Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Генодиагностика рака

На правах рукописи

КОНДРАТОВА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ГЕНОДИАГНОСТИКА РАКА: ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ В ДНК ТКАНЕЙ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 СЕН 2015

Москва - 2015

005562396

005562396

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор - академик РАН, профессор М.И. Давыдов)

Научный руководитель;

Лихтенштейн Анатолий Владимирович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией биохимии опухолей научно-исследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Официальные оппоненты:

Владимирский Михаил Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунологических исследований и молекулярной диагностики туберкулёза научно-исследовательского института фтизиопульмонологии, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ягужинский Лев Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией структуры и функции мембран научно-исследовательского института физико-химической биологии

имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр"

Защита диссертации состоится « » 2015 года в /О часов на

заседании диссертационного совета Д 001.017.02 при ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С текстом диссертации можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru.

Автореферат разослан .2015 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д001.017.02

доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Ю.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Циркулирующие в кровотоке внеклеточные нуклеиновые кислоты стали в последние годы - объектом пристального внимания клиницистов и экспериментаторов в качестве перспективных опухолевых маркеров. В крови онкологических больных вначале были обнаружены происходящие из опухолевых клеток фрагменты ДНК с характерными аберрациями (мутантный онкоген K-A4S, измененные микросателлитные последовательности, метилированные СрО-островки в промоторах генов-супрессоров), а затем -«опухолевые» мРНК и микроРНК [Schwarzenbach et al., 2011].

Тестирование плазмы крови онкологических больных на предмет присутствия в ней ассоциированных с опухолевым ростом ДНК служит нескольким целям. Во-первых, такая «жидкостная биопсия» (liquid biopsy) [Diaz et al., 2012] становится необходимой в тех случаях, когда присутствующий в биоптате клон мутантных клеток, ответственных за лекарственную устойчивость опухоли, количественно незначителен. Во-вторых, одиночный биоптат обычно не дает полного представления о клональной гетерогенности и мутационном «профиле» всей опухоли [Gerlinger et al., 2012]. В-третьих, жидкостная биопсия, будучи малоинвазивным подходом, может выполняться многократно и до и после удаления опухоли, что позволяет следить за ходом заболевания и оценивать эффективность лечения. Вместе с тем, этот многообещающий подход технически довольно труден, поскольку «опухолевые» нуклеиновые кислоты присутствуют в крови в низких концентрациях, сильно фрагментированы и разведены обычно избытком последовательностей дикого типа. Эти обстоятельства предъявляют высокие требования к методам их выделения и анализа.

Цель исследования

Целью данной работы явилось совершенствование некоторых уже существующих и разработка новых подходов «жидкостной биопсии» онкологических заболеваний.

Задачи исследования

1. Разработать метод количественного выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма.

2. Разработать способ количественной денситометрии ДНК.

3. Сопоставить методы сканирования мутаций и выявить пригодные для клинического применения.

4. Сопоставить серологические и генетические маркеры опухолевого роста при жидкостной биопсии рака полости рта.

5. Оценить значимость транскриптов сателлитных ДНК в качестве маркера опухолевого роста при жидкостной биопсии рака толстой кишки.

Научная новизна Впервые оказано присутствие в плазме крови человека гетерогенной популяции некодирущих РНК, транскрибируемых на перицентромерных многократно повторяющихся сателлитных последовательностях НБАТЛ и ОЗАТП. В пилотном исследовании впервые обнаружены статистически значимые различия в соотношении транскриптов НБАТЛ/ОЗАТЛ в плазме крови здоровых доноров и онкологических больных (рак толстой кишки). Этот показатель (соотношение экспрессии НБАТИ/СБАТП) может служить маркером опухолевого роста и быть использованным для мониторинга заболевания.

Практическая значимость работы

1. Разработан метод изотахофореза для количественного выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма.

2. Разработан денситометрический метод определения концентрации ДНК.

3. Проведено сопоставление числа копий ДНК ВЭБ в плазме крови больных раком носоглотки и другими опухолями полости рта (содержание в крови вирусных последовательностей характеризует активность процесса). Плавление вирусных ампликонов обнаруживает в ряде случаев их возможный полиморфизм.

4. Впервые получены данные о возможной диагностической значимости присутствующих в крови сателлитных РНК.

Апробация работы

Диссертация была апробирована 28 мая 2015 года на совместной научной конференции лабораторий биохимии опухолей, молекулярной эндокринологии, вирусного канцерогенеза, молекулярной биологии вирусов, генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».

Структура и объем работы Диссертация изложена на 107 стр. машинописного текста, содержит 20 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, публикации, список литературы (210 источников).

Публикации

18 печатных работ, в том числе 13 статей в журналах, рекоменованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проанализирована отечественная и иностранная литература, проведены эксперименты, статистически обработаны и интерпретированы их результаты, сформулированы конечные выводы.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно пунктам 1, 2,3.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод изотахофореза нуклеиновых кислот, обеспечивающий их количественное выделение из биологических жидкостей организма.

