Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация

Никитина, Татьяна Николаевна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Никитина, Татьяна Николаевна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация

НИКИТИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

На правах рукописи

СТИМУЛЯЦИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРЕПАРАТАМИ

ЦИТОКИНОВ И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ

14.03.09 - КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ, АЛЛЕРГОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О ИЮН 2010

МОСКВА-2010

004605620

Работа выполнена в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Николай Васильевич Медуницын

Доктор медицинских наук, профессор Жанна Ильдаровна Авдеева

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Людмила Ивановна Краснопрошина

Доктор медицинских наук, профессор Леонид Васильевич Ковальчук

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, г. Москва

/ л

Защита состоится « » О^СОи^ЗЛ 10 г. в х часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01. при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: г. Москва, Малый Казенный переулок, д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И. В. Яковлева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одна из основных проблем современной иммунологии связана с вопросами регуляции иммунного ответа. Интенсивность иммунного ответа на введение чужеродного антигена (АГ) зависит от многих факторов, таких как функциональное состояние организма, его генетических особенностей, а также свойств самого ЛГ, дозы и схемы его введения (Петров Р.В., Хаитов P.M., 1999; Медуницын Н.В., 2010). Особую значимость вопросы регуляции иммунного ответа приобретают в связи с необходимостью обеспечения формирования надежного поствакцинального иммунитета.

В настоящее время отмечается рост как острых, так и хронических инфекционных заболеваний. Одним из основных и надежных способов профилактики распространения инфекционных болезней является вакцинация. Лица с длительно протекающими заболеваниями (хронические воспалительные и инфекционные заболевания, гепатиты, туберкулез, ВИЧ-инфекция, хроническая почечная патология, лица, находящиеся на гемодиализе и др.) составляют группу риска, которая является наиболее восприимчивой к инфекциям и должна быть вакцинирована в первую очередь.

Вопрос обеспечения адекватного иммунного ответа на вакцинацию у лиц с ослабленной иммунной активностью и с проявлениями иммунодефицита является актуальным. Решению этой проблемы способствует поиск и разработка средств, направленных на увеличение эффективности вакцинопрофилактики (Смирнов М.Н. с соавт., 1999; Медуницын Н.В., 2010).

Повышение эффективности вакцинации достигается путем использования адъювантов - веществ, которые усиливают иммунный ответ при одновременном их введении с АГ.

Имеются сообщения об исследовании адъювантных свойств ряда цитокинов -ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФу, ФНОа, КСФ при иммунизации экспериментальных животных бактериальными и вирусными АГ (Лебедев В.В. с соавт., 1992; Авдеева Ж.И. с соавт., 2007; Pasquini S. et al., 1997; Sin J-I. et al., 1999; Hornef M.W. et al., 2000; Kim J.J. et al., 2000). Эффективность ИЛ-1 показана при вакцинации против гепатита В, инфекций, вызванных стрептококками и пневмококками, использовании гриппозной вакцины (Rao K.V.S., Nayak A.R., 1990; Blecha F. et al., 1995). ИЛ-2 в качестве адъюванта

использован для повышения иммуногенности вакцин БЦЖ и гриппозной (Maes R.F., 1999), в экспериментальных исследованиях - ангирабической вакцины (Акользина С.Е., 1996; Provinciali М. et al., 1994), в ветеринарии - вакцин против ящура, бронхопневмоний, вирусных диарей крупного рогатого скота (Смирнов М.Н. с соавт., 1999).

В настоящее время, благодаря достижениям молекулярной биологии, разработаны лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков цитокинов, которые могут быть использованы не только для проведения цитокинотерапии, но и в качестве иммуноадъювантов (Симбирцев A.C., с соавт., 2000; Масычева В.И., с соавт., 2001; Мац А.Н., с соавт., 2008; Медуницын Н.В., 2010).

Производство препаратов цитокинов на основе генно-инженерных технологий требует выполнения специальных требований как к контролю этапов процесса производства, так и к методам контроля качества готового продукта.

Для оценки качественных и количественных характеристик медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), включая препараты рекомбинантных цитокинов, необходимо использование валидированных и аттестованных методов контроля показателей качества, включая оценку специфической активности, а также использование стандартных образцов (Петухов В.Г., 2003; Давлетбаева JI.P., 2005; Борисов В.А., 2006).

Необходимость валидации методов контроля МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), а также отечественными нормативными документами. При отсутствии Международных стандартных образцов важное место занимают отечественные отраслевые стандартные образцы, использование которых обеспечивает проведение качественного контроля препаратов МИБП (ГОСТ Р 52249-2004. Национальный стандарт Российской Федерации; Добровинский И.Е., 2005). Изучение вопросов стандартизации и валидации методов оценки качества МИБП по показателю специфической активности, включая лекарственные препараты цитокинов, является актуальным.

Таким образом, приведенные данные указывают на перспективность исследований по изучению иммуноадъювантных свойств лекарственных препаратов цитокинов и стандартизации методов их контроля.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение иммуностимулирующих свойств препаратов цитокинового ряда на экспериментальных моделях, включая модель с индуцированной иммуносупрессией, при иммунизации животных вакциной против гепатита В.

Валидация методов определения специфической активности препаратов рекомбинантных цитокинов человека - «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)» и аттестация отраслевых стандартных образцов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан» на интенсивность иммунного ответа животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

2. Установить дозы и схемы введения вакцины и препаратов цитокинов при иммунизации экспериментальных животных.

3. Изучить адъювантные свойства цитокинов на модели животных без иммуносупрессии и животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией при однократной и двукратной иммунизации вакциной против гепатита В.

4. Изучить влияние цитокинов на интенсивность иммунного ответа по уровню частоты сероконверсии и концентрации в сыворотке крови специфических антител (АТ).

5. Провести валидацию методов определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОр с определением следующих характеристик - подлинность, воспроизводимость, повторяемость, линейность.

6. Разработать и аттестовать отраслевые стандартные образцы (ОСО) рчФНОа и рчФНОр для определения специфической активности препаратов «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)». Разработать нормативную документацию на стандартные образцы (ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОР).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Исследованные препараты цитокиновового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан», оказывают иммуноадъювантное действие при иммунизации экспериментальных животных вакциной против гепатита В.

Одновременное введение вакцины против гепатита В с препаратами цитокинов повышает интенсивность иммунного ответа животных, что сопровождается увеличением уровня сероконверсии и повышением концентрации специфических АТ по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без цитокинов.

При иммунизации животных низкими дозами вакцины выраженный иммунный ответ развивается только в случае использования вакцины в сочетании с цитокинами. Иммунный ответ на вакцину, вводимую с цитокинами, приближается к ответу, который развивается на большую дозу вакцины без цитокинов.

Уровень иммунного ответа животных с иммуносупрессией при иммунизации вакциной с препаратами цитокинов соответствует уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных аналогичными дозами АГ без цитокинов.

Проведена валидация методов определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОр. Разработаны и аттестованы ОСО определения специфической

активности, оформлены нормативные документы на ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНО|3 (ОСО 42-28-401-08).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Экспериментальные исследования позволили расширить представления об особенностях иммунного ответа иммунодефицитных животных и животных без иммуносупрессии на сопоставимые дозы АГ вакцины против гепатита В, вводимой без цитокинов или с цитокинами, используемыми в качестве иммуноадъювантов.

Результаты исследований показали, что изученные препараты цитокинового ряда -«Беталейкин (рчШЫР)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин», а также препарат «Имунофан», повышают уровень иммунного ответа на специфический АГ вакцины против гепатита В, что свидетельствует о перспективности использования указанных препаратов в качестве адъювантов при вакцинации.

Результаты исследований на животных с индуцированной иммуносупрессией свидетельствуют о возможности использования препаратов цитокинов для стимуляции иммунного ответа при вакцинации лиц, имеющих проявления иммунодефицита (хронических инфекционных и онкологических заболеваниях, травмах, ожогах, ВИЧ-инфицированных, пациентов, находящихся на гемодиализе и др.).

Для усовершенствования и стандартизации методов контроля качества препаратов «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)» проведена валидация методов определения их специфической активности и подлинности. Разработаны два ОСО, утверждены Свидетельства и Инструкции по применению - ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНОР (ОСО 42-28-401-08), которые внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Методы оценки специфической активности внесены в проекты ФСП на вновь разрабатываемые в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Бердск) отечественные лекарственные препараты «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)».

Разработанные и аттестованные ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОР используются при контроле качества указанных препаратов по показателю специфической активности.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На экспериментальных моделях животных (без иммуносупрессии и с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией) показана эффективность использования исследованных препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-ф)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан», в качестве адъювантов при иммунизации вакциной против гепатита В.

При одновременном введении вакцины с препаратами цитокинов отмечена их способность усиливать иммунный ответ. У животных наблюдается более высокая частота сероконверсии и большая концентрация специфических ЛТ по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без цитокинов.

Адъювантное действие цитокинов более демонстративно проявляется при использовании малых доз вакцины, на которые развивается слабый иммунный ответ в случае их использования без цитокинов, а также на экспериментальной модели животных с индуцированной иммуносупрессией.

Интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных при иммунизации низкой дозой вакцины, вводимой с препаратами цитокинов, приближается к интенсивности ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных аналогичными дозами вакцины без цитокинов.

На примере валидации методов определения специфической активности препаратов цитокинов рчФНОа и рчФНОр предложен подход к валидации методов оценки специфической активности других препаратов цитокинов. Установленные в процессе валидации характеристики позволили аттестовать два ОСО препаратов цитокинов -рчФНОа и рчФНОр.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация прошла апробацию 21. 04. 2009 г. на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Основные положения диссертационной работы представлены на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», Уфа, 2004; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; 6-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств», Москва, 2007; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008; XIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в С-Петербурге», С-Петербург, 2009; X Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 2009.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав

собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы и двух приложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 103 отечественных и 157 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты по изучению адъювантных свойств препаратов цитокинов провели на 1303 мышах линии Balb/c (самки), весом 14 - 16 г.

Для иммунизации животных использовали вакцину против гепатита В «Engerix В» (фирма «GlaxoSmithKline», Бельгия). Вакцина содержит рекомбинантный HBsAg, полученный из дрожжевых клеток (Saccnharomyces cerevisiae), адсорбированный на 3% растворе гидроокиси алюминия.

В качестве иммуноадъювантов использовали следующие препараты:

- «Беталейкин (интерлейкин 1-бета), лиофилизат для приготовления раствора для

внутривенного и подкожного введения» (ФГУП ГосНИИ ОЧБ ФМБА, г. С - Петербург);

- «Ронколейкин (интерлейкин-2 человека рекомбинантный), раствор для

внутривенного и подкожного введения» (ООО «Биотех», г. С-Петербург);

- «Аффинолейкин» (Пермский Филиал ФГУП НПО «Микроген»);

- «Имунофан» (ООО НПП «Бионокс», г. Москва).

Препараты рекомбинантных цитокинов человека, для которых проведена валидация методов контроля специфической активности, разработаны и аттестованы ОСО:

- «Альнорин (рчФНОа), лиофилизат для приготовления раствора для инъекций»

- «Бефнорин (рчФНОР), лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Бердск).

В работе также использованы;

- кроличьи поликлональные AT к рчФНОа и AT к рчФНОр, любезно предоставленные сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»;

- линия клеток мышиных фибробластов L-929, любезно предоставленная сотрудниками института Иммунологии (п. Любучаны);

- актиномицин Д («Serva»);

- «Циклофосфан» (ОАО «Биохимик», г. Саранск).

При аттестации ОСО использовали Международные стандартные образцы:

- рчФНОа («NIBSC» Великобритания) 86/504, активность 40000 МЕ/мкг белка,

- рчФНОР («NIBSC» Великобритания) 87/640, активность 150000 МЕ/мкг белка. Для определения в сыворотке крови экспериментальных животных специфических

AT к HBsAg использовали тест-систему «BeKTOHBsAg-антитела-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск).

Схема иммунизации животных вакциной против гепатита В

Иммунизацию экспериментальных животных проводили вакциной против гепатита В «Engerix В». Использовали несколько доз вакцины, начиная с дозы 2,5 мкг/мышь до 0,003 мкг/мышь, которую вводили в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно, однократно или двукратно с интервалом в две недели. Разведения вакцины готовили на 3% растворе гидроокиси алюминия - Л1(ОН)3, используя 3-х кратный шаг разведения.

Цитокины, применяемые в качестве иммуноадъювантов, использовали в виде монопрепаратов или в комплексе, включающем «Беталейкин (рчИЛ-lß)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)». Цитокины вводили подкожно одновременно с вакциной однократно или двукратно.

При использовании монопрепаратов вводимая доза для каждого из цитокинов (расчет на 1 мышь) составляла: 10 нг для «Беталейкина (рчИЛ-lß)», 100 МЕ -«Ронколейкина (рчИЛ-2)», 1,0 ед - «Аффинолейкина», 0,05 мкг - «Имунофана» в объеме 0,5 мл. Дозы препаратов, вводимых в комплексе, составляли 5 нг для «Беталейкина (рчИЛ-lß)» и 50 МЕ - «Ронколейкина (рчИЛ-2)» (Лебедев В.В. с соавт., 1992; Акользина С.Е. 1996).

Для создания иммунодефицитного состояния животным до иммунизации ежедневно вводили циклофосфан в дозе 1 мг/мышь в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно. Курс введения включал три инъекции препарата ежедневно. Перед реиммунизацией животным также 3-х кратно вводили циклофосфан. Состояние иммуносупрессии оценивали по снижению количества нейтрофилов и лейкоцитов в периферической крови животных.

Интенсивность иммунного ответа животных, иммунизированных вакциной против гепатита В, оценивали по частоте сероконверсии (в %), концентрации в сыворотке специфических AT к HBsAg. Оценку иммунного ответа проводили в динамике. Взятие крови проводили через 15 дней после первой иммунизации из ретроорбитального синуса и 15 дней после повторного введения АГ- тотально. Свежие образцы сывороток хранили при температуре от 2 до 8 °С не более одной недели. При длительном хранении образцы сывороток сохраняли при температуре минус 20°С, подвергая оттаиванию однократно.

Определение уровня сероконверсии и концентрации AT к HBsAg

Определение уровня сероконверсии и концентрации AT к HBsAg в исследуемых образцах сыворотки экспериментальных животных проводили с использованием иммуноферментной тест-системы «BeKToHBsAg-антитела-стрип» (г. Новосибирск). При анализе результатов выделяли подгруппы животных, в сыворотке которых концентрация специфических AT составляла менее 20, от 20 до 100 и выше 100 мМЕ/мл. В указанных подгруппах определяли средние значения концентрации специфических AT и частоту выявления соответствующих уровней AT (в %).

