Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Сравнительный анализ структурных и биологических особенностей конъюгатов аминокислот и углеводов (гликоаминов) плазмы крови при злокачественном росте и их синтетических аналогов (больные опухолями женских репродуктивных органов и животные-опухоленосители)

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ, ОНКОЛОГИИ И РАДИОБИОЛОГИИ им. Р. Е. КАВЕЦКОГО АН УКРАИНЫ

На правах рукописи

ЛИНЕЦКИЙ Михаил Дмитриевич

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ КОНЬЮГАТОВ АМИНОКИСЛОТ И УГЛЕВОДОВ (ГЛИКОАМИНОВ) ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОМ РОСТЕ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ (БОЛЬНЫЕ ОПУХОЛЯМИ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ И ЖИВОТНЫЕ — ОПУХОЛЕНОСИТЕЛИ)

14.00.14 — Онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ — 1992

Работа выполнена в Институте экспериментально! патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Каведкого АН Украины.

Научные руководители:

Официальные опонситы:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Н. М. БЕРЕЖНАЯ,

кандидат биологических паук, 10. Л. РАДАВСКИЙ

доктор медицинских наук профессор БЕРЛИНСКИХ Н. К.

доктор биологических наук, КИБИРЕВ В. К.

НИИ онкологии им. проф. II. И. Петрова МЗ России (г. Санкт-Петербург)

. ц/си-^ . . . 1992 г. в мин: на

на заседании специализированного совета Д 016.38.01 в Институте экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавсикого АН Украины (252022, Киев, ул. Васильковская, 45).

Защита состоится

Ж

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан » . . . .199 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

ю. в. яниш.

Актуальность теми. Псвьпкнии г^кткЕности лечения сп=:слогических больных ЪО МНОГОМ зависит ОТ раШ'»'Й ДИАГНОСТИКИ маркеров, биологических индикаторов (тлекул). продуктов олус^'г'л клеток, ПОЯВЛЯЮЩИХСЯ В высоких КОНЦеНТрЭДИЯХ в СИОЛОГИЧ^КИа костях и/или тканях организма при опухолевом процесс« .

Опухолевые маркеры долкны быть специфичны для данного с пухового процесса, доступны определению.на раннйх стадиях болезни., oiгн«>лг состояние 'неопластической ткани под влиянием терапевтических к*-действий и давать вогмокноегь кеполговання их для прогноза трч--нг-опухолевого процесса. Согласно даннкм 3.3ell (16.30), R. W. Ruu.i.-л Т1978), Р. Chandra (1983) большинство опухолевых маркеров <» удоьл-.-ряет перечисленным внше критериям, так как они W' является дост.-ш.ч-к специфичными, и, поэтому не могут Скгь использован;.' для д-.-f-KU.:,! •-.гу-холей при массовых наблюдениях.

С целью поикав кия эффективности использования опухолевсх морк-ров в клинике, предпринимаются исследования по двум иапраьу-ни»^ создание панели известных маркеров и поиск новых более чувств;;re.:iHi и специфичных биологических маркеров (Virji М. А. et al. , iöSvO.

В этих исследованиях важнее место принадлехиг структурно-$ункпи овальным характеристикам последних, так как от этого зависит kww по нимание биологии опухолевого процесса (S-i.Hakowori, 1950).

Одним из новых гуморальных маркеров опухолевой болезни являете гликоамины. Гликоамины (коньюгаты аминокисдот и углеводов) представ, ляют собой ранее, неизвестный класс эндогенных биополимеров с молеку .тарной, массой нике 10 кД, циркулирующих в плазме крови млекопитаюкг в свободной и белок-связанной форме (Г; В. Глинский и др. , Iii?.'; 1986,1987). Согласно структурному анализу гликоаминов плазмы крон, животных-опуходе носите лей, они представляют углевод-аминокислотнь: коньюгаты (Глинский Г. Б. и, др., 1089,1830).; Установлено, что уровень свободной форш гликоаминов (Гл) повышен ¡в 2-3 раза в плазме крови при злокачественных новообразованиях и лейкобах у животных и человека (Глинский Г. В., 1983,1990). К настоящему времени информация о структуре и биологическом действии гликоаминов плазмы крови людей больных злокачественными новообразованиями крайне ограничена.

Все вышеизложенное определяет актуальность исследований, направленных на выяснение структурно-1 функциональных характеристик гликоаминов (Гл) при опухолевом pocite. j

Дели и задачи исследования. Целью работы!являлось исследование структурно-функциональных характеристик гликоаминов плазмы крови онкологических больных и животных с экспериментальными опухолями. В этой связи в работе решались следующие .задачи:!

" 1. Провести количественный анализ гликоаминов в плазме (сыворотке) крови онкологических больных.

2. Выделить и очистить гликоамины из плазмы крови онкологически;-: больных.

2. Изучить характер связей мекду аминокислотами и угл^юд г. .:

пходяпдами б состав соединений.

4. На основании данных, подученных с использованием еиквенса, ^инокислотного, углеводного анализа гликоаминов определить основные 'акономерности присушив' этим соединениям.

С. Провести сравнительный анализ свойств гликоаминов плазмы .тропи онкологических больных , животных с экспериментальными опухоля-•й: со структурными синтетическими аналогами гдикоаминов.

б. Изучите влияние гликоаминов и их структурных аналогов на процессы сфероидообразования опухолевыми клетками.

Научная ноъизна. При изучении нового класса эндогенных биопо-,т «еров пдйзмн крови - гликоаминов впервые получен комплекс их хими-• биологических характеристик заклшьхйздйся в повышении уровня втих .-динг>к;»й при опухолях ковочной хелгэы и капских гениталий, что поз-коллег рассмативать их неспецифическими опухолевыми маркерами; налив составе втих соединений сл.ожнозфирнь:х связей, связей типа осно-.аний isa^íu и продуктов Амавори); проведен сравнительный анализ пове-■ния ьтих соединений и синтетических аналогов гликоаминов при хрома-1 гравировании, мягких кислотном и щелочном гидролизах, сиквенсе, а ъ- '№3 их Ж- спектров; впервые показано йнгибирование гликоаминами и их синтетическими аналогами процессов сфероидообразования и колонизации легких клетками мышиной рабдомкосаркомы ЫХ-1.

Шу-шо-практтесиая значимость работы. Повышение уровня гдикоа-к-иоь в плазма крови Сольных опухолями молочной железы и ленских гениталий цэшт быть-'использовано в качестве дополнительного . критерия для диагностики злокачественных новообразований. '

Ап[»-/бшж рабоги. Основнда положения диссертации доложены и об-еУлдены на 5-й международной конференции по опухолевым.маркерам ; г. Стокгольм, Швеция, 1833), 6-й международной конференции по опухолевом маркерам (г.Токио, Япония, 1989), 7-й международной конференции по опухолевым маркерам (г.- Киев, Украина, 1990), 20-й республиканской конференции молодых медиков (г. _ Тбилиси, Грузия,-1991), на заседании экспертного совета по апробациям докторских и кандидатских диссертаций института экспериментальной патологии, онкологии к радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины 29 апреля 1992 г. 'Публикации. Основные положения ' диссертации опубликованы в 10 печатных работах.'

Объем и структур* работы, диссертация изложена на 168 странице машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов к методов исследования, трех глав собственных исследований, их обсуждения, вньодоь и списка литературы содержащего 77 отечестве! них и 151иностранных источника, диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ.

¡¿¡ТерИнЛЫ И ШТОДЫ ЮЪЯгг&ШНИЙ.

F-noxpHtM поставленных задач нел'и проведено исследование количественного сод-рханид гл^коамннолодобннх субстанций плазмы и сы-?оротки крови у у^нзш с доброкачественными и злокачественными опухо-

1ми молочной железы и гениталий. Обследовано 148 человек, из которых 85-- злокачественные, опухоли; у 40 - доброкачественные опухоли и 23 энора (практически здоровые женщины). Из них у 41 пациентки - рак элочной железы, 8 - фиброаденоматоз молочных желез, 45 - онкологи-эские заболевания гениталий (злокачественная опухоль яичников 15, ак тела., матки - 22, рак шейки матки- 8), 31 - доброкачественные яухолевые.заболевания гениталий (доброкачественные опухоли яичников 18, миома' матки - 13). Определение уровня гликоаминоподобных убстанций проводили по методике Глинского Г. В. и Винницкой . & (199(3). Определение уровня гликоаминоподобных субстанций в плазме зыворотке) крови больных опухолями, молочной железы проводилось в 387-1988гг. , ' опухолями .' женских гениталий в 1989-1991гг. Выделение ликоаминов из плазмы и сыворотки крови больных злокачественными но-ообразованиями проводили по методикам Глинского Г.Ей соавт. (1986, 988, 1989) применяя;сочетание методов ультрафильтрации на молекуляр-ых фильтрах с. пределом исключения ниже 1 и 10 кД и различных видов ЭЖХ (зксклюзионная, обраиенно-фазовая. норьгальнофазовая).

Уровни¿-аминогрупп в гликоаминах плазмы крови животных опухоле-осителей и людей анализировали по реакции с тринитробензосульфоновой ислотой по методике Кастрикиной Т.Ф. и соавт. (1981). Определение вы-ода аминокислот "гликоаминов и их * структурных аналогов Г1А( Б-0-Alanine-С-Mst-Jlglucopyranos i dehydrobromide), rir(ü-O^Glycine-¿-lfet-9glucopy-anosidehydrobromide,■ r2A(2,3-di-0-Alaníñe-¿-Ktet-j>erlucopyranosidedi- ■ lydrobromide), И АЗГ( 6-0- Ala- 2,3,4- tr i - О- Glyc i ne- Мэ t-0 glucopyranos ide-etrahiydrobromi.d9)_,rHr(61ucosyl-N-Glyctrie) ,AKT(Arabinosyl-N-Glycine), HJI( 1-N-Fructosyl leucine), $-K(l-N-Fructosyl isoleucine), Ф-TCl-N-'ructosyl glycine), .®-í(i-NfFructosyl valine), ®-<Kl-N-Fructosyl phenylalanine), Ф-fi -Á(I-,N-Friictosyl^-.alaniné) производили по методике Co-ien №A et al. (1986), при помощи системы аминокислотного анализа PICO* 'AG "Waters" США. Определение моносахаридного, состава гликоаминов и их структурных аналогов проводили по методике описанной в работе Хороша А. Я. и соавт. (1987). Секвенирование гликоаминов и их структурных шалогов и определение М-концевых аминокислот проводили на автомати-юском микросеквенаторе модели 890М2 фирмы "Becktnan" (США) с идентификацией продуктов секвенирования при помощи жидкостного хроматографа шсокого давления по методикам рекомендуемым фирмой изготовителем.'

Для выяснения влияния гидролизов (0. IN TFA и 10% NfyOH) на моле-сулярные размеры гликоаминов образцы хроматографировались (исходный и •идролизованный) в системе зксклюзионнойВЭЖХ на эксвлюзионной колон-се TSK G-2ООО SWLKB Швеция, аналитической рефрактометрической ячейки 'AÍtex" (США). В оптически активных фракциях проводили, определение углеводного и аминокислотного состава ИК-спектрометрию гликоаминов t их синтетических структурных аналогов проводили на приборе "Спекорд ¿-80 " фирмы Карл Цейс Иена (ГДР) с инфракрасным диапазоном,от 4000 до 200 с А микротаблетках КВт.

Эксперименты были проведены на 180 2-3 месячных мышах-самках лиши BALB/c разводки вивария Института проблем онкологии и радиобиоло-

гии им. Р. Е. Кавецкого АН Украины. Моделью опухолевого роста служил ли-нейноспецифкческий штамм перевивной, рабдомисаркомы МХ-1, индуцированной ранее 20-метилхолантреном, который трансплантировали внутримышечным введением 1x10® изолированных трипсинизацией опухолевых-клеток.

Для получения сфероидов в краткосрочных статических суспензионных культурах нами модифицирован метод агрегационных культур злокачественно трансформированных клеток (Steur А. F. et al. ,1983). Для изучения модифицирующего влияния Гл на процесс сфероидообразования в лунки одновременно с опухолевыми клетками вносили 30% Гл, в.контроль-н ¡е лунки - 30% ЗТС. Процент стимуляции <ши ингибиции сфероидообраэо-i 1ния вычисляли по формуле (А~Б)/АхЮ0Х, где А - среднее количество 1 |ероидов в контроле, а Б - в опьпе. Структурные аналоги гликоаминов вносились в культуральную среду таким образом, чтобы их концентрация не превышала 2,5 мМ. .По предварительным данным эта концентрация нетоксична для опухолевых клеток. F

Для оценки влияния ; Гл на метастатический потенциал опухолевых ■ 1 теток их инкубировали 2 часа при 37 С, 5% СС^в среде RPMI-1640; в . присутствии 30% Гл. После' культивирования, опухолевое клетки, в дозе 0,25x1в 0,3 мл инкубационной среды, Содержащей 30% Гл, . вводили внутривенно интактным .мышам. Ба 21. сутки подсчитывали число метаста- -зов в легких, фиксированных в растворе Бузна.; Подсчет метастатических' ■ узлов проводили визуально под бинокулярной лупой ИБС-2 при увеличении, хб. Число метастазоз :более 250.на орган считали недостоверным. . Про- -цент ингибиции-стимуляции метастрзирования расчитьвали/ncj',. представленной Еыше формуле. Достоверность различий , полученных данных ;оцени- . вали с помощью критерия Стьюдента. ■;."■•.

Количественный анализ, выделений, очщгка к структурный■ анаша •■

гликоаминов ллаэш крови окюлогтесклх-больных. . ■ ; :

С помощью гликоаминового теста'обследована 41 больная раком. мо- • лочной железы IГ и III стадии, 8 больных фиброаденоматозом молочных желез и 10 практически здоровых женщин^ Анализ реэ^татов' исследований больных раком молочной железы был'проведен с учетом стадии и!поражения лимфатических "регионарных узлов; больные со второй 'Стадией заболевания 18 человек, в том числе: без поражения, лимфатических реги- . онарных узлов-15, с поражением лимфоузлов - 3; больные с третьей ста-, дией заболевания - 23, среди них с поражением лимфоузлов - 15 ,;.-|беэ поражения -8. Образцы ультрафильтратов плазмы крови больных фиброаде-номатозом молочных желеи без пролиферации - 4 и с пролиферацией^- А подвергались дифференцированному анализу. Результаты исследований представлены ь таблице 1. Как видно из таблицы уровень гликоаминопо-добных субстанций повышен у больных раком молочной железы в среднем на 31,4 Z, при этом у больных РЫЖ II стадии,это повышение, более значительно (45%).У больчых- РМЖ II и III стадии с поражением 'лимфоузлов уровень Г АТС был несколько вь№ по сравнению с группами-больных без яорал?ния лимфоузлов.

,. Вэ второй серии экспериментов было проведено исследование ГАПС в 'плазме крови 74 больных , с добро- и злокачественными опухолями женских половых органов и 13 практически здоровых небеременных женщин. Из них с диагнозом злокачественная опухоль яичников - 15, рак тела матки - 22,' рак шейки матки - 8, с доброкачественными опухолями яичников - 18, с миомами матки - 13 . По стадиям процесса больные распределялись следующим образом: злокачественные опухоли яичников I стадии .- 6 больных (40%), II стадии - 2 (13,3%), III-IV стадий - 7 больных (46,7%), рак.тела матки I стадии - 11 больных (50%), II стадии - 5 (22,7%), III стадия - 6 больных (27,3%). У 5 из 8 больных (62,5%) раком шейки матки определена I стадия заболевания, у 3 (37,5%) -II стадия. Всего было обследовано 31 человек с I-II стадиями злокачественных новообразований. Результаты анализов по определению ГАПС в сыворстке крови приведен в таблице а. Как видно из таблицы средний уровень ГА в сыворотке : крови у доноров соответствовал 273,3±41,2 УЕ. Следует отметить, что максимальный уровень ГА в плазме крови доноров составил 495 УЕ и поэтому для сравнения частоты повышения уровня ГА при различных заболеваниях был выбран условный уровень 500 УЕ. Средний уровень ГА в сыворотке крови больных доброкачественными опухолями матки и яичников достоверно не отличался от та-'кового у доноров. В каждой из.этих групп уровень ГАПС выше 500 УЕ был зафиксирован в 2 случаях, (при миомах матки и при кистомах яичников), фи злокачественном процессе уровень ГАПС достоверно выше (Р< 0,001) концентрации ГА в сыворотке крови доноров и больных доброкачественными опухолями^ 'Частота, повышения, уровня ГА при раке яичников составила 86,6% ' при раке тела'матки г 71,4% и 100% при раке шейки матки. При I- И стадиях злокачественного процесса женских гениталий уровень ГАПС выше' 500 УЕ определялся, в 26 случаях из 31,что составило 84%. Таким образом, при количественном анализе плазмы крови обнаружено повышенная • их концентрация при злокачественной форме роста опухолей, фи сравнительной'оценке уровня ГАПС в плазме крови больных доброкачественными и злокачественными опухолями женских половых органов выявлено повышение их по среднему уровню в 3 раза при раке яичников, в 2 раза при раке тела матки по сравнению с миомами матки. " Частота повышения при раке яичников составила 86,6%, при раке тела матки -71,4%, при раке шейки матки -100%, в то время как при доброкачественных опухолях яичников частота повышения ГАПС составила 11,1%, а при миомах матки -15,3%.- фи I— 11 стадиях злокачественных опухолей женских гениталий обнаружено повышение уровня ГАПС выше 500 УЕ в 34% случаев. Таким образом, нами был установлен факт, что плазма крови больных различными злокачественными опухолевыми заболеваниями подобно плазме ■ крови животных опухоленоеителей содержит повышенный уровень гликоаминов, что позволяет рассматривать их неспецифическими маркерами опухолевого процесса.

Для выделения, очистки и идентификации указанных выше соединений, определяемых в ультрафильтратах плазмы кроьи доноров и больных злокачественными новообразованиями наш использовано сочетание мето-

№Ш; - .1 П5Ш11.

уимсгаешй ада рапс в шж кон шомв,,{оиш , Шмкташв! ими ГАЗС в шазве ыоев «ымвз I $шш >ахвк Шош! «¡ем I №ршшо1. . Шп- к этомгсгвдашя ошлш ннсш: шшви оргааов.

ГР7ШШ «бскшшш Уетеп тхятт, 11.

. Л Грпзи о5сишанш . !мвгт кшшвив, И - ■ . .. * я <»

Шт (10) ИЗ 1 10,1 ; В

их ((1) Ш 121,1« Ш«РН (13) . 271,3141,г

гах (Ш (ш гот ♦ 15.7 Г ' Мршчестгеввве нпш ишшШ) ..-г!5,0112.«

■ ИХ (111) (25) »211!, 5 Зйшесгвшас ошгм ншш (13), , ШТ.11 1Н.5«

«и ронатвз (1) КЗ 122,8 ' М5РШШ каш ни 455.Т Х ЗТ.7 ' ..

Я кит с иш(тме! 111 211125,3« , р» теза 81Ш (221 ; ШМ 1 155,1«

♦ рштоз бгз дршШгшМ) . 151 1 29,1 Ра* «ш наш Ш ! " .-. 1009,1 х 9М>

1. ст.с шшшн ш(ауизгш .229 16,9

11 ст.£ез вормеш ш!мзш(151 203 1 К, 5 ■

111 ст.с ворамвхгв лМмзмвШ) 203 1 26,1 г- - ■ "• ' ^

111 ст.бе! вндош ш»073ш1!). 1Ш 1Т. 4 . . «>мзнш исговгш смясшесп 1Р<(Ш11 кш иыл-

........................................................... теикх > грше *оит i дморм. Н-Д «обш ;шаю

■ I Щ«1> в^СШОШИЙ Йаш!.'-'-7,: ' ••,

«•ни» и 1шт 1мшк1ш в гиш (нш1 кптт- - 'к < :1 .■

ист со мсгоат «<о,»Я 11-1 сио» пот ш» - . X •••'•.'••• :

о(с1мшзш1 боти. •;.,, ' • - я.'■■ '-,/'-'■",

дов ультрафильгграции и высокоэффективной жидкоотной хроматографии, Выделение и очистка включали- в себя ультрафильтрацию'на молекулярных фильтрах с. пределом исключения'ниже 10 кД й последовательное хрома-, тографирование ультрафильтратов плазмы-крови ;на эксклюзионной,: .обра-шэннофазой и/или нормальнофазовой ;КК2-колонках (Материалы и - методы).

Согласно . результатам, структурных исследований,22 соединений; . ультрафильтратов плазмы крови больных с новообразованиями количество углеводных остатков (без глюкозы) колеблемся от 2 до 17,' а аминокислот от 6 до 29. Все исследуемые соединений содержат глюкозу. Соотношение аминокислоту: глюкоза: в образцах5 близко к. 1-й составило всреднем 1,17±0.194. / В большинстве, случаев соотношение - аминокислоты: углеводы'(без глюкозы) варьировало от 1:1 до'5:1 (таб.1). Как правило, усложнение 'процедуры выделения и-' очистки сопровождалось преимущественной потерей аминокислот гликоам^ов, что могло приводить к снижению соотношения аминокислоты: углеводы в образцах до 0,3. Следует отметить, что выделяемые соединения в.используемых хроматографи-мсских системах хорошо отделялись от углеводных мономеров и свободных аминокислот (рис.1). В следующей серии экспериментов исследовали поведение гликоаминов при секвенировании. Свободные аминогруппы гдикоа-минов являются «(-аминогруппами аминокислот, так как при сиквенсе-иден-фицирукяся в виде фенилтиогидантоиновых производных аминокислот (-11Т-) как- продукты первого цикла секвенирования при деградации' по

Рис«2.Идантификация аминокислот Гл в вида ФТГ-производных на 1-й /А/ и 2-й цикле свквенирования /Б/.

-а-

Эдману гликоаминов (рис. 2). Дальнейшая деградация по Здману не, приво-

. Таблица

Результаты структурного, анализа некоторых иэ гликоаминов плазмы • крови людей. ' I

Н/й Время : ■ .

: удер-ния: Аминокислотный состав : мин. ,: : тип : : кол-ки :

Продукты первого : цикла.секвениро- : Углеводный вания, ФГГ-амино-: состав кислоты :

1 :3. 4/МК2

6.0/С18

2.7/Ш2

4 :1.8/С18

Азр(1) 51у(1) А1а(3) Уа1(1) РЬе(1) Азр(2) б1у(3) Рго(1) Пе(1) Ьуз(1) Абр(1)

01у(1)

Туг(1) Ьеи( 2) Азр(1)

,б1и(2) ,Аге(1) ,Рго(1) ,11е(1) .ЬуэС1) ,31и(2) ,ТЬг(1) ,Туг(1) ,Ьеи(2)

,5ег(1), ,№(1), ,Туг(1), Леи(1),

,3ег(?.), •, А1а(1), ,Уа1(1), ,РЬе(1),

,в1и(2) ,Бег(1), ,А,1аС1).РгоС1), .Уа1(1),11е(1), ,ЬуБ(1). . ,б1и(3),3ег(2).

б1у( 2) ,А1а(1) ,Рго(2), Уа1(3),ЬугС1).

, Абп,01п, ,61у, А1а, ,Тгр,Суз, ,Ьеи,Рго,

, Аэп^г, .ТЬг'.^г,

Азр,61и,, Бег, ТЬг,| Туг, Уа1,' РЬе, Не, кщ.

Азр,61и, 61п,61у, А1а, Це.Тгр, ^уз-, Р1те,ТугЛеи,\Га1.

: Мап( 3), :Рис(2), : 6аШАс( 4). : 6а1(2), :й1сМАс(1). : Мап(2), : Оа1(б).

Азр.бХи.Зег.фзп, : Мап(2), б1у,А1а,Туг,Уа1, : Рис(1),

Рго,ЬуБ, Пе.иуэ. Азр,б1и,2ег,ф.п,

:<3а1(1), : 6а1НАс(1). : Мап(2), : 6а1(1), : Й1у, А1а, Рго, Аг^, Рис(2), '.

Ьуз, Азп.ТЬг-

6а1МАс( 2), в1сЫАс(2).

при сбквенкровшшй

дкт к освобождению аминокислот, Выход „аминокислот различных фракций гликоаминов значительно отличается друг от друга. Принимая во внимание лабильность аминокислот-углеводных связей в гликоаминах, мы сравнивали выходы при секвенированйи аминокислот гликоаминов и свободных аминокислот. Общий.выход свободных аминокислот на первом цикле секЕенирования бьш от 20 до 25£в среднем 22%). ; В большинстве, случаев еькоды аминокислот'гликоаминов,' были значительно выше однако в двух случаях обшие выходы аминокислот гликоаминов были в 1,3 и 1,7 раза ниже по' сравнению со свободными аминокислотами (рис.3). Такое варьирование в выходах аминокислот ¡говорит о различной доступности их£аминогрупп для взадействия с ■ фе^иЛизотиоцианатом : в реакционной' камере ееквенатора. Это подтвердил анализ выхода отдельных аминокислот гликоаминов после секьенироьания. ¡Выход каждой аминокислоты в индивидуальном* образце выражался как индекс соотношения выхода отдельной аминокислоты гдикоамина к выходу. соответствующей1 свободной аминокислоты. Каждая из исследуемых аминокислот гликоаминов

показывала индексы, (соторые значительно выше или нике соответствующих аминокислот или, близкие к ним. Только'аргинин и лейцин являются исключением. ; Выход аргинина. в гликоаминовых. образцах всегда выше,; в то время как у лейцина всегда ниже, чем.у соответствующих свободных аминокислот. ¡Величина разброса в индексах выхода отдельных аминокислот в различных образцах варьируёт от нескольких раз (2-10 раз) до нескольких десятков раз (26-55 раз), а Иногда в несколько сотен раз (130-280,раз)[; ЗСия того, чтобы"проверить гипотезу о наличии в составе гликоаминов'сложноэфирной связи между."кором" и аминокислотой в следующей серди экспериментов нами исследевалось влияние мягкого кислотного (0. IN TFA 40 С, 1 час) и щелочного (10% fffl^OH, 40вС,1 час и 16 часов) гидролиза на молекулярные размеры и структурные характеристики гликоаминов. Амшогликоконьюгат с в. у, 1,2 мин в'системе ОФВЗЖХ рехроматографировали в системе эксклюзионной БЗЖХ до и- после указанных воздействий j e рефрактометрической, регистрацией оптически активных 'компонентов |(рис.,4). Щелочной гидролиз в течение 1 часа не изменял хроматографического поведения аминогликоконьюгата Кислотный гидролиз в; течение 3 часа и 16-ти-иасодыйщелочной гидролиз приводили к уменьшению молекулярных размеров аминогликоконьюгата; проявившемуся в увеличении времени выхода на, эксклюзионной колонке (рис.4). Деполимеризация гликоамина сопровождается значительной (более чем на 80%) потерей аминокислот, (рис.5) и существенно,меньшей потерей углеводов (около 7%). Молярное соотношение .аминокислоты : углеводы, отщепляемых при., рехроматографии после 1б-ти часового: щелочного гидролиза составило 1,9:1., Гак как эти типы;гидролиза не' вызывают деструкции гликозид-ных свя'зей, можно заключить, что. деполимеризация-аминогликоконьюгатов в этих условиях происходила за счет гидролиза сложноэфирных. связей. Дополнительные эксперименты показали, .что 16-ти часовой щелочной гидролиз (ЮЭД^ОН.ЧОс) приводит лишь к незначительному деблокированию (менее ' 10Z j от общего'уровня) выявляемых в реакции с ТНБС аминогрупп гликоаминов, | что подтверждает предположение о преимущественной деструкции в эти^ условиях слозою-эфирных связей.

Данные ИК-спектроскопии амшогликоконыогатов, проведенной для гомогенных соединений в виде таблеток бромида калия и ■ в растворе, коррелируют с результатами химического анализа Характеристичными полосами поглощения для гликоаминов, закономерно повторяющимися при исследовании различных по химическому составу образцов, являются полосы поглощения около 1740-1730 см ; около 1710- '■ 16g0 см"* и около 1660см"1. Данные полосы поглощения соответствуют карбонильной Родосе поглощения (валентные колебания)' в сложных эфирах (около. 1740 см"*); альдегидному и (или кетонному карбонилу) около 1700 см ; (С=Мсвязи) около 1660 см'Стабильной в ИК-спектре гликоаминов являеться также полоса около 1640 см\ соответствующая, по-видимому, деформационным колебаниям свободных аминогрупп первичных аминов. Это тем более вероятно, что в обзорном ИК-спектре гликоаминов регистрируются отчетливые полосы поглощения около 3300- 3500 см* , что соответствует частотам валентных колебаний NH^- групп первичных и вторичных аминсв.

Рис.3 Выходы ФТГ-аминокислот Гл и свободных аминокислот.

Asp Glu Ser Gly ha Arg Tfir Ala Pro Туг Vul Met Ile Leu Phe 1уз Угл-лм Mie. I.; ■ .1 Гидролизовонныя В Натиония Рис.5.; ВЫХОДЫ ОМИНОКИСЛйГ Г/1ИКОСМИНО до

i и после щелочного гидролиза.

Следует отметить, что набор характеристичных' для гликоаминов полос поглощения отсутствует в ИН-спектрах смеси мономеров, входящих в состав аминогликоконьвгатов (глюкоза и ..свободные аминокислоты) и присутствующих в свободной форме в миллимолярных концентрациях в уль-трофильтратах плазмы крови. Соответствие-определенных полос поглощения определенным химическим'связям верифицировано в, экспериментах по влиянию мягкого щелочного (10% NH^0H,40 C,15 ч. )'и кислотного (0.1N HCl, 1С5°С, 16 ч.) гидролиза;на спектральные характеристики и уровень свободных'аминогрупп гликоаминой. У гликоаминов, подвергшихся перечисленным выше типам'гидролиза происходит исчезновение полосы в диэ. пазоне 1740-1730 см* соответствующей карбонильной полосе' поглощена, .(валентные колебания в сложных эфирах) в гликоаминах,уменьшению интенсивности полосы 1660 . см"' соответствующей . колебаниям -ON- связи. Согласно результатам структурного" анализа исследуемых веществ можно предположить,,., что-структурными;, единицами гликоаминов, могут быть ; сложные зфиры аминокислот -' и. углеводов,; . основания Шиффа й/или продукта ■ Амадори: ; - ■ '...-■" д- ':: --Г':"■];'-".■.-/• -г -/•'. ',,

•-. Модифицируют^ влияние гликоаминов сыворотки ' крови 'иьшеА.

BALB/c на агрогационнш свойства клеток перевивной рабдот- .

осарюш. b/lL-'f''" '^" •' , ■

-,-.,-. / Селективным й надежным маркёром ■ злокачественной: - трансформации опухолевых' клеток является .( их способность формировать в суспензии •трехмерные колокивподобнке.структуры, т. е. пролиферировать в-агрегированной ;форме,. Кроме1того сфероида являются уникальной микромоделью опухолевого узла и рассматриваются как аналог аваскулярной стадии . развития злокачественной-опухоли. В связи.с. этим определенный интерес представляло/.изучение,на способность опухолевых :;клеток;;фор1мроват*>"' сфероиды - in. v i tro и, влиять на ме-тастазирование- i г. v i vo. = При изучении непосредственного влияния сывог . ротки крови:: мышей: и i ее .фракций с различней молекулярной. массой на " способность клетск рабдомиосаркомы (формировать сфероиды выявлены следующие закономерности. Сыворотка крови животных на всех этапах роста опухоли стимулирует формирование сфероидов опухолевыми клетками как на субстрате миллипорового фильтра, так и в суспензии (рис.6). Способность» ингкбировать. формирование сфероидов обладают фракции с молекулярной массой меньше 1 и/или 10 кД, максимально стимулирующей сфероидообразование, активностью обладает фракция ' с молекулярной массой выше 100. кД (рис.б). Опухолевые клетки в присутствии 30% фракции сыворотки крови (м.м.<1 и/или: 10 кД) теряют, агрегационные свойства от-подложки, приобретая адгезивные,свойства, , при этом регистрируемый эффект носит дозо-зависимый," характер. ' " Дезагрегация молекул. ,Гл приводит <к полной потере .способности ингибировать сфероидообразование. Установлено, что .низкомолекулярная фракция сыворотки (<1 и/ или ЮкД) крови мышей и очищенных Гл ингибирует стимулирующий эффект высокомолекулярной, фракции сыворотки крови мышей (> 100 кД). Структурные аналоги Гл (Г1А, Г1Г,, Г2А, Г1АЗГ, Ф-Г, Ф-Л, 4-И,

Ь-В, Ф-Ф, ' Ф-/-А) также проявляют ингибирующий эффект на агрегацию опухолевых клеток. В культуральной среде з!ти соединения в концентрации'2,5 мМ, не оказывая цитотоксического действия на опухолевые кле-i-ки, ингибируюг сфероидообразование опухолевыми клетками на 60% у ПГ, на 30% у И'АЗГ, ' на 20% у ПА, на 10% у Г2А для зфиров аминокислот и углевода и на 38% • у Ф-Ф, 20% у Ф-Г,, 58% у |ф-Л, 46% у Ф-И, 76% у Ф-Е, 99% у Ф->-А для продуктов Амадори что, по-видимому, указывает на значение положения аминокислоты в молекуле сахара (Г1Г, И.А, Г?,А, Г1Л?Д" и природы аминокислотного радикала .аминокислоты (Ф-.Г, Ф-Л, Ф-Ii, &-Б. Ф-Ф, Ф-^-А);, .а также специфичности биологического эффекта различных аминокислот. ' При изучении модифицирующего (влияния Гл на колони-Зс^ы* легких опухолевыми клетками установлено, Что фракция сыворотки крог с молекулярной массой выше 10 кД стимулировала метастазирование, личество метастазов в легких увеличивалось более чем в 2 раза, .t фракция сыворотки крови с молеклярной массой ниже 1 и/или 10 кД практически полностью ингибировала метастазирование. При совместном вк«-дении этой фракции с высокомолекулярной фракцией также отмечено инги-бирование' стимулирующего:эффекта и колонизации. легких. Добавление к высокомолекулярной фракции (>.100 кЮ' сыворотки равного количества низкомолекулярной фракции (<1 и/или 1 -10. кД) не только приводило к снятию эффекта стимуляции метастазирования в легких, но и ■ оказывало ингибирующий эффект.; . Эффективность ингибирующего влияния Гл на колонизацию легких подтверждена гистологическими' исследованиями.

Структурный анализ синтетических структурных аналогов гдшоаыи-нов (ССЛГ). ■•'.. . ' 1

Исходя из результатов структурного анализа гликоаминов, описанных выше . было высказано предположение , ч^со аминокислоты и. угле воды,которые входят .в состав гликоаминов соединены сложнозфирными связями .связями типа оснований Шиффа и/или продуктов Амадори. • Для подтверждения .наличия таких связей в'структуре 1гликоаминов были синтезированы, соединения представляющие структурные ''аналоги гликоаминов : со сложнозфирной связью между углеводом ' и ., аминокислотой (ПА, ПГ,Г2А,Г1АЗГ)., основания Шиффа' (Г-Ы-Г,А^-Я-Г) .продуктов Амадори ' (Ф-Л,Ф-&Ф-В,Ф-Ф,Ф-А). Соединения Г1Л,Г1Г,Г2А1ИАЗГ были синтечирова-ниы сотрудником Института биоорганической и ;нефтехимии АН Украины к. х. н. А. В. Огороднийчуком,основания Шиффа и продукты Амадори бы,:*и синтезированы сотрудником Института фиэхимии 'АН . Украины к. х. н. В. синым. Зти соединения хроматоградировались в системах, в которых ¡¡рог ■ дилось выделение и очистка гликоаминов, , поведение их при щелочном кислотном гидролизе ,сиквекее. ; а также сьемка) ИК-спектров. Результаты исследования хроматоГрафического поведенияI. структурных 'аналогов гликоаминов приведены в таблице 4. ! Как видно из таблицы 4, ССАГ в системе зксклюэионной ВЗЖХ достаточно хорошо отделяются как от высоко, так и от низкомолекулярных соединений. j

Таблица.4.

Хроматографическое поведение - синтетических -структурных аналогов гликоаминов,; в системах зксклшионной.обращенно-фаэовой.нормальнофа-эовой взюс. • - ••'■"!•■.'■:

н/н : Название :( Бремя удерживания,(мин.) :

: соединения

' : Тип колонки/скорость потока (мл/мин)

~ . : РгоЬет-Рак :: КаШ а1 Рак.. (?асЦа1. Рак

: : 1-60/(. 5мл/мин) С18/(2мл/мин)' !ЯН2/(2мл/мин):

1 г1г 18.6 :;'. ; . 2. 95

2 г1а , 18.6 - 1.4 v -2.85

3 . г2а 18.5 ; 1.55 3.7

4 г1азг 18.7 1.6 ' 3. 7 :

5 . г-я-г. 19.6 . 1.6 3.8

6 а-н-г . 18. 6; гд' 1.06 , "; . 3.8

7 ф-г ; 16.1 - . 2.0 : /•'■'•- 7.5

8 р-л ' ,17. 8 ■ ■ .3.-1- ■■>;■■.■• 6.2

9 . ф-и 16.7 v" 2.9 •'л';. 6.7 ,

10 ф-в -.■ . 15.8 3.25 ' - 8.4

11 ф^-а " 19.6 .; 2.1 ; 5.9

12 . ф-ф . . 18.8 л-.: 8.1 : -о - .-.: 9.1 '

13

14

15

глюкоза . садзсь аминокислот бычий сывороточный альбумин '

25

•25

12.1

Из приведенных выше результатов, '.по хроматографированию сс можно сделать вывод, что только последовательное применение эксы эионной , 0Ф-, НФ-хроматографии может быть использовано для доетатс но эффективного хроматографического разделения и выделен ССАГ. По-видимому, последовательное применение этих систем было дост точно эффективным и при хроматографированиии природных гликоаминов плазмы или сыворотки крови .

В следующей серии экспериментов исследовано влияние различи типов гидролиза (гидролиз 0.НС1 и 10£.№Ц0Н в течение 16 часов п 37*С) на стабильность ССАГ. Проводили также исследование влияние дер ватиэации ССАГ с ФИТЦ на их стабильность. Результаты исследован приведены на рис.-7. Как видно иэ- рисунка, действие данных типов гид ролиэа приводит к практически полному разрушению ССАГ. Следует отм тить.что при кислотном гидролизе происходит более полный гидрол ССАГ рис.?, чем при щелочном.

Следует отметить,что даде : кратковременное увеличение рН . аетвора (.около 20 минут), которое происходит при взаимодействии САГ с ФИГИ приводит, к значительному повышению выхода аминокислот соединений. 1-6. (соединения со свободными аминогруппами и Шиффо-ы основания). ,

Данные по щелочному и кислотному гидролизах коррелируют с д&нны-и по гидролизу природных'гликоаминов плазмы'(сыворотки) крови живот-ых опухоленосктелей ( в тех же условиях природные гликоамины теряют т 80 до 99 X "' аминокислот в зависимости от типа гидролиза и образам что говорит о подобных типах связей между аминокислотами и угле-одами в составе ССАГ и природных соединений.

В следующих сериях экспериментов-проводено секзенирование ССАГ таб.5). Показано,что . только соединения .1-5 (сложные эфиры амино-ислот и углеводов и основание Шиффа) секвенировались с выхо-1 - , ' . / '. ■ Таблица 5.

Выходы ФТГ-производных. ССАГ и .свободных аМИНОКИСЛОТ после первого цикла секвенирования.

/Н : Название соединения : Выходы аминокислот после первого • . р.;' ■;. : цикла секвенирования (X)

1/.'•'" ■' ПА . ■' .'•, — 3.8.

2 иг .У: "

3 Г2А ' ' •■ • ■ • У..

4' Г1АЗГ . ; А1а(4. 2) , 61 у( 7. 7)

5 ■ Г-М-Г ■•■ 1з.з

6 Ф-Л :

7 Ф-И •■••'. - ^ 1.0- ,

8 Ф-Ф '-' : о.7:"Ч"г

9 ' Ф-Г - •' ' 1..1: '; ■

10 А1а ; 35. 7 : . г ¡-'

11 61у 25.5

ом достаточным, чтобы его можно было зарегистрировать (от 3. 8 до 13 )¡соединения 6-9 (фруктозилы ) давали очень низкие выходы соот-етствуюших ФТГ-аминокислот при секвенировании (от 0.7 до 1.1%), что огло соответствовать секвенировании ¡примесных аминокислот из которых ыли синтезированы данные соединения. Соединения 1- '5 показывали в хо-е секвенирования полное соответствие свойствам гликоаминов выделен-ых из плазмы (сыворотки) крови людей с опухЬлевым процессом : амино-:ислоты полученные после полного гидролиза б-ти нормальной соляной ислотой полностью соответствовали., аминокислотам; вьивленным после -го цикла секвенирования; все,аминокислоты ССАГ (1-5) выявляются как родукты 1-го цикла секвенирования в виде ФТГ- производных амино-ислот; дальнейшее секвенирование-приводит к значительному падению ыхода аминокислот ССАГ (рис.®). Следует также отметиь , что соединен

шш рис Н ю*мн сн СИЗ о.1 n ней

Рис.7.Влияние деривагизации с РПС (А),

О б 12 ■ 18 Т, и±а

Рио.8. Идентификация продуктов 1-го и 2-го циклов саквенирования синтетичаского аналога глиноамина б-0-аланил-2,3,4-0-три-глицил-^-ывгил-Д-глюнопиранозид тетрагидробромида в вида фанилтиогидантоиновых производных аминокислот.

: 1-5 отличаются по выходу аминокислот после первого цикла сквени-¡ания от соответствующих свободных аминокислот (таб.5).

Съемка ИК-спектров ССАГ проводили в диапазоне 2000-1450 см . Зта гасть имеет наиболее характеристичный набор полос для природных шогликоконыогатов(см. выше). Данные по ИК-спектроскопии ССАГ полу-шые при. съемке их спектров в таблетках бромида калия коррелирует с шыми спектоскопии гомогенньос гликоаминов из плазмы (сывротки) кро-онкологических больных и животных опухоленосителей, полученных в : же условиях. Для соединений которые являются сложными зфирами [нокислот и^-метилглюкопиранозида основные . характеристические по-ы лежат в областях 1756-1744 см'*.и 1630-1628 см"''. Полоса 1756-1744

-по-видимому , соответствует карбо нильной полосе поглощения юнтные колебания )в сложных зфирах. Следует отметить , что увели-me количества сложнозфирных связей в составе зфиров . ( соединения 1 и Г1АЗГ)приводит к незначительному сдвигу в более близкую красную ¡асть спектра. - Полосы 1630-1628 см соответствуют, nor видимому, де-мационным колебаниям свободных аминогрупп первичных аминов. Фрук-1илы имеют в.своем спектре полосу 1673-1669 си" ■ которая йтвеча-по-видимому,валентным колебаниям -С=М- группа,

. • , ВЫВОДЫ V::"; j-vv-'k. .

1. Установлено', что; частота'повшюния уровня гликоаминов плазмы сыворотки ) крови ' больных опухолями молочной железы составила 4%, "при.раке яичников - 86.6%, • при раке тела матки - 71.4Z, при в шейки матки ..- 1.00%,; что позволяет рассматривать их.неспецифи-кими опухолевыми маркерами. •. . ' -

2. В состав, гликоаминов' плазмы ( сыворотки'). крови. онкологических ьных входят, аминокислоты и. углеводы, которые соединены между собой редством сложнозфирных связей, связей типа оснований Шиффа и/или дуктов Амадори. ; • : :•';' : ' '

- 3. Синтетические, структурные аналоги гликоаминов коррелируют с родными гликоаминами в при хроматографировании в системах обращен-фаэовой, нормально-фазовой и зксклюзионной высокоэффективной жид-тной хроматографии, имеет■подобные ИК-спектры, аминокислоты синте-еских структурных аналогов показывают близкое к аминокислотам при-ных гликоаминов поведение при;секвёнкровании. . 4. Гликоамины сыворотки - крови мьшей-опухоленосителей более чем 95% ингибируют образование сфероидов клетками рабдомиосаркомы МХ-1. дение предобработанных гликоаминами'сыворотки крови мышей опухоле-Ителей клеток рабдомиосаркомы приводит к очень слабой их колониэа-

л0гких. ,

5. Синтетические структурные аналоги гликоаминов ингибируют на - ИГ, 30% - Г1АЗГ, 20%-И А, 10%- Г2А, 38%- Ф-Ф, 20%- Ф-Г, 58% А 46% -Ф-И, 76% -Ф-'В, 99% - Ф- -А образование сфероидов клетками ¡¡ЙЧиосаркомы.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ Ю ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ '

1. Primary structure of the aminoglicoconjugates: amino acid and carbohydrate composition,, sequencing-of 22 glycoamines, isolated fron blood plasma : ' oncological , patients. //J. Tumor Marker Oncology. -1988.-v, 3.-n. 3. -p.317. /соавт. Глинский Г. В. .Винницкий В.Б./;. . , • '. • ••■■..- .' ; '

2. Structural analysis ,of a new class of humoral tumor markers: characterization of 48 aininoglycoconjugates (glycoamines)isolated from rat and human • blood plasma. //J. Tumor Marker Oncology.-1990.-v. 5. -n. 2.-p. 107-118. ;

/соавт. Глинский Г. R /

3. Structural analysis .of the : carbohydrate core ; of aminoglicoconjugates (glycoamines) from blood plasma oncological patients.//там же 1989.-v. 4.'-п. 2.-p.! 85. / соавт. Глинский Г.В./

4. Structural analysis of the carbohydrate core of aminog1icoconjurates (glycoamines) from blood plasma oncological patients.//там же '. - 1S89. -v. 5. 4i2. -p. 137-160. /соавт. Глинский Г. В./

5. Glycoamine-synthetizing reaction : molecular mechanism of the incorporation of monomers' iinto aminoglycoconjugates.//там.же.-1989. -v. 4. -n. Z. -p. 134. /соавт . Глинский Г. Е . Ливенцов В. Е , Сидоренко М. В., Винницкий В. Бс / , . ' • " . - " ..-.,'

.e.Glycoamine-synthetizing reaction ; molecular mechanism of the incorporation of monomers into., aminoglycoconjugates. // там. же.г1989.-у. 5. -п. 2.-p. 119-136. /соавт Глинский Г.Е, Ливенцов ЕЕ, Сидоренко 1L. Е , Винницкий Е Б., Сурцило Н. И. / :

7. ¡Chemical,biochemical,spectroscopic , and" biological identification of ^structure-function ,determinants'. of. glycoamines (aminoglycocorijugates).//там же.-1990. - v.5.-п.3. - p.250. / соавт. Глинский Г.Е, Иванова А. Б., Осадчая Л. П. и др. /

8. Structural analysis* of synthetic structural analogues of gl lcoamines : contribution into elucidation of the structure and biogenesis * of ,' hatural , aminoglycoconjugates. //там же. -1990- - v. 5. -п. 3. -p. 250. /соавт. Глинский Г. Е , Огороднийчук А. С.,Ши-лин ЕЕ и др. /

9. Структурный анализ нового класса гуморальных опухолевых маркеров : характеристика. 48 ашногликокоиыогатов (гликоаминов) .выделенных из плазмы крыс и людей.// Материалы XX республиканской научной юбилейной конференции (тезисы).-1991.-с.223.- г.Тбилиси/ соавт. Глинский Г. В., Шемякин В. Е , Маркин Е А. /

10. Модифицирующее влияние эндогенных биополимеров - гликоаминов сыворотки крови мышей линии BALB/c на агрегационные свойства клеток перевивной рабдомисаркомы. //Экспериментальная онкология 1991. -т. 13. -п. 6. -с. 27-33.