2. Оределение числа копий вирусной ДНК в плазме крови больных раком носоглотки — эффективное средство мониторинга опухолевого роста.

3. В плазме крови человека присутствуют сателлитные РНК (НБАТП и ОБАТЛ), соотношения которых различны у здоровых лиц и больных раком толстой кишки; этот показатель может служить новым маркером опухолевого роста.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Объект исследования: удаленная хирургическим путем нормальная и опухолевая ткань (10 больных аденокарценомой прямой и толстой кишки) и образцы крови онкологических больных (48 раком носоглотки, 9 раком толстой кишки, 78 больных другими опухолями полости рта, ДОПР), проходивших лечение в ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», а также образцы крови 120 здоровых доноров.

Образцы крови (~5 мл) собирали в сосуды, содержащие ЭДТА, центрифугировали 10 мин при 1500xg и комнатной температуре, после чего клетки осаждали и аликвоты плазмы хранили при 60°С.

Нуклеиновые кислоты выделяли из тканей и плазмы крови депротеинизацией фенолом, хлороформом, гуанидинизотиоцианатом. Концентрацию определяли спектрофотометрическим (Nano-Drop 1000; Thermo Scientific, USA) или спектрофлуориметрическим (Plate Reader Chameleon V multilabel counter, Hidex Oy, Turku, Finland) методами.

Для анализа нуклеиновых кислот использовали следующие методы: электрофорез в геле агарозы или полиакриламида; изотахофорез; ПЦР в реальном времени; ОТ-ПЦР в реальном времени; плавление ампликонов (на приборах BioRad iQ5 и CFX96, USA). Для выявления мутаций K-RAS применяли секвенирование по Сэнгеру, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorpliism), SSCP (Single Strand Conformation Polymorpliism), HRMA (High Resolution Melting Analysis), NIRCA (Non-Isotopic RNA Cleavage Assay), Surveyor.

В ходе выполнения диссертационного исследования разработаны новые методические приемы: изотахофорез нуклеиновых кислот в полужидкой агарозе и количественная денситометрия ДНК.

Результаты исследования и обсуждение 1. Изотахофорез нуклеиновых кислот

Любое исследование нуклеиновых кислот предполагает в качестве первого этапа их выделение, от полноты которого в значительной мере зависит его успех: потери, особенно избирательные, могут исказить конечные результаты. Величина выхода критически важна при исследовании ДНК из «бедных» источников, в частности, плазмы крови. Используемые сегодня методы не учитывают, однако, специфических особенностей данного объекта (низкого содержания и фрагментации молекул) и не обеспечивают количественного выхода ДНК, следствием чего являются разброс и противоречивость конечных результатов (Sozzi et al., 2003¡Herrera et al., 2005;van der Vaart ét al., 2010).

В данной работе мы разработали оригинальный метод количественного выделения нуклеиновых кислот посредством изотахофореза (ИТФ).

1.1. Теоретическое обоснование метода

В неоднородном поле, в системе с общим катионом (Tris"*) и разными анионами (ведущим быстрым СГ - в анодном буфере и замыкающим медленным Р-аланином' - в катодном), формируется подвижная, движущаяся к аноду граница. В ней анализируемые молекулы располагаются друг за другом в виде узких полос в порядке убывания их подвижности (Abelev and Karamova, 1984).

В отличие от белков, нуклеиновые кислоты имеют одинаковую подвижность (отрицательный заряд фосфатных групп равномерно распределен по длине полимера) и в отсутствие сопротивления среды (агарозного или полиакриламидного геля) движутся независимо от длины с одной скоростью. В соответствии с величиной своей электрофоретической подвижности, промежуточной между таковой анионов хлора и р-аланина, все нуклеиновые кислоты (большие и малые, одно- и двуниетвые, РНК и ДНК) должны концентрироваться в зоне подвижной границы в виде одной полосы. Это предположение легло в основу предлагаемого нами метода.

1.2. Практическая реализация метода

На рис. 1 представлена принципиальная схема ИТФ в двух вариантах исполнения: (А) в трубке из кварцевого стекла и (В) в самодельном устройстве, состоящем из наконечника микропипетки и тефлонового капилляра.

Рис. 1. Схема ИТФ.

(A) ИТФ в стеклянных трубках. Нижняя часть стеклянной трубки заполнена 0,1% агарозным гелем, приготовленным на анодном буфере. Над гелем диализованный образец ДНК (~1 мл). Оба конца трубки закрыты диализной пленкой. Верхняя камера заполнена катодным буфером, нижняя камера - анодным буфером. 1 - образец ДНК; 2 - 0.1% гель агарозы; 3 - катодный буфер; 4 - направление миграции молекул; 5 - анодный буфер.

(B) ИТФ в капиллярном агарозном геле (внутренний диаметр трубочки 2 мм). 1 - образец ДНК (1 мл); 2 - трубочка заполнена 0,1% агарозным гелем, приготовленным на анодном буфере; 3 - катодный буфер; 4 - направление миграции молекул; 5 - анодный буфер.

В описанных условиях все нуклеиновые кислоты «сводятся» в одну полосу, движущуюся непосредственно перед БФС (рис. 2,А и 2,В), в отличие от обычного электрофореза, при котором ни образования полосы, ни концентрации молекул не происходит (ср. рис. 2,С и 2,Б). Поскольку аккуратное извлечение полосы нуклеиновых кислот из длинных стеклянных трубок крайне затруднительно, было применено простое самодельное устройство (рис. 2,С), которое, во-первых, позволяет сконцентрировать нуклеиновые кислоты в минимальном объеме и, во-вторых, легко их выделить (нужный сегмент тефлонового капилляра иссекают и содержимое получают коротким центрифугированием.

А

В

ABC D

12 12 12 I

Рис. 2. ИТФ ДНК в трубках агарозного геля.

(A-D) ДНК (100 нг в 1 мл диализованного раствора) концентрировали в стеклянных и пластиковых трубках. Распределение «свидетеля» (ВФС) наблюдали в видимом свете (изображения № 1), распределение ДНК - в УФ свете (изображения № 2).

(A) ДНК перед ИТФ (в стеклянной трубке).

(B) ДНК после ИТФ (окраска бромистым этдием).

(C) ДНК после ИТФ в тефлоновом капилляре (отмечен участок иссечения трубки; окраска SYBR Gold).

(D) Электрофорез ДНК в гомогенном поле (буфер - 12 мМ Трис-(3-аланин, рН 8,6).

По результатам спектрофлуорометрческого анализа ИТФ обеспечивает практически 100%-ный выход ДНК, тогда как коммерческие наборы "glass milk" двух производителей (Promega и QiaGen) - не более 60-70% (здесь не представлено). Таким образом, разработанный нами метод обеспечивает количественный и исключающий избирательные потери выход нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма, а также визуальный контроль за ходом процесса. Предлагаемый метод может найти применение в судебно-медицинских и клинических исследованиях, т.е., в тех случаях, когда речь идет о микроколичествах фрагментированных нуклеиновых кислот в разведенных растворах.

Применение ИТФ для выделения ДНК из плазмы крови здоровых людей и онкологических больных обнаруживает в ней довольно значительные количества ДНК (рис. 3), пригодной для дальнейших исследований посредством ПЦР.

1600

1400

1200

f 1000

- 800 5 800

200

0 8

1

— ДОНОРЫ—БОЛЬНЫЕ I

Рис. 3. Содержание ДНК в плазме крови доноров и онкологических больных. Группа 1 - доноры, группа 2 - больные раком полости рта.

3. Опухоли полости рта: циркулирующие вирусные ДНК

Рак носоглотки (РНГ) - одна из форм злокачественных новообразований человека, ассоциированных с вирусной инфекцией, а именно вирусом Эпштейна—Барр (ВЭБ). Важным средством диагностики и скрининга РНГ, применяемым в эндемичных районах (Китай, Тайвань, Гонконг), является определение в сыворотке крови ВЭБ-специфических антител. Помимо этого активно развивается диагностика, основанная на анализе циркулирующих в крови вирусных ДНК. Сопоставление иммунологического и генетического подходов, отражающих разные, но при этом взаимосвязанные стороны патологического процесса (иммунную реакцию организма на инфекцию, с одной стороны, и распад пораженных вирусом клеток, с другой), представляется перспективным, особенно в случае неэндемичного района, каковым является Россия. Такое сопоставление явилось целью данной работы.

3.1. Материалы и методы

Клинические образцы. Объектом исследования были образцы плазмы крови больных, проходивших лечение в ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина». Для выделения ДНК из плазмы крови применяли разработанный нам метод ИТФ.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции. Для определения титра IgG- и IgA-антител к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр (BKA) использовали клеточную линию P3HR1, продуцирующую вирус и его капсидный антиген. В

результате обработки клеток индуктором 12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом (20 нг/мл) в течение 3-6 сут в популяции появляется примерно 10% клеток, содержащих антиген. Реакцию непрямой флюоресценции проводили как описано ранее (Гурцевич и др., 2011). (Определение титра антител проводилось в лаборатории вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза).

Количественная ПЦР-РВ вирусной ДНК Для амплификации в реальном времени фрагмента размером 76 п.о. в области регуляторных повторов ВашШ-W вирусной ДНК (GenBank accession number V01555) использовали праймеры W-44F (5 '-cccaacactccaccacacc), W-119R (5'-tcttaggagctgtccgaggg) и гидролизуемый флуоресцентный зонд TaqMan W-67T (5'-FAM-cacacactacacacacccacccgtctc-RTQl) (Lo et al., 1999). Реакцию вели в 96-луночных планшетах на приборе Bio-Rad CFX96, используя коммерческий набор (Синтол, Москва).

Плавление вирусных ампликонов проводили в присутствии красителя EvaGreen: денатурация 1 мин при 95°С, прогрев 2 мин при 50°С, после чего плавление от 55°С до 90°С с шагом 0,3°С и выдержкой 12 с. Результаты анализировали с использованием Bio-Rad Precision Melt Analysis software.

3.2. Результаты

В плазме крови исследуемых лиц определяли 3 показателя: число копий ДНК-ВЭБ, титры IgG- и IgA-антител к капсидному антигену вируса (BKA).

На рис. 4 представлены калибровочные кривые, используемые для количественной ПЦР-РВ. Кривые амплификации вирусной ДНК сдвигаются влево при увеличении исходного ее содержания в образце (рис. 4,А), что объясняется меньшим значением Ct (пороговый цикл, при котором достигается превышающий фон уровень флуоресценции). Линейная зависимость между значением Ct и логарифмом изначально присутствующих в образце копий вирусной ДНК демонстрирует большой динамический интервал (в пределах 4 порядков величины) и высокую степень точности ПЦР-РВ (рис. 4,В).

RFU - относительные единицы флуоресценции; эффективность амплификации Е - 92,1%, коэффициент корреляции R2 - 0,989.

(A) Кривые амплификации (зависимость интенсивности флуоресценции от числа циклов ПЦР). Кривые: 1 - 7 копий вирусной ДНК; 2-38 копий; 3-190 копий; 4 - 950 копий; 5 -4750 копий; б - 23750 копий.

(B) Линейная зависимость Ct от числа копий вирусной ДНК, изначально присутствующих в образце (в полулогарифмическом масштабе).

Ампликоны ДНК-ВЭБ анализировали методом HRMA (High Resolution Melting Analysis), выявляющим генные полиморфизмы и мутации (Erali and Wittwer, 2010). Оказалось, что пики плавления ампликонов у некоторых больных РНГ имеют, в отличие от таковых большинства, «двугорбую» форму, свидетельствующую, возможно, о полиморфизме их нуклеотадной последовательности (рис. 5). Детальное исследование этого неожиданного феномена - предмет дальнейших исследований.

Рис. 5. Плавление вирусных ампликонов.

-чЗ(ДРи)/(1Т — отрицательная первая производная кривых плавления.

(A) Мономорфные пики плавления исследованных ампликонов ВЭБ большинства больных РНГ.

(B) «Двугорбые» пики плавления ампликонов ВЭБ у некоторых больных РНГ.

Больных РНГ мы подразделили на 3 группы: первичные, после начала лечения, с рецидивом опухоли и сопоставляли два показателя: титры антител IgA/BKA (как наиболее специфичные для РНГ) и число копий ДНК-ВЭБ.

На рис. 6 видно, что титры IgA/BKA у здоровых доноров не превышают фоновых величин, тогда как у больных опухолями полости рта они повышены: относительно незначительно (до 40-80) у больных ДОПР и весьма существенно (до 640-1280) - у больных РНГ (выделены цветом). Видно, что этот показатель весьма инерционен: после начала лечения титры продолжают нарастать и снижаются только на поздних стадиях процесса - при возникновении рецидива опухоли.

Существенно по-иному ведет себя второй показатель - содержание в плазме крови вирусных последовательностей (рис. 7). Их присутствие оказалось высокоспецифичным маркером РНГ, а число копий - чувствительным индикатором активности процесса: с началом лечения ДНК-ВЭБ в большинстве случаев в плазме крови не определяется, но появляется в ней вновь (причем в концентрации миллионов копий в 1 мл плазмы) - при рецидиве опухоли.

Титры антител 1400

1200

1000

300

600

400

200

0

© 1-ДОНОРЫ (19) ■•©• 4 ■ Лечение (13) В 2-ДОПР(24) 5 • Рецидив (3) -«♦- 3 - РНГ первичный (6)

Рис. 6. Антитела ¡^А/ВКА в плазме крови доноров и больных с опухолями полости рта. 1 - доноры; 2 - больные ДОПР; 3-5 - больные РНГ; в скобках - число исследованных лиц в группе. Выделенная цветом панель - больные РНГ первичные (группа 3), после лечения (группа 4), с рецидивом опухоли (группа 5). Стрелка - начало лечения.

Копик/мл 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 о

© 1. ДОНОРЫ (19) н 2-ДОПР(24) - - 3 • РНГ первичный (6)

и 4 - Лечение (13) 5- Рецидив (3)

Рис. 7. Уровень вирусной ДНК у доноров и больных с опухолями полости рта. 1 - доноры; 2 - больные ДОПР; 3-5 - больные РНГ; в скобках - число исследованных лиц в группе; числа над символами - медиана значений и в скобках - межквартильный интервал. Выделенная цветом панель - больные РНГ первичные (группа 3), после лечения (группа 4), с рецидивом опухоли (группа 5). Стрелка - начало лечения. Значения числа копий ДНК-ВЭБ больных группы 3 - на левой оси ординат, больных группы 5 - на правой оси ординат.

3.3. Резюме

Серологические показатели, исследованные нами у российских больных с опухолями головы и шеи, соответствуют в основном таковым у больных в эндемичных для РНГ районах. Характерные для РНГ изменения состоят в повышении титров антител и в появлении в крови ДНК ВЭБ.

Наиболее специфичным и чувствительным в отношении РНГ тестом явилось определение в плазме крови ДНК-ВЭБ. Кроме того, он оказался простым и удобным средством мониторинга заболевания (эффективности лечения и появления рецидива или метастаза). Судя по тому, что в нашей работе концентрация вирусных ДНК у больных РНГ оказалась выше, чем в работах других авторов, использованный нами оригинальный прием выделения ДНК посредством ИТФ дает более полный выход анализируемых молекул.

Обнаруженный нами феномен гетерогенности пиков плавления вирусных ампликонов у некоторых больных РНГ может свидетельствовать об их полиморфизме, что составляет предмет самостоятельного исследования.

Копии/мл

4. Сателлнтные РНК как маркеры опухолевого роста

Повторяющиеся нуклеотидные последовательности привлекают в последнее время большое внимание как обладающие функциональной активностью и участвующие в канцерогенезе (предполагается, в частности, что усиленная транскрипция некоторых из них ведет к дестабилизации генома) (Burgess et al., 2011). Так, анализ транскриптома аденокарциномы поджелудочной железы мыши обнаружил высокую активность перицентромерных сателлитных повторов, многократно превышающую таковую в нормальных клетках. Аналогичное исследование тканей человека обнаружило сходную ситуацию, а именно усиление в опухолях транскрипции сателлитных повторов, причем между двумя их подтипами (HSATII и GSATTI) существуют, как оказалось, реципрокные отношения: резкое превалирование транскрипции первого из них в опухолях и второго — в соответствующих нормальных тканях (Ting et al., 2011).

Мы предприняли первую, насколько нам известно, попытку оценить диагностическую значимость некодирующих сателлитных РНК HSATII и GSATTt. В связи с этим было необходимо, во-первых, разработать протокол ОТ-ПЦР-РВ для их обнаружения (в оригинальной работе применен метод секвенирования без предварительной амплификации транскриптов), во-вторых, выяснить, присутствуют ли они в плазме крови и, в случае положительного ответа, в третьих, провести пилотное (на небольших группах испытуемых) исследование уровней транскриптов HSATII и GSAHI в плазме крови здоровых людей и онкологических больных.

4.1. Материалы и методы

Выделение РНК. РНК цлазмы крови (1 мл) депротеинизировали обработкой фенолом и хлороформом, после чего выделяли посредством ИТФ (Kondratova et al., 2011)

Дизайн праймеров. Праймеры к исследуемым сателлитным повторам hsath и GSAT11 определяли с помощью программы Primer3 (v. 0.4,0). Последовательности праймеров, где I - инозин, приведены ниже (курсивом обозначены короткие олигонуклеотиды, присоединенные к 5'-концам праймеров для оптимизации и выравнивания температур отжига в ПЦР): HSAT П прямой 5'-ciagactgCGAATGGAITCGAATG-3 ' HSAT П обратный 5'-aggCCATICAATGATGATTCC-3 ' GSAT П прямой 5'-aagacgTTTCCTTCCAC AICAC-3 ' GSATH обратный 5'-aaiaagCAIGGGIGAAAGTGC-3 ' Alu прямой 5 '-GAGGCTGAGGC AGGAGAATCG-3 '

Alu обратный 5'-GTCGCCCAGGCTGGAGTG-3'

ОТ-ПЦР в реальном времени проводили в две стадии с промежуточной этанольной преципитацией. Для синтеза кДНК использовали набор RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Продукты обратной транскрипции осаждали этанолом и растворяли в 20 мкл деионизованной воды.

На второй стадии (ПЦР-РВ) использовали по два праймера (прямой и обратный) к каждому из повторов - HSATII, GSATII и Alu. Реакцию вели в 96-луночных планшетах на приборе Bio-Rad CFX96 в присутствии флуоресцентного красителя SYBR Green I. Условия ПЦР-РВ: начальная денатурация - 3 мин при 95°С, после чего 40 циклов - 25 с при 95°С, 25 с при 65°С (уровень флуоресцентного сигнала регистрировали при 65 °С)..

Плавление ампликонов. По завершении ПЦР продукты реакции прогревали 3 мин при 95°С, 3 мин при 45°С, затем от 45°С до 95°С с шагом 0,5°С (выдержка 20 с). Полученные данные экспортировали в Microsoft Excel для построения пиков плавления.

Электрофорез. ДНК разделяли в 1,5% агарозном геле.

4.2. Результаты

Этапы и условия эксперимента. Исследование экспрессии сателлитных последовательностей, имело ряд особенностей. Прежде всего, количественному сопоставлению в этом случае подлежали не индивидуальные, как обычно, а гетерогенные РНК, транскрибируемые на многократно повторяющихся последовательностях. Поскольку в оригинальной работе секвенировали одиночные транскрипты (без предварительной амплификации), условия ОТ-ПЦР мы подбирали самостоятельно, в частности, использовали вырожденные праймеры с включением инозина. Поскольку компоненты реакции обратной транскрипции ингибировали последующую ПНР, нами был избран вариант двухэтапной ОТ-ПЦР-РВ с промежуточной этанольной преципитацией кДНК, синтезированных с использованием ген-специфических праймеров.

В силу сходства объектов исследования (транскрипты многократно повторяющихся последовательностей) в данной работе в качестве нормализующего показателя была избрана экспрессия повторов Alu (Marullo et al., 2010). Поскольку между транскриптами GSATII и HSATH существуют реципрокные отношения, они предположительно могли взаимно служить внутренними контролями друг для друга.

Выявление сателлитных РНК в культивируемых клетках. Выявление сателлитных РНК посредством ОТ-ПЦР-РВ мы апробировали на клетках MCF-7 (любезно предоставлены М.А. Красильниковым, Институт канцерогенеза, Москва). В исследуемых клетках больше всего оказалось транскриптов Alu (рис. 8,а), а следующими в порядке убывания — транскрипты HSATII и GSATII, что соответствует данным оригинальной работы (Ting et al., 2011). Пики плавления (рис. 8,Ь) демонстрируют гетерогенность ампликонов и снижение их средних размеров в ряду Alu, HSATH и GSATII, что подтверждается результатами электрофоретического анализа (рис. 8,с).

Рис. 8. Сателлитные РНК в клетках MCF-7.

Тотальную РНК использовали в реакции обратной транскрипции, после чего кДНК амплифицировали в ПЦР-РВ с красителем SYBR Green I, а - сателлитные последовательности; b -плавление ампликонов; с - электрофореграмма продуктов ПЦР. М -маркеры молекулярных масс. 1 - Alu; 2 - HSATII; 5 - GSATII.

Выявление сателлшпных РНК в плазме крови. На рис. 9,А представлены кривые амплификации кДНК Alu, GSATII и HSATII, выделенных из образцов плазмы крови 10 здоровых доноров и 9 больных раком толстой кишки (разные символы, соответственно); на рис. 9,В представлены пики плавления соответствующих ампликонов. Видно, во-первых, что концентрации исследуемых РНК в плазме крови как здоровых, так и больных людей варьируют в широких пределах; во-вторых, наиболее высок в плазме крови уровень траяскриптов Alu, тогда как транскрипты GSATII и HSATII присутствуют в ней в существенно меньших концентрациях; в-третьих, транскрипты обоих типов чрезвычайно гетерогенны (они различаются, видимо, как размерами, так и нуклеотидным составом; и, наконец, в-четвертых, ампликоны GSATII состоят из двух субпопуляций, между которыми существуют реципрокные отношения: в плазме больных доминирует одна, тогда как в плазме доноров — другая.

Meit Peak

Amplification

Temperature

Amplification

Melt Peak

GSATII

Temperature

Melt Peak

Amplification

HSATII

Temperature

Рис. 9. Сателлитные РНК в плазме крови здоровых и больных людей. А - амплификация Alu, GSATII и HSATII.

В - плавление ампликонов Alu, GSATII и HSATII (образцы здоровых доноров и онкологических больных обозначены разными символами, соответственно).

Количественные соотношения сателлитных РНК в плазме крови. Для оценки количественных соотношений между анализируемыми популяциями РНК мы применили два способа нормализации: по отношению каждой из них к величине популяции транскриптов Alu, принимаемой за единицу (Marullo et al., 2010), и по отношению друг к другу - GSATII/HSATII (Sheinerman et al., 2013).

При первом способе расчета, при котором популяции транскриптов GSATII и HSATII определяются как доля популяции Alu (образцы 1-10 -доноры; образцы 11-19 - онкологические больные) обнаружено, что концентрация в плазме крови РНК GSATII у здоровых и больных людей

практически не различается. Напротив, концентрация РНК ШАТП в плазме крови онкологических больных, по сравнению с донорами, существенно и статистически значимо снижена: в первом случае - медиана 0,04; МКИ (межквартильный интервал) 0,02-0,12; во втором - медиана 0,36, МКИ 0,22-0,62 (р=0,008; и-критерий Манна—Уитни).

Наиболее наглядно различия между здоровыми и больными людьми проявляются соотношением ОБАТН/ШАТИ, определяемым индивидуально у каждого испытуемого по величине ДО, т.е. разнице О ОЗАТП и О Н8АТП (рис. 10). Если у большинства доноров эта величина положительна, то у больных - отрицательна. При этом следует учесть, что чем больше величина О, т.е. чем больше число циклов амплификации, необходимых для достижения порогового уровня флуоресценции, тем соответственно меньше исходное число копий анализируемых матриц. Таким образом, в плазме крови большинства доноров преобладают РНК Н5АЛ"П, а большинства больных раком толстой кишки преобладают РНК ОБАТП.

Плазма крози

11.. 1. !

| а в р и

12 3 4 5 5 7 8 5 № 11 12 13 М 15 К 17 13 1В

Рис. 10. Соотношение РНК С8АТП/Н8АТП в плазме крови доноров и онкологически?: больных. Соотношение РНК СЭЛТП/ШАТП определяли по величине ДО. Доноры -образцы 1-10; онкологические больные - образцы 11-19.

4.3. Резюме

Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о присутствии в плазме крови здоровых и больных людей некодирующих гетерогенных РНК, транскрибируемых на перицентромерных сателлитных повторах HSATII и GSATII, и, во-вторых, о существовании между этими популяциями реципрокных отношений (у здоровых доноров превалирует одна популяция, у больных - другая). Интересно отметить, что эти отношения диаметрально противоположны тем, что существуют внутри клеток (см. Ting et al., 2011 и рис. 8 данной работы). Это может указывать на появление в плазме крови транскриптов GSATII и HSATII не только вследствие клеточного распада, но и как результат активной клеточной секреции.

Циркулирующие сателлитные РНК, существование которых впервые показано в этой работе, могут представлять интерес и как возможные участники горизонтального переноса генетической информации, и как потенциальные маркеры опухолевого роста. Детальное изучение их свойств является предметом дальнейших исследований.

Выводы

1. Разработан оригинальный метод изотахофореза нуклеиновых кислот, обеспечивающий количественное выделение, концентрирование и очистку нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма, в том числе из плазмы крови. Метод может быть применен для судебно-медицинских и клинических исследований, в том числе для жидкостной биопсии онкологических больных.

2. Разработан простой, не требующий специальной аппаратуры метод количественной денситометрии ДНК.

3. Сопоставлен ряд существующих методов мутационного сканирования (RFLP, SSCP, NIRCA, Surveyor, HRMA) в отношении их производительности, чувствительности, затрат времени и труда; наиболее пригодным для клинического применения является метод плавления

полученных в ПЦР ампликонов.

4. С целью жидкостной биопсии рака носоглотки сопоставлены иммунологические (титры антител к вирусным антигенам) и молекулярно-биологические (содержание ДНК ВЭБ) показатели плазмы крови у больных разными формами рака полости рта. Показана высокая диагностическая значимость определения числа копий вирусной ДНК в плазме крови этих больных. Этот показатель служит также эффективным средством мониторинга заболевания.

5. Впервые установлено, что в плазме крови человека присутствуют РНК, транскрибируемые на многократно повторяющихся перицентромерных сателлитных повторах, и что соотношение уровней двух типов сателлитных РНК (HSATII и GSATII) существенно различается у здоровых лиц и онкологических больных (рак толстой кишки). Впервые показана диагностическая значимость соотношения РНК HSATII/GSATII как потенциального маркера опухолевого роста.

Список работ по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Кондратова, В.Н. Противоточный изотахофорез как способ концентрирования и выделения ДНК из биологических жидкостей. / В.Н. Кондратова, О.И. Сердюк, В.П. Шелепов, Г.И. Потапова, A.B. Лихтенштейн // Доклады Академии наук. -2005. - Т. 402, № 2. - С. 268-271.

2. Kondratova, V.N. Concentration and isolation of DNA from biological fluids by agarose gel isotachophoresis. / V.N. Kondratova, O.I. Serd'uk, V.P. Shelepov, A.V. Lichtenstein // BioTechniques. - 2005. - Vol. 39, № 5. - P. 695-699.

3. Ботезату, И.В. Детекция генных мутаций в биопробах онкологических больных: сопоставление сканирующих методов NIRCA и SSCP / И.В. Ботезату, В.Н. Кондратова, В.Л. Черкес, Ю.А. Барсуков, В.Э. Алиев, В.П. Шелепов, A.B. Лихтенштейн // Вопросы онкологии. — 2007. — Т. 53, № 5. — С. 549-553.

4. Кондратова, В.Н. Изотахофорез нуклеиновых кислот в трубках агарозного геля / В.Н. Кондратова, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, A.B. Лихтенштейн // Биохимия. — 2009. — Т. 74, № 11. — С. 1577-1581.

5. Kondratova, V.N. Tube gel isotachophoresis: a method for quantitative isolation of nucleic acids from diluted solution / V.N. Kondratova, I.V. Botezatu, V.P. Shelepov,

A.V. Lichtenstein // Analytical Biochemistry. — 2011. — Vol. 408, № 2. — P. 304-308.

6. Botezatu, I.V. DNA melting analysis: application of the "open tube" format for detection of mutant К -Ras / I.V. Botezatu, V.N. Kondratova, V.P. Shelepov, A.V. Lichtenstein I I Analytical Biochemistry. — 2011. — Vol. 419, № 2. — P. 302-308. .

7. Ботезату, И.В. Сканирование мутаций в коротких ампликонах: оптимизация метода плавления ДНК / И.В. Ботезату, К.И. Жордания, А.И. Карселадзе, А.М. Строганова, В.Н. Кондратова, В.П. Шелепов, М.В. Телков, А.В. Лихтенштейн II Молекулярная биология. — 2012. — Т. 46, № 3. — С. 461-468.

8. Кондратова, В.Н. Маркеры вируса Эпштейна-Барр при раке носоглотки / В.Н. Кондратова, Н.А. Пирогова, В.Н. Степина, Б.К. Поддубный, Е.Г. Матякин, В.Э. Гурцевич, А.В. Лихтенштейн. // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2012. -Т. 23, № 1.-С. 33-39.

9. Гурцевич, В.Э. Сиквенсные варианты онкогена LMP1 у больных опухолями полости рта, ассоциированными и не ассоциированными с вирусом Эпштейна-Барр / В.Э. Гурцевич, Л.С. Яковлева, Л.Н. Щербак, Е.В. Гончарова, К.В. Смирнова, С.В. Дидук, В.Н. Кондратова, Д.М. Максимович, А.В. Лихтенштейн, Н.Б. Сенюта // Молекулярная биология. - 2013. - Т. 47, № 6. - С. 987-995.

10. Кондратова, В.Н. Внеклеточные нуклеиновые кислоты как маркеры опухолевого роста / В.Н. Кондратова, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, А.В. Лихтенштейн // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - № 3. - С. 3-10.

11. Кондратова, В.Н. Транскрипты сателлитной ДНК в плазме крови: возможные маркеры опухолевого роста / В. Н. Кондратова, И. В. Ботезату, В. П. Шелепов, А.

B. Лихтенштейн // Молекулярная биология. - 2014. - Т. 48, № 6 - С. 999-1007. 12.Senyuta, N. Epstein-Barr virus status and LMP1 oncogene polymorphism in patients

with nasopharyngeal carcinoma and other tumors of the oral cavity in a non-endemic region / N. Senyuta, E. Goncharova, V. Kondratova, L. Scherback, K. Smirnova, V. Vayradyan, M. Lomaya, D. Maksimovich, A. Lichtenstein, V. Gurtsevitch // В книге "Neck cancer. Epidemiology, Management and Treatment Outcomes" (M.R. Hall, ed.). Nova Science Publishers, New York.- 2015. - Chapter 6. - P. 101-121.

13. Гурцевич, В.Э. Диагностическая значимость уровней ДНК и антител к капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр в плазме крови больных раком носоглотки в неэндемическом регионе / В.Э. Гурцевич, Н.Б. Сенюта, В.Н. Кондратова, Е.В. Гончарова, A.B. Игнатова, М.В. Ломая, М.А. Кропотов, A.M. Мудунов, A.B. Лихтенштейн // Успехи молекулярной онкологии. - 2015 -Т. 2, № 2. - С. 45-51.

Тезисы конференций

1. Кондратова, В.Н. Применение противоточного изотахофореза для выделения и концентрирования ДНК из разведенных растворов при диагностике онкологических заболеваний / В.Н. Кондратова // Биология - наука XXI века: 7 Пущинская школа-конференция молодых ученых 14-18 апреля 2003 г. Сборник тезисов. Пущино. - 2003. - С. 343.

2. .Кондратова, В.Н. Применение ультрафильтрации биологических жидкостей на мембранах Amicon при диагностике онкологических заболеваниий. / В.Н. Кондратова // Биология - наука XXI века: 8 Пущинская школа-конференция молодых ученых 17-21 апреля 2004 г. Сборник тезисов. Пущино. - 2004. - С. 16.

3. Кондратова, В.Н. Обнаружение ДНК-маркеров опухолевого роста в биологических жидкостях. / В.Н. Кондратова, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, В.П. Шелепов, A.B. Лихтенштейн // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск. - 2004. - Часть 1. - С. 280.

4. Сенюта, Н.Б. Генетические варианты онкогена LMP1 вируса Эпштейна-Барр у больных назофарингеальной карциномой и другими опухолями полости рта / Н.Б. Сенюта, Е.В. Гончарова, Л.С. Яковлева, Л.Н. Щербак, C.B. Дидук, К.В. Смирнова, В.Н. Кондратова, A.B. Лихтенштейн, В.Э. Гурцевич // Инфекция и иммунитет. Материалы международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». - 2013. - Т. 3, № 2. - С. 169-170.

5. Кондратова, В.Н. Транскрипты сателлитной ДНК в плазме крови: возможные маркеры опухолевого роста. / В.Н. Кондратова, И.В. Ботезату, В.П. Шелепов, A.B. Лихтенштейн // Евразийский онкологический журнал. Тезисы Vin Съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии 16-18 сентября 2014 г. Казань, Россия. -2014.-№3(03)-С. 102.

Подписано в печать гз. 07.15 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 395 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Капшрское ш., 24