Определение специфической активности препаратов рчФНОа н рчФНОР

Специфическая активность препаратов рчФНОа и рчФНОР оценивается по их способности оказывать цитолитическое действие на клетки мышиных фибробластов 1,-929 в присутствии актиномицина Д. Предварительно подобранная «рабочая» концентрация актиномицина Д, присутствуя в среде для культивирования, должна вызывать не более 10% гибели клеток. РчФНО усиливает действие актиномицина Д, вызывая больший процент гибели клеток. Активность исследуемого образца оценивают по минимальной дозе, вызывающей гибель 50% клеток по сравнению с контролем, которым служат клетки, культивированные в среде, содержащей актиномицин Д в «рабочей» концентрации и не содержащей рчФНО. Уровень жизнеспособных клеток, сохранившихся после цитолитического действия рчФНО, оценивают путем определения оптической плотности (ОП) элюирующего раствора при длине волны 540 нм. Показатели ОП увеличиваются пропорционально количеству живых клеток, т.е. значения ОП обратно пропорциональны концентрации рчФНО в исследуемом образце. Определение специфической активности препаратов рчФНО проведено в сравнении с соответствующими Международными стандартными образцами (МСО) рчФНОа и рчФНОР («МВБС», Великобритания).

Реакция нейтрализации цитолитического действия рчФНО

Реакцию нейтрализации проводят с целью определения подлинности препаратов рчФНО (рчФНОа или рчФНОР). Постановку реакции осуществляют с использованием специфических кроличьих сывороток, соответственно против рчФНОа или рчФНОр. Препарат рчФНОа должен быть специфичен и его действие должно нейтрализоваться специфической кроличьей сывороткой против рчФНОа и не нейтрализоваться сывороткой к рчФНОр. Соответственно, действие препарата рчФНОР должно нейтрализоваться сывороткой против рчФНОР и не нейтрализоваться сывороткой к рчФНОа. Препараты считаются подлинными, если «рабочее» разведение специфической сыворотки полностью нейтрализует определенную величину цитолитической активности (в МЕ) как исследуемых препаратов, так и стандартного образца.

Статистические методы обработки результатов. Статистическую обработку данных проводили на ПК с использованием стандартного пакета статистических программ «Statgraf¡cs». Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью I - критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение адъюваптиых свойств препаратов цнтокинов при нммунизацнн экспериментальных животных вакциной против гепатита В

На экспериментальных моделях с индуцированной иммуносупрсссией и без иммуносупрессии у животных было изучено влияние препаратов цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В.

1. Экспериментальные исследования на животных без иммуносупрессии.

Первоначально проведены эксперименты по выбору адекватных доз вакцины, используемых для иммунизации, которые вызывали низкий уровень иммунного ответа и позволяли оценить иммуноадъювантный эффект препаратов цитокинов. Животных иммунизировали однократно, используя разные дозы вакцины - 2,5; 0,83; 0,27; 0,09; 0,03; 0,01; 0,003 мкг/мышь. Установлены оптимальные дозы АГ - 0,27 и 0,09 мкг/мышь, при введении которых наблюдался низкий уровень иммунного ответа, частота сероконверсии составляла от 20% до 33%.

Далее проведены эксперименты по подбору доз цитокинов, стимулирующих развитие специфического иммунного ответа.

Изучена зависимость уровня иммунного ответа экспериментальных животных от схемы введения цитокинов. Вакцину вводили в ранее подобранных дозах однократно. Цитокины вводили с вакциной одновременно, за 2 дня или через 2 дня после введения вакцины. В условиях проведенных экспериментов сроки введения цитокинов, относительно введения вакцины, существенно не влияли на уровень иммунного ответа. В последующих экспериментах препараты цитокинов вводили одновременно с вакциной, поскольку одновременное введение максимально приближено к условиям практического применения адъювантов.

На следующем этапе исследования оценивали уровень сероконверсии животных при однократной иммунизации различными дозами вакцины (от 0,83 до 0,01 мкг/мышь) в сочетании с препаратами цитокинов «Беталейкин (рчИЛ-1р)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)». Контролем служили животные, иммунизированные одной вакциной (Табл. 1).

Проведенные эксперименты показали, что уровень сероконверсии животных, иммунизированных вакциной в сочетании с цитокинами, выше, чем показатель в контрольной группе при сопоставлении ответа на аналогичные дозы (р<0,05).

Ответ на меньшие дозы вакцины, вводимой на фоне цитокинов, приближался к ответу на большую дозу вакцины. Уровень сероконверсии на 15 день эксперимента отмечен в 40 - 60% случаев после иммунизации вакциной в дозах 0,09 мкг и 0,27 мкг/мышь на фоне введения цитокинов. Аналогичный уровень сероконверсии (40%) отмечался у животных контрольной группы, иммунизированных одной вакциной в дозе

0,83 мкг/мышь. Более выраженный ответ наблюдали в группах животных, которым вакцину вводили в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1|3)».

Таблица 1.

Оценка влияния препаратов цитокинов - «Беталейкии (рчИЛ-1р)», «Ронколейкнн (рчИЛ-2)» на выраженность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепат ита В (однократная иммунизация)

Доза АГ при Количество сероположительных животных (в %)

иммунизации АГ (контроль) АГ+рчИЛ-1В АГ+рчИЛ-2

(мкг/мышь) 15 день 30 день 15 день 30 день 15 день 30 день

0,83 (п=190) 40,0± 6,9 20,0± 5,7 50,0± 6,0** 33,3± 5,6 25,0± 5,2 20,0± 4,8

0,27(п=185) 28,5± 3,3 17,1± 2,7 57,9±4,9* 22,2± 4,1 47,8± 5,0* 21,0± 4,0

0,09 (п= 160) 20,0± 5,2 0 60,0± 6,9*' ** 25,0± 6,1* 40,016,9* 30,0± 6,5*

0,03 (п=40) 0 0 16,0± 8,4* 10,0± 6,8* 20,0± 9,1* 0

0,01 (п=40) 0 0 10,0± 6,8*' ** 0 0 16,0± 8,4*' **

Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе ** - различие достоверно (р<0,05) между показателями опытных групп - в таблице представлены результаты 4-х экспериментов

Следует отметить, что при иммунизации животных минимальными дозами вакцины (0,03 и 0,01 мкг/мышь) ответ наблюдали только в случае использования АГ в сочетании с цитокинами (рчИЛ-1(5 или рчИЛ-2), тогда как при введении одного АГ иммунный ответ не развивался.

В следующей серии экспериментов оценивали иммунный ответ животных после двукратной иммунизации (с интервалом 15 дней), используя ранее подобранные дозы вакцины (0,27 или 0,09 мкг/мышь). Цитокины - «Беталейкин (рчИЛ-1|3)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» вводили животным как на этапе иммунизации, так и реиммунизации. Схема экспериментов представлена на рисунке 1.

Иммунизация

Забор крови на 15 день

Серо (-)

Реиммунизация

АГ АГ+Цк АГ

Рисунок 1. Схема экспериментов с использованием цитокинов на этапе иммунизации и реиммунизации.

Перед реиммунизацией на 15 день эксперимента были выделены группы серонегативных и серопозитивных животных. Животные серонегативной группы были

разделены на две подгруппы. Опытную подгруппу реиммунизировали вакциной в сочетании с препаратами цитокинов, контрольную одной вакциной.

Результаты исследований на 30 день эксперимента представлены на рисунке 2.

НАГ

■ АГ+рчИЛ-1р

■ АГ+рчИЛ-2

0,27 мкг/мышь 0,09 мкг/мышь Доза антигена

Рисунок 2. Оценка влияния цитокинов («Беталейкин - рчИЛ-1(3» и «Ронколейкин - рчИЛ-2») на выраженность иммунного ответа после реиммунизации серонегативных животных вакциной против гепатита В (30 день эксперимента).

Как видно из рисунка 2, при реиммунизации выделенной серонегативной подгруппы животных вакциной в сочетании с иитокинами, количество серопозитивных животных на 30 день эксперимента было больше по сравнению с животными контрольных групп, реиммунизированных одной вакциной. В группах с рчИЛ-1(3 при дозах вакцины 0,27 или 0,09 мкг/мышь уровень сероконверсии был в 2,3 и 4,5 раза выше (100%; 90,9%) по сравнению с контролем. Уровень сероконверсии в контроле составлял для дозы 0,27 мкг/мышь - 42,8%, 0,09 мкг/мышь - 20%. В группах с рчИЛ-2 количество серопозитивных животных было в 1,7 и 3.4 раза больше (75,0 %; 69,2%) по сравнению с контролем. Отмечено, что уровень иммунного ответа животных, реиммунизированных вакциной в сочетании с рчИЛ-1р, был выше по сравнению с группой животных, реиммунизированных АГ в сочетании с рчИЛ-2 (р<0,05).

Группа серопозитивных животных, выделенная на 15 день эксперимента после первичной иммунизации, была реиммунизирована одной вакциной. К 30 дню все животные остались серопозитивными.

В следующей серии экспериментов оценивали иммуноадъювантное действие комплекса препаратов цитокинов, включающего «Беталейкин (рчИЛ-ф)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», а также препаратов «Аффинолейкин», «Имунофан», которые использованы как на этапе иммунизации, так и реиммунизации. Животных иммунизировали вакциной в дозе 0,27 мкг/мышь (рис. 3).

Результаты проведенных исследований показали, что все исследуемые препараты цитокинов проявляли иммуноадъювантное действие.

15 день 30 день

Сроки эксперимента

□ АГ

■ ЛГ + комплекс цитокинов (рчИЛ-1в и рчИЛ-2)

■ АГ + Аффинолейкин

□ АГ + Имунофан

Рисунок 3. Оценка влияния препаратов цитокинов на выраженность иммунного ответа животных, иммунизированных вакциной против гепатита В в динамике (15 и 30 дни эксперимента).

Введение комплекса, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1р)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», было так же эффективно, как и ранее изученное индивидуальное введение указанных препаратов. Следует отметить, что стимулирующий эффект цитокинов наблюдался как на 15, так и на 30 дни эксперимента. Исключением является препарат «Аффинолейкин», его стимулирующее действие отмечено только на 30 день эксперимента, то есть после повторного введения с вакциной.

При реиммунизации животных в сочетании с комплексом препаратов цитокинов на 30 день эксперимента количество сероположительных животных было в 1,2 раза больше (85,8%) по сравнению с группой животных, иммунизированных одной вакциной (68,6%). При введении вакцины с препаратом «Аффинолейкин» количество сероположительных животных было в 1,2 раза больше (85,7%), с препаратом «Имунофан» в 1,3 раза больше (87,2%) по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, в результате исследований, проведенных на животных без индуцированной иммуносупрессии, установлено, что все используемые препараты цитокинов в виде монопрепаратов или комплекса цитокинов оказывали в различной степени иммуноадъювантное действие при иммунизации животных вакциной против гепатита В. Введение цитокинов одновременно с АГ приводило к увеличению числа серопозитивных животных по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ. Наибольшим стимулирующим эффектом обладал препарат «Беталейкин (рчИЛ-1Р)» по сравнению с другими препаратами цитокинов.

Стимулирующий эффект цитокинов отмечен как после первичной иммунизации животных вакциной против гепатита В, так и после реиммунизации животных, которые

оставались серонегативными через 2 недели после первичной иммунизации, по сравнению с животными, иммунизированными одной вакциной. Меньшие дозы вакцины, используемые в сочетании с цитокинами, вызывали иммунный ответ, сопоставимый с ответом на большие дозы вакцины, вводимые без иммуноадьювантов. 2. Экспериментальные исследования на животных с индуцированной иммуносупрессией.

Состояние иммуносупрессии вызывали двукратным курсом введения циклофосфана (перед иммунизацией и реиммунизацией). Использовали две дозы вакцины - 0,83 мкг и 0,27 мкг/мышъ. Оценивали интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных (опытные группы) по сравнению с уровнем ответа животных без иммуносупрессии (контроль) на 15 день после иммунизации.

В результате проведенных исследований установлено, что иммунный ответ иммунодефицитных животных на одинаковые дозы вакцины был менее выраженным. Количество сероположительных животных в опытной группе было в 1,8 и 1,6 раза меньше (26,1±5,7% и 25,3±5,6%), соответственно двум дозам АГ (0,83 мкг и 0,27 мкг), по сравнению с контрольной группой животных. Количество сероположительных животных в контрольной группе составляло 48,5±6,5% и 40,1 ±6,3% при использовании двух вышеуказанных доз вакцины. Различия между сравниваемыми показателями опытной и контрольной групп статистически достоверны (р<0,05).

Животные опытной и контрольной групп на 15 день исследования были разделены на серонегативных и серопозитивных. Серонегативных животных реиммунизировали одним АГ или АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1 (3)». Схема построения эксперимента представлена на рисунке 4.

Иммунизация АГ

Забор крови НН^ЯВ на 15 день

Реиммунизация

Рисунок 4. Схема экспериментов с использованием цитокинов на этапе реиммунизации. Результаты исследования приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, к 30 дню эксперимента после реиммунизации группы серонегативных животных АГ в сочетании с рчИЛ-1(3 уровень иммунного ответа был значительно выше по сравнению с группой животных, реиммунизированных одним АГ. Так, в опытной группе иммунодефицитных животных, реиммунизированых АГ в

сочетании с рчИЛ-1р, количество серопозитивных животных было в 1,7 и 1,2 раза больше (87,5% и 62,5%) по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ (55,5% и 50,0%), соответственно двум дозам АГ (0,83 и 0,27 мкг/мышь).

В контрольной группе животных без иммуносупрессии, после реиммунизации серонегативных животных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», уровень сероконверсии был в 1,4 раза выше (100%) по сравнению с животными, реиммунизироваными одним АГ (68,6 и 70,0%, соответственно двум дозам АГ). Иммунный ответ иммунодефицитных животных (опытные группы) на одинаковые дозы вакцины был ниже по сравнению с животными без иммуносупрессии (контроль). Однако, следует отметить, что уровень иммунного ответа при использовании цитокинов у иммунодефицитных животных (62,5% - 87,5%) приближается к уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных одним АГ (68,6% - 70%).

Таблица 2.

Оценка выраженностн иммунного ответа серонегативной группы животных после реиммунизации вакциной против гепатита В (30 день эксперимента)

Группа Доза АГ (мкг/мышь) Реиммунизации

АГ АГ +рчШЫР

Контрольная (АГ) (п=70) 0,83 68,6 ± 7,9 100

0,27 70,0 ± 7,8 100

Опытная (ЦФ +АГ) (п=120) 0,83 55,5 ± 6,4 87,5 ±4,3*'**

0,27 50,0 ±6,5* 62,5 ± 6,3*

Серопозитивная группа животных была реиммунизирована одним АГ. У всех животных сохранялась сероконверсия до 30 дня эксперимента.

На следующем этапе исследования оценивали интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных, которым вводили цитокины - «Беталейкин (рчИЛ-1р)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» как на этапе иммунизации, так и реиммунизации (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ в дозах 0,83 или 0,27 мкг/мышь.

Результаты исследований показали, что на 15 день после первичной иммунизации количество сероиоложительных животных, иммунизированных АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчШЫР)», в 1,6 и 1,3 раза больше (42,3±6,4% и 35,1±6,2%), соответственно двум дозам АГ, по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ. После иммунизации АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» - в 1,5 и 1,2 раза больше (39,2±6,3% и 30,6±5,9%) по сравнению с контролем. Уровень сероконверсии в контрольной группе составил 26,1±5,7% и 25,3±5,6%, соответственно двум дозам АГ. Статистически значимое различие показателей отмечено в группе животных (доза

0,83 мкг/мышь), иммунизированных АГ в сочетании с рч11Л-1р, по сравнению с контрольной группой.

Так же, как в предыдущей серии экспериментов, на 15 день животные были разделены на серонегативных, которым повторно вводили АГ или АГ в сочетании с цитокинами, и серопозитивных, которых реиммунизировали одним АГ.

Результаты исследований представлены на рисунке 5.

Как видно из рисунка 5, к 30 дню эксперимента при реиммунизации серонегативных животных АГ в сочетании с препаратами цитокинов уровень иммунного ответа был существенно выше по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ. Так, в группах животных, реиммунизированных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», отмечена 100% сероконверсия соответственно двум дозам АГ 0,83 мкг и 0,27 мкг/мышь. При реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-2 сероконверсия наблюдалась в 85,7% и 100% случаев при двух указанных дозах. Тогда как при реиммунизации одним АГ - 87,5% -82,1% и 66,6% - 80%, соответственно указанным группам животных.

Группа 1 Группа 2

□ АГ

■ АГ + рчИЛ-1в

□ \Г + рчИЛ-2

Группа 1 -

Циклофосфаи + АГ + рчИЛ-1 в Группа 2 -

Циклофосфаи +

0,83 0,27 0,83 0,27 АГ + рчИЛ-2

Девы АГ (мкг/мышь)

Рисунок 5. Оценка влияния цитокинов (рчШЫр и рчИЛ-2) на выраженность иммунного ответа сероиегатиепой группы иммунодефицитных животных после реиммунизации (30 день эксперимента).

Группы сероположительных животных после реиммунизации АГ на 30 день эксперимента сохранили сероконверсию в 100% случаев.

3. Экспериментальные исследования по оценке эффективности иммунизации вакциной против гепатита В на животных с индуцированной иммуносупрессией по уровню специфических А Т.

В данной серии экспериментов оценивали уровень иммунного ответа по концентрации специфических АТ у животных с индуцированной иммуносупрессией (опытные группы) и животных без иммуносупрессии (контроль). На 15 день эксперимента были выделены серопозитивные животные опытной и контрольной групп, которых реиммунизировали одним АГ. При оценке результатов выделяли подгруппы животных с

концентрацией АТ менее 20, от 20 до 100 и выше 100 мМЕ/мл. Определяли также средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) и частоту их выявления в каждой из подгрупп (в %). Результаты оценки уровня специфических АТ в динамике (на 15 и 30 дни эксперимента) приведены в таблицы 3.

Таблица 3.

Оценка концентрации АТ серопозитивной группы животных с иммунодефицитом и без иммунодефицита на 15 и 30 дни эксперимента (иммунизация вакциной против гепатита В)

Группы животных Концепт рация АТ (мМЕ/мл) Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) (Диапазон выявляемых показателей уровня АТ) Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

15 день 30 день

0,83 0,27 0,83 0,27

АГ контроль пая (п=90) <20 15,1±0,8 (12,3-19,6) 64,8±8,1 14,1 ±0,5 (12,9-15,9) 54,5±8,5 14,6±2,1 (12-19) 27,2±7,6

20-100 47,1±11,6 (25-74) 35,2±8,1 43,2±11,1 (27-72) 45,5±8,5 34,5±17,4 (23-86) 25,0±7,3 45,6±12,2 (23-64) 27,2±7,6

>100 420,6±65,2 (170-798) 75,0±7,3 452,0±131 (182-790) 45,6±8,5

ЦФ + АГ опытная (п=90) <20 13,3±1,3 (12-20) 84,5±4,7* 13,5±0,9 (12-19) 80±5,2* 19,1 ±0,4 (18-20) 60,0±10,3*

20-100 41,4±5,8 (23-62) 15,5±4,7* 44,5 ±14,6 (30-59) 20,0±5,2* 25,2±1,5 (21-34) 83,3±4,8* 42,7±4,3 (31-51) 40,0±6,3*

>100 160,5 ±19,6* (141-180) 16,7±4,8*

Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе - в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

Как видно из таблицы 3, уровень иммунного ответа иммунодефицитных животных был ниже по сравнению с животными без иммунодефицита. Указанная закономерность отмечена как после однократного, так и после двукратного введения АГ. Так, на 15 день эксперимента в опытной группе иммунодефицитных животных максимальная концентрация АТ была в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл и частота их выявления в 2,3 раза ниже (15,5% и 20,0%) по сравнению с контрольной группой животных без иммуносупрессии - 35,2% и 45,5%, соответственно двум дозам АГ.

К 30 дню эксперимента (доза 0,83 мкг/мышь) в опытной и контрольной группах животных стали выявляться АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл. При этом в опытной

группе количество животных с указанным уровнем АТ было в 4,5 раза меньше (16,7%) по сравнению с контрольной - 75,0%. При дозе 0,27 мкг/мышь в опытной группе концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной -выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл.

Средние значения концентрации АТ на 30 день эксперимента в опытной группе животных (доза 0,83 мкг/мышь) были в 2,6 раза ниже (160,5 мМЕ/мл) по сравнению с контрольной группой, где средние значения концентрации АТ составляли 420,6 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг отмечена аналогичная закономерность.

Таким образом, интенсивность иммунного ответа иммунодефицитных животных на вакцину против гепатита В ниже по сравнению с животными без иммуносупрессии, об этом свидетельствует как более низкая частота выявления, так и более низкие уровни концентрации специфических АТ, определяемых на 15 и 30 дни эксперимента.

Анализ выделенной серонегативной группы животных будет приведен ниже в таблице 5.

Следующая серия экспериментов проведена на животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией, изначально иммунизированных АГ на фоне введения цитокинов - «Беталейкин (рчИЛ-ф)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)» (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ.

На 15 день эксперимента были выделены группы серопозитивных животных, которых реиммунизировали одним АГ (Табл. 4).

Как видно из таблицы 4, на 15 день эксперимента при двух дозах АГ в опытной группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Животных с указанным уровнем АТ в опытной группе (доза АГ 0,83 мкг/мышь) было в 2,3 раза больше (35,0%) по сравнению с контрольной, иммунизированной одним АГ (15,5%). При дозе АГ 0,27 мкг наблюдалась аналогичная закономерность (соответственно 45% и 20%).

В группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» при двух дозах АГ, максимальная концентрация АТ находилась также в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Количество животных с указанной концентрацией АТ было в 2,4 и 1,5 раза больше (37,5%; 31,5%) по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных без цитокинов (15,5% и 20,0%), соответственно двум дозам АГ.

В группе животных с рчИЛ-ф (доза 0,83 мкг/мышь) на 30 день эксперимента стали выявляться АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл. Частота их выявления была в 2,7 раза больше (44,4%) по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ, где количество животных с указанной концентрацией АТ составляло 16,7%. При дозе АГ 0,27 мкг/мышь в опытной группе с рчИЛ-1Р у 20% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл.

Таблица 4.

Оценка концентрации АТ серопозитивной группы иммунодефицитных животных на 15 и 30 дни эксперимента (иммунизация вакциной против гепатита В на фоне введения цитокинов)

Группы животных Концентр ация АТ (мМЕ/мл) Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) (Диапазон выявляемых показателей уровня АТ) Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

15 день 30 день

0,83 0,27 0,83 0,27

ЦФ+АГ контроль пая (п = 90) <20 13,3±1,3 (12-20) 84,5±4,7 13,5±0,9 (12-19) 80±5,2 19,1 ±0,4 (18-20) 60,0±10,3

20-100 41,4±5,8 (23-62) 15,5±4,7 44,5 ±14,6 (30-59) 20,0±5,2 25,2±1,5 (21-34) 83,3±4,8 42,7±4,3 (31-51) 40,0±6,3

>100 160,5±19,6 (141-180) 16,7±4,8

ЦФ + АГ + рчШЫр опытная (п = 89) <20 18,4±0,4* (17-20) 65,0±6,2* 19,1 ±0,4* (17-20) 55,0±5,7* 17,6±1,2 (17-20) 16,8±4,8 17,8±0,7 (16,2-19,8) 40,0±6,3*

20-100 39,2±7,6 (21-80) 35,0±6,2* 46,3±3,2 (30-59) 45,0±5,7* 42,4±6,3* (24-69) 38,8±6,3* 30,7±3,2* (30-37) 40,0±6,3

>100 368,0±52,5* (153-525) 44,4±6,4* 158,5±6,5* (152-165) 20,0±5,2*

ЦФ + АГ + рчИЛ-2 опытная (п = 90) <20 17,1±0,5* (15-19) 62,5±6,3* 17,9±0,3* (17-19,6) 68,5±6,0* 18,6±0,9 (18-20) 23,2±5,4*

20-100 32,8±5,0* (20-48) 37,5±6,3* 26,8±2,2* (21,2-32) 31,5±6,0* 43,0±3,9* (20-56) 78,5±5,3* 40,7±6,3 (20-74) 61,5±6,3*

>100 215,0±34,9 (180-284) 21,5±5,3 156,0±25,2* (131-181) 15,3±4,6*

В группе животных, иммунизированных АГ с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)» при дозе АГ 0,83 мкг/мышь, количество животных с концентрацией АТ выше 100 мМЕ/мл составляло 21,5%, что в 1,3 раза больше, чем в контрольной группе, иммунизированной одним АГ - 16,7%. При дозе АГ 0,27 мкг/мышь в опытной группе у 15,3% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл. В контрольной группе максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл.

Средние значения максимальных концентраций ЛТ (выше 100 мМЕ/мл) на 30 день эксперимента в опытной группе с рчИЛ-1Р составляли 368,0 и 158,5 мМЕ/мл, с рчИЛ-2 -215,0 и 156,0 мМЕ/мл, соответственно указанным дозам АГ. В контрольной группе животных, иммунизированных одним АГ, концентрация АТ была существенно ниже. Средняя концентрация АТ при дозе 0,83 мкг составляла 160,5 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ были в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл (среднее значение - 42,7 мМЕ/мл).

В результате проведенных исследований на иммунодефицитных животных установлено, что частота выявления специфических АТ и средние значения концентрации АТ были значительно выше в группах животных, иммунизированных вакциной в сочетании с препаратами цитокинов, по сравнению с контрольными животными, иммунизированными одной вакциной.

В следующем разделе работы проанализированы результаты обследования животных с индуцированной иммуносупрессией, иммунизированных одним АГ, которые оставались серонегативными до 15 дня после первичной иммунизации. Контролем служили животные без иммуносупрессни. Животные опытной и контрольной групп были реиммунизированы АГ или АГ в сочетании с препаратом «Беталейкин (рчИЛ-1Р)». Концентрацию специфических АТ в исследуемых группах животных оценивали после реиммунизации (30 день эксперимента). Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, в опытной группе иммунодефицитных животных после реиммунизации одним АГ (доза 0,83 мкг) максимальные концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной группе выявлялись АТ выше 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опытной группе составляли 45,0 мМЕ/мл, в контрольной - 297,2 мМЕ/мл.

После реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-1р в опытной группе иммунодефицитных животных появились АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, и количество животных с указанной концентрацией АТ составляло 22,5%, что в 3,8 раза меньше по сравнению с контролем - 87,5%.

При реиммунизации АГ в дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ в опытной группе находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл и выявлялись у 50,0% животных, что в 1,4 раза меньше по сравнению с контролем - 70%. При использовании АГ в сочетании с рчИЛ-1р в опытной группе максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, в контрольной - выше 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опытных группах составили 21,9 мМЕ/мл (реиммунизация одним АГ) и 52,2 мМЕ/мл (реиммунизация АГ с рчИЛ-1Р). В контроле - 42,0 и 414,5 мМЕ/мл, соответственно указанным группам.

Таблица 5.

Оценка концентрации АТ на 30 день эксперимента у животных, которые оставались серонегатиеньши после первичной иммунизации вакциной против гепатита В

Иммунизация животных Концентра ция АТ (мМЕ/мл) Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) (Диапазон выявляемых показателей АТ) Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

Ренммунизация животных

АГ АГ + 54 ИЛ-10

0,83 0,27 0,83 0,27

АГ Контрольная (п = 60) <20 16,5±1,4 (15-19,5) 30,0±7,8 19,0±0,1 (17-19) 9,0±4,9

20-100 65,0±16,2 (39-94) 42,8±8,4 42,0±4,5 (24-60) 70,0±7,8 28,0±2,0 (26-30) 12,5±5,6 52,2±7,9 (21-70) 54,5±8,5

>100 297,2±131 (160-90) 57,2±8,4 597±66 (282-800) 87,5±5,6 414,5±139,2 (180-680) 36,5±8,2

ЦФ + АГ опытная (п = 58) <20 17,5±0,9 (16,3-20) 22,0±5,3 16,3±0,8 (15-19) 50,0±6,5* 19,3±0,3 (19-20) 39,5±6,3 18,2±0,8 (16-20) 37,5±6,3*

20-100 45,0±18,0* (22-80) 78,0±5,3* 21,9±0,5* (20-23) 50,0±6,5* 46,0±15,3* (20-70) 38,0±6,3* 52,2±13,6 (22-85) 62,5±6,3*

>100 240±121* (120-360) 22,5±5,4*

В результате проведенных исследований установлено, что средние значения концентрации АТ и частота встречаемости АТ в опытных группах иммунодефицитных животных были ниже по сравнению с животными контрольных групп без иммунодефицита. При реиммунизации АГ с рчИЛ-1Р интенсивность иммунного ответа была выше по сравнению с животными, реиммунизированными одним АГ. Уровень иммунного ответа иммунодефицитных животных в случае их реиммунизации АГ в сочетании с цитокинами приближался к уровню ответа животных без иммунодефицита, реиммунизированных одним АГ.

В следующей серии экспериментов проанализированы результаты обследования иммунодефицитных животных, изначально иммунизированных АГ в сочетании с препаратами цитокинов, которые оставались серонегативными до 15 дня после первичной иммунизации. Выделенные группы серонегативных животных реиммунизировали АГ или АГ в сочетании с препаратами цитокинов - «Беталейкин (рчИЛ-1Р)» или «Ронколейкин (рчИЛ-2)» (опытные группы). Контролем служили иммунодефицитные животные, иммунизированные одним АГ. Концентрацию

специфических АТ оценивали после реиммунизации животных на 30 день эксперимента. Результаты исследования приведены в таблицы 6.

Как видно из таблицы 6, в опытной группе животных, иммунизированных АГ (доза 0,83 мкг) на фоне введения рчИЛ-1р, после реиммунизации одним АГ у 6,3% животных выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контрольной группе максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. При дозе 0,27 мкг/мышь максимальные концентрации АТ в исследуемых группах были в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл, но частота выявления указанной концентрации АТ в опытной группе в 1,7 раза выше (87,5%) по сравнению с контрольной группой, иммунизированной одним АГ (50%).

После реиммунизации АГ в сочетании с рчИЛ-1р, концентрация АТ в сравниваемых группах была выше 100 мМЕ/мл, при этом частота выявления АТ в группе животных с рчИЛ-1р (доза 0,83 мкг) была в 1,5 раза выше (33,4%), по сравнению с контрольной группой иммунодефицитных животных (22,5%). Средняя концентрация АТ в опыте составила 288,0 мМЕ/мл, в контроле - 240,0 мМЕ/мл.

В группе животных, иммунизированных АГ (доза 0,83 мкг) с препаратом «Ронколейкин (рчИЛ-2)», после реиммунизации одним АГ у 25% животных выявлялись АТ в концентрации выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контроле максимальные значения концентрации АТ находились в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опыте - 142,0 мМЕ/мл, в контроле - 45,0 мМЕ/мл.

После реиммунизации АГ с рчИЛ-2 в опытной группе частота выявления и средняя концентрация АТ была выше по сравнению с контрольной группой. Так при дозе 0,83 мкг после реиммунизации АГ с рчИЛ-2 у 41,7% животных выявлялись АТ выше 100 мМЕ/мл, тогда как в контроле концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл. Средние значения концентрации АТ в опыте составили 464,0 мМЕ/мл, в контроле -45,0 мМЕ/мл.

При дозе АГ 0,27 мкг после реиммунизации животных АГ или АГ с рчИЛ-2 отмечена аналогичная закономерность. У 45,4% животных концентрация АТ была выше 100 мМЕ/мл (средние значения концентрации АТ 190,1 мМЕ/мл). Тогда как в контроле максимальная концентрация АТ находилась в пределах от 20 до 100 мМЕ/мл (средние значения концентрации АТ 21,9 мМЕ/мл).

Таблица 6

Оценка концентрации АТ в сыворотке крови на 30 день эксперимента у иммунодефицитных животных, которые оставались серонегативньши после первичной иммунизации вакциной против гепатита В

Группы животных Концентрация АТ (мМЕ/мл) Средние значения концентрации АТ (мМЕ/мл) (Диапазон выявляемых показателей АТ) Количество животных с указанным уровнем АТ(%)

Рсиммунизация животных

АГ АГ + рчИЛ-13 АГ + рчИЛ-2

0,83 0,27 0,83 0,27 0,83 0,27

ЦФ+АГ (контроль) (п = 72) <20 17,5±0,9 (16,3-20) 22,0±5,3 16,3±0,8 (15-19) 50,0±6,5 19,3±0,3 (19-20) 39,5±6,3 18,2±0,8 (16-20) 37,5±6,3 - -

20-100 45,0±18,0 (22-80) 78,0±5,3 21,9±0,5 (20-23) 50,0±6,5 46,0±15,3 (20-70) 38,0±6,3 52,2±13,6 (22-85) 62,5±6,3

>100 - - 240±12,1 (120-360) 22.5±5,4 - - -

ЦФ + АГ + рчИЛ-1р (п = 70) <20 18,1±0,8 (16-20) 25,1±5,6 17,0±1,0 (16-18) 12,5±4,3* 19,0±0,6 (18-20) 16,6±4,8* 17,6±1,6 (16,0-19,2) 11,1 ±4,0*

20-100 32,2±6,0 (22-80) 68,6±6,0 33,4±5,4* (21-98) 87,5±4,3* 64,8±8,4 (29-98) 50,0±6,5 51,0±6,5 (32-90) 61,2±6,3

>100 143±11* (132-154) 6,3±3,1* 288±74,5** (141-567) 33,4±6,1** 192,0±31,2*** (138-306) 27,7±5,8*'**

ЦФ + АГ + рчИЛ-2 (п = 74) <20 - 17,9±0,4 (17,2-18,4) 30,0±5,9* - - - 18,7±0,8 (18-20) 36,3±6,2*

20-100 43,6±8,9 (21-94) 75,0±5,6 35,8±3,3* (26-45) 50,0±6,5 46,6±5,7 (30-78) 58,3±6,4* 45,0±3,0 (42-48) 18,3±5,0*

>100 142,0±9,8* (134-141) 25,0±5,6* 113,5±11,5* (102-125) 20,0±5,2* 464±13,8*'** (100-820) 41,7±6,4*'** 190,1±3,5*'** (131-314) 45,4±6,4*-**

Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе

** - различие достоверно (р<0,05) между подгруппами животных, рсиммунизированных АГ или АГ в сочетании с цитокинами - в таблице представлены результаты 3-х экспериментов

В результате проведенных исследований установлено, что интенсивность иммунного ответа в группах иммунодефицитных животных, иммунизированных и реиммунизированных на фоне введения препаратов цнтокинов, выше по сравнению с контрольной группой иммунодефицитных животных, иммунизированных одним АГ.

Таким образом, проведенные исследования показали, что исследуемые препараты цитокинов являются эффективными иммуноадъювантами, специфически усиливающими иммунный ответ экспериментальных животных при иммунизации вакциной против гепатита В. Наиболее демонстративно иммуноадъювантное действие цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В в случае использования малых доз АГ проявляется на модели животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрсссией, по сравнению с животными без иммуносупрессии. У животных с иммуносупрессией при первичной иммунизации АГ с цитокинами или реиммунизированных на фоне введения цитокинов, наблюдается более выраженный иммунный ответ по сравнению с животными, иммунизированными АГ без цитокинов. Отмечен более высокий уровень сероконверсии и большая частота встречаемости высоких концентраций специфических АТ. В случае использования исследуемых препаратов цитокинов как на этапе иммунизации, так и реиммунизации иммунодефицитных животных, уровень иммунного ответа приближается к уровню ответа животных без иммуносупрессии, иммунизированных одним АГ.

Результаты проведенных исследований предопределяют возможность использования лекарственных препаратов цитокинов не только с терапевтической целью, но также в качестве иммуноадъювантов для обеспечения формирования адекватного поствакцинального иммунного ответа, что наиболее значимо для лиц с проявлениями иммунодефицита.

Валидация методов определения специфической активности и разработка СО препаратов цитокннов - рчФНОа и рчФНОр.

Для контроля качества как коммерческих, так и вновь разрабатываемых лекарственных препаратов МИБП должны использоваться стандартизованные аттестованные методы. Это в полной мере относится к методам оценки специфической активности препаратов МИБП. Кроме того, при осуществлении контроля производственных процессов, а также контроля качества готовых лекарственных средств, необходимо использование стандартных образцов.

В настоящее время разрабатываются новые отечественные лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков цитокинов человека. Одними из таких препаратов являются «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)». Для указанных препаратов выполнен полный объем доклинических исследований, в настоящее время они находятся на второй фазе клинических испытаний.

С целью обеспечения контроля их качества следующий раздел работы включал исследования по валидации методики определения специфической активности указанных препаратов цитокинов (рчФНОа и рчФНОР) и аттестации соответствующих ОСО.

Для определения повторяемости и воспроизводимости методики, оценки колебаний результатов анализа проводили исследования с разными схемами построения опытов - при одновременной постановке на одном и двух планшетах одного или нескольких образцов в одной лаборатории, а также в разные дни на разных планшетах нескольких образцов в двух лабораториях.

Исследования проведены в сравнении с Международными стандартными образцами, аттестованными «NIBSC» (Великобритания) - рчФНОа, активность 40 ООО МЕ/мкг белка; рчФНОр, активность 150 ООО МЕ/мкг белка.

В результате проведенного исследования валидированы методики определения специфической активности препаратов цитокинов - рчФНОа и рчФНОр. Используя валидированные методики, аттестованы два ОСО определения специфической активности соответствующих препаратов рчФНОа и рчФНОр. Аттестованная активность ОСО рчФНОа 3,1 х 104 ± 0,3 х 104 МЕ/мкг белка, коэффициент вариации 25,1%. Активность ОСО рчФНОР 6,8 х 104± 0,6 х 104 МЕ/мкг белка, коэффициент вариации -19,1%.

Для определения срока годности ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОР была проведена оценка стабильности препаратов методом ускоренного теста - при воздействии повышенных температурных режимов (37°С, 65°С, 95°С) в течении различных промежутков времени (от 5 часов до 6 недель). Контролем служили образцы препаратов рчФНО, хранившиеся при температуре от 2 до 8 °С в течение 2-3,5 лет.

Проведенные исследования показали, что активность препаратов рчФНОа и рчФНОр под воздействием различных температурных и временных режимов не меняется. Результаты наших исследований согласуются с данными ВОЗ, касающихся стабильности стандартных образцов препаратов рчФНО. Согласно данным ВОЗ, специфическая активность стандартных образцов препаратов рчФНО снижается на 0,01% в течение одного года в условиях хранения при температуре от 2 до 8°С.

Установлен срок годности разработанных и аттестованных ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОР - 3 года.

Оформлены и утверждены два Свидетельства и две Инструкции по применению -ОСО определения специфической активности рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и ОСО определения специфической активности рчФНОр (ОСО 42-28-401-08). Разработанные ОСО внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

выводы

1. На экспериментальных моделях установлено, что препараты цитокинового ряда «Беталейкин (рчИЛ-1Р)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан» усиливают иммунный ответ животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

2. Иммуноадъювантное действие цитокинов на интенсивность иммунного ответа при иммунизации вакциной против гепатита В наиболее демонстративно проявляется на животных с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией.

3. При иммунизации или реиммунизацни животных вакциной в сочетании с цитокинами, используемыми в виде монопрепаратов или комплекса, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1Р)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», наблюдается более высокий уровень сероконверсии и частота выявления высоких концентраций специфических антител по сравнению с животными, иммунизированными без цитокинов.

4. У животных с индуцированной иммуносупрессией и без иммуносупрессии, иммунизированных и реиммунизированных вакциной против гепатита В в сочетании с цитокинами, уровень сероконверсии как на 15, так и на 30 сутки был существенно выше по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных вакциной без цитокинов.

5. Концентрация специфических антител у животных, иммунизированных и реиммунизированных вакциной с цитокинами, в 1,2 - 4,5 раза превышала уровень антител животных, иммунизированных без цитокинов.

6. Дозы вакцины, которые не индуцировали выработку антител, вызывали развитие иммунного ответа в случае их использования с цитокинами. Интенсивность иммунного ответа на малые дозы вакцины, используемой в сочетании с исследованными препаратами цитокинов, соответствует уровню ответа на большие дозы вакцины, вводимой без цитокинов.

7. Проведена валидация метода определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОр с установлением следующих характеристик -воспроизводимости, повторяемости, линейности.

8. Разработаны два отраслевых стандартных образца определения специфической активности - ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОр. Составлены и утверждены нормативные документы - на ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОр (Свидетельства и Инструкции по применению соответствующих ОСО). Разработанные ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и рчФНОР (ОСО 42-28-401-08) внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никитина Т.Н. Стимуляция поствакцинального иммунного ответа препаратами цитокинов при иммунизации животных вакциной против гепатита В // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых. «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». Уфа.

- 2004. - С. 67.

2. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов / Авдеева Ж.И. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва. - 2006. - С. 73.

3. Никитина Т.Н. Препараты цитокинов как иммуноадъюванты при иммунизации вакциной «Энджерикс» / Авдеева Ж.И., Карпова Е.В. // Шестая межд. конференция «Клинические исследования лекарственных средств». - 2007. - С. 82-83.

4. Авдеева Ж.И. Показатели клеточного иммунного ответа при иммунизации мышей антирабической вакциной на фоне цитокинов / Акользина С.Е., Алпатова H.A., Никитина Т.Н., Медуницын Н.В. // Цитокины и воспаление. - 2008. - Т. 7, № 4. -С. 15-20.

5. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов / Авдеева Ж.И. // Биопрепараты. - 2008. - № 1 (29). - С. 16-20.

6. Никитина Т.Н. Разработка ОСО фактора некроза опухолей альфа / Авдеева Ж.И., Петухов В.Г., Масычева В.И. // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». Москва. -2008.-С. 91.

7. Никитина Т.Н. Иммуноадъювантное действие цитокинов при иммунизации животных вакциной против гепатита В / Авдеева Ж.И. // Цитокины и воспаление.

- 2009. - Т. 8,№1.-С. 28-31.

8. Никитина Т.Н. Цитокины как иммуноадъюванты / Авдеева Ж.И., Алпатова H.A. // Материалы XIII Всероссийскойго Научного форума с межд. участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». 8-12 июня 2009. Мед. иммунология - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 328-329.

9. Авдеева Ж.И. Отраслевые стандартные образцы определения специфической активности препаратов рекомбинантных цитокинов человека / Петухов В.Г., Никитина Т.Н., Алпатова H.A. // Сб. Тр. X Межд. Конгресса. «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвящ. 100-летию со дня рожд. акад. АМН А.Д. Адо, 20-23 мая 2009. Казань. - 2009. - С. 459-460.

Ю.Авдеева Ж.И. Влияние цитокинов на иммуногенные свойства вакцины против клещевого энцефалита / Акользина H.A., Алпатова H.A., Никитина Т.Н., Ращепкина М.Н., Медуницын Н.В. И Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8, №2.-С. 16-21.

11. Никитина Т.Н. Изучение иммуноадьювантного действия цитокинов на экспериментальных моделях / Авдеева Ж.И. // Цитокины и воспаление. - 2010.-Т. 9, №2.-С. 31-34.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген AT - антитела

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ИФ - интерферон ИЛ - интерлейкин

КСФ - колониестимулирующий фактор

ME - международная единица

МСО - международный стандартный образец

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

ОСО - отраслевой стандартный образец

рчИЛ-ip - рекомбинантный ИЛ-ip человека

ФИО - фактор некроза опухолей

ЦФ - циклофосфан

NIBSC - National Biological Standards Board

Отпечатано в ООО «КопиМастер» 119049, г. Москва, Калужская пл., д. 1 www.copymaster.biz; e-mail: info@copymaster.biz; тел: (495) 229-56-62 Заказ № 106. Тираж 100 экземпляров. 08.05.2010 г.

Оглавление диссертации Никитина, Татьяна Николаевна :: 2010 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Иммунобиологические свойства цитокинов.

1.1. Общие представления о «цитокиновой сети».

1.2. Участие цитокинов в формировании иммунного ответа.

2. Цитокины и поствакцинальный иммунитет.

2.1. Участие цитокинов в вакцинальном процессе.

2.2. Адъювантные свойства цитокинов.

3. Иммунобиологические препараты на основе цитокинов.

4. Вопросы стандартизации методов контроля препаратов цитокинов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

ГЛАВА 3. Изучение адъювантных свойств препаратов цитокинов при иммунизации экспериментальных животных вакциной против гепатита В.

3.1. Исследования на животных без иммуносупрессии.

3.2. Исследования на животных с индуцированной иммуносупрессией.

ГЛАВА 4. Разработка ОСО определения специфической активности рчФНОа и рчФНО(3.

4.1. Валидация методики определения специфической активности препарата рчФНОа и аттестация ОСО рчФНОа.

4.2. Валидация методики определения специфической активности препарата рчФНОр и аттестация ОСО рчФНОр.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Никитина, Татьяна Николаевна, автореферат

Одна из основных проблем современной иммунологии связана с вопросами регуляции иммунного ответа. Интенсивность иммунного ответа на введение чужеродного антигена (АГ) зависит от многих факторов, таких как функциональное состояние организма, его генетических особенностей, а также свойств самого АГ, дозы и схемы его введения (60, 71). Особую значимость вопросы регуляции иммунного ответа приобретают в связи с необходимостью обеспечения формирования надежного поствакцинального иммунитета.

В настоящее время отмечается рост как острых, так и хронических .инфекционных заболеваний. Одним из основных и надежных способов профилактики распространения инфекционных болезней является вакцинация. Лица с длительно протекающими заболеваниями (хронические воспалительные и инфекционные заболевания, гепатиты, туберкулез, ВИЧ-инфекция, хроническая почечная патология, лица, находящиеся на гемодиализе и др.) составляют группу риска, которая является наиболее восприимчивой к инфекциям и должна быть вакцинирована в первую очередь.

Необходимость проведения вакцинации лиц с хронической патологией обусловлена также тем, что отдельные вирусные вакцины не только создают противоинфекционный иммунитет, но и препятствуют развитию онкологических заболеваний, возникающих под влиянием вирусной инфекции (при вакцинации против гепатита В происходит профилактика первичного рака печени). Известно, что лица с проявлениями иммунодефицита наиболее подвержены риску развития вирусных инфекций (60, 91).

На введение вакцины лица с иммунодефицитом отвечают слабо или не отвечают совсем. Кроме того, существуют группы людей с сильной и слабой иммунной активностью, обусловленной генетическими особенностями организма. Вопрос обеспечения адекватного иммунного ответа на вакцинацию у лиц с ослабленной иммунной активностью и с проявлениями иммунодефицита является актуальным. Решению этой проблемы способствует поиск и разработка средств, направленных на увеличение эффективности вакцинопрофилактики.

Повышение эффективности вакцинации достигается путем использования адъювантов - веществ, которые усиливают иммунный ответ при одновременном их введении с АГ. Известно, что при высокой степени очистки АГ снижается его иммуногенная активность. Поэтому для вакцин, созданных на основе высокоочищенных гомогенных АГ (анатоксины, рекомбинантные и синтетические вакцины), необходимо использование адъювантов.

Согласно современным представлениям, механизм действия большинства используемых в настоящее время адъювантов опосредуется через активацию эндогенных цитокинов. В начале девяностых годов было высказано предположение об использовании цитокинов в качестве адъювантов вакцин. Это обусловлено тем, что в развитии иммунного ответа самое непосредственное участие принимают цитокины, которые являются низкомолекулярными гликопротеинами, секретируемыми различными клетками организма, выполняющими .иммунорегуляторную функцию. Цитокины характеризуются специфичностью действия, определяют тип развития иммунного ответа преимущественно по гуморальному или клеточному. В зависимости от типа иммунного ответа на ту или иную вакцину предпочтение отдается адъювантам целенаправленного избирательного действия, стимулирующим развитие адекватного иммунного ответа (41, 47).

Имеются сообщения об исследовании адъювантных свойств ряда цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФу, ФНОа, КСФ, при иммунизации экспериментальных животных бактериальными и вирусными АГ (3, 51, 161, 173, 234, 241). Эффективность ИЛ-1 показана при вакцинации против гепатита В, инфекций, вызванных стрептококками и пневмококками, использовании гриппозной вакцины (121, 221). ИЛ-2 в качестве адъюванта использован для повышения иммуногенности вакцины БЦЖ и гриппозной (192), в экспериментальных исследованиях - антирабической вакцины (7, 218, 220), в ветеринарии - вакцин против ящура, бронхопневмоний, вирусных диарей крупного рогатого скота (91).

В настоящее время, благодаря достижениям молекулярной биологии, разработаны лекарственные препараты на основе рекомбинантных белков цитокинов. Учитывая широкий спектр биологической активности, препараты цитокинов могут быть использованы не только для проведения цитокинотерапии, но и в качестве иммуноадъювантов (53, 54, 60, 87).

Для оценки качественных и количественных характеристик медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), включая препараты рекомбинантных цитокинов, необходимо использование валидированных и аттестованных методов контроля показателей качества, и прежде всего, оценку специфической активности, а также использование стандартных образцов (14, 29, 74).

Необходимость валидации методов контроля МИБП определена международными документами, рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), а также отечественными нормативными документами. При отсутствии Международных стандартных образцов важное место занимают отечественные отраслевые стандартные образцы, использование которых обеспечивает проведение качественного контроля препаратов МИБП (23, 32). Изучение вопросов стандартизации и валидации методов оценки качества МИБП по показателю специфической активности, включая лекарственные препараты цитокинов, является актуальным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-1{3)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан» на интенсивность иммунного ответа животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

4. Изучить влияние цитокинов на интенсивность иммунного ответа по уровню частоты сероконверсии и концентрации в сыворотке крови специфических антител (AT).

5. Провести валидацию методов определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОР с определением следующих характеристик - подлинность, воспроизводимость, повторяемость, линейность.

6. Разработать и аттестовать отраслевые стандартные образцы (ОСО) рчФНОа и рчФНОР для определения специфической активности препаратов «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОР)». Разработать нормативную документацию на стандартные образцы (ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОр).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На экспериментальных моделях показано, что исследованные препараты цитокиновового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-ip)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан», оказывают иммуноадъювантное действие при иммунизации экспериментальных животных вакциной против гепатита В.

Одновременное введение вакцины против гепатита В с препаратами цитокинов повышает интенсивность иммунного ответа животных, что сопровождается увеличением уровня сероконверсии и повышением в сыворотке концентрации специфических AT по сравнению с группой животных, иммунизированных вакциной без цитокинов.

Установлено, что при иммунизации животных низкими дозами вакцины выраженный иммунный ответ развивается только в случае использования вакцины в сочетании с цитокинами. При этом иммунный ответ на вакцину, вводимую с цитокинами, приближается к ответу, который развивается на большую дозу вакцины без цитокинов.

Проведена валидация методов определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОр. Разработаны и аттестованы ОСО определения специфической активности, оформлены нормативные документы на ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНО(3 (ОСО 42-28-401-08).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты проведенных экспериментальных исследований показали, что изученные препараты цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-ip)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин», а также препарат «Имунофан», повышают уровень иммунного ответа на специфический АГ вакцины против гепатита В, что свидетельствует о перспективности использования указанных препаратов в качестве адъювантов при вакцинации.

Для усовершенствования и стандартизации методов контроля качества препаратов «Альнорин (рчФНОа)» и «Бефнорин (рчФНОр)» проведена валидация методов определения их специфической активности и подлинности. Разработаны два ОСО, утверждены Свидетельства и Инструкции по применению - ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и ОСО рчФНОр (ОСО 42-28-401-08), которые внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Разработанные и аттестованные ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОр используются при контроле качества указанных препаратов по показателю специфической активности.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На экспериментальных моделях животных (без иммуносупрессии и с индуцированной циклофосфаном иммуносупрессией) показана эффективность использования исследованных препаратов цитокинового ряда - «Беталейкин (рчИЛ-ip)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарата «Имунофан», в качестве адъювантов при иммунизации вакциной против гепатита В.

При одновременном введении вакцины с препаратами цитокинов отмечена их способность усиливать иммунный ответ. У животных наблюдается более высокая частота сероконверсии и большая концентрация специфических AT по сравнению с животными, иммунизированными вакциной без цитокинов.

На примере валидации методов определения специфической активности препаратов цитокинов рчФНОа и рчФНОр предложен подход к валидации методов оценки специфической активности и других препаратов цитокинов. Установленные в процессе валидации характеристики позволили аттестовать два ОСО препаратов цитокинов - рчФНОа и рчФНО(3.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы и двух приложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 103 отечественных и 157 иностранных источников.

Заключение диссертационного исследования на тему "Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация"

ВЫВОДЫ

1. На экспериментальных моделях установлено, что препараты цитокинового ряда «Беталейкин (рчИЛ-ip)», «Ронколейкин (рчИЛ-2)», «Аффинолейкин» и препарат «Имунофан» усиливают иммунный ответ животных при иммунизации вакциной против гепатита В.

3. При иммунизации или реиммунизации животных вакциной в сочетании с цитокинами, используемыми в виде монопрепаратов или комплекса, включающего «Беталейкин (рчИЛ-1|3)» и «Ронколейкин (рчИЛ-2)», наблюдается более высокий уровень сероконверсии и частота выявления высоких концентраций специфических антител по сравнению с животными, иммунизированными без цитокинов.

7. Проведена валидация метода определения специфической активности препаратов рчФНОа и рчФНОР с установлением следующих характеристик - воспроизводимости, повторяемости, линейности.

8. Разработаны два отраслевых стандартных образца определения специфической активности - ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОр. Составлены и утверждены нормативные документы - на ОСО рчФНОа и ОСО рчФНОР (Свидетельства и Инструкции по применению соответствующих ОСО). Разработанные ОСО рчФНОа (ОСО 42-28-400-08) и рчФНОР (ОСО 42-28-401-08) внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Никитина, Татьяна Николаевна

1. Абрамова Н.Н., Симбирцев А.С., Долгушин И.И. Влияние Бестима и Беталейкина на иммунный статус больных с вторичными иммунодефицитными состояниями при вакцинации против вирусного гепатита В // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 4. - С. 29-35.

2. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Акользина С.Е. и др. Иммуноадьювантный эффект цитокинов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. - № 3. -С. 19-22.

3. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Акользина С.Е. и др. Цитокины и вакцины // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. - № 3. - С. 2227.

4. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Показатели клеточного иммунного ответа при иммунизации мышей антирабической вакциной на фоне цитокинов // Цитокины и воспаление. Т. 7, № 4. -2008.-С. 15-20.

5. Авдеева Ж.И. Разрабатываемые препараты для цитокинотерапии // Биопрепараты. 2005. - № 3 (19). - С. 2-6.

6. Авдеева Ж.И. Цитокины как иммунобиологические препараты // Биопрепараты. 2004. - № 4 (16). - С. 2-6.

7. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Действие цитокинов на протективные свойства антирабической вакцины // Цитокины и воспаление. Т. 6, № 2. - 2007. - С. 46-50.

8. Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В. Препараты системы цитокинов // Цитокины и воспаление. 2002. - Т. 1, № 2. - С. 33.

9. Азнабаева Л.Ф., Симбирцев А.С., Арефьева Н.А. Влияние терапии рекомбинантным интерлейкином-1 бета на продукцию цитокинов лейкоцитами крови у больных хроническим гнойным риносинуситом //

10. Новости оториноларингол. логопатологии. 2001. - № 2 (26). - С. 173-175.

11. Акользина С.Е. Цитокины в вакцинах и их адъювантные свойства // Автореф. Дис. .канд. мед. наук. М., 1996. - 30 с.

12. П.Арчакова Л.И., Елкин А.В., Скворцова Л.А. и др. Ронколейкин в комплексном режиме терапии туберкулеза легких // Биопрепараты. -2008. № 4 (32). - С. 16-19.

13. Бережная Н.М. Иммунореабилитация и злокачественный рост: надежда и реальность // Intern. J. Immunorehabilitation. 1999. - № 11. - С. 27-35.

14. Бисенков Л.Н., Симбирцев А.С., Золотарев Д.В. и др. Местное применение рекомбинантного интерлейкина-1 Р в комплексном лечении больных с острыми абсцессами легких // Вестник хирургии. 2001. -Т. 160, №3,-С. 20-23.

15. Борисов В.А., Гаврилов Б.М., Горшков В.Б. и др. // Межлабораторная аттестация стандартных образцов при малом количестве лабораторий. Стандартные образцы. 2006. - № 2. - С. 35-41.

16. Бродовская О.Б., Бачерикова Е.А., Симбирцев А.С. Эффективность местного применения Беталейкина (рекомбинантного интерлейкина-1 бета) у больных хроническим тонзиллитом // Цитокины и воспаление. -2003.-Т. 2, № 3. С. 9-12.

17. Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов. МУ 3.3.2.1886-04. М., 2004. С. 50.

18. Воробьев А.А. Микробиология и иммунология // М.: Медицина, 1999. -464 с.

19. Волкова Р.А. Система контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов химическими и иммунохимическими методами // Автореф. Дис. . докт. биол. наук. М., 2009. - 46 с.

20. ГОСТ Р 52249-2004. Национальный стандарт Российской Федерации. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. М. Издательство стандартов. 2004. - С. 211.

21. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. Госстандарт России. М., 2002. С. 23.

22. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике. Госстандарт России. М., 2002. С. 42.

23. ГОСТ РМГ 29-99 ГСИ. Метрология. Основные требования и определения. Издательство стандартов. 2003. - ИПК. С. 62.

24. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства интерлейкина-1 человека // Цитокины и воспаление. 2005. - Т. 4, № 2. -С. 3-21.

25. Дворкин В.И. // Внутрилабораторный контроль качества точности результатов измерений по стандартам ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ 57256-2002. Ж. Партнеры и конкуренты. М., 2003. № 1. - С. 26-39.

26. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. 2003. - Т. 2, № 3. - С. 20-35.

27. Добровинский И.Е. // Государственная служба стандартных образцов веществ и материалов. Ж. Стандартные образцы. Екатеринбург, 2005. -№ 1.-С. 11-14.

28. Добровинский И.Е. // РЕМКО Комитет ИСО по стандартным образцам. Ж. Стандартные образцы, 2005. - № 1. - С. 43-48.

29. Егорова В.Н., Смирнов М.Н. Новые возможности иммунотерапии с использованием «Ронколейкина» рекомбинантного интерлейкина-2 человека //Terra Medica, 1999. - № 2. - С. 15-17.

30. Карпов И.А., Долгушин И.И., Симбирцев А.С. Использование цитокинотерапии в реконструктивно-восстановительной хирургии головы и шеи // Цитокины и воспаление. 2005. - Т. 4, № 4. - С. 22-25.

31. Костинов М.П. Вакцинация детей с нарушенным состоянием здоровья. -М., 2000. 78 с.

32. Кетлинский С, А., Калинина Н.М. Иммунология для врача // СПб.: Гиппократ, 1998.- 156с.

33. Кетлинский С.А., Симбирцев А. С., Воробьев А. А. // Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ, 1992. - 256 с.

34. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Ищенко A.M. и др. Иммуномодулирующий препарат «Беталейкин» // Патент РФ № 2128706 от 10.04.1999. Приоритет от 23.04.98.

35. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины // СПб.: Фолиант, 2008. -552 с.

36. Кнорринг Г. Ю. Цитокиновая сеть как мишень системной энзимотерапии // Цитокины и воспаление. 2005. - № 4. - С. 6-9.

37. Козлов В.К. Эффективность иммунотерапии рекомбинантным IL-2 при инфекционной патологии // III Международный медицинский форум «Человек и инфекция», Нижний Новгород, 13-16 марта 2002. С. 73-78.

38. Козлов В.К., Лебедев М.Ф., Смирнов М.Н. Дрожжевой рекомбинантный интерлейкин-2 человека: клиническая и иммунологическая эффективность. Использование в медицинской практике // Успехи клинической иммунологии и аллергологии. 2002. - Т. 3. - С. 280-300.

39. Козлов В.К. Смирнов М.Н., Егорова В.Н. и др. Коррекция иммунореактивности рекомбинантным интерлейкином-2. Пособие для врачей // СПб.: изд. СПбГУ. 2001. - С. 161.

40. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека // Иммунология. 1990. - № 3. - С. 4-7.

41. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Никитина Л.В. и др. От аутолимфокинотерапии к контролируемому препарату комплекса цитокинов Суперлимфу // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2001. - Т. 19, № 4. - С. 414-419.

42. Клименко С.М. Биология вируса гепатита В. Заболеваемость гепатитом В в России // Вакцинация. 1999. - № 4. - С. 6-7.

43. Масычева В.И., Ширинский B.C., Старостина Н.М. и др. Результаты клинического испытания препарата Бефнорин на здоровых добровольцах // Вестник РАМН. 2004. - № 11. - С. 18-21.

44. Масычева В.И., Пустошилова Н.М., Даниленко Е.Д. Разработка препаратов на основе генно-инженерных цитокинов // Медицинская иммунология. 2001. - Т. 3, № 3. - С. 369-378.

45. Мац А.Н., Боков М.Н., Кузьмина М.Н. Концепция низкомолекулярных антигенспецифических цитокинов и ее новые практические приложения // Аллергология и иммунология. 2008. - № 4. - С. 444-447.

46. Мац А.Н. Вновь о препаратах «трансфер-фактора» как средстве специфической иммунотерапии // Медицинская иммунология. 2001. -Т. 1, № 2. - С. 328-329.

47. Медуницын Н.В. Комбинированные вакцины // Биопрепараты. 2006. -№1.-С. 5-9.

48. Медуницын Н.В. Регуляция вакцинального иммунитета // Аллергология и иммунология. 2005. - Т. 6, № 2. - С. 137-139.

49. Медуницын Н.В. Медицинские иммунобиологические препараты, применяемые для специфической профилактики бешенства // Вакцинация. 2005. - № 1 (37). - с. 7.

50. Медуницын Н. В. , Литвинов В. И. , Мороз А. М. // Медиаторы межклеточного иммунитета и клеточного взаимодействия. М.: Медицина, 1980. - 263 с.

51. Медуницын Н. В. Вакцинология // М.: Триада-Х, 2010.-508 с.

52. Медуницын Н.В. , Алексеев Л.П. // Система 1а-антигенов. М.: Медицина, 1987. - 174 с.

53. Меледина И.В., Абрамов В.В., Абрамова Т.Я. и др. Функциональное состояние иммунной и нервной системы у пациентов с инфекцией вирусом простого герпеса различной степени тяжести // Сибирский медицинский журнал. 2008. - № 7. - С. 49-54.

54. Микробиология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. // .Медицина, 1999.-464 с.

55. Михайлова Н.Б., Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. и др. Беталейкин (rhIL-1) как протектор гемопоэза при интенсивной полихимиотерапии // Цитокины и воспаление. 2003. - Т. 2, № 2. - С. 28-31.

56. Носик Н. Н. Цитокины при вирусных инфекциях // Вопросы вирусологии.- 2000. № 1.-С. 4-10.

57. Немеровская А. М., Базарова М.В., Блохина Н.П. и др. Эффективность вакцинации против гепатита В у больных различного возраста, получающих лечение амбулаторным гемодиализом // Биопрепарат. 2005.- № 4. С. 19-21.

58. Носырев П., Носырева М., Рассказова Т. и др. // Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория и практика. Часть 1. Теория. Ж. Ремедиум. 2003. - № 10. - С. 62-64.

59. Об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов». Приказ МЗ РФ от 26.05.2003г. № 220. М., 2003.

60. Петров Р. В., Хаитов Р. М. Вакцины нового поколения на основе синтетических полионов: история создания, феноменология и механизмы действия, внедрение в практику // Intern. J. Immunoreabilitation. 1999. - № 11.-С. 13-25.

61. Петров Р. В., Хаитов Р. М. Искусственные антигены и вакцины // М.: Медицина, 1988. 288 с.

62. Петров Р. В., Хаитов P.M. Атауаллаханов Р. И. Иммуногенетика и искусственные антигены // М.: Медицина, 1983. 256 с.

63. Потапнев М.П. Интерлейкин-2 и интерлейкин-2-активированные лимфоидные клетки человека. Характеристика иммуномодулирующих свойств in vivo и in vitro // Автореф. дис. . докт. мед. наук. Минск, 1994.

64. Петухов В.Г. // Отраслевые стандартные образцы. Основные положения, порядок разработки, изготовления, аттестации, утверждения и регистрации. Методические рекомендации. Утверждены Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича. М., 2003. С. 4.

65. Производство лекарственных средств. Валидация. Основные положения. МУ 64-04-001-2002. Мин. пром. науки и технологии РФ, 2003. С. 15.

66. Романова Е.С., Кабанова В.И., Кузнецов Н.И. и др. Лечение репликативной формы хронического вирусного гепатита С с использованием иммуномодулирующего препарата Беталейкин // Здравоохранение Урала. 2002. - Т. 11, № 5. - С. 26-28.

67. Романова Е.С., Рахманова А.Г., Симбирцев АС. и др. Результаты лечения больных гепатитами В и С рекомбинантным интерлейкином // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - № 3. - С. 29-31.

68. Рязанцева Н.В., Наследникова И.О., Коненков В.И. и др. Аллельный полиморфизм генов ИЛ-4 и ИЛ-10 как один из возможных механизмов,способствующих хронизации вирусных гепатитов // Иммунология. -2007. Т. 28, № 2. - С. 68-72.

69. Саламатов А.В., Баринов О.В., Синеченко А.Г. и др. Эффективность рекомбинантного ИЛ-1 бета в лечении гнойно-деструктивных заболеваний легких и плевры // Цитокины и воспаление. 2006. - Т. 5, № 4. - С. 39-45.

70. Семенов Б.Ф., Баранов А.А. Вакцинопрофилактика при нарушении здоровья. М., 2001. - 339 с.

71. Семёнова И.Б., Семёнов Б.Ф. Закономерности коррекции вторичных иммунодефицитов разными по своей природе иммуномодуляторами // Intern. J. Immunorehabilitation. 1997. - № 6. - С. 35-40.

72. Сенников С.В., Силков А.Н., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг в формировании полиморфной структуры системы цитокинов // В кн.: Система цитокинов. Новосибирск, Наука, 2004. С. 7-22.

73. Симбирцев А. С. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. - 2002. - № 1. - С. 9-16.

74. Симбирцев А. С. Цитокины: классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. 2004. - № 2. - С. 16-21.

75. Симбирцев А.С. ИЛ-2 и рецепторный комплекс ИЛ-2 в регуляции иммунитета // Иммунология. 1998. - № 6. - С. 3-8.

76. Симбирцев А.С. Применение препарата Беталейкин в клинической практике // Terra Medica, 2002. № 3 (27). - С. 16-19.

77. Симбирцев А.С., Кетлинский С.А., Гершанович М.Л. Новые подходы к клиническому применению Беталейкина рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека// Terra Medica, 2000. - № 1 (17). - С. 3-6.

78. Симбирцев А.С., Попович A.M. Сфера применения рекомбинантного интерлейкина-1 бета при лечении больных с иммунодефицитными состояниями при травме и сепсисе // Анестезиология и реаниматология. -1996.-№4.- С. 76-78.

79. Симбирцев А.С. Биология интерлейкина-1 человека в норме и патологии // Автореф. дис. докт. мед. наук. СПб, 1993.

80. Смирнов М.Н., Журкин А.Т., Фирсов C.JI. и др. Влияние терапии рекомбинантным интерлейкином-2 (Ронколейкином) на иммунологические показатели больных хроническим гепатитом С // Медицинская иммунология. -1999. -Т. 2, № 3-4. С. 134.

81. Соловьев М.М., Симбирцев А.С., Петропавловская О.Ю. и др. Препарат «Беталейкин» в лечении гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области // Terra Medica, 2003. № 2. - С. 14-16.

82. СП 3.3.2.1288-03. Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов. Минздрав России. М., 2003. С. 80.

83. Старцева Е.П. Оценка иммунокомпетентности детей с вторичной иммунной недостаточностью при вакцинальном процессе: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Екатеринбург, 1999. - 27 с.

84. Устинникова О.Б. Стандартизация и валидация методов ракетного иммуноэлектрофореза и иммуноферментного анализа при контроле качества медицинских биологических препаратов. // Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2007. - 28 с.

85. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты // СПб.: НТФФ Полисан, 1998.- 112 с.

86. Шамшева О.В., Кладова О.В., Кузин С.Н. Профилактика гепатита В у детей с хроническими заболеваниями с помощью вакцины Эувакс Б // Вакцинация. -2001. № 6 (18). - С. 10-11.

87. Шамшева О.В. Особенности вакцинации детей с хроническими заболеваниями: Автореф. дис. . док. Мед. наук. М., 2001. 38 с.

88. Ярилин А. А. // Основы иммунологии. -М.: Медицина, 1999. 607 с.

89. Ярилин А.А. Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции цитокинов в тимусе // Цитокины и воспаление. 2003. - Т. 2, № 2. С. 3-11.

90. Ярилин А.А. Цитокины в тимусе. Выработка и рецепция цитокинов // Цитокины и воспаление. 2003. - Т. 2, № 1. - С. 3-13.

91. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Регуляторные Foxp3 + Т-клетки и их роль при аллергии // Росс. Аллергологический журн. 2005. - № 2. - С. 22-26.

92. Abbas А. К., Lichtman А. Н. Pober J. S. // Cellular and molecular immunology. hiladelphia. - 991. - 417p.

93. Afonso L.C.C., Scharton T.M., Vietra L.Q., et al. The adjuvant effect of interleukin-12 in a vaccine against Leishmania major // Science 1994. -Vol. 263. P. 235-237.

94. Almeida A., Legrand N., Papiemik M. et al. Homeostasis of peripheral CD 4+ T-cells: IL-2R alpha and IL-2shape a population of regulatory cells that controls CD 4+ T-cell numbers // J.Immunol. 2002. - Vol. 169. - P. 48504860.

95. Al-Shami A., Spolski R., Kelly J. et al. A Role for Thymic Stromal Lymphopoietin in CD 4+ T-cell Development // J. Exp. Med. 2004. -Vol. 200.-P. 159-168.

96. Anaya J., Sias J. The use of interleukin-2 in human immunodeficiency virus infection // Pharmacotherapy. 2005. - Vol. 25. - P. 86-95.

97. Anderson G., Urbano O., Fedorka-Cray P., et al. Intrleukin 2 and protective immunity in Hemophilus pleuropneumoniae. Preliminary studies // In: Vaccines, Cold Spring Harbor Press. 1987. - P. 22-25.

98. Antony P., Restifo N. CD4+CD25+T Regulatory Cells, Immunotherapy of Cancer, and Interleukin-2 //J. Immunother. 2005. - Vol. 28. - P. 120-128.

99. Arima K., Umeshita-Suyama R., Sakata Y. et al. Upregulation of IL-13 concentration in vivo by the IL 13 variant associated with bronchial asthma // J.Allergy Clin. Immunol. 2002. - Vol. 109. - P. 980-987.

100. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements. Part 2: Validation. WHO Geneva. 1999.

101. A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements by department of vaccine and other biologicals. WHO Geneva. 1993. - P. 47.

102. Bandeira-Melo S., Welter P. Mechanisms of eosinophil cytokine release // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005. - Vol. 100, Suppl. 1. - P. 73-81.

103. Barouch D.H., Santra S., Steenbekc T.D., et al. Augmentation and suppression of immune responses to an HIV-l DNA vaccine by plasmid cytokine/Ig ad ministration//J. Immunol. 1998. - Vol. 161. - P. 1875-1882.

104. Basak S., Esk S., Gutzmer R., et al. Colorectal cancer vaccines: antidiotypic antibody, recombinant protein, and viral vector // Ann NY Acad Sci. 2000. -Vol. 910. - P. 237-252.

105. Becker Т., Wherry E., Boone D. et al. Interleukin-15 is required for proleferative renewal of virus-specific memory CD8 T-cells // J. Exp. Med. -2002.-Vol. 195.-P. 1541-1548.

106. Beq S., Delfraissy J., Theze J. Interleukin-7 (IL-7): immune function, involment in the pathogenesis of HIV infection and therapeutic potential // Eur. Cytokine Netw. 2004. - Vol. 15. - P. 279-289.

107. Biological standardization and Control. WHO. A Scientific Review commissioned by the UK National Biological Standards Broad (NBSB). -Geneva. 1997. - P. 8.

108. Blecha F., Reddy D.N., Chitko-McKown C.G., et al. Influence of recombinant bovine interleukin-1 and interleukin-2 in pigs vaccinated and challenged with Streptococcus suis // Vet. Immunol. Immunopathol. 1995. -Vol. 44. - № 3-4. - P. 329-346.

109. Bronte V., Tsung K., Rao J.B., et al. IL-2 enhances the function of recombinant poxivirus-based vaccines in the treatment of established pulmonary metastases // J. Immunol. 1995. - Vol. 154. - P. 5282-5292.

110. Budagain V., Bulanova E., Orinska Z. et al. Reverse signaling through membrane-bound Interleukin-15 // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 42192-42201.

111. Braddock M., Quinn A. Targeting IL-1 in inflammatory disease: new opportunities for therapeutic intervention // Nat. Rev. Drug Discov. 2004. -Vol. 3. - P. 330-339.

112. Chiaramonte M., Cheever A., Malley J. et al. Studies of murine schistosomiasis reveal interleukin-13 blockade as a treatment for established and progressive liver fibrosis // Hepathology. 2001. - Vol. 34. - P. 273-282.

113. Christodoulou C., Choy E. Joint inflammation and cytokine inhibition in rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Med. 2006. - Vol. 6. - P. 13-19.

114. Chow Y-H., Huang W-L., Chi W-K., et al. Impprovement of hepatitis В virus DNA vaccines by plasmids coexpessing hepatits В surface antigen and interleukin-2 // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - № 1. - P. 169-178.

115. Chung H., Young H., Goon P. et al. Activation of interleukin-13 expression in T-cells from HTLV-1-infected individuals and in chronically infected cell lines // Blood. 2003. - Vol. 102. - P. 4130-4136.

116. Chitu V., Stanley E. Colony-stimulating factor-1 in immunity and inflammation // Curr. Opin. Immunol. 2006. - Vol. 18. - P. 39-48.

117. Clary B.M., Coveney E.C., Philip R., et al. Inhibition of established pancreatic cancers following specific active immunotherapy with IL-2 gene transduced tumor cells // Cancer Gene Ther. 1997. - Vol. 4. - P. 97-104.

118. Cooper M., Bush J., Fehniger T. et al. In vivo evidence for a dependence on interleukin-15 For natural killer cell survival // Blood. 2002. - Vol. 100. - P. 3633-3638.

119. Curotto de Lafaile M., Lino A., Kutchuknidze N. et al. CD25- T-cells generate CD25+Fox3+ Regulatory T-cells by peripheral expansion // J.Immunol. 2004. - Vol. 173. - P. 7259-7268.

120. D1 Andrea A., Rcngaraju M., Valiante N.M., et al. Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells // J. Exp. Med. 1992. - Vol. 76. - P. 1387-1398.

121. Defranse Т., Vanbervliet В., Briere F. et al. Interleukin-10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B-cells to secrete immunoglobulin A // J. Exp. Med. 1992. - Vol. 175. - P. 671-682.

122. Defranse Т., Carayon P., Billian G. et al. Interleukin-13 is a B-cell stimulating factor // J. Exp. Med. 1994. - Vol. 179. - P.135-143.

123. Doyle M.V., Nevell A.D., Nunberg J.H. et al. Human IL-2 as a vaccine adjuvant // Pat. 5100664,USA, MKI5, A61K37/02, Cetus Corp. 1992.-№ 374602.

124. Ertl H.C.J, and Xiang Z. Novel vaccine approaches // J. Immunol. 1996. -Vol. 156.-P.3579-3582.

125. Ewend M.G., Thompson R.C., Anderson R., et al. Intracranial parcrine inter leukin-2 therapy stimulates prolonged antitumor immunity that extends outside the central nervous system // J. Immunother. 2000. - Vol. 23. - № 4. . p. 438-448.

126. Ferrari D., Pizzirani C., Adinolfi E. et al. The P2X7 receptor: a key player in IL-1 processing and release // J. Immunol. 2006. - Vol. 176. - P. 3877-3883.

127. Fichtner-Feigl S., Strober W., Kawakami K. et al. IL-13 signaling through the IL-13 alpha-2 Receptor is involved in induction of TGF-beta-1 production and fibrosis //Nature Medicine. 2005. - Vol. 12. - P. 99-106.

128. Fleo J., Tisminctzky S., Baralle F. Modulation of the immune response to DNA vaccine by costimulatory molecules // Immunology. 2000. - Vol. 100. - № 2. - P. 259-267.

129. Fontenot J., Gavin M., Rudensky A. Foxp3 programs the development and function of CD4(+) CD25(+) regulatory T-cells // Nat.Immunol. 2003. -Vol. 4. - P. 330-336.

130. Frucht D., Fukao Т., Bogdan C. et al. IFN-y production by antigen-presenting cells: mechanisms emerge // Trends Immunol. 2001. - Vol. 22. - P. 556-560.

131. Fry Т., Mackall C. The many faces of IL-7: from lymphopoiesis to peripheral T-cell maintenance // J.Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 6571-6576.

132. Furtado G., Gurotto de Lafaille M., Kutchuknidze N. et al. Interleukin-2 Signaling is required for CD4(+) regulatory T-cell function // J. Exp. Med. -2002.-Vol. 196.-P. 851-857.

133. Geissler M., Geisier A., Tokushige K. et al. Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis С virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokin-expressing plasmids // J. Immunol. 1997. -Vol. 158.-P.1231.

134. General Chapter <1225>. Validation of compendial methods. United States Pharmacopeia XXIII. National Formulary. XVIII. Rockville. MD. The United States Pharmacopeial Convention. 1995. - P. 1710-1712.

135. General Chapter <1225>. Validation of compendial methods. United States Pharmacopeia XXV. National Formulary. XXV. Rockville. MD. The United States Pharmacopeial Convention. 2002. - P. 2256-2259.

136. Gibbs В. Human basophils as effectors and immunomodulators of allergic Inflammation and innate immunity // Clin. Exp. Med. 2005. Vol. 5. - P. 43-49.

137. Goldman M., Thierry V. L' Interleukin-10 une nouvelle cytokine immunosuppressive et anti- inflammatoire // Med. Sci. 1993. - Vol. 9. - P. 453-455.

138. Grace M. J. Bober L.A. Pugliese С. C. Human recombinant IL-10 is an inhibitor molecule for allergen and lectin driven T cell proliferation in PBMNC culture with limited species cross reativity // J. Cell. Biochem.1992. Suppl. 16 C.-P. 75.

139. Grunig G., Warnock M., Wakil A. et al. Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 2261-2263.

140. Gursel M., Gregoriadis G. Interlcukin-15 acts as an immunological co-adjuvant for liposomal antigen in vivo // Immunol. Lett. 1997. - Vol. 55. -№ 3. - P. 161-165.

141. Gursel M., Gregoriadis G. The immunological co-adjuvant action of liposomal interleukin-2: the role of mode of localisation of the cytokine and antigen in the vesicles // J. Drug Target. 1998. - Vol. 5. - № 2. - P. 93-98.

142. Hackett C.J. Focus on the immunological of effective vaccines // Immunolo-gist. 1997. - Vol. 5. - № 5. - P. 171-174.

143. Hazama M., Mayumi-Aono A., Asakawa N. et al. Adjuvant-independent enhanced immune responses to recombinant herpes simplex virus type 1 glycoprotein D by fusion with biologically active intcrleukin-2 // Vaccine.1993.-Vol. 11.-P. 629-636.

144. Heath A.W., Playfair J.H.L. Cytocines as immunological adjuvants // Vaccine. 1992. - Vol. 10. - P. 427-434.

145. Holmes W., Lee J., Kuang W. et al. Structure and functional expression of a human interleukin-8 receptor// Science. 1991. - Vol. 253. - P. 1278 - 1280.

146. Hornef M. W., Noll A., Schirmbeck R. et al. DNA vaccination using coexpression of cytokine genes with a bacterial gene encoding a 60-kDa heat shosk // Med. Microbiol. Immunol. 2000. - Vol. 189. - № 2. - P. 97-104.

147. Howard M., O' Gara A. Biological properties of interleukin-10 // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13. - № 6. - P. 198-200.

148. Hsieh C.S., Macatonia S.E., Tripp C.S., et al. Development of TH1 CD4+ cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages // Science. -1993. Vol. 260. - P. 547-549.

149. Hughes H.P., Campos M., van Drunen Little-van den Hurk, et al. Multiple administrations with interleukin-2 potentiates antigen specific responses to subunit vaccinations with bovine herpesvirus-1 glycoprotein IV // Vaccine. -1992.-Vol. 10.-P. 226-230.

150. Inohara N., Chamaillard M., McDonald C. et al. NOD-LRR proteins: role in host-microbial interactions and inflammatory disease // Annu. Rev. Biochem. -2005.-Vol. 74.-P. 355-383.

151. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical procedures, ICH-Q2A. 1994. - P. 5.

152. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical procedures: Methodology. ICH-Q2B. 1996. - P. 8.

153. Jiang Q., Li W., Aiello F. et al. Cell biology of IL-7 a key lymphotrophin // Cytokine Growth Factor Rev. 2005. - Vol. 16. - P. 513-533.

154. Katz J.M., Lu X., Young S.A., Galphin J.C Adjuvant activity of the heat-labile enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli for oral administration ofinactivated influenza virus vaccine // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 175. - № 2. -P. 352-363.

155. Kawamura H., Rosenberg S., and Berzofsky J.A. Immunization with antigen and interleukin-2 in vivo overcomes Ir gene low responsiveness // J. Exp. Med. 1985.-Vol. 162. - P. 381-386.

156. Kennedy M., Glassum M., Brown S. et al. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T-cell lineages in interleukin-15 deficient mice // J. Exp. Med.-2000.-Vol. 191.-P. 771-780.

157. Kim J. J., Simbiri K. A., Sin J. I., et al. Cytokine molecular adjuvants modulate immune responses induced by DNA vaccine constructs for HIV-1 and SIV // J. Interferon Cytokine Res. 1999. - Vol. 19. - № 1. - p. 77-84.

158. Kim J.J., Yang J.S., Montaner L., et al. Coimmunization with IFN-gamma or IL-2, but not IL-13, or IL-4 cDNA can enhance Th-1 type DNA vaccine-induced immune responses in vivo // J. Interferon Cytokine Res. 2000. -Vol. 20.-№3.-P. 311-319.

159. Kimoto M., Kindler V., Higaki M., et al. Recombinant murine IL-3 fails to stimulate T or В lymphopoesis in vivo, but enhances immune responses to T cell-dependent antigens. // J. Immunol. 1988. - Vol. 140. - P. 1889-1894.

160. Kirberg J., Bruno L., Von Boehmer H. CD4+ B-help presents rapid deletion of CD8+ cells after a transient response to antigen // Eur. J. Immunol. 1993. - Vol. 23. - №. 8. - P. 1963-1967.

161. Knoechel В., Lohr J., Kahn E. et al. Sequential development of interleukin-2 Dependent effector and regulatory T-cells in response to endogenous systemic antigen // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 202. - P. 1375-1386.

162. Knoops L., Renauld J. IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis // Grow Factors. 2004. - Vol. 22. - P. 207-215.

163. Kovanen P., Leonard W. Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the ус-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15 and 21, and their signaling pathways // Immunol. Rew. 2004. - Vol. 202. - P. 67-83.

164. Krol J., Paepke S., Jacobs V. et al. G-CSF in the prevention of febrile neutropenia in chemotherapy in breast cancer patients // Oncologie. 2006. -Vol. 29.-P. 171-178.

165. Krup О. C., Kroll I., Bose G., Falkenberg F. W. Cytokine depot formulations as adjuvants for tumor vaccines. I. Liposome-encapsulated IL-2 as a depot formulation // J. Immunotherapy. 1999. - Vol. 22. - № 6. - P. 525.

166. Kullberg M.C., Pearce E.J., Heiny S.E. et al. Infection with Schistosoma mansoni alters Thl/Th2 cytokine responses to a nonparasite antigen // J. Immunol. 1992. - Vol. 148. - P. 3264-3270.

167. Kurstak E. Modern vaccinology // Plenum Medical book company. New York and London. 1993. - 397 p.

168. Larrick J.W., Graham D., Troy K. et al. Recombinant tumor necrosis factor causes activation of human granulocytes // Blood. 1987. - Vol. 69. - № 2. P. 3431-3436.

169. Lee J., Lee E.-N., Kirn E.-Y. et al. Administration of agonistic anti-4-1 BB mob leads to the amelioration of inflammatory bowel disease // J. Immunol. Lett 2005. - Vol. 101. - P. 210-216.

170. Letscher-Bru V., Villard O., Risse В., et al. Protective effect of vaccination with a combination of recombinant surface antigen 1 and interleukin-12 against toxoplasmosis in mice // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - № 9. - P. 4503-4506.

171. Liles W. С., Van Voorhis W. C. Nomenclature and biologic significance of cytokines in inflammation and host immene response // J. infect. Dis. 1995. -Vol. 172,- P. 1573-1580.

172. Lindblad E. В., Elhay M. J., Silva R., et al. Adjuvant modulation of immune responses to tuberculosis subunit vaccines // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - № 2. - P. 623-629.

173. Locrsley R.M., Scott P. Helper T cell subsets in mouse leishmaniasis: induction, expansion and effector function // Immunol. Today. 1991. - № 12. -P. A58-A61.

174. Lopez A. Elliott M., Woodcock J., Vadas M. GM-CSF, IL-3 and IL-5: cross-competition on human haemopoietic cells // Immunol. Today. 1992. - Vol. 13.-P. 495-500.

175. Lyman G. Pegfilgrastim: a granulocyte colony-stimulating factor with sustained duration of action // Expert Opin. Biol. Ther. 2005. - Vol./5. - P. 1635-1646.

176. Maes R. F. Tuberculosis II: The failure of the BCG vaccine //; Med. Hypothesis. 1999. - Vol. 53. - № 1. - P. 32-39.

177. Mariathasan S., Monack M. Inflammasome adaptors and sensors: intracellular regulators of infection and inflammation // Nat. Rev. Immunol. 2007. - Vol. 7.-P. 31-40.

178. McCulloch C., Downey G., EI-Gabalawy H. Signalling platforms that modulate the inflammatory response: new targets for drug development // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. - Vol. 5. - P. 864-876.

179. McCullough K.C., Pullen L., and Parkinson D. The immune response against foot-and-mouth disease virus: influence of the T lymphocyte growth factors IL-1 and IL-2 on the murine humoral response in vivo. // Immunol. Lett. -1991.-Vol. 31.-P. 41-46.

180. McLaughlin J.P., Schlom J., Kantor J.A., and Greiner J.W. Improwed immunotherapy of recombinant carcinoembryonic antigen vaccinia vaccine when given in combination with interleukin-2. // Cancer Res. 1996. - Vol. 56.-P. 2361-2367.

181. Mebra N.K. Major histocompatibility compex and future vaccination strategies // Proc. Indian. Nat. Sci. Acad. B. 1998. - Vol. 64. - № 2. - P. 81-100.

182. Metier S.C., Dumann H., Meyer Zum Buschenfelde K.H. et al. Low-dose interleukin-2 induces systemic immune responses against HBsAg in immunodefi-cient non-responders to hepatitis В vaccination //Lancet. 1989. -Vol.1.-P. 15-18.

183. Minami Y., Oishi I., Liu L. J. et al. Signal transduction mediated by the reconstituted IL-2 receptor. Evidensce for a cell type-specific function of IL-2 receptor b-chain//J. Immunol. - 1994. - Vol. 152. - №.12. - P. 5680-5690.

184. Moller P., Moller H„ Sun Y., et al. Increased non-major histocompatibility complex-restricted lytic activity in melanoma patients vaccinated with cytokine gene-transfected autologous tumor cells // Cytokine. 2000. -Vol. 12.- №6.-P. 8-833.

185. Mosman Т., Cherwinski H., Bond M. // Two types of murine T-helper cell clones. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins // J. Immunol. 1986. - Vol. 136 - P. 2348-2357.

186. Moss В., Fnerst T.R., Flexner C. et al. Roles of vaccinia virus in the development of new vaccines // Vaccine. 1988. - Vol. 6. - P. 161-163.

187. Mowen K., Glimcher L. Signaling pathways in Th2 development // Immunol. Reviews. 2004. - Vol. 202. - P. 203-239.

188. Nishikomori R., Ehrhardt R., Strober W. T-helper type 2 cell differentiation occurs in the presence of interleukin-12 receptor beta2 chain expression and signaling // J. Exp. Med. 2000. - Vol. - 191. - P. 847-858.

189. Notria A., Rubin R. H. Cytokines as potencial vaccine adjuvants // Biotherapy. 1994. - Vol. 7. - P. 261-269.

190. Novelli F., Casanova J.-L. The role of IL-12, IL-23 and IFN-y in immunity to viruses // Cytokine Growth Factor Rev. 2004. - Vol. 15. - P. 367-377.

191. Numberg J., Doule M.V., York S.M. et. al. Interleukin 2 acts as adjuvant to enhance the potency of inactivated rabies virus vaccina // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 4240-4243.

192. Ohteki Т., Suzue K., Maki C. et al. Critical role of IL-15-IL-15R for antigen-presenting cell functions in the innate immune response // Nat. Immunol. -2001.-Vol. 2.-P. 1138-1143.

193. Ozaki K., Kikly K., Michalovich D. et al. Cloning of a type I cytokine receptor most related to the IL-2 receptor beta chain // Proc. Natl. Acad. Sci. -2000. Vol. 97. - P. 11439-11444.

194. Palph P., Nakoinz I., Rennick D. Role of interleukin-2, interleukin-4, and alpha-, beta and gamma-interferon in stimulating macrophage antibody-dependent tumoricidal activity // J. Exp. Med. - 1988. - Vol. 167. - № 2. - P. 712-717.

195. Panzer S., Madden M., Matsuki K. Interaction of IL-1 of IL-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) in human T cell activated by murine antigens // Clin. Exp. Immunol. 1993. - Vol. 93. - P. 471-478.

196. Panzer S., Madden M., Matsuki K. Interaction of IL-1 p, IL-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) in human T cells activated by murine antigens // Clin. exp. Immunol. 1993. - Vol. 93. - P. 471-478.

197. Pasquini S., Xiang Z., Wang Y., et al. Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvants // Immunol. Cell Biol. 1997. - Vol. 75. - № 4. - p. 397-401.

198. Pighetti G.M., Sordillo L.M. Enhanced antigen-specific responses in bovine mammary glands following administration of interleukin-2. // J. Dairy Sci. -1995. Vol. 78. - №. 3. - P. 528-529.

199. Plaettinsk G., Combe M. C., Corthesy P. et al. Control of IL-2 receptor-alpha exspression by IL-1, tumor necrosis factor, and IL-2. Complex regulation via elements in the 5' flanking region // J. Immunol. - 1990. -Vol. 145. - №. 10. - P. 3340-3347.

200. Potrovita I., Zhang W., Barely L. et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis-induced neuro-degeneration // J. Neurosci. 2004. - Vol. 24 (38). - P. 8237-8244.t

201. Provinciali M., Di Stefano G., Colombo M. et al. Adjuvant effects of low dose interleukin-2 on antibody response to influenze virus vaccination in healthy elderly subjects // Mech. Aging Dev. 1994. - Vol. 77. - P. 75-82.

202. Rabu C., QuemenerA., Jacques Y. et al. Production of recombinant human trimeric CD137L (4-1BBL) // J. Biochem. 2005. - Vol. 280. - P. 414724148.

203. Rajananthanan P., Attard G. S., Sheikh N. A. et. al. Novel aggregate structure modulate lymphocyte proliferation and Thl and Th2 cytokine profiles in ovalbumin immunized mice // Vaccine. 1999. - Vol. 18. - № 1-2. - P. 140-152.

204. Quiroga J.A., Castillo I. et al. Recombinant gamma interferon as adjuvant to hepatitis В vaccine in haemodialysis patients // Hepatology. 1990. - Vol. 12. -P. 661-663.

205. Reddy D.N., Reddy P.G., Xue W. et al. Immunopotentiation of bovine respiratori disease virus vaccines by interleukin-113 and interleukin-2 // Vet. Immunol. 1993. - Vol. 37. - P. 25-38.

206. Rees R. C. Cytokines: their role in regulating immunity and the response to infection // Rev. Med. Microbiol. 1992. - Vol. 3. - №. 1. - P. 9-14.

207. Rutella S., Zavala F., Danese S. et al. Granulocyte colony-stimulating factor: a novel mediator of T cell tolerance // J. Immunol. 2005. - Vol. 175. - P. 7085-7091.

208. Sadettin S. Ozturk, Wei-Shou Hu. // Cell Culture technology for pharmaceutical and cell-based therapies. Cell Culture Technology An Overview. Medium Development (A. Burgener and M.Butler). Taylor & Frarcis. New York - London. - 2006. - P. 755.

209. Sagara Т., Mori S., Ohkawara S. et al. A limited role of IL-1 immune enhancement by adjuvants // Immunology. 1990. - Vol. 71. - P.251-257.

210. Sasaki S., Tsuji Т., Asakura Y. et al. The search for a potent DNA vaccine against AIDS: The enhancement of immunogenicity by chemical arid genetic ag-juvants // Anticancer Res. 1998. - Vol. 18. - № 5. - P. 3907-3915.

211. Schrader J.W. Peptide regulatory factors and optimization of vaccines // Molecul. Immunolgy. 1991. - Vol. 28. - №. 3. - P. 295-299.

212. Scott P., Pearce E., Cheever A.W. et. al. Role of cytokines and CD4+ T cell subsets in the regulation of parasite immunity and disease // Immun. Rev. -1989.-Vol. 112. P. 161-182.

213. Shahum E., Therien H.M. Liposomal adjuvanticity: effect of encapsulation and surfase-linkage on antibody production and proliferation response. // Int. J. Immunopharmacol. 1995. - Vol. 17. - № 1. - P. 9-20.

214. Shi Y., Liu C., Roberts A. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: what we do and don't know //Cell Research. 2006. - Vol. 16. - P. 126-133.

215. Sin J-I., Kim J.J., Boyer J.D. et. al. In vivo modulation of vaccine responses toward a Thl phenotype increases potency and vaccine effectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model // J. Viron. 1999. -Vol. 73. - № 1. -P. 501-509.

216. Sjolander A., Bengtsson K.L., Morein B. Kinetics, localisation and cytokine profile of T-cell responses to immune stimulating complexes (iscoms) containing human influenza virus envelope glycoproteins // Vaccine. 1997. -Vol. 15.-№9.-P. 1030-1038.

217. Snapper C.M., Finkelman F.D., Paul W.E. Differential regulation of IgGl and IgE synthesis by interleukin-4 // J. exp. Med. 1988. - Vol. 167. - № 1. - P. 183-196.

218. Snapper C.M., Finkelman F.D., Stefany D. et al. IL-4 induces co-expression of intrinsic membrane IgGl and IgE by murine B-cells stimulated with lipopolysaccharide // J. Immunol. 1988. - Vol. 141. - № 2. - P. 489-498.

219. Souberbielle B.E., Knight B.C., Morrow W.J., et al. Comparison of IL-2- and IL-4-transfected B16-F10 cells with a novel oil-microemulsion adjuvant for

220. B16-F10 whole cell tumour vaccine // Gene Ther. 1996. - Vol. 3. - № 10. -P. 853-858.

221. Staruch M.J. & Wood D.D. The adjuvanticity of interleukin 1 in vivo II J. Immunol. 1983. - Vol. 130. - P. 2191-2194.

222. Tagliabue A., Boraschi D. Cytokines as vaccine adjuvants: interleukin 1 and its synthetic peptide 163-171 // Vaccine. 1993. - Vol. 11. - P. 594-595.

223. Strober W., Murray P., Kitani A. et. al. Signalling pathways and molecular interactions of NODI and NOD2 // Nature Rev. Immunol. 2006. - Vol. 6. -P. 9-20.

224. Taira S., Kato Т., Yamamoto K. et al. Differential requirement of humoral factors for IL-2R expression of murine T-cell subsets, Thl, Th2, and CD8Th clones // Cell. Immunol. 1993. - Vol. 147. - № 1. - P. 41-50.

225. Takatsuki F., Okano A., Suzuki C. et al. Human recombi-nant IL-6/B-cell stimulatory factor 2 augments murine antigen specific antibody responses in vitro and in vivo // J. Immunol. 1988. - Vol. 141. - P. 3072-3077.

226. Talmadge J.E., Phillips H., Schneider M. et al. Immuno-modulatory properties of recombinant murine and human tumor necrosis factor // Cancer Res. 1988. - Vol. 48. - P. 544-550.

227. Taniguchi Т., Minami Y. The IL-2/IL-2 receptor system: a current overview // Cell. 1993. - P. 5-8.

228. Tarasov V.A., Filatov M.V., Kisliakova T.V. et al. Combined surgical and immunotherapeutic treatment of patients with fourth stage colon cancer // Hybridoma. 1999. - Vol. 18. - № 1. - P. 99-102.

229. Ting J., KastnerD., Hoffman H. Caterpillers, pyrin and hereditary immunological disorders // Nature Rev. Immunol. 2006. - Vol. 6. - P. 183-195.

230. Tough D.F., Sun S., Zhang X. et. al. Stimulation of naive and memory T cells by cytokines // Immunol. Rev. 1999. - Vol. 170. - P. 39-47.

231. Trinchieri G. Interleukin-12 and its role in the generation of Th-1 cells // Immunol. Today. 1993. - Vol. 14. - № 7. - P. 335-338.

232. Tsuij Т., Hamajima K., Fukushima J. et al. Enhancement of cell-mediated immunity against HIV-l induced by coinoculation of plasmid-encoded HIV-l antigen with plasmid expressing IL-12 // J. Immunol. 1997. - Vol. 158. -P. 4008.

233. Weinberg A., Mcrigan T.C. Recombinant interleukin 2 as an adjuvant for vaccine-induced protection: immunization og guines pigs with herpes simplex virus subunit vaccines // J. Immunol. 1988. - Vol. 140. - P. 294-299.

234. Watanabe N., Wang Y., Lee H. et al. HassaH's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+ CD25+ regulatory T-cells in human thymus // Nature. -2005.-Vol. 25.-P. 1181-1185.

235. Wesselborg S., Janssen O., Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells // J. Immunol. 1993. - Vol. 150. - № 10 - P. 4338-4345.

236. Watanabe N., Wang Y., Lee H. et al. Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+ CD25+ regulatory T-cells in human thymus // Nature. -2005.-Vol. 25.-P. 1181-1185.

237. WHO Expert Committee on biological standardization. Fifty-fifth report. WHO Technical report. Series 932. Geneva. 2004. - P. 137.

238. Wood K., Sawitzki B. Interferon-gamma: a crucial role in the function of induced regulatory T-cells in vivo // Trends Immunol. 2006. - Vol. 27. - P. 183-187.

239. Xin K.Q., Hamajima K, Sasaki S. et al. IL-15 expression plasmid enhances cell-mediated immunity induced by an HIV-l DNA vaccine // Vaccine. x 1999. - Vol. 17. - № 7-8. - P. 858-866.

240. Zeng R., Spolski R., Finkelstein S. et al. Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+ T-cell expansion and function // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 201.-P. 139-148.

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация

Автореферат диссертации по медицине на тему Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация

Оглавление диссертации Никитина, Татьяна Николаевна :: 2010 :: Москва

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Никитина, Татьяна Николаевна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Стимуляция иммунного ответа препаратами цитокинов и их стандартизация"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Никитина, Татьяна Николаевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций