Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Структурно-функциональные особенности белка терминального повтора вируса Эпштейна-Барр и закономерности его экспрессии при раке носоглотки

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. акад. H.H. Блохина

U г g ТГп

I U U А» На Правах рукописи

1 1 MAP 18SS

Афанасьева Татьяна Александровна УДК 612.118.24.017-1:(578.828.4)

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БКЛКА ТЕРМИНАЛЬНОГО ПОВТОРА ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР И ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЕГО ЭКСПРЕССИИ ПРИ РАЖЕ НОСОГЛОТКИ.

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор недицинских наук В. Э. Гурцевич

Москва - 1996

Работа выполнена в Онкологической научной центре имени H.H. Блохина Академии медицинских наук Российской Федерации.

Научный руководитель: руководитель лаборатории вирусного канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН, доктор медицинских наук В. Э. Гурцевич.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

в 14.00 на заседании Специализированного Совета К.001.17.01. Онкологического научного центра АМН РФ (11547В, Москва, Каширское воссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН

К. В. Ильин;

доктор биологических наук А. Ф. Бобков.

Ведущая организация: Институт Иммунологии Минздрава РФ

1996 г.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета д.м.н., проф. B.C. Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ!

1. Актуальность проблемы. Изучение этиопатогенетической роли вирусов при злокачественных новообразованиях человека и животных является одним из главных направлений в современней экспериментальной онкологии. Имеющиеся дайные относительно семейства герпес-вирусов свидетельствуют о том, что некоторые его члены способны трансформировать клетки in vitro и индуцировать образование опухолей у лабораторных животных. Одним из таких вирусов является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), который ассоциирован с широким спектром патологических процессов у человека, включая и злокачественные (лимфо-ма Беркитта, к ди'ференцированный рак носоглотки и др.).

В инфицированных клетках вирус способен устанавливать как продуктивную (литическую) инфекцию с освобождением зрелых вирусных частиц и гибелью инфицированных клеток, так и непродуктивную (латентную) инфекцию, когда экспрессируется только часть вирусного генома. Обнаружение того факта, что в трансформированных клетка.. ВЭБ находится в латентном состоянии, предопределило направленность современных работ, в центре которых находится изучение функциональной роли генов латентной инфекции ВЭБ и их продуктов.

Одними из последних открытых генов латентной инфекции ВЭБ является гены, кодирующие латентные мембранные белки - белки терминального повтора {ТР1 и ТР2), имеющие сходную молекулярно-генети-чесхую организацию и отличающиеся лишь по первому N-концевому эк-эону, который входит в состав гена ТР1 и отсутствует у ТР2. основная гипотеза, существующая на сегодня, предполагает, что в латент-но-инфицированных ВЭБ В-лимфоцитах ТР1 является ключевым звеном, обеспечивающим сохранение латентного статуса инфекции и, соответственно, препятствующим активации литической инфекции ВЭБ.

Ракономерности экспрессии TP в клетках недифференцированного рака носоглотки (нРНГ) практически не изучены, в частности, вследствие низкого уровня экспрессии этих белков, а также отсутствия соответствующих поли- и моноклональных антител. Тем не менее, существующие на сегодня данные позволяют предположить, что TP мо-чет играть важную роль в патогенезе нРНГ. Так, транскрипты ТР1 в опухоле-ых клетках нРНГ определялись практически в 100% случаев, причем не только-в первичнс "J опухоли, нл и в метастазах. Кроме того, по предварительным данными антитела к TP выявлялись только и

сыворотках крови больных нРНГ, но не в сыворотках крови больных другими ВЭБ-ассоциированными заболеваниями.

Такая специфичность иммунного ответа к ТР представляет большой интерес и с практической точки зрения, поскольку диагностика и дифференциальная диагностика опухолей носоглотки затруднена (в частности, вследствие сложности визуального осмотра исследуемой области, взятия биопсийного материала и его морфологической трактовки). Между тем, выделение различных гистологических форм РНГ является крайне актуальной задачей, поскольку это связано с их различным клиническим течением и прогнозом. 2. Цели н задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в разработке подходов к изучению экспрессии ТР в клетках недифференцированного рака носоглотки, а также анализе клинической значимости гуморального иммунного ответа к ТР у этих больных.

В ходе выполнения исследований предполагалось решить следующие задачи:

1) Получить рекомбинантные белки ТР1 в прокариотической системе. Отработать оптимальный способ экспрессии, выделения и очистки рекомбинантных белков.

2) Собрать сыворотки крови и биопсийный материал от больных опухолями верхних дыхательных и пищеварительных путей. Используя тест по определению уровня антител к белкам литической инфекции ВЭБ, выделить группу больных нРНГ с последующим морфологическим подтверждением диагноза.

3} Провести скрининг сывороток крови больных нРНГ на ■ наличие антител к ТР ВЭБ; исследове.ть динамику уровня этих антител,в процессе лечения.

4) Проанализировать наличие зависимости между характером гуно-рального ответа к ТР и клиническими характеристиками опухолевого процесса у больных нРНГ.

5) Провести предварительный иммунологический анализ . мблекулы ТР1: а) выявить участки молекулы белка, принимающие участие в формировании антигенных детерминант; б) оценить направленность гуморального ответа больных нРНГ к конкретным эпитопам молекуты ТР1.

3. Научная новизна. Научная новизна данной работы заключается в тон, что впервые был проведен комплексный анализ гукорального иммунного ответа к ТР у больных нРНГ (включая пациентов, находящихся в ремиссии свыше 5 лет, а также у больных, умерших от прогрессиро-вания этого заболевания) в зависимости от клинических характеристик этого заболевания. Получение коллекции плазмидных клонов, экс-прессирующих как полноразмерный ТР1, так и отдельные участки его молекулы позволило оценить структурные и функциональные особенности молекулы ТР, а именно: иммуногённость и участие в формировании антигенных детерминант доменов белка, а также направленность гуморального ответа у больных нРНГ к конкретным эпитопам ТР. Полученные данные, свидетельствующие о направленности анти-ТР антител человека и животных к разным участкам белка, позволили проанализировать возможные причины неудач по изучению экспрессии этого белка в опухолевых клетках нРНГ и разработать подходы по получению соответствующих серологических реагентов (поли- и моноклональных антител) •

4.Научно-практическая значимость работы, Проведенные исследования вносят определенный вклад в малоизученную проблему взаимоотношения вируса с клетками эпителия на уровне функционирования индивидуальных генов латентной инфекции ВЭБ и их продуктов, а также способствуют пониманию особенностей иммунного ответа к ВЭБ при различных ВЭВ-ассоциированных патологиях и поиску эффективных путей иммунологического контроля этой инфекции. Решение поставленных в данной работе задач позволило проанализировать диагностическую и прогностическую значимость выявления антител к ТР у больных нРНГ. Полученное данные являются предварительными и работа в данном направлении будет продолжена. Тем не менее, применение в клинике теста по оценке изменения уровня антител к ТР до и после лечения в качестве параметра, определяющего эффективность проведенного лечения и прогноз заболевания в каждом индивидуальном случае, представляется весьма перспективным. Таким образом, полученные данные будут способствовать разработке новых подходов к мониторингу и прогнозу больных НРНГ.

5; Апробация работы. Апробация диссертационной работы была прове-

дена 30 января 1996 г. на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН.

Основные положения диссертации докладывались на II и III международных конференциях "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1994 и 1995 г.г.)» на школе иммунологии им. Джона Хампфри (Россия, Пущино, 1994 г.), а также на XXI Европейском симпозиуме по опухолевым вирусам человека (Австрия, Иннсбрук, 1995 г.)

6. Публикации. По материалам .выполненных исследований опубликовано 7 работ.

7. Структура и объан дпсавртацнн. диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (включающего б глав), описания использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит Iff рисунков, 2 таблицы, 1 приложение, занимает ЮЗ страниц машинописного текста. Библиография включает 4 источника отечественной и 122 иностранной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. материалы и методы. В качестве источника плазмидной ДНК использовали клон U549/S, полученный на основе вектора рАТН-10, содержащий BamHI-Smal рестриктазный фрагмент M-ABA/CBL1 кДНК, включающий практически полную последовательность гена ТР1 за исключением 18 N-концевых аминокислот (119-1556 п.н.), клон р48/1б на ос-нозе вектора рАТН-1, включающий в свой состав Pstl-HindlII ,(62-842 п.н.) фрагмент N-концевой области TPI, а также клон G27-14 (вектор рАСУ-184), содержащий фрагмент геномной ДНК ВЭБ (166615-169035), зоз п.о. кЬторого кодируют первый экзон ТР1 (166615-16691:8). Данные плазмидныг клоны были любезно представлены проф. G; Bcfrnkamm (Германия). В качестве экспрессирующи^ векторов использовали рАТН (-1, -11) с триптофан-регулируемым промотором (trp), а также pMAL с синтетическим tac-промотором, индукция транскрипции с которого осуществляется с помощью ИПТГ (изопропил-О-тиогалактопирянозид).

- s

Вектор pMAL был использован в двух вариантах - pMALp и pMALc, которые имеют общий полилиниер и отличаются лишь наличием в pMALp сигнальной последовательности, необходимой для секреции экспресси-руеиого рекомбинантного белка в периплазму.

При работе с рАТН-производными клонами согласно методу spindler et al.(1984) для репликациии и выделения рекомбинантных плазмид использовали гес" штаммы Е. coli DHf-1 и 490А, для химической индукции синтеза гибридного белка С600 и Ion" SG21063 штаммы Б. coli, трансформированные соответствующими рекомбинантными плазми-дамй. При работе с pMAL-производиыми клонами согласно рекомендациям фирмы "Biolabs" (Англия) использовали XLBlue и ТВ-1 штаммы Е. coli.

Компетентные для трансформации стоки бактерий готовили рубидиевым методом. Выделение и очистку плазмидной днк, гидролиз ДНК рестриктаэами ("Sigma"; НПО "Fermentas"), ферментативные реакции с фрагментом полимеразы Кленова ("BoehrInger Hannheim"), щелочной фосфатазой теленка, электрофорез ДНК в агарозном геле выполняли согласно Davis et al. (1936). Лигирование и выделение фрагментов ДНК, использовавшихся в ходе клонирования из рестриктазной смеси, проводили как было описано ранее О.Павлишем с соавт. (1993).

Определение растворимости рекомбинантных продуктов проводили согласно методическим рекомендациям фирмы "Biolabs" (Англия): осадок клеток из 20 мл бактериальной культуры через 1 ч индукции pMAL-проиэводных клонов ресуспендировали в 2,5 мл лизируюгего буфера (10 иМ Na2HP03 pH 7,0; NaCl 30 кМ, Твин 20 0,253í, ß- меркап-тоэтанол 10 «M, EDTA 10 мМ, EGTA 10 мМ) и замораживали при -20° С в течение ночи. Суспензию размораживали на льду и обрабатывали ультразвуком, затем центрифугировали при 9000g в течение 20 мин при 4°С. Супернатаит содержал растворимую, а осадок - нерастворимую фракции белков. Формирование сферопластов проводили по Н. Neu et al. EDTA-лизоцимным методом (1964). Мембранные фракции клеток Е. coli коллекционировали путем дифференциального центрифугирования по методу М. Rüssel (1980).

Приготовление белковых лиэатов и электрофорез белков в ДСН-ПААГ проводили по U. Laemmly (1970). Электроперенос на фильтр ("Schle-

icher h Schuell", "Mlllipore") выполняли по стандартной методике (H. Towbin et al.,' 1984). Для анализа полученных рекомбинантных белков в иммуноблоттинге использовали гипериммунную сыворотку кролика против экспрессированного в бакуловирусной Оистеме ТР1 (ан-ти-TPl), любезно предоставленную проф. N. Mueller-Lantzsch (Германия), а также сыворотку кролика против бактериальной аптранилат-синтаэы (анти-АС), полученную ' в нашей лаборатории (о. Павлиш, 1993).

сыворотки крови 212 больных различными. ВЭБ-ассоцнировашшии и неассоциированными заболеваниями были собраны в ходе проведения дифференциальной диагностики от пациентов, наблюдавшихся в Онкологическом и Гематологическом центрах РАМН. Тестирование сывороток крови на наличие антител к белкам литической инфекции (вирус-кап-сидному (BKA) и раннему (РА) антигенным комплексам) ВЭБ проводили в реакции непрямой иммунофлюоресценции (ИФА), как было описано ранее В. Гурцевичем с соавт.(1986). Для выявления антител к TP использовали препараты клеток насекомых SF158, инфицированных ре!$ом-бинантным бакуловирусом, несущим вставку практически полноразмерного гена ТР1 из M-ABA/CBL1 библиотеки кДНК ВЭБ. Клетки SF15B, инфицированные диким типом бакуловируса, использовали в качестве контроля. Рекомбинантный бакуловирус был любезно предоставлен нам проф. Mueller-Lantzsch (Германия). Культивирование клеток и постановку реакции ИФА проводили согласно В. Frech с соавт. (1990).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Ранее в нашей лаборатории предпринимались попытки экспрессии полноразмерного ТР1 в Е. coli на основе различных векторных систем (pLEX, рАТН). Полученные результаты не удовлетворяли необходимым требованиям в силу высокого уровня лротеолнтической деградации и', соответственно, низкого выхода рекомбинантного продукта. Поэтому.в дальнейшем работа шла по двум направлениям: 1) уменьшение размеррв клонируемых фрагментов гена ТР1, что могло бы привести к стабилизации экспрессируемых рекомбинантных белков, на основе вектора рАТН; 2) использование новой векторной системы (pMAL) для клонирования И экспрессии полноразмерного ТР1.

2.1. Конструирование плазмидных клонов, экспрессирувших как ролнораэмерний ТР1, так и отдельные участки его молекулы.

В процессе работы нами была получена коллекция плазмидных клонов, экспрессирующих как полноразмерный ТР1 на основе вектора pMAL, так и различные фрагменты его N- и С-концевых областей .(рАТН-производные клоны). Сайты рестрикции, использовавшиеся для выделения клонируемых фрагментов из исходных плазмидных клонов, указаны на рис. 1. Следует отменить, что при выполнении большинства протоколов мы использовали процедуру лигирования фрагментов ДНК, содержащих "тупые" и "липкие" концы, что позволило нам в ряде случаев упростить процедуру клонирования.Для этой цели при гидролизе Sac I-сайта мы использовали фермент Eel 136II (НПО "Фер-ментас".Вильнюс), являющийся изошизомером Saie I, но генерирующий "тупые" концы.

2.3. Анализ экспрессии рАТЯ-проиэводных клонов, содержащих раз* личные фрагменты W- и С-концевых областей ТР1.

Плаэмидные Клоны, полученные;на основе вектора рАТН, способны' экспрессировать гибридные белки, N-концевая часть которых представлена бактериальной антранилатсинтазой (АС) с мол. массой 37 кДа, а С-концевая область - продуктон клонированной последовательности. Для идентификации экспрессируемых рекомбинантных продуктов лизаты клеток В. coli исследовали как в полиакрйламидном геле после окраски Кумасси, так и в иммуноблоттинге с анти-АС и с гчти-ТР1 сыворотками. Максимальный уровень экспрессии обычно наблюдали на 6-21 часу после добавления индуктора - йндолилакриловой кислоты.

Кинетика экспрессии клонов, содержащих последовательности N-концевой области ТР1, показала, что стабильный тип экспрессии был характерен только для клона р37/5 (рис.2, дор.2), содержащего последовательность 1-го экэона ТР1. Для рекомбинатных продуктов остальных клонов был характерен нестабильный характер экспрессии, когда видимый рекомбинантный белок отсутствовал в Дсн-ПААГ при ок-'раске голубым Кумасси, но мог быть выявлен в иммуноблоттичге. Тем не менее, среди последних следует особо . выделить продукт клона рТА/Э-3 с Мол., массой 74 КДа (дор. 5), поскольку он, по-видимому.

РИС. 1. СХЕМА КЛОНИРОВАНИЯ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ТР1 И ОТДЕЛЬНЫХ УЧАСТКОВ ЕГО N- И С-КОНЦЕВЫХ ОБЛАСТЕЙ а — вектор рАТН , б - вектор pMAL

Nco I Avo Ш

а)

1U549/5. 1437

£с1136 К BsuRi Pvull Ehe)

Г

P*8/Î6. 780 п.в.

Ehel

BomHI ВдШ

G27-14. 803 вд. I

cTA/2-8. 6«9 пж

pKH-2. 196 П.В.

B»uPJ

Ehel

PÎ7/5, 303 пл.

gTA/3-3. 720 n.B.

0

1

Eci 13€ IlSno l

б) С

1)549/5,1437 п.н

"W"------

Avo U

gTA/4—5. '437 п и

рТА/5-ю. 1437 na.

I ■ , ШЖШМЯ]

Размеры клонируемых фрагментов TPI указаны в п.н. Штриховкой выделена, последовательность гена TPI. Белыми блоками указаны последовательности плазмиды рАТН и фрагмента геномной ДНК

обладает промежуточным характером экспрессии. Интенсивность его выявления как анти-АС (не показано), тах и анти-ТР1 сыворотками значительно выше, чем при выявлении продуктов клонов рТА/1-5 (мол. масса 60 кДа, дор. 3) и рТА/2-8 (мол. масса 72 кДа, дор.4). В им-муноблоттинге анти-ТР1 сыворотка выявляла также белки в диапазоне от 48 до 63 кДа, которые, вероятно, является продуктами деградации указанных выше полноразмерных рекомбинантных продуктов.

Рис.2. Анализ экспрессии рАТН-производных клонов, содержащих различные участки N-концевой области ТР1. Иммуноблоттинг с ан-ти-TPl сывороткой. 1 - контроль рАТН. 2 Г- клон р37/5, 3 г* клон рТА/1-5, 4 - клон рТА/2-8, 5 - клон рТА/3-3. Распределение маркеров молекулярной массы указано слева; положение экспрессируемых продуктов - справа.

Следует отметить, что рекомбинантные продукты полученных клонов аномально мигрировали в ДСН-ПААГ, что приводило к завышению элект-рофоретической оценки их мол. масс,.возможно, вследствие увеличения содержания пролина в укороченных вариантах молекулы ТР1.

При индукции ' клонов, содержащих фрагменты С-концевой области TP,, в ДСН-ПААГ легко выявлялись основные продукты экспрессии с мол. массами 34 (рКН-1) и 39 (рКН-2) кДа, что значительно ниже

расчетных иол. масс полноразнерных рекоибинантных белков (65 и 44 кДа, соответственно)."иммуноблоттинг с антн-АС сывороткой показал, что в процесса индукции появлялись белки с мол. массами, близкими к расчетным, однако интерпретировать полученные данные оказалось сложно, поскольку уровень акспрессиии этих белков был чрезвычайно низким. В иммуноблоттинге с анти-TPl сывороткой уточнить характер экспрессии не удалось - сыворотка в основном не реагировала с прр-дуктами этих клонов.

Для снижения протеолнэа рекоибинантных белков, ркспресснрован-ных в векторной системе рАТИ, мы использовали Lon- штамм SG21063 Е. coll, который является дефектным по La-протеэзе. В результате анализа экспрессированных в SG21063 штамма В. со11 гибридных белков, было установлено, что характер протеолитической деградации не изменился. Таким образом, протеолиз рекоибинантных белков, по-видимому, не обусловлен активностью Ьа-протеазы и зависит от других бактериальных протеолитических систем.

2.3. Анализ экспрессии полнораонарного ТР1 а векторной сиатмв EMMlx. ■

Векторная система pMAL предназначена для экспрессии и эффективной одноэтапной очистки рекомбинантных' белков путей аффинной .хроматографии на колонках, содержащих анилозу. Полученные на основе векторной системы pMAL плазнидные клоны способны окспрсссировать гибридные белки, N-концевая область которых представлена нальто-зосвязывающим белком с иол. массой 42 кДа, а С-концевая область -продуктом клонированной последовательности.

Полученные в нашей работе плазнидные клони рТА/4-5 (на основа вектора pMALc) и pTA/5-lo (рМАЬр-пронэводный клон) были проанализированы на способность экспрессировать рекомбинанткыЛ белок в процессе индукции в иммуноблоттинге с анти-TPl сывороткой. На pvtc. 3 представлена кинетика индукции клона рТА/4-5сконструированного на основе вектора pMALc. В качестве контроля показана кинетика экспрессии дикой плазмиды pHALc (рис.3, а). Как видно на рис.3, б, максимум экспрессии полнораэмерного реконбинанткого белка приходился на 1 ч после начала индукции и его молекулярная иасса соот-

ветствовала расчетной (93 кДа). Выход.рекокбинантного белка был удовлетворительным, хотя и имела. место его протеолитичвская деградация, продукты которой обнаруживались в'иммуноблоттингв и аккумулировались в зоне 52-90 кДа.

..... а ■ ¿Г

чз~ ■ 29- •

О f 2 3 0 1 2 3

Время ,ч

Рис.3. Кинетика индукции продукта клона рТА/4-5. Иммуноблоттинг с анти-TPl сывороткой, а - контроль pMALc, б - клон рТА/4-5. Внизу указано время в часах от начала индукции. Распределение маркеров молекулярной массы указано слева, положение экспрессируемых продуктов - справа.

Мы предполагали, что использование секретирующего варианта вектора pMAL, возможно, будет способствовать приобретению белкой дополнительных потенций для встраивания в мембрану Е. coli. В таком случае* вероятно, можно было бы ожидать стабилизации рекомбинант-ного белка, который, будучи встроенным в цитоплазматическую немб-рану, становился бы менее доступным для цитоплазматических проте-аэ. Кинетика индукции клона рТА/5-10 на основе вектора pMALp показала, что рекомбинантный продукт этого клона действительно подвергался протеолитической деградации в меньшей степени, чем продукт

клона рТА/4-5, однако выход его был значительно ниже, чей в случае pMALc-производного клона (не представлено).

Поскольку вектор pMAL сконструирован с расчетом на выделение ре-комбинантных белков путем аффинной хроматографии,-то нам необходимо было установить наличие рекомбинантного ТР1 в растворимой фракции клеток Е. coli. Результаты определения растворимости продуктов клонов рТА/4-3 и рТА/5-10 приведены на рис. 4. Полноразиерный реконбн-нантный ТР1 (93 кДа), экспрессировашшйвв векторе pHALc, а также продукты его деградации находились в клетке как в растворимой (рис. 4, а; дор. 4), так и в нерастворимой (рис. 4, а; дор.6) форме примерно в равных соотношениях. Полноразиерный рекомбинантный белок, экспрессированный в pMALp векторе (рис. 4, б), находился а клетке в основном в нерастворимом состоянии (рис, б; дор.б), что соот-

ветствовало нашим предположениям о возможности дополнительного

о

встраивания рекомбинантного белка в мембрану клеток Е- coli.

а $

Sj _ Ш Lü Б

_ 18.... 5» '

-53

43 -

/

29*

1 2 VJ Ч 5 S 1 2 3 4 5 6

. Рис.4. Определение растворимости рекомбинантных белков, зкс-прессированных в векторе pMAL. Иимуноблоттинг с анти-TPi сыворот- ' кой. а - кяон рТА/4-5, б - клон рТА/5-10. 2- тотальный яизат клеток К. coli, трансформированных соответствующими реко.чбинантншш< плаэмидами; 4 - растворимая фракция, 6 - нерастворимая фракция. 1, 3, 5 - аналогичные фракции клеток В. coli, трансформированных диким вектором рНАЬ. Распределение маркеров молекулярной нассы указано слева, положение рекомбинантных белков - справа.

Для объяснения различий в характере экспрессии и физико-химических свойствах рекомбинантных продуктов, полученных на основе векторной системы pMAL, было проведено фракционирование клеток В. соИ, трансформированных соответствующими рекомбинантными плазми-дамн. Рекомбинантные продукты клонов рТА/5-10 и рТА/4-5 определялись как в мембранной, так и в цитоплаэк&тнческой фракциях (не представлено). В мембранных фракциях определялись как полнораэмер-ныа рекомбинантные белки с мол. массой 93 кДа, так и продукты их деградации, аккумулированные, главным образом, в диапазоне от 52 до 93 кДа. Визуальная оценка и денснтометрический контроль показали, что более обогащенной рекоибинантным белком оказалась мембранная фракция клеток Е. coli, трансформированных плазмидным клоном рТА/4-5 на основе вектора pMALc, в то время как рекомбинантные продукты клона pTA/5-Ю локализовались преимущественно в цитоплазме, вероятно, а виде нерастворимых белковых включений.

г.4, Исследование сывороток кооэи Рольных ВЭБ-ассоииироаанныхи и наассоииированными заболеваниям на наличие антител к TP ВЭБ.

Следует отметить, что выделение и изучение различных гистологических форм рака носоглотки представляется весьма важной задачей, поскольку это связано с их различным клиническим течением, прогнозом и лечением. Ранее в нашей лаборатории был разработан метод дифференциальной диагностики нРНГ, основанный на определении уровня антител к белкам литической инфекции ВЭБ. Этот метод находит широкое применение в клинической практике, особенно в диагностически сложных случаях, и позволяет достоверно выделить группу больных нРНГ. Однако прогностические возможности этого теста ограничены, поскольку уровень антител к белкам литической инфекции ВЭБ отличается некоторой стабильностью и может оставаться неизменным в течение достаточно длительного срока после лечения. Поэтому поиск диагностических и прогностических маркеров нРНГ является крайне актуальной задаче**.

На наличие антител к ВЭБ в реакции непрямой имнуиофлуоресценцни было протестировано 212 сывороток крови от, больных раэличныни формами ВЭБ-ассоциироваиных заболеваний (нРНГ - 89 случаев, иифекци-

□нный мононуклеоэ - 10 случаев, лимфогранулематоз - 10 случаев), а также здоровых доноров крови (20 случаев) и больных с ВЭБ-неассо-циированными заболеваниями, сопровождающихся, однако, повышением титров антител к белкам литической инфекции ВЭБ (линфоадонопатии неясной этиологии - 20 случаев, ревматоидный артрит - 20 случаев, плоскоклеточный рах носоглотки - 31 случай, плоскоклеточный рак миндалин, гортани и ротоглотки"- 7 случаев. Следует отметить, что в число 89 больных нРНГ вошли .40 больных, обследовавшихся в нашей лаборатории ранее, что дало нам возможность впервые изучить гуморальный иммунный ответ к ТР как у пациентов с ремиссией свышо 5 лет, так и у больных, умерших впоследствии от прогрессирования этого заболевания.

Проведенное исследование показало, что антитела к ТР выявлялись только в'группе больных нРНГ примерно в 40* случаев. Факт выявления антител к ТР только у больных нРНГ является уникальным, поскольку антитела к другим латентным белкам 8ЭБ (ЕВИА-2, ШР) также выявляются в сыворотках крови больных нРНГ, но они могут присутствовать и в сыворотках крови как больных различными ВЭБ-ассоЦииро-ванными заболеваниями, так и сыворотках крови здоровых людей. Тем не менее, выявление антител к ТР только в 40% случаев нРНГ предполагает, что использование данного теста в диагностических целях, вероятно, не представляется целесообразным, хотя он может быть полезен в качестве подтверждающего теста в диагностически сложных случаях нРНГ.

2.5. Прогностическое значение антител к ТР ВЭБ У больных нРНГ.

Для изучения возможной прогностической значимости выявления антител к ТР мы попытались соотнести наличие или отсутствие антител к ТР в сыворотке крови больных нРНГ до лечения и клиническим течением болезни. На рис. 5 представлены данные клинического течения болезни в группах ТР-позитивных и ТР-негативных до лечения больных нРНГ'. В процессе наблюдения были выявлены следующие тенденции. Полный клинический эффект проведенного лечения в целом оказался выше в группе ТР-негативных до лечения больных. Из 15 пациентов, в сыворотке крови которых не выязлялись антитела к ТР до лочения, 13

РИС. 5. ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ НАЛИЧИЕМ АНТИТЕЛ К ТР И КЛИНИЧЕСКИМ ТЕЧЕНИЕМ БОЛЕЗНИ

ТР-позитивные больные

ТР—негативные больные

(п=15)

рецидив 27%

<0 ремиссия 40%

нет рециссии 33%

(п=15)

ремиссия 81%

■

<я

нет ремиссии 13% рецидив 6%

пациентов (87Х) вышли в ремиссию после проведенного лечения на срок не менее 1 года и у двух больных (13Х) прогноз заболевания представляется неблагоприятным вследствие развития отдаленного не-тастазирования. В то же время в группе ТР-позитивных больных отсутствие эффекта проведенного лечения было выявлено у 5 из 15 больных (33%), и 10 пациентов вышли в ремиссио на срок ив менее 1 года (67%)-

Дальнейшее наблюдение за больными, вышедшими в ремиссию после проведенного лечения, показало, что в группе ТР-позитивных до цвг чения больных частота возврата болезни (рецидива) превышает таковую в группе ХР-негативных до лечения больных. Так, х настоящему времени рецидив опухоли (в среднем через два года после проведен-? ного лечения) выявлен у 4 из 10 ТР-позитивных до лечения больных с полным клиническим эффектом проведенного лечения, в то время как из 13 ТР-негативных до лечения больных, вышедших в ремиссию после проведенного лечения, в течение того же срока наблюдения только у одного больного был выявлен локализованный рецидив опухоли.

Таким образом, создается впечатление, что присутствие антител к ТР в сыворотке крови больных нРНГ до лечения является настораживающим фактором, и эта группа больных требует более строгого клинического контроля. Отмеченные нами тенденции, тем не менее, не являются статистически достоверными, возможно, вследствие недостаточного числа наблюдений. Работа в этом направлении продолжается.

2.6. Исследование динамики уровня антител к ТР е процессе лечения.

Для оценки прогноза, по-видимому, необходимо учитывать такой фактор, как эффективность проводимого лечения для каждого больного. Поэтому в дальнейших исследованиях мы изучили индивидуально гуморальный иммунный ответ к ТР у больных нРНГ в динамике - до лечения, через 3 мес. после проведенного лечения и в период ремиссии, где это было возможно. В обследование были включены две группы больных: а) пациенты, вышедших в ремиссию после проведенного лечения (рис. 6, а). В эту группу вошли 3 пациента со сроком ремиссии более.5 лет и 5 пациентов со сроком наблюдения больше 1 го-

Рис. 6. Динамика уровня антител к ТР в группах больных:

а) с полным клиническим эффектом проведенного лечения;

б) с прогрессирующим течением заболевания.

а 1

и 2

до лечения после лечения

Ьп(Т) - логарифмическое значение титров антител 1-8 - пациенты, обследоаабшиеся в данном наблюдении

да, но менее 5 лет; 6) больные с прогрессирующим течением болезни (рис. 6, б). В группу больных с прогрессирующим течением болезни вошли 4 больных в момент рецидива и 4 первичных больных, умерших впоследствии или имевших неблагоприятный "прогноз вследствие развития отдаленного метастазирования.

Как следует из представленных данных, в группе из S пациентов, вышедших в ремиссию после проведенного лечения на срок не менее 1 года, уровень антител к ТР понижается после лечения. Более того, в период ремиссии уровень этих антител становится практически неопределяемым. Так, при обследовании 12 больных без признаков рецидива и метастазов, антитела к ТР не были выявлены ни в одном случае (на рис. 6 данные не представлены). В то же время уровень антител к ТР э группе больных с неблагоприятным течением болезни имеет тенденцию к повышению. Используя параметры логнормального распределения было показано, что отношения логарифмов титров антител к ТР до и после лечения в двух обследованных группах • статистически различны. Таким образом, динамика титров антител к ТР в процессе лечения, по-видимому, может служить показателем, отражающим клиническое течение болезни, и может использоваться в клинике для оценки прогноза больных нРНГ.

В процессе наблюдения у нас создалось впечатление, что наличие антител к ТР у больных нРНГ до лечения коррелирует с тяжестью клинического течения болезни. Однакр нам не удалось выявить зависимость между наличием антител и распространенностью опухолевого процесса, а так же степенью вовлеченности в патологический процесс регионарных лимфоузлов. Таким образом, наличие антител к ТР у больных нРНГ, вероятно, вряд ли может быть объяснено антигенной нагрузкой первичной опухоли, как' и в случаях с другими латентными белками ВЭБ.

2.7. Исследование направленности гуморального иммунного ошееша к конкретным эпитопап нолвкулы ТР1,

К настоящзму моменту в литературе отсутствуют данные о получении поли- и моноклоиальных антител, которые позволяли бы изучить ■ .'экспрессию высокогидрофобного ТР2 в инфицированных ВЭБ клетках, ' а

также экспрессию белков ТР в клетках рака носоглотки. Для того, чтобы проанализировать возможные причины неудач, мы провели предварительную иммунологическую характеристику молекулы TPI, а именно: выявили участки белка, с которыми реагируют антисыворотка кролика к TPI, а также сыворотки крови больных, содержащие анти-ТР антитела. Для этой цели мы проводили преинкубацию исследуемых сывороток с рекомбинантными вариантами ТР1 на основе вектора рАТН: продуктом первого зкзона ТР1 (клон рЭ7/5)и продуктом клона U549/5, соответствующим практически полноразмерному белку ТР1, использованным как в нативной, так и в денатурированной форме (табл. 1).

Эти исследования показали, что иммунная анти-TPl сыворотка кролика истощалась и продуктом, кодируемым первым экзоном, и полноразмерным белком независимо от их конформации. Однако после истощения продуктом первого экзона анти-TPl сыворотка кролика уже не реагировала с полноразмерным белком, что свидетельствует о том, что гипериммунная сыворотка кролика содержит антитела, направленные преимущественно к продукту первого экзона ТР1.. ТР-позитивная сыворотка бального нРНГ истощалась только полноразмерным белком в нативной форме, и не истощалась как полноразмерным белком в денатурированной форме, так и продуктом первого экзона. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела чёло'века к ТР направлены к конформационно-эависимому эпитопу (эпитопам) в гидрофобией транс-кембранной части молекулы.

Для более точной локализации эпитопов ТР1, распознаваемых антителами человека к ТР, мы дополнительно использовали делецированные варианты рАТН-производных клонов, содержащие различные участки N-и С-концевых областей ТР1..Как следует из табл. 1, сыворотка крови человека не истощалась рекомбинантными продуктами клонов, содержащими С-концевые участки ТР, а истощалась только нативным продуктом клона рТА/3-3, соответствующем наиболее полноразмерному полипептиду N-концевой области ТР1. Таким образом, сыворотка крови человека, вероятно, способна распознавать конформациоино-эависимыи эпи-топ (эпитопы), локализующиеся в пределах первых четырех трансмембранных доменов молекулы ТР1, как это продемонстрировано на рис. 7.

Табл.1. Анализ направленности гуморального ответа больных нРНГ к эпитопам молзхулы ТР1.

Продукт клока Конформацня Эффект истощения «IfTH-TPl сьонки кролика Эффект истощенна ТР-П031ГПШ. СЫИ01 человека

U549/5 (18-497 ам.к.) Д* н** + + +

р37/5 (18-119 ам.к.) д H + + -

рТА71-5 (1-146 ам.к.) H -

рТА/2-8 ('-2)6 ам.к.) H -

рТА/3-3 (1-239 ам.к.) д H +

pKH-i (240-497 ам.к.) H •■» -

Д* - денатурированная форма полипептида

н" - нативная форма полипептида

Рис. 7. Схематичесхое представление предполагаемой структуры ТР1 в цитоплаэматической мембране ВЭБ-инфицированной клетки (по Longneker et. al., 1993),

1-497 - аминокислотная последовательность ТР1. Стрелками указаны границы полипептидов, соответствующих рекомбинантным продуктам, экспрессьрованным в плаэмидных клонах: 1 -рТА/1-5; 2 - рТА/2-8; 3 - рТА З-.З.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ .

Таким образом, в результате проведенных исследований получена коллекция рАТН-проиэводых клонов, экспрессирующих делецироваиные варианты молекулы ТР1, которая позволила нам проанализировать стабильность и антигенность отдельных участков белковой молекулы, а так е оценить направленность анти-ТР антител разного происхождения к конкретным эпитопан молекулы ТР1. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что Н-концевая область ТР1 в целом является более антигенной и подтверждают предположения других исследователей об отсутствии антигенных участков в с-концевой области ТР. Причем характер реакции с анти-TPl сывороткой позволяет предположить, что наибольший вклад в формирование линейных эпитопов молекулы белка, по-видимому, вносят участки , кодируемые 1-м экзоном.

В свете полученных данных о направленности анти-ТР антител человека и животных к разным участкам молекулы ТР1, нам стали понятными причины неудач по выявлению антител к ТР у больных нрнг в стандартном иммуноблоттинге, проводящемся в денатурирующих условиях. Между тем, разработка иной тест-системы для скрининга анти-ТР антител человека (иммуиоблоттинг в нативных условиях и/или elisa) представляется достаточно важной задачей, поскольку единственный существующий на сегодня метод на основе бакуловирусной системы, используемый и в настоящей работе, не свободен от некоторых недостатков. Для проведения дальнейшей работы в этом направлении, а также для получения антител к гидрофобной части белка нам кажется перспективным использование продукта клона рТА/3-3, содержащего 62-782 п.н. фрагмент N-концевой области ТР1, который обладает рядом преимуществ, сыворотки крови человека практически не содержат антител к антранилатсинтазе - бактериальной части этого рекомби-нантного ёелка , что позволяет решить проблему кросс-реактивности. Кроме того, можно ожидать, что данный делецированный вариант ТР1 будет '"олее гидрофильным по сравнению с полноразмерным белком.

На основе вектора pMALc был получен клок (рТА/4-5), содержащий последовательность практически полноразмерного ТР1, представляы-щийся нам весьма перспективным для получения в препаративных количествах растворимого белкового продукта, который достаточно легко

может быть выделен из бактериг. 1ьного лиз .та путем аффинной хроматографии. Немаловажно, что при получении клона рТА/4-5 область полилинкера, узнаваемая протеолитическим фактором Ха, осталась ин-тактной, что позволяет отщепить бактериальную часть рекомбинантно-го продукта и получить полипептид, соответствующий полноразмерному ТР1, в дискретном виде. Также хотелось бы отметить, что использование нами вектора pMAL для клонирования полноразмерного белка оказалось особенно удачным в свете полученных данных о наличии в молекуле конформационно-зависимых эпитопов, поскольку йредус-мотренное для этой системы выделение рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии по сродству, вероятно, позволит нам получить требуемый продукт в нативной форме, не прибегая дополнительно к методам ренатурации.

Таким образом, в результате проведенных исследований мы создали необходимую базу для проведения дальнейшей работы, направленной на изучение экспрессии белков ТР в биопсийном материале больных нРЫ, а также на создание иной тест-системы для скрининга сывороток крови человека на наличие антител к ТР.

В ходе проведения клинических исследований были сделаны следующие наблюдения. Выявление антител к ТР в сыворотке крови больных нРНГ не коррелирует с распространенностью первичного опухолевого процесса. По предварительным данным, частота неудач лечения и возврата болезни (рецидива) оказались выше в группе больных, в сыворотке крови которых до лечения выявлялись антитела к ТР ВЭБ. Изменение уровня антител к ТР в процессе лечения является фактором, отражающим, по-видимому, клиническое течение болезни и индивидуальный ответ больного на пр введенное лечения, эти данные позволяют предполагать перспективность применения этого теста в клинике для мониторинга и оценки прогноза больных нРН*". Работа в данном направлении продолжается.

ВЫВОДЫ

L) На основе вектора рАТН получена коллекция клонов, экспрессирую-щих. различные участки N- и С-концевых областей ТР1. Данная коллекция была использована для изучения стабильности отдельных фрагментов белка, а также для иммунологического картирования ыолекулы ТР1.

i) Разработаны подходы для эффективной экспрессии полноразмерного TPi в клетках Е. coli на основе вектора pMALc. Полученный плаз-мидный клон рТА/4-5 дает возможность получения в препаративных количествах растворимого белкового продукта, который достаточно легко может быть выделен из бактериального лизата путем аффинной хроматографии. I) Из гетерогенной группы больных ВЭБ-ассоциированными и не ассоциированными заболеваниями антитела к TP выявляются только у больных нРНГ с частотой около 40Х случаев. I) Изменение уровня антител к TP в процессе лечения отражает его эффективность, что, вероятно, может быть использовано в клинике для мониторинга и оценки прогноза больных нРНГ. S) Анти-ТР сыворотка кролика и сыворотки крови человека, содержат щие антитела к TP, реагируют с разными участками молекулы ТР1. Анти-ТР антитела больных нРНГ распознают конформационно-зависи-мый эпитоп(ы), располагающиеся в пределах первых четырех трансмембранных доменов молекулы ТР1, в то время как антисыворотка кролика к ТР1 реагирует с гидрофильной N-концевой частью белка, кодируемой 1-м экэоном гена ТР1 ВЭБ.

список шучшос работ, опубликованных по теме диссертации :

1) Afanasyeva ™.А., Kistoglu H., Pavlish O.A., Stepina V.N., ïurtsevich V.E.: Expression of EBV terminal jirotein 1 in procaryo-:ic system and its preliminary immunological analysis. Report at i-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviru-ies", St.-Petersburg, Russia, November 29-December 3, 1993, p. 26.

2) Afanas'eva T.A., Pavlish O.A., Kistoglu Kh., Gurtsevich f.Z.: Expression of Epetein-Barr virus Terminal Repeats Protein 1 In Escherichia coli. J. Mol. biology, 1994, Vol. 28, N 5, Part 2,

pp. 691-696.

3) Afanasyeva т., Kondratyeva Т., Steplna V., Gurtsevlch V.: The mapping of the EBV terminal protein epitope recognized by human antibodies. Abstracts of the 22nd European Congress of Cytology. Э. of Clinical cytology and Cytopathology, 1994, Vol. 38, p. 621.

4) Белоусоаа H.B., Афанасьев^ Т.А., Кондратьева Т.Т., Пробатова и.А., Сталина В.Н., Михайлова Н.А., Гурцевич в.Э.: опухоли головы и шеи. р-агностика, лечение: Материалы Всероссийской конференции. / Под редакцией Б.Н. Зырянова. - Тонек, 1994. - стр. 19-20.

5) Т. Afanasyeva, V. stepina, N. Belousova, Т. Kondratyeva, V. Gurtsevitch: The immune response to terminal protein of Epste-in-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma patients. Abstracts of the XXI Meeting of the European tumor virus group. Э. of Cancer Research and clinical Oncology, 1995, Vol. 121, p. in.

6) Афанасьева т.А., Белоусова H.B., Кондратьева Т.Т., Пробатова Н.А., Степина В.Н., Михайлова Н.А., Павлиш О.А., Щербак Л.Н., Алг-ев Б.М., Алферов B.C., Гурцевич В.Э.: Иммунный ответ к белку терминального повтора вируса Эпштейна-Барр у больных недифференцированным раком носоглотки. Бюллет. эксперим. биологии и медицины, 1995, N3, стр.311-314,

7) Stepina V.N., Afanasyeva Т.Д./ Gurtsevitch V.E.: Epste-in-Barr virus and lymphoproliterative diseases. Abstracts of the 3-rd international Conference "AIDS, Cancer and Related Problems". St. Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, p. 70.

Автор выражает серДечн>.о благодарном' научному руководителю доктору медицинских наук В.3. гурцевичу за ценные советы в процессе исследования.

Приношу глубокую благодарность•доктору мед. наук В.Н. Степиной и канд. мед. наук.о.А. Павлишу за методическую помощь в процессе выполне-чя работы, а также канд. мед. наук Т.е. Бобровой и канд. биол. наук О.А. Мизениной за критические замечания при обсуждении,

результате^..

\ Участок множительной техники ОНЦ РАМН

: Поли к печати 23.2,36 Заказ 3 и ' - , Тирлж 1 00, экз.