Beckman Coulte», США), CD41+-FITC («Beckman Coulte», США), CD42b+- PE («Becton Dickinson Pharmingen», США), результат выражали в условных единицах флюоресценции (у.е.ф.) среднепикового значения. Из цельной крови выделяли популяции лейкоцитов по интенсивности экспрессии CD45-PerCP («Beckman Coulte», США) и характеристикам светорассеяния клеток. Оценка тромбоцитарно-лейкоцитарных коопераций осуществлялась по относительному количеству лимфоцитов, моноцитов, гранулоцнтов, взаимодействующих с тромбоцитами.

Статистические методы. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0»' (Реброва О.Ю., 2006). Для анализа нормальности распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий — критерий Левена, Проверку статистических гипотез проводили с использованием параметрических (парный критерий Стьюдента) и непараметрических (U - критерий Манна-Уитни, WW - критерий Вальда-Вольфовитца, W -критерий Вилкоксона) критериев. При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони. Для выявления связи между параметрами использовали коэффициент корреляции Спирме-на (R). Силу влияния факторов на исследуемые показатели вычисляли методами дисперсионного анализа. Отличия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу. До процедуры

гемодиализа время кровотечения удлиняется в среднем на 60%, количество пе-техий в манжеточной пробе Румпеля-Лееде-Кончаловского увеличивается в среднем в 6 раз (табл. 1). Процедура гемодиализа приводит к удлинению времени кровотечения и увеличению количество петехий. Установлено, что патогенез геморрагического синдрома у больных ХПН связан с развитием тромбо-цитопении, тромбоцитопатии и эндотелиальной дисфункции. У больных ХПН при исследовании до и после гемодиализа в крови снижается количество тромбоцитов и уменьшается их средний объем (табл. 2).

Развитие тромбоцитопатии у больных ХПН презентируется угнетением АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, усугубляемой после процедуры гемодиализа (табл. 3). Доказано, что время кровотечения удлиняется, а количество петехий в манжеточной пробе возрастает по мере снижения количества тромбоцитов (соответственно 11=-0,65; 11=-0,63; р<0,05), и замедления агрегации тромбоцитов (соответственно Я=-0,67; Т1=-0,64; р<0,05).

У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается эндотелиаль-ная дисфункция, констатируемая активацией нитроксидергических процессов и повышением уровня в крови. При оценке уровня N0* в сыворотке до гемодиализа наблюдается преимущественный прирост нитритов по сравнению с нитратами (табл. 4). После процедуры гемодиализа концентрация 1МОх в сыворотке снижается до нормы. При анализе индивидуальной реактивности отмечена гетерогенность содержания метаболитов "N0 в сыворотке у больных ХПН, выраженность которой возрастает после диализа. Активность у\УР в крови значимо нарастает по мере увеличения концентрации N0* (11=0,84; р<0,05). Полагают, что пероксинитрит (ОТЧОО-), образующийся в условиях оксидативного стресса при ХПН, напрямую повышает синтез и экспрессию в эндотелио-цитах (Ма1укгко .1. ег а1, 2004). Угнетение агрегации тромбоцитов у больных ХПН нарастает по мере повышения концентрации N0* (11=-0,76; р<0,05).

У больных ХПН развивается окислительный стресс в плазме и в тромбоцитах. До процедуры гемодиализа регистрируется повышенный уровень продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы (табл. 5), снижается активность каталазы и СОД (табл. 7). У больных ХПН до процедуры гемодиализа в гептановой фракции липидного экстракта обогащенной тромбоцитами плазмы возрастает содержание первичных, вторичных, конечных продуктов ПОЛ, в изопропанольпой фракции - первичных и вторичных продуктов ПОЛ (табл. 6). Процедура гемодиализа приводит к элиминации из тромбоцитов первичных и вторичных продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фракции липидного экстракта. Установлено, что дисфункция тромбоцитов при ХПН нарастает по мере увеличения содержания продуктов ПОЛ в плазме и в тромбоцитах и снижения активности ферментов антиокислительной защиты в плазме.

У больных ХПН в плазме зафиксирован значительный прирост содержания ВНиСММ, креатинина и мочевины, частично корригируемый процедурой гемодиализа (табл. 8). Угнетение агрегационной способности тромбоцитов у больных ХПН нарастает по мере увеличения уровня в плазме ВНиСММ

(R=—0,90; p<0,05), но не мочевины (R=-0,18; р>0,05) и креатинина (R=-0,39; р>0,05). В аналитических экспериментах in vitro креатинин и мочевина в концентрациях, сопоставимых с таковыми в крови у больных ХПН, не изменяют показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Исследование экспрессии наиболее значимых тромбоцитарных рецепторов у больных ХПН не подтвердило ожидаемую связь с изменением функции тромбоцитов. До процедуры гемодиализа у больных ХПН повышается представительство на тромбоцитах Gp llb-llla на 35%, Gp lib - на 43%, Gp lb - на 52% (табл. 10). Количество клеток, экспрессирующих Gp lb, значимо не изменяется, что свидетельствует об увеличении плотности рецепторов. После гемодиализа экспрессия Gp Ilb-Iila и Gp lb возвращается к нормальному уровню. Уремические тромбоциты имеют дефекты цитоскелета, ассоциированные с молекулами актина, альфа-актинина и миозина, что препятствует нормальной интернализа-ции гликопротеинов внутрь тромбоцита и приводит к их накоплению на поверхности (Diaz-Ricart М. et al., 2000).

Установлено, что уремические тромбоциты усиленно взаимодействуют с нейтрофилами (прирост 31%) и моноцитами (прирост 84%), связь тромбоцитов с лимфоцитами ослабевает (табл. 11). После гемодиализа количество тромбо-цитарно-нейтрофильных коагрегатов снижается до нормального уровня, а тромбоцитарно-моноцитарных и тромбоцитарно-лимфоцитарных - значимо не изменяется. Установлено, что, количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов до гемодиализа нарастает по мере увеличения экспрессии на тромбоцитах Gp Ilb-IIIa (соответственно R=0,75; R=0,47; р<0,05), после гемодиализа такая зависимость сохраняется только в отношении тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов (R=0,48; р<0,05). Дисфункция тромбоцитов у больных ХПН в определенной мере связана с изменением тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий в крови. Скорость агрегации тромбоцитов угнетается по мере увеличения тромбоцитарно-нейтрофильных (R =-0,33; р<0,05) и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (R =-0,41; р<0,05) в крови. Взаимодействие тромбоцитов с эритроцитами до процедуры гемодиализа ослабевает, а после гемодиализа восстанавливается до нормального уровня (табл. 11).

Установлено, что анемия у больных ХПН вносит определенный вклад в развитие геморрагического синдрома, тромбоцитопатии и угнетение тромбоци-тарно-эритроцитарных взаимодействий. Время кровотечения и количество пе-техий в манжеточной пробе, а также угнетение агрегации тромбоцитов нарастают по мере снижения количества эритроцитов, гемоглобина и гематокрита. Количество тромбоцитарно-эритроцитарньгх коагрегатов уменьшается по мере снижения количества эритроцитов в крови у больных ХПН (R=0,65; р<0,05).

При экспериментальной ХПН наблюдается активация системы фибрино-образования с заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего путей по показателям тромбинового, протромбинового и активированного парциального тромбопластинового времени (табл. 12). Зафиксированная гиперфибриногене-мия, вероятно, развивается в ходе ответа острой фазы, так как фибриноген от-

носится к положительным реактантам острой фазы (Назаров П.Г., 2001). Активность системы фибринолиза не изменяется, а антитромбина - уменьшается, что может свидетельствовать об истощении противосвертывающей системы. При кратковременной уремии (модель ОПН), как и при ХПН, фиксируется активация коагуляционного каскада, повышается активность антитромбина и ускоряется фибринолиз (табл. 13).

Применение ЭПО у больных ХПН приводит к снижению выраженности геморрагического синдрома: время кровотечения укорачивается, количество петехий уменьшается (табл. 1). Данный факт связан с увеличением количества эритроцитов (соответственно 11=-0,50; И=-0,49; р<0,05), гемоглобина (соответственно Л=-0,73; Я=-0,51; р<0,05) и гематокрита (соответственно 11=41,76; Т1=-0,60; р<0,05). Однако, укорочение времени кровотечения у больных ХПН наблюдается менее чем через две недели после начала терапии ЭПО, когда уровень гемоглобина и гематокрита еще существенно не изменяются, что свидетельствует о прямых гемостазиологических эффектах ЭПО при ХПН.

Таблица 1

Клинические тесты оценки гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (М±т)

Группы / показатели Группа 1: здоровые (п=16.) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

Проба Румпеля-Лееде-Конча-ловского, петехий 1,69±0,35 10,4б±1,54* 14,50±2,89*# 5,90 ±0,78*# 7,50 ±0,87*&

Время кровотечения, сек 85,05±4,11 132,60±6,55* 141,11±7,86*# 121,18±5,48*# 126,00±5,89*&

Примечание. Здесь и далее * - значимые различия (р<0.05) с группой 1, # - с группой 2, & - с группой 3,л - с группой 4.

ЭПО у больных ХПН увеличивает количество тромбоцитов, тромбокрит, средний объем тромбоцитов (табл. 2). После гемодиализа снижается количество тромбоцитов и уменьшается их средний объем, что является следствием механизма негативной селекции тромбоцитов в ходе процедуры гемодиализа. Механизм действия ЭПО может быть связан со стимуляцией мегакарио- и/или тромбоцитопозза, принимая во внимание общие предшественники эритроцитов и тромбоцитов, на которые ЭПО оказывает пролиферативное и антиапоптиче-ское влияние.

ЭПО у больных ХПН восстановливает скорость агрегации тромбоцитов (табл. 3). Сразу после гемодиализа скорость агрегации тромбоцитов вновь падает, вероятно, за счет избыточной активации и удаления функционально полноценных молодых форм тромбоцитов. Полагаем, что ЭПО напрямую, через связывание с рецепторами вмешивается в реализацию активности тромбоцитов, о чем свидетельствуют данные в экспериментах in vitro, где ЭПО дозо-зависимо (R=-0,44; р<0,05) ускоряет агрегацию интактных и от больных ХПН тромбоцитов в диапазоне доз от 1,88 МЕ/л до 30 МЕ/л (рис. 2). Причем, наибольшей сти-

мулирующей активностью обладают малые дозы ЭПО, а в максимальной дозе 30 МЕ/л ЭПО вообще не оказывает влияния на тромбоциты больных ХПН.

Таблица 2

Количественный состав и морфологические признаки тромбоцитов периферической крови у _ больных ХПН, находящихся на гемодиализе (М±т)_

Группы / показатели Группа 1: здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

Тромбоциты, • Ш9/л 328,85±8,26 178,92±5,46* 163,82±7,08* 253,79±7,58*# 239,94 ±8,37*&/

Тромбокрит, % 0.19±0,01 0,14 ±0,01* 0,13 ±0,01* 0,20 ±0,02# 0,21 ±0,02&

Средний объем, фл 9,71±0,19 8,38 ±0,11* 8,46 ±0,13* 8,51 ±0,07 *# 7,82 ±0,14*&л

Ширина распределения по объему 14,54±0,14 13,30 ±0,19* 13,35 ±0,30* 13,34 ±0,16* 12,34 ±0Д6*&Л

Таблица 3

Показатели агрегации тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (М±т)

Группы / показатели Группа 1: здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

Амплитуда агрегации, % 86,59±2,08 33,27±3,18* 22,52±6,02*# 55,77±2,70*# 17,37±1,53*Л

Время агрегации, мин 4,85±0,13 3,91±0,24* 3,79±0,17* 3,44±0,15*# 3,38±0,19*

Скорость агрегации, %/мин 18,24±0,69 8,44±0,55* 5,62±1,26*# 17,70±0,99# 5,25±0,35*л

88 тромбоциты больных ХПН ЕЗ интактные тромбоциты -

0 (контроль) 1,88 3,75 7,5 15 30

доза ЭПО, МЕI л

Рис. 2. Влияние эритропоэтина на агрегацию тромбоцитов в условиях ш укго. * - значимые (р<0,05) различия с группой контроля при исследовании тромбоцитов больных ХПН, # - интактнътх тромбоцитов.

Эндотелиотропные эффекты ЭПО у больных ХПН проявляются снижением продукции N0 и вероятно, за счет прямого вмешательства в метаболизм эндотелиоцитов, т.к. на их поверхности обнаружены специфические рецепторы, инициирующие активацию внутриклеточных сигнальных путей с последующей регуляцией активности ферментов, в т.ч. сЫОБ (Teng К с! а1., 2011). Концентрация Ы0Х в сыворотке снижается за счет нитратов, процедура гемодиализа не оказывает значимого влияния на выраженность нитроксидергиче-ских процессов (табл. 4). Активность под влиянием ЭПО снижается, но остается выше, чем в группе здоровых людей. Данные эффекты ЭПО находят свое отражение в восстановлении функциональной активности тромбоцитов при ХПН: увеличение скорости агрегации тромбоцитов под влиянием ЭПО нарастает по мере снижения N0* (11=-0,82; р<0,05).

Таблица 4

Содержание стабильных метаболитов оксида азота (II) в сыворотке и активность фактора _Виллебранда в плазме у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (М±тп)_

Группы / показатели Группа 1: здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

ЫОх", мкмоль/л 14,68±0,85 19,72±1,53* 12,14±0,63 16,77±1,02# 14,37±0.72

ЫОг", мкмоль/л 3,01±0,22 4,89±0,32* ЗД5+0Д9 4,20±0,34*# 3,41 ±0,24

N03", мкмоль/л 11,71±0,81 14,78±1,3б* 9,49 ±0,68 12,57 ±0,82# 10,96 ±0,68

Активность фактора Виллебранда, % 114,46±5,68 165,00±3,41* 16б,25±4,01* 151,74±5,05*# 162,11±2,93*

Влияние ЭПО на функциональную активность тромбоцитов и эндотелиоцитов в определенной мере опосредовано изменением процессов СРО и выраженности азотемии. ЭПО при ХПН проявляет ПОЛ-ограничивающий эффект в плазме и в тромбоцитах. В гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы, а также обогащенной тромбоцитами плазмы снижается содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ (табл. 5, 6).

Таблица 5

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и изопропанольной фракциях липидного экстракта плазмы у больных ХПН, находящихся на гемодиализе (М±т)

Группы / показатели, ед. индексов окисления Группа 1: здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

ДКМ 0,64±0,02 1,10±0,13* 1,34±0,25* 0,72±0,04 # 0,69±0,03&

КДиСТМ 0Д1±0,01 0,24±0,03* 0,29±0,04* 0,18±0,03 0Д6±0,03&

ШО |г] 0,11±0,01 0,14±0,02* 0,15±0,03 0,08±.0,01# 0,15±0,04

ДКМ 0,51 ±0,02 0,78±0,09* 0,75±0,07* 0,60±0,04# 0,78±0,09*

КД и СТ Ги1 0,30±0,01 0,35±0,03* 0,39±0,07* 0,27±0,01 # 0,37±0,05

ШО [и] 0,06±0,01 0,04±0,01* 0;0б±0.01 * 0,02±0,01*# 0,02±0,01 *&

Примечание. Здесь и в табл. 7 «г» - гептановая фракция, «и» - изопропанолъная фракция.

Таблица 6

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в гептановой и изопропанолыгой фракциях шшидного экстракта обогащенной тромбоцитами плазмы у больных ХПН, нахо-__дящихся на гемодиализе (1Ш-т)_

Группы / показатели, ед. индексов окисления Группа 1: здоровые (п~25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

ДК[г] 0,09±0,01 0,25±0,01* 0,14±0,02# 0,15±0,02*# 0,21±0,05*

КДиСТГг] 0,22±0,05 0,16±0,01 0,10±0,01# 0,15±0,01 0,13±0,02

ШО [г] 0,10±0,01 0,15±0,01* 0,11±0,01* 0,12±0,02# 0,09±0,01

дкн 0,45±0,01 0,54±0,02* 0,49±0,02# 0,47±0,02# 0,46±0,01&

КДиСТГи] 0,24±0,01 0,30±0,01* 0,24±0,01 # 0,29±0,01* 0,23±0,01л

ШО [и] 0,019±0,003 0,015±0,001 0,017±0,003 0,011 ±0,001# 0,014±0,002

В плазме больных ХПН повышается активность ферментов антиокислительной защиты СОД и каталазы (табл. 7). Эффект ЭПО наиболее выражен до процедуры гемодиализа, вероятно, прооксидантный потенциал плазмы возрастает в ходе гемодиализа при контакте фагоцитов и тромбоцитов с мембраной диализатора и элементами экстракорпорального контура. Полагают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации антиоксидантного транскрипционного ядерного фактора-2 и как следствие изменения активности НАД(Ф)Н-оксидоредуктазы, глутатион-8-трансферазы а-1, глютатионперокси-дазы, гемоксигеназы-1, а также снижения внутриклеточного содержания железа (И) (Jin W. et al.,2011, Zhang J. et al., 2010).

Таблица 7

Активность ферментов ангиокислительной системы плазмы у больных ХПН, находящихся __ на гемодиализе (М±т) __

Группы / показатели Группа 1: здоровые (п=26) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) ГруппаS: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

СОД, Ед/мл 0,87±0,11 0,44±0,02* 0,47±0,02* 0,53±0,03*# 0,51±0,01*

Каталаза, мкат/л 17,88±0,72 б,52±0,47* 9,79±2,49* 13,58±2,00*# 12,51±2,18*&

Дезинтоксикационлый эффект ЭПО при ХПН проявляется снижением концентрации в плазме ВНиСММ, креатинина и мочевины (табл. 8), При этом, эфферентные свойства ЭПО оказались наиболее выраженными в отношении мочевины и креатинина, их концентрация после процедуры гемодиализа еще больше снижалась, но не достигала значений контрольной группы здоровых людей. Дезинтоксика-ционный эффект ЭПО проявляется при экспериментальной ХПН у крыс (табл. 9). Корреляционный анализ продемонстрировал значимую зависимость ПОЛ-ограничивающего эффекта ЭПО при ХПН от выраженности азотемии и гемиче-ской гипоксии. По мере снижения концентрации мочевины, креатинина и ВНиСММ в плазме снижается содержание вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции плазмы, а также нарастает активность ката-

лазы и СОД в плазме. В тоже время, по мере увеличения количества эритроцитов в периферической крови в изопропанольной фракции липидного экстракта плазмы снижается содержание вторичных и конечных продуктов ПОЛ, уменьшается концентрация мочевины, креатинина и ВНиСММ в плазме.

Таблица 8

Влияние эритропоэтина на показатели эндогенной интоксикации в крови у больных ХПН, __ находящихся на гемодиализе (М±т)_

Группы / показатели Группа I: здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) : Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

Мочевина, ммоль/л 4,98±0,17 34,57±1,94* 8,28 ±0,72 *# 27,52 ±0,97*# 6,44±0,41*&л

Креатинин, мкмоль/л б9,77±2,09 1109,59±43,42* 224,65+9,86*# 816,58±35,99*# 189,21+6,21*&л

ВНиСММ, г/л 0,61±0,02 1,58±0,05* 0,70 ±0,06*# 1,40±0,07*# 0,77±0,05*л

Таблица 9

Влияние эритропоэтина на показатели эндогенной интоксикации в крови крыс при экспери-• __ментальной ХПН (М±т)__

Группы/ показатели Группа 1: Ложно-оперированные (п=16) Группа 2: ХПН ( п=11) Группа 3: ХПН+ЭПО (п=16)

Мочевина, ммоль/л 5,98±0,33 10,28±0,80* 8,29 ±0,40*#

Креатинин, мкмолъ/л 95,28±3,55 168,49±10,09* 135,16±3,06*#

Мочевая к-та, мкмоль/л 76,34±5,86 99,25±7,43* 86,33 ±4,31*#

Примечание. Здесь и в табл. 12, 13 * - значимые различия (р<0.05) с группой 1, # - с группой 2.

ЭПО у больных ХПН снижает представительство рецептора Ib и комплекса llb-Illa, причем, последнего до уровня, наблюдаемого у здоровых людей и, вероятно, за счет субъединицы Ша, т.к. экспрессия субъединицы IIb значимо не изменяется (табл. 10). Установлено, что представительство Gp TTb-TIIa и Gp Ib на тромбоцитах уменьшается по мере снижения продуктов ПОЛ в плазме и в тромбоцитах, увеличения активности каталазы и СОД, а также снижения в плазме концентрации ВНиСММ, креатинина и мочевины.

Таблица 10

Влияние эритропоэтина на экспрессию рецепторов тромбоцитов у больных ХПН, находя____ щихся на гемодиализ<М± ф__

Группы / показатели Группа I: здоровые (n=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=24) Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа . (п=38)

Gp Ilb-IIIa, у.е.ф. 1,66±0,04 2,25±0,18* 1,93±0,15 1,63±0,04* 1,77±0,07

Gp Hb, у.е.ф. 1,99+0,04 2,84+0,16* 2,70+0,14* 2,40+0,06* 2,65+0,10*

Gp Ib, у.е.ф. 560,40±39,34 850,09+79,41* 728,36±7б,74 650,29±27,93*# 529,54±26,84&л

Gp Ib,% кл. 74,86±3,68 73,66±4,44 61,92±4,92* 85,56±1,89*# 60,89±3,84л

ЭПО уменьшает количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоци-тарно-моноцитарных коагрегатов в связи со снижением представительства Gp llb-IIla на тромбоцитах, увеличивает количество тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов до нормы (табл. 11). Полагаем, что восстановление тромбоцитарно-лимфоцитарной кооперации обусловлено антиапоптогенными свойствами ЭПО в отношении лимфоцитов. Известно, что процедура гемодиализа инициирует апоптоз лимфоцитов, а лимфоциты экспрсссируют рецепторы ЭПО и опухольнекротизирующего фактора, через которые ЭПО активирует ан-тиапоптические сигнальн, включая NF-kB, JANUS-2/STAT, гены bel-XL (Li-sowska К. et al., 2010, 2011; Borges A. et al., 2011). ЭПО y больных ХПН приводит к восстановлению количества эритроцитарно-тромбоцитарных коагрегатов за счет малых форм розеток. Эффект ЭПО, в том числе, обусловлен увеличением количества эритроцитов в кровотоке (R=0,27; р<0,05), а возможно, и ангиок-сидантным эффектом и как следствие стабилизацией цитоплазматической мембраны, маркируемой экстернализацией фосфатидилсерина (Amer J. et al.; 2010). Установлено, что скорость агрегации тромбоцитов возрастает по мере снижения тромбоцитарно-нейтрофильных (коэффициент корреляции Спирмена R = -0,39; р<0,05) и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (R = - 0,37; р<0,05) в крови.

Таблица 11

Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-клеточные взаимодействия у больных ХПН, на__холящихся на гемодиализе (М±ш)__

Группы / показатели Группа 1 : здоровые (п=25) Группа 2: ХПН до диализа (п=24) Группа 3: ХПН после диализа (п=241 Группа 4: ХПН+ЭПО до диализа (п=38) Группа 5: ХПН+ЭПО после диализа (п=38)

ТНА, % клеток 24,58±0,93 32,16±4,05* 26,90±1,58 24,78±0,71# 23,93±0,68

ТМА, % клеток 23,12±0,79 42,59±5,54* 32,40±2,57* 29,75±1,96*# 27,68±1,02*

ТЛА, % клеток 20,76±0,63 15,17±0,64* 14,88±0,94* 21,22±0,76# 21,68±1,02&

ТЭА, • 10''/л 120,55±9,55 84,32±9,12* 105,92±10,51 106,91±6,32# 109,91±6,32&

Примечание. ТНА - тромбоцитарно-нейгрофильные агрегаты, ТМА - тромбоцитарно-моноиитарные агрегаты, ТЛА - тромбоцитарно-лимфоцитарные агрегаты, ТЭА - Тромбоци-тарно-эритроцитарные агрегаты.

Применение ЭПО при экспериментальной ХПН частично восстанавливает показатели коагуляционного гемостаза (табл. 12). При экспериментальной ОПН ЭПО полностью восстанавливает показатели внешнего, внутреннего и общего путей активации коагуляционного каскада (табл. 13). Влияние ЭПО на коагуляционные процессы не опосредовано изменением активности антитромбина в крови. На этом фоне снижается активность системы фибринолиза, она становится ниже, чем в контрольной группе. Эффекты ЭПО на показатели активности плазменных протеолитических систем при почечной недостаточности могут быть связаны, во-первых, с прямым нефропротекторным действием этого гликопротеина, т.к. рецепторы ЭПО обнаружены на нефроэпителии (Уеэеу Б.А. е! а!., 2004, Таоийк Е. а1., 2008). Во-вторых, с дезинтоксикационным и анти-

оксидантным действием. При экспериментальной ХПН установлена обратная значимая корреляция между показателем протромбинового времени и концентрацией креатинина (R=-0,41; р<0,05) и мочевой кислоты в плазме (R=-0,36; р<0,05). Угнетая нитроксидергические и оксидативные процессы при ХПН, ЭПО может оказывать позитивное влияние на эндотелиальную функцию, восстанавливать баланс между про- и антикоагулянтными факторами эндотелио-цитов, предупреждать изменение структуры и функции факторов свертывания и компонентов противосвертывающей и фибринолитической систем.

Гемокоагуляционные эффекты ЭПО проявляются только при патологии и отсутствуют при его введении интактным животным. В тоже время, в экспериментальных условиях in vitro установлено, что эффекты ЭПО на активность плазменных систем фибринообразования и фибринолиза носят самостоятельный прямой дозозависимый характер (рис. 3).

Предполагаемый механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции отражены на интегральной схеме (рис. 4).

Таблица 12

Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при эксперименталь-

Группы животных / Показатели Группа I: Ложноопе-рированные (п—16) Группа 11: ХПН (п=12) Группа 111: ХПН+ЭПО (п-20)

ТВ, с Зб,50±0,79 15,70±1,62 * 20,40±3,94*#

АПТВ, с 33,82±4,15 29,77±2,59 * 34,57±2,80#

ПТВ, с 54,64±7,43 24,38±0,78 * 39,41±3,69#

Фибриноген, г/л 1,63±0,07 2,45±0,13 * 2,55±0,09*

Фнбринолиз, мин 6,31±0,35 7,05±0,81 6,58±0,55

Активность антитромбина, с 95,31±4,35 72,72±5,36 * 129,08±10,39*#

Таблица 13

Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при зксперимеяталь-

Группы животных / Показатели Группа 1: Интактные (п=19) Группа 11: ОПН (п=18) Группа 111: ОПН+ЭПО (п=13)

ТВ., с 59,58±9,71 24,55±3,57* 64,32±10,59#

АПТВ, с 32,13±3,98 18,21 ±1,00* 24,98±2,66#

ПТВ, с 27,48±2,16 22,25±0,10* 29,85±2,45#

Фибриноген, г/л 1,84±0,17 2,83±0,12* 2,81±0,38*

Фибринолиз, мин 11.41±1,07 6,58+0,69* 14,07±2,69*#

Активность антитромбина, с 104,96±8,02 131,09±3,92* 129,08±10,39

О (контроль) 1,88 3,75 7,5 15 30

доза ЭПО, МЕ / л

Рис. 3. Влияние ЭПО на показатели коагуляционного гемостаза в условиях iti vitro. * - значимые (р<0,05) различия с группой контроля.

Рис. 4. Предполагаемый механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции.

Двусторонние стрелки обозначают установленную зависимость. Штриховые стрелки - механизмы гемостазиологических эффектов ЭПО

выводы

1. У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается геморрагический синдром по петехиально-гоггнистому типу, выраженность которого возрастает после процедуры гемодиализа. Патогенез геморрагического синдрома связан с развитием анемии, тромбоцитопении, тромбоцитопатии и эндотелиальной дисфункции.

2. Патогенез тромбоцитопатии у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, включает активацию процессов свободно-радикального окисления в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, азотемию, изменение тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови и экспрессии глико-протеинов Ib-Ix и llb-IIIa на тромбоцитах.

3. Особенностями индивидуальной реактивности у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, являются неоднородность показателей клинических тестов выраженности геморрагического синдрома, функциональной активности тромбоцитов и нитроксидергических процессов.

4. При экспериментальной ХПН наблюдается активация системы фибрино-образования и подавление активности противосвертывающей системы крови. Применение эритропоэтина при экспериментальной ХПН восстанавливает активность плазменных протеолитических систем, участвующих в гемокоагуляции.

5. В экспериментальных условиях in vitro эритропоэтин дозо-зависимо ускоряет агрегацию тромбоцитов здоровых людей и больных хронической почечной недостаточностью, снижает активность систем фибринообразова-ния и фибринолиза в плазме здоровых людей.

6. Эритропоэтин снижает выраженность геморрагического синдрома у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, в связи с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов.

7. Гемостазиологические эффекты эритропоэтина при ХПН обусловлены его антианемическим, ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным действиями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на показатели агрегации тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Медицинский академический журнал. -2010.-Т. 10,№5.-С. 27.

2. Осиков, М.В. Эритропоэтин и агрегация уремических тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, В.А. Сумеркина, Э.Н. Коробейникова // Фундаментальные науки и практика. — 2010: - Т.1, №4. С. 126-127 [материалы третьей международной телеконференции]. - Томск, 2010.

3. Осиков, М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто -тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией почеч-

ной недостаточности / M.B. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - С. 462 - 466.

4. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия и экспрессию тромбоцитарных гли-копротсинов у больных с терминальной почечной недостаточностью / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Вестпик Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1. - С. 56-57.

5. Григорьев, Т.А. Процессы свободно-радикального окисления и роль эритропоэтина в их коррекции у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / Т.А. Григорьев, М.В. Осиков // Современные проблемы науки и образования - 2011. - №2. (Электронный журнал); URL: www.science-education.ru/96-4584 (дата обращения: 02.09.2011).

6. Осиков, М.В. Патохимические паттерны дисфункции тромбоцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Вестник ЮжноУральского государственного университета. Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». - 2011. - Вып. 28, №26 (243). -С. 134 -138.

7. Осиков, М.В. Роль эритропоэтина в реализации межклеточных взаимодействий у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Н.П. Масленникова // Вестник ЮжноУральского государственного университета. Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». - 2011. - Вып. 26, №7 (224). - С. 57-62.

8. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, В.Ю. Ахматов, К.В. Ахматов // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии». Москва, 2011. - С. 395 - 396.

9. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на количество и функциональную активность тромбоцитов периферической крови у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Материалы IF международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск: изд-во «ЧелГМА», 2011. — С. 175 - 179.

10. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на показатели коагуляционного гемостаза при экспериментальной почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения) : материалы международной научной конференции / под науч. ред. A.B. Муравьева. -Ярославль : Изд-во ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2011. - С. 70.

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВ Тимофей Александрович

ПАТОГЕНЕЗ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА И РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИНА В ИХ КОРРЕКЦИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 23.09.2011. Бумага ВХИ. Ризография. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Зак. 420.

Отпечатано в типографии «Три Кита». 454081, г. Челябинск, ул. Островского, 81.

Актуальность темы

Количество больных с синдромом хронической почечной недостаточности (ХПН) ежегодно увеличивается в связи с ростом заболеваемости нефропатиями различной природы, артериальной гипертензией, сахарным диабетом, атеросклерозом, учащением сосудистых поражений почек, общим старением населения, а также значительным прогрессом в области заместительной почечной терапии, увеличением ее доступности и расширением объемов [8, 47, 63, 69]. По данным регистра Российского диализного общества, число больных ХПН, получающих заместительную терапию, составило в 2007 г. 20212 человек, или 142,3 на 1 млн. населения.

Медико-социальная значимость ХПН во многом- связана с ее осложнениями. К числу наиболее значимых проблем при ХПН относят артериальную гипертензию, анемию, инфекционные осложнения, энцефало-и нейропатии, эндокринопатии, костно-минеральные нарушения, изменения водно-электролитного и кислотно-основного состояния и др. Одним из проявлений патологической реактивности при ХПН являются нарушения в системе гемостаза, которые могут проявляться как геморрагическими, так и тромбэмболическими осложнениями [148, 333]. У больных ХПН возникают изменения количества и функциональной активности тромбоцитов, вазопатии, нарушения гемореологии, системы свертывания и противосвертывания, которые приводят к целому ряду клинических проявлений, включая такие социально значимые как повышенный риск развития инсульта, атеросклероза, гематом, гемартрозов и др. [186, 293]. По данным The US Renal Data System, у 15,1% пациентов ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается инсульт, тогда как в общей популяции этот показатель равен 2,6%, смертность при этом составляет соответственно 74 % и 28 % [214, 287]. Частота развития кровотечений у больных с терминальной стадией ХПН может достигать более 12 % на 1 пациент-год [293]. При ХПН частота возникновения атеросклероза выше в 2,5 раза, чем в общей популяции, застойной сердечной недостаточности — в 4 раза, смертность - в 3 раза [162].

Максимальная выраженность клинических и лабораторно-инструментальных проявлений при ХПН наступает в терминальную (уремическую) стадию, когда необходимо применение эфферентных мероприятий, среди которых в РФ наиболее распространен гемодиализ. В тоже время, процедура гемодиализа сама, а также сопутствующие ей факторы, такие как применение антикоагулянтов, вносят существенный вклад в патогенез нарушений гемостаза и препятствуют его объективной оценке при ХПН [160, 187, 209].

Обширный массив сообщений по нарушению системы гемостаза при ХПН в основном посвящен дисфункции тромбоцитов и эндотелия. Однако противоречивость представленных данных препятствует пониманию участия нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза в единой концепции • патогенеза гемостазиологических нарушений при ХПН. Неоднозначно трактуются при ХПН изменения количества тромбоцитов [142, 263], их функциональной активности [109, 185, 350], функционального состояния эндотелиоцитов [112, 170, 217, 302, 320, 362]. К сожалению, до сих пор не достигнуто консенсуса в понимании патогенеза тромбоцитопатии при уремии. Заслуживают внимания сведения о роли анемии [223, 374], нарушениях взаимодействия тромбоцитов с фактором фон Виллебранда и др. компонентами сосудистой стенки [88, 373], неоднозначных изменениях экспрессии тромбоцитарных рецепторов Gplb-Ix, GpIIb-IIIa, CD51, Р-селектина [74, 110, 255, 315]. Были попытки выяснить роль конкретных уремических токсинов в патогенезе уремической тромбоцитопатии, однако результаты исследований в этом направлении также противоречивы [238]. Отсутствуют данные о роли тромбоцитарно-клеточных коопераций в крови в патогенезе нарушений гемостаза при ХПН. Сведения по изменению коагуляционного гемостаза у больных с больных ХПН, находящихся на гемодиализе, малочисленны в виду известных трудностей его оценки, в этом отношении перспективными являются исследования системы гемостаза при экспериментальном моделировании ХПН. Значимость исследований гемостаза при ХПН подчеркивает тот факт, что факторы системы гемостаза: плазменные, сосудистые, клеточные одновременно являются компонентами других регуляторных систем или вмешиваются в их функционирование, что позволяет рассматривать гемостаз как мультипотентую систему регуляции гомеостаза, несущую значительную часть аллостатической нагрузки при патологии, в том числе при ХПН [129, 247, 248].

Перспективным подходом к коррекции нарушений системы гемостаза при ХПН является расшифровка механизмов ее эндогенной регуляции. В этом отношении неподдельный интерес вызывает именно эритропоэтин f

ЭПО) как средство базисной терапии при ХПН, плейотропные эффекты которого в последние 2-3 года являются объектом пристального внимания исследователей во многих странах мира. Установлены нейро- и ( кардиопротекторные свойства ЭПО, его влияние на аффективный статус, сосудистый тонус и пролиферацию эндотелиоцитов, изменение , функциональной активности лейкоцитов, во многом связанные с антиапоптическим, пролиферацию стимулирующим, антигипоксическим действиями [4, 52, 106, 164, 207, 215, 216, 259]. Впервые в 2010 г. были обнародованы сведения о прямом нефроцитопротекторном действии ЭПО в экспериментальных условиях [136]. Такие плейотропные эффекты ЭПО реализуются за счет наличия специфических рецепторов на нейронах, кардиомиоцитах, эндотелиоцитах и гладкомышечных клетках, Т- и В-лимфоцитах, эпителии почечных канальцев и- др. клетках [28, 29, 231, 254, 327]. В тоже время, сведения о влиянии ЭПО на систему гемостаза базируются, в основном, на его антианемическом действии. Однако, изменения гемостаза в условиях применения ЭПО наблюдаются уже через несколько дней после начала терапии, когда уровень гемоглобина и гематокрит у ряда пациентов еще не изменяются [335]. Остаются малоизученными эффекты ЭПО на количество и функцию тромбоцитов, эндотелиоцитов, состояние систем плазменного протеолиза, участвующих в гемостазе. Исследование и уточнение некоторых механизмов нарушений системы гемостаза при ХПН, а также расшифровка механизмов гемостазиологических эффектов ЭПО заслуживают особого внимания и представляются весьма актуальными.

Цель работы

В клинических и экспериментальных условиях исследовать ведущие механизмы нарушений гемостаза при хронической почечной недостаточности и установить патогенетическую роль эритропоэтина в их коррекции.

Задачи исследования

1. Исследовать с учетом индивидуальной реактивности выраженность £ нарушений гемостаза, количество, функциональную активность тромбоцитов и эндотелиоцитов у больных хронической почечной , недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

2. Оценить роль процессов свободно-радикального окисления, нитроксидергических процессов, азотемии, экспрессии рецепторов тромбоцитов и тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови в патогенезе нарушений гемостаза у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе.

3. Изучить состояние систем плазменного протеолиза, участвующих в гемостазе при экспериментальной хронической почечной недостаточности.

4. Исследовать в экспериментальных условиях in vitro влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов и плазменных протеолитических систем, участвующих в гемостазе.

7.

Изучить влияние эритропоэтина на выраженность геморраг синдрома и состояние сосудисто-тромбоцитарного гемо< больных хронической почечной недостаточностью, находяю: гемодиализе. зческого ггаза у йхся на

Изучить влияние эритропоэтина на состояние систем плаз£: пч4єнного

-хальной протеолиза, участвующих в гемостазе, при эксперимегзпг хронической почечной недостаточности.

Исследовать при хронической почечной недостаточности .д-^злияние эритропоэтина на экспрессию рецепторов- тромбоцит-агов и тромбоцитарно-клеточные взаимодействия в крови, выражу процессов свободно-радикального окисления и азотемии. нность

Научная новизна исследования

Впервые продемонстрировано, что в патогенезе геморрагии синдрома у больных хронической почечной недостаточностью, веского на гемодиализе, имеют значение анемия, тромбоцитопения, тромбоците

-опатия и эндотелиальная дисфункция. Выраженность геморрагического синди: больных хронической почечной недостаточностью не завис?: нозологического профиля непосредственной причины хронической ПО" недостаточности, стажа гемодиализа, возраста и пола больных. трома у ^згг от з:ечнои

Впервые приведены данные о роли в патогенезе тромбоцитошьтии у больных хронической почечной недостаточностью, находящюсс на гемодиализе, процессов свободно-радикального окисления в плазіузі-^^ и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, выраженности азо^^згемиИ' изменений тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови и экегг; тромбоцитарных рецепторов врІЬ, ОрІІЬ-Ша.

Показано, что при экспериментальной хронической по^^з: недостаточности изменения активности систем плазменного протез участвующих в гемокоагуляции, включают активацию сиі-с фибринообразования и снижение активности противосвертывающей сисс цессии крови и впервые продемонстрироавно, что эритропоэтин частично восстанавливает активность данных систем.

Впервые установлен протекторный эффект эритропоэтина на систему гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности, презентируемый снижением выраженности геморрагического синдрома и связанный с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. Впервые продемонстрирован механизм гемостазиологических эффектов эритропоэтина при хронической почечной недостаточности, определяемый не только его антианемическим действием, но и ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным влияниями.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Результаты проведенного исследования позволили вскрыть некоторые механизмы нарушений системы гемостаза, а также определить оптимальные точки приложения патогенетической терапии при хронической почечной недостаточности. В частности, установлено, что геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу, развивающийся у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, обусловлен тромбоцитопенией, тромбоцитопатией и дисфункцией эндотелия. Существенно дополнены некоторые представления о патогенезе тромбоцитопатии у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе, связанные с развитием окислительного стресса в плазме и в самих тромбоцитах, азотемии, влиянием нитроксидергических процессов, тромбоцитарно-лейкоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий в крови, экспрессией тромбоцитарных рецепторов вр1Ь, врИЬ-Ша. Дополнены имеющиеся представления об изменении активности коагуляционного гемостаза при хронической почечной недостаточности. Результаты проведенного исследования позволили установить некоторые механизмы влияния эритропоэтина на сосудистое, клеточное и плазменное звенья гемостаза при хронической почечной недостаточности и расширить имеющиеся сведения о роли эритропоэтина в эндогенной регуляции гомеостаза. Полученные результаты важны для развития медицины, патофизиологии, нефрологии, гемостазиологии и могут быть использованы в преподавании соответствующих разделов на теоретических и клинических кафедрах медицинских ВУЗов. Полученные сведения о гемостазиологических эффектах существенно дополняют имеющиеся представления о плейотропном действии эритропоэтина и являются предпосылкой для проведения дальнейших исследований по расширению показаний для его клинического применения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности развивается геморрагический синдром, патогенез которого связан с развитием анемии, тромбоцитопении, тромбоцитопатии и дисфункции эндотелия, его выраженность нарастает по мере активации процессов свободно-радикального окисления* в плазме и в тромбоцитах, нитроксидергических процессов, прироста азотемии, изменений тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови.

2. При экспериментальной хронической почечной недостаточности изменения коагуляционного гемостаза презентируются активацией системы фибринообразования и подавлением активности противосвертывающей системы крови; эритропоэтин частично восстанавливает активность плазменных протеолитических систем, участвующих в гемокоагуляции.

3. Применение эритропоэтина у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности снижает выраженность геморрагического синдрома в связи с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. Механизм гемостазиологических эффектов эритропоэтина при хронической почечной недостаточности реализуете^ за счет антианемического, ПОЛ-ограничивающего и дезинтоксикационного действия.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской наукпя: третьего тысячелетия», посвященной 120-летию со дня основания НИЗНЇ экспериментальной медицины СЗО РАМН' (Санкт-Петербург, 2010); И международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодые^ ученых ЧелГМА (Челябинск, 2011); V Всероссийской конференции международным участием «Клиническая гемостазиология. и гемореология ^ сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011); 8-ой международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (от ангиогенеза до центрального кровообращения) (Ярославль, 2011); научно-практической конференции «Хроническая болезнь почек — этапы заместительной почечной: терапии» (Челябинск, 2011); третьей международной телеконференции: (Томск, 2011).

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в преподавание патофизиологии1 в разделе «Патофизиология гемостаза» в ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России». Методы исследования тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови внедрены в научную работу кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в практику отделений диализа ГБУЗ

Челябинская областная клиническая больница», ГУЗ «Свердловская областная клиническая больница №1».

Заключение

Хроническая почечная недостаточность представляет клинико-лабораторный синдром, возникающий при любом прогрессирующем заболевании почек, характеризующийся постепенной, необратимой гибелью нефронов и проявляющийся утратой функции почек и нарушением гомеостаза в организме. Осложнения терминальной стадии ХПН включают широкий спектр клинических и лабораторно-инструментальных проявлений: артериальную гипертензию, анемию, синдром инфекционных осложнений, эндокринопатии, нарушения водно-электролитного и кислотно-основного состояния, язвенные поражения желудочно-кишечного тракта, полисерозиты, энцефало- и нейропатии и др. Не последнее место в структуре осложнений терминальной ХПН занимают нарушения системы гемостаза, которые приводят как к геморрагическим, так и тромбэмболическим последствиям. По данным Holden R.M. et al., частота развития геморрагического синдрома у больных ХПН составляет в среднем 2,5% на 1 пациент-год и возрастает до 6,3% на 1 пациент-год при назначении антикоагулянтов и антиагрегантов [186]. Каждый эпизод развития кровотечения у больного ХПН требует затрат времени и средств на коррекцию состояния гемостаза и вынуждает использовать альтернативные подходы к антикоагулянтной и антиагрегантной терапии. В тоже время, несмотря на огромное количество публикаций, посвященных гемостазиологическим проблемам при ХПН, в настоящее время не достигнуто всеобщего понимания в вопросах патогенеза нарушений гемостаза при уремии. Особую значимость проблемы подчеркивает тот факт, что факторы системы гемостаза: плазменные, сосудистые, клеточные одновременно являются компонентами других регуляторных систем или вмешиваются в их функционирование, что позволяет рассматривать систему гемостаз/антигемостаз как мультипотентую систему регуляции гомеостаза, несущую значительную часть аллостатической нагрузки при патологии, в том числе при ХПН. Так, плазменные факторы гемостаза неотделимы от других протеолитических систем в плазме: комплемента, калликреин-кининовой, фибринолиза, противосвертывающей. Эндотелиоциты участвуют не только в гемостатических реакциях, но и в реализации воспалительного процесса, регуляции сосудистого тонуса и ремоделировании сосудов. Взаимодействие тромбоцитов с популяциями лейкоцитов и эритроцитами определяет функциональную активность последних по обеспечению защитных реакций организма, поддержанию баланса процессов- свободно-радикального окисления, адекватного кислородообеспечения и др.

Кроме того, актуальной и клинически значимой проблемой является поиск эндогенных регуляторов системы гемостаза. В этом отношении неподдельный интерес вызывает именно эритропоэтин как средство базисной терапии при ХПН, плейотропные эффекты которого в последние 2-3 года являются объектом пристального внимания исследователей во многих странах мира. В частности, доказаны его нейро- и кардиопротекторные свойства, влияние на сосудистую стенку и внутриклеточный метаболизм, включая антиапоптогенный и антигипоксический эффекты.

Нами установлено, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, зафиксирован геморрагический синдром по петехиально-пятнистому типу. До процедуры гемодиализа по сравнению с группой здоровых людей время кровотечения удлиняется в среднем на 60%, количество петехий в манжеточной пробе Румпеля-Лееде-Кончаловского увеличивается в среднем в 6 раз (рис. 10). Процедура гемодиализа приводит к удлинению времени кровотечения и увеличению количество петехий. Анализ индивидуальной реактивности показал, что процедура гемодиализа увеличивает дисперсию клинических тестов выраженности геморрагического синдрома: до гемодиализа ни у одного больного время кровотечения и количество петехий не было меньшим, чем в контрольной группе; после гемодиализа из 24 больных время кровотечения у 6 укорачивалось, количество петехий у 4 уменьшалось.

Снижение среднего объема тромбоцитов у больных ХПН может свидетельствовать об угнетении их образования в костном мозге и/или усилении тромбоцитодиэреза. В пользу последнего предположения свидетельствуют данные других исследователей о негативной селекции тромбоцитов в крови у больных ХПН [58, 328].

Развитие тромбоцитопатии у больных ХПН презентируется угнетением АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, усугубляемой после процедуры гемодиализа (рис. 12). Доказано, что время кровотечения удлиняется, а количество петехий в манжеточной пробе возрастает по мере снижения количества тромбоцитов, тромбокрита и замедления агрегации тромбоцитов. оооооооо сиоог-юю-^-согд 1 ■ Амплитуда, % □ Время, мин ЕЗ Скорость%/мин

Г- Г - . Вт-

-Ш-І-- ■

1 # 1— :

10 0 Щж ЩЩш контроль ХПН до диализа ХПН после диализа

Рис. 12. Показатели агрегации тромбоцитов у больных ХПН, находящихся на гемодиализе

У больных ХПН, находящихся на гемодиализе, развивается эндотелиальная дисфункция, констатируемая активацией нитроксидергических процессов и повышением уровня фактора фон Виллебранда в крови. При оценке уровня конечных стабильных метаболитов N0 в сыворотке до гемодиализа наблюдается преимущественный прирост нитритов по сравнению с нитратами (рис. 13). подтверждается наличием обратной средней силы связью между этими показателями до и после процедуры гемодиализа. В тоже время, количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов уменьшается по мере снижения количества эритроцитов в периферической крови у больных ХПН.

Выявлено, что дисфункция тромбоцитов у больных ХПН в определенной мере связана с изменением тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий в крови. Скорость агрегации тромбоцитов угнетается по мере увеличения тромбоцитарно-нейтрофильных (Я = — 0,33; р<0,05)< и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (Я = — 0,41; р<0,05) в крови.

В связи с тем, что объективная оценка коагуляционного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, невозможна из-за постоянного применения антикоагулянтов прямого действия, нами проведено экспериментальное моделирование ХПН двухэтапным удалением 5/6 почечной ткани у крыс. При экспериментальной ХПН наблюдается активация системы фибринообразования с заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего путей по показателям тромбинового, протромбинового и активированного парциального тромбопластинового времени (рис 23).

Зафиксированная гиперфибриногенемия, вероятно, развивается в ходе ответа острой фазы, так как фибриноген относится к положительным реактантам острой фазы [46]. Активность системы фибринолиза не изменяется, а антиромбина — уменьшается, что может свидетельствовать об истощении противосвертывающей системы.

Для выяснения вопроса о влиянии длительности уремии на изменение коагуляционного гемостаза мы моделировали кратковременную уремию у крыс подкожным введением хлорида ртути (И) - экспериментальная модель острой почечной недостаточности. На 5 сутки эксперимента, как и при ХПН, фиксируется активация коагуляционного каскада. Кроме этого, отмечено повышение активности антитромбина и ускорение фибринолиза (рис. 24). Механизм активации гемокоагуляции при почечной недостаточности может быть вызван контактом с полианионными поверхностями, например, уремическими токсинами, поврежденными мембранами клеток крови,

183 эндотелиоцитов и др. Полагаем, что изменение активности антитромбина и системы фибринолиза являются следствием гиперкоагуляции при почечной недостаточности.

100 80 и

60 8- 40

20 о контроль хпн Антитромбин, с □ фибринолиз, мин контроль хпн

14

12 10 X

3 8 2

6 | 4 2 0

Рис. 23. Показатели коагуляционного гемостаза, фибринолиза и противосвертывающей системы при экспериментальной ХПН

IАмплитуда, %□ Время, мин □ Скорость%/мин ■ Амплитуда, %□ Время, мин □ Скорость%/мин

50 40 30 20 10 0

20

15

10

ХПН

ХПН +ЭПО

ХПН

ХПН +ЭПО а) б)

Рис. 27. Влияние эритропоэтина на агрегацию тромбоцитов у больных ХПН до (а) и после (б) гемодиализа

70 60 X I 50 5s 40 л" h чп -1| * ■ тромбоциты больных ХПН □ интактные тромбоциты • и ! о О. О ?Г) « « а * о 10 Г| 1 ------. 1 1 1 1 и

0 (контроль) 1, 88 3,75 7,5 15 30 доза ЭПО, ME / л

Рис. 28. Влияние эритропоэтина на агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro - значимые (р<0,05) различия с группой контроля при исследовании уремических тромбоцитов, # - интактных тромбоцитов.

Применение ЭПО у больных ХПН оказывает благоприятное влияние на функциональное состояние эндотелиоцитов. Эндотелиотропные эффекты ЭПО при ХПН реализуются за счет снижения продукции оксида азота (II) и

Полагаем, что восстановление тромбоцитарно-лимфоцитарной кооперации обусловлено антиапоптогенными свойствами ЭПО в отношении лимфоцитов. Известно, что процедура гемодиализа инициирует апоптоз лимфоцитов, в тоже время лимфоциты экпрессируют рецепторы ЭПО, а также рецептор I опухольнекротизирующего фактора, через которые ЭПО активирует антиапоптические сигнальные пути, включая NF-kappaB, JANUS-2/STAT киназу, гены bel-XL и антиапоптогенные белки [102, 234, 235, 327].

ЭПО у больных ХПН приводит к восстановлению количества эритроцитарно-тромбоцитарных коагрегатов за счет влияния на формирование малых форм розеток (рис. 40). Эффект ЭПО, в том числе, обусловлен увеличением количества эритроцитов в кровотоке (R=0,27; р<0,05), а возможно, и ПОЛ-ограничивающим эффектом и как следствие стабилизацией цитоплазматической мембраны, маркируемой экстернализацией фосфатидилсерина [79].

120

100

80

60

40

20 ТЦ-ЭЦ, малые □ ТЦ-ЭЦ, большие В ТЦ-ЭЦ, всего

ХПН

ХПН +ЭПО ТЦ-ЭЦ, малые •j 2о □ ТЦ-ЭЦ, большие В ТЦ-ЭЦ, всего

60

40

20

100

80

ХПН

ХПН +ЭПО а) б)

Рис. 40. Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия у больных ХПН до (а) и после (б) гемодиализа

Установлено, что влияние ЭПО на тромбоцитрно-лейкоцитарные взаимодействия в крови при ХПН вносит определенный вклад в восстановление функциональной активности тромбоцитов по показателям агрегации. Так, скорость агрегации тромбоцитов возрастает по мере снижения тромбоцитарно-нейтрофильных (коэффициент корреляции Спирмена Я = — 0,39; р<0,05) и тромбоцитарно-моноцитарных взаимодействий (II = - 0,37; р<0,05) в крови.

Применение ЭПО при экспериментальной почечной недостаточности частично восстанавливает активность систем фибринообразования и фибринолиза и противосвертывающей. При кратковременной уремии (модель ОПН) ЭПО полностью восстанавливает показатели внешнего, внутреннего и общего путей активации коагуляционного каскада (рис. 41). Влияние ЭПО на коагуляционные процессы не опосредовано изменением активности антитромбина в крови. На этом фоне снижается активность системы фибринолиза, она становится ниже, чем в контрольной группе.

При. экспериментальной ХПН ЭПО восстанавливает первый этап коагуляционного гемостаза, связанный с образованием комплекса активной протромбиназы, тромбиновое время, отражающее второй этап гемокрагуляции, восстанавливается частично. Выраженность острофазовой реакции не корригируются в полной мере на фоне применения ЭПО; т.к. содержание фибриногена в плазме остается повышенным (рис. 42)

Эффекты ЭПО на показатели активности плазменных протеолитических систем при почечной недостаточности могут быть связаны с несколькими механизмами. Во-первых, с прямым нефропротекторным действием этого гликопротеина, т.к. рецепторы ЭПО обнаружены' на нефроэпителии, а при экспериментальной ишемии почки ЭПО блокирует апоптоз и стимулирует митотические процессы в клетках почечных канальцев [28, 29, 303, 327, 348]. Во-вторых, опосредованно в связи с ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным действием. При экспериментальной ХПН установлена обратная значимая корреляция между показателем протромбинового времени и концентрацией креатинина (11= — 0,41; р<0,05) и мочевой кислоты в плазме (11= - 0,36; р<0,05). Угнетая синдрома. Механизм действия ЭПО у больных ХПН связан с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением, тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов. При экспериментальной ХПН ЭПО восстанавливает активность плазменных протеолитических систем, участвующих в гемокоагуляции. Гемостазиологические эффекты ЭПО при ХПН обусловлены его антианемическим, ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным действиями. Механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции отражены на интегральной схеме (рис. 44).

Рис. 44. Предполагаемый механизм нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, и роль ЭПО в их коррекции

6. Эритропоэтин снижает выраженность геморрагического синдрома у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, в связи с повышением количества тромбоцитов в периферической крови, восстановлением тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови, функциональной активности тромбоцитов и эндотелиоцитов.

7. Гемостазиологические эффекты эритропоэтина при ХПН обусловлены его антианемическим, ПОЛ-ограничивающим и дезинтоксикационным действиями.